Validacao Protocolos Analises Quimicas 2010

CONSELHO REGIONAL DE
QUMICA - IV REGIO (SP)

Ministrante: Leonardo Csar Amstalden
Laboratrio T&Analtica - Campinas/SP
Contatos: leonardo@teanalitica.com.br
Ribeiro Preto, 22 de maio de 2010
Validao e protocolos
emanlises qumicas
Apoio
Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formato
PDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
M i ni cur so s C R Q -I V -2010
Val idao e Pr ot ocol os em Anl ises Qumicas
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
VALIDAO
E PROTOCOLOS EM
ANLISES QUMICAS
Leonardo Csar Amstalden
Gerente da Qualidade - Laboratrio T&E Analtica Campinas SP
Mtodos Qumicos: So procedimentos empregados para IDENTIFICAR
(Anlise Qualitativa) e/ou QUANTIFICAR (Anlise Quantitativa) compostos
qumicos:
Anlise qualitativa
A anlise qualitativa empregada quando se pretende determinar ou
identificar as espcies ou elementos qumicos presentes numa amostra,
podendo ser eles atmicos ou moleculares.
Anlise quantitativa
A anlise quantitativa empregada para se determinar a quantidade de
uma espcie ou elemento qumico numa amostra. Sendo utilizada para a
determinao de concentraes, volumes ou massa exata da substncia,
atravs de tcnicas de: gravimetria, volumetria, instrumentais, entre outras
expressa por resultados numricos dos componentes da amostra.
Mtodos Instrumentais emqumica analtica foramdesenvolvidos a partir
do incio do sculo XX, baseados em propriedades como condutividade
eltrica, emisso ou absoro de luz dos analitos presentes em um
composto.
Tcnicas de separao, determinao e quantificao das espcies
qumicas passaram a ser conhecidas como MTODOS DE ANLISE
INSTRUMENTAL e foram favorecidas pelos dispositivos tecnolgicos
eletrnicos e capacidadede processamentodos computadores.
A maioria dos equipamentos analticos modernos possuem ou esto
conectados a umou mais dispositivos eletrnicos sofisticados capazes de
detectar e registrar dados relativos aos analitos
Um mtodo quantitativo baseado na resposta do sistema de
deteco do instrumento ao sinal gerado pela espcie qumica de
interesse presente na amostra emestudo, comparado comaquele
gerado por umproduto que temesta mesma espcie qumica de
interesse presente emuma concentrao conhecida de declarada
(PadroAnaltico).
A resposta geralmente umsinal eletrnico que gera umpico de
intensidade, cuja rea calculada atravs de um software de
aquisio de dados do instrumento, fornecendo um valor
numricoaos sinais que representama espcie.
Assim so quantificados os sinais gerados pelas tcnicas de
HPLC, CFG, AA, ICPlasma, dentre outras.
At as dcadas de 80 e 90, umlaboratrio desenvolvia um
mtodo analtico baseando-se principalmente na resposta
linear do detector a diferentes concentraes do analito em
uma faixa de interesse. Se fosse razovel, o mtodo era
aceito sem maiores questionamentos, muitas vezes
descrito apenas como uma receita de bolo. Pormalgumas
questes comearama ser levantadas, emespecial duas:
Como asseguro que o resultado obtido verdadeiro?
Se outro laboratrio for utilizar meu mtodo, ser que
conseguir reproduzir os resultados que obtive?
Para responder essas questes preciso VALIDAR meu
mtodo
Definio: Validar um mtodo testar o seu desempenho, de acordo com
critrios estabelecidos, tendo como objetivo confirmar se ele apropriado para o
uso pretendido.
O laboratrio deve validar:
Mtodos no normalizados
Mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio laboratrio
Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram criados
Ampliaes ou modificaes em mtodos normalizados
Deve haver um procedimento que descreva o
processo de validao e cada estudo deve ser
planejado atravs de umPlano ou Protocolo de
estudo.
O laboratrio deve utilizar equipamentos
adequados e calibrados ou qualificados, quando
aplicvel.
O responsvel pelo estudo deve ser
competente na rea, sendo capaz de tomar
decises apropriadas durante a realizao do
estudo.
Documentos de referncia:
INMETRO DOQ-CGCRE-008 R03 - Orientao Sobre Validao de
Mtodos Analticos, fev/2010
ANVISA: RE 899 de 29 de maio de 2003 - GUIA PARA VALIDAO
DE MTODOS ANALTICOS E BIOANALTICOS
Os parmetros de validao devem estar claramente
declarados no procedimento documentado e incluir, quando
aplicvel:
Seletividade/Especificidade
Linearidade
Faixa de trabalho e Faixa linear
Limite de deteco
Limite de quantificao
Tendncia/recuperao
Preciso (repetitividade, preciso intermediria e
reprodutibilidade)
Robustez
Como validar?
X
X
REP
REPR
PADRES
INTERLABO
EXATIDO
A
PRECISO
Seletividade/Especificidade
Linearidade e
faixa linear
Limites
Robustez Recuperao
Estabilidade
ELEMENTOS DE UM ESTUDO DE VALIDAO
Figura 1 Parmetros de validao conforme o tipo de ensaio
(1) Dependendo da faixa de concentrao do analito pode no ser
necessria a determinao dos limites de deteco e de
quantificao, como por exemplo: determinao de sacarose em
balas e determinao do teor de gordura emcarnes, por exemplo,
componentes maiores comconcentraoentre 1 a 100%.
(2) So considerados como de menor teor, concentraes entre 0,01 e
1% e como traos, os elementos em concentrao abaixo de
0,01%
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da
medio. Os interferentes podemaumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito
tambmpode depender da concentrao.
Assim, verifica-se se o mtodo seletivo ou especfico para o analito de interesse, ou
seja, se a resposta do instrumento ao se aplicar o mtodo no sofre interferncia de
outros componentes da matriz.
Comoavaliar a seletividade?
1) Analisar umbranco de reagentes, analisar o padro, analisar a amostra come semo
analito de interesse (placebo). Caso o placebo no seja disponvel fazer acrscimo
controlado de padro sobre a amostra.
2) Avaliar a amostra na presena de interferentes, ou seja, introduzir elementos que
provoquemstress
SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE
Avaliao de Seletividade
Agente Condies
Luz
Ex: Exposio da embalagemprimria a Luz Fluorescente comum
e Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga por umperodo
de tempo definido
Temperatura
Ex: 60
o
C na embalagem primria por um perodo de tempo
definido
Umidade
30
o
C / 75% UR na embalagemprimria por umperodo de tempo
definido
AgenteAlcalino
Adio soluo alcalina NaOH 0,1M por um perodo de tempo
definido
Agente cido Adiosoluo cida HCl 0,1M por umperodo de tempo definido
Agente Oxidante
Adio de soluo de H
2
O
2
5% v/v por um perodo de
tempo definido.
SELETIVIDADE
Um mtodo seletivo quando existe probabilidade acima 80% de ser a espcie
pesquisada
ESPECIFICIDADE
Um mtodo especfico quanto ele consegue definir uma funo qumica especfica ou
ainda uma nica espcie distinta em um nico sinal.
Um mtodo especfico quando h uma boa (>95%) probabilidade de ser a espcie
pesquisada
SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE
1- Teor de LCOOIS = Seletivo
2- Teor de BUTEN-2-OL-2 = Especfico
Teor de LCOOIS = Seletivo
3- Teor de Trans- BUTEN-2-OL-2 = Especfico
Teor de BUTEN-2-OL-2 = Seletivo
Teor de LCOOIS = Seletivo
INTEGRAO
NORMAL
1e 2
a
derivada
1e 2
a
derivada
start do pico
possvel pico
pico confirmado
Linha de Base
possvel
pico
pico
confirmado
INTEGRAO:
CALDAS
INTERFERNCIA
b1
b2
Fator de Assimetria
As =b1 /
b2 O fator de assimetria, T tailing factor, uma
medida de simetria de pico, sendo que valores de
T=1,0 referem-se a picos perfeitamente simtricos.
O valor de T pode variar aleatoriamente
dependendo da assimetria do pico. Comvalores de
T < 1,0 observa-se que o pico apresenta uma
assimetria frontal, e com valores de T >1,0 uma
assimetria distal. A variao da assimetria influi no
reconhecimento instrumental do inicio e final do
sinal cromatogrfico (derivada 1 e derivada 2),
responsvel pela variabilidadeda rea integrada.
R = 0 h total coeluio.
R = 1,0 representa 94% da resoluo
em linha de base.
R = 1,5 representa 99,8% da
resoluo em linha de base.
Branco Adio de padro
INTERFERNCIAS
BP
PB
P =Baseline Penetration
BB
Begins or
ends on
Baseline
BV
VB
V=Valley
Mesmo na integrao BB que fornece maior
preciso haver variabilidade em funo da
definio de primeira e segunda derivada
INTEGRAO DE REA
LINEARIDADE - CURVAS
CURVA PADRO: sucesso crescente ou decrescente de pontos obtidos da relao entre a
concentrao da espcie padro pela sua intensidade de sinal proveniente do sistema de
deteco
CURVA DE CALIBRAO: utilizada com a finalidade de se obter o ajuste. Neste caso o
padro definido pelo fabricante ou instituies que zelem pela qualidade.
CURVA DE RESPOSTA: utilizada coma finalidade de se obter comparao analtica para a
quantificao. Busca linearidade dinmica. Aplica-se na curva de resposta a relao
sinal/concentraoa fimde verificar a linearidade (relao direta ouregresso linear)
Na realidade o que se busca a RESPOSTA do sistema de deteco do sistema
grandeza introduzida do analito.
x
y
Coeficiente Angular : expressa a inclinao da curva aos eixos
Coeficiente Linear: expressa a interseco da curva aos eixos
Coeficiente de Correlao: expressa a relao de x a y
CURVA DE RESPOSTA
LINEARIDADE
y=ax +b
Fator de Resposta (FR) =relao
sinal / concentrao
sinal
concentrao
1
2
Variabilidade dos FR = Fator de Linearidade
Fator de Linearidade s a 2% , pode-se
considerar a relao como sendo linear.
Fator de Linearidade >que 2% , neste caso
deve-se utilizar da regresso linear
LINEARIDADE
Coeficiente de Correlao (r): Pode-se estabelecer o nvel da relao entre duas variveis atravs do
coeficiente de correlao o qual denotamos por r, que varia de -1 a 1.
Coeficiente de Determinao (r
2
): Obtido elevando-se r ao quadrado e varia de 0 a 1.
Assimse uma relao possui coeficiente de correlao 0,80 ento (0,80)
2
=0,64 que multiplicado por
100%=(64%) indica que a variao dos y
s
so explicadas em64%pela relao comx.
Se r =0,40 r
2
=0,16 ou 16%, ou seja, a variao dos y
s
explicada em16%pela variao de x.
Quanto mais prximo de 1 for o valor de r
2
, melhor ser a reta descrita pela regresso linear dos pontos.
Normalmente procuram-se obter retas comr 0,99
A maioria dos equipamentos de medio existentes estabelece a sua faixa
dinmica linear. necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa de
concentrao do analito coincide coma faixa dinmica linear e assegurar
que nenhumoutro fenmeno tenha impacto indesejvel na resposta.
A quantificao requer que se conhea a dependncia entre a resposta
medida e a concentrao do analito. A linearidade obtida por
padronizao interna ou externa e formulada como expresso matemtica
usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na
amostra real. A equao da reta que relaciona as duas variveis :
y =ax+b
LINEARIDADE
sendo:
y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.);
x = concentrao;
a = inclinao da curva analtica = sensibilidade;
b = interseo com o eixo y, quando x = 0.
O mtodo mais sensvel quando pequenas variaes de concentrao
resultamemmaior variao na resposta, ou seja, maior inclinao(a).
Em geral, sero necessrios vrios nveis de concentrao, no mnimo
cinco, para construir a curva analtica. O nmero de replicatas em cada
nvel de concentrao deve ser o mais prximo possvel daquele
empregadona rotina do laboratrio.
A verificao da ausncia de valores discrepantes pode ser feita pelo teste
de Grubbs (ISO 5725-3,1994 e ISO 5725-2, 1994) ou de resduo Jacknife
(SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) e a homocedasticidade, isto ,
homogeneidade da varincia dos resduos pelo teste de Cochran
(ISO 5725-3:1994) ou teste de Levene (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) ou o
teste de Brown-Forsythe (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005).
Alguns procedimentos analticos no demonstram linearidade mesmo aps
qualquer transformao. Nesses casos, a resposta analtica pode ser descrita
por uma funo que modela a concentraodo analito na amostra.
1- Por diluio da soluo -me
- definir a concentrao estimada ou esperada.
- preparar a soluo-me com o dobro da concentrao estimada ou esperada.
- por diluio obter os pontos de acordo com a tabela que se segue:
ponto ( eixo x ) concentrao
5 soluo me
4 80% da soluo me
3 50% da soluo me
2 30% da soluo me
1 10% da soluo me
2- Por preparao de cada ponto
Cada ponto da curva preparado individualmente. Neste caso evita-se o erro de obteno
da soluo-me. Os valores podem ter como base a tabela acima.
CURVA DE RESPOSTA - PREPARO
A - BRANCO
Sempre que possvel a amostra ou o branco desta amostra deve ser a base para os valores de uma
curva, tanto para a adio como para a diluio. Obtido os pontos da curva de resposta,
podem-se definir regras de qualidade para a curva.
AVALIANDO A CURVA DE RESPOSTA
B - A CURVA
1) A curva deve ter no mnimo 5 pontos, incluindo o menor valor (menor valor mensurvel
ou o menor valor de interesse para a quantificao) e o maior valor.
2) Podem-se excluir pontos da curva, mas deve-se manter 5 pontos. O menor e o maior
devem permanecer.
3) Deve-se evitar excluir dois pontos seqenciais.
Nota: nesta situao para se ter 5 pontos, deve-se elaborar a curva com no mnimo 6
pontos, supondo-se a possibilidade de rejeitar um deles.
AVALIANDO A CURVA DE RESPOSTA
C) EXCLUSO DE PONTOS
Um ponto da curva pode ser excludo dependendo do estudo e caso seja previsto em protocolo (lembrando que o ponto
excludo pode ser o valor mais prximo do valor verdadeiro). Umdos motivos da excluso ou no excluso do ponto a sua
influncia sobre a concentrao a ser analisada. Algumas instituies definemvalores numricos para a excluso, por exemplo:
Variaes acima de 15% entre o valor da concentrao obtida para a concentrao de preparao (conc.=massa/volume do
balovolumtrico) seria ummotivo de excluso. Exemplo:
Pto. Conc.Terica
(mg/L)
Conc.Real
(mg/L)
Replicata1
(mg/L)
Variao R1
(%)
Replicata2
(mg/L)
Variao R2
(%)
1 0,50 0,52 0,75 144,2 0,44 84,6
2 1,00 0,98 1,02 104,1 0,97 98,9
3 1,50 1,53 1,48 96,7 1,55 101,3
4 2,00 2,10 2,30 109,5 1,77 84,2
5 2,50 2,45 2,38 97,1 2,65 108,1
6 3,00 3,20 2,70 84,3 3,05 95,3
7 3,50 3,60 3,50 97,2 3,68 102,2
ConcentraoTerica: a ideal planejada
ConcentraoReal: a obtidapela relaomassa pesada do padro/volumedo balo volumtrico
Variao: medidada relao entreo valorda replicata/concentraoreal
TESTE DE GRUBBS
Rejeita valores emrelao estimativa do desvio-padro. Este teste observa
valores dispersos anmalos maiores ou menores que aparecemno grupo de
medidas.
Para aplicao do teste de Grubbs, utiliza-se a amplitude em relao mdia:
1. Colocar os valores obtidos em ordem crescente
2. Determinar a mdia aritmtica
3. Determinar a amplitude do maior (maior valor - mdia)
4. Testar o maior valor do conjunto segundo a equao:
s
x x
G
maior
) (
=
S =desvio padro
5. Testar o menor valor do conjunto segundo a equao:
s
x x
G
menor
) (
=
6. Comparar os valores de G com os valores crticos a 95% de confiana
Nmero de resultados (n) G (95%)
3 1,155
4 1,481
5 1,715
6 1,887
7 2,020
8 2,126
9 2,215
10 2,290
7. Se G
calculado
>G
tabelado
o maior valor rejeitado e, se G
calculado
<G
tabelado
o
maior valor , por enquanto, aprovado.
8. Se o maior valor for rejeitado, determinar a nova amplitude e testar o
menor valor da srie. Se o maior valor no for rejeitado testar o menor
valor da srie.
9. Repetir o processo at que o maior e o menor valores sejam aceitos
http://www.graphpad.com/quickcalcs/GrubbsHowTo.cfm
A A(crescente) A B B(crescente) B
7,08 7,07 Med:7,13 8,16 7,89 Med:8,18
7,19 7,08 S=0,05 8,08 8,01 S=0,306
7,12 7,09 8,29 8,03
7,09 7,11 9,00 8,08
7,16 7,12 8,03 8,10
7,14 7,14 8,01 8,13
7,07 7,14 8,13 8,13
7,14 7,16 7,89 8,16
7,23 7,19 8,13 8,29
7,11 7,23 8,10 9,00
Produto A
Analisando o maior:
G=(7,23-7,13)/(0,05)=0,1/0,05=2,0 G
tabelado 95
=2,290
Maior aprovado
G=(7,13-7,07)/(0,05)=0,06/0,05=1,2 G
tabelado 95
=2,290
Maior aprovado
Analisando o menor:
Exerccio: Fazer o mesmo para o produto B
Faixa de Trabalho e Faixa Linear
Para qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes do
analito ou valores da propriedadeno qual o mtodo pode ser aplicado.
Todo experimento de determinao da faixa de trabalho iniciado pela
escolha de uma faixa preliminar. A faixa de trabalho deve cobrir a faixa de
aplicao para a qual o ensaio vai ser usado e a concentrao mais
esperada da amostra deve, sempre que possvel, se situar no centro da
faixa de trabalho.
No limite inferior da faixa de concentrao, o fator limitante o valor do limite
de quantificao. No limite superior, os fatores limitantes dependem do
sistemade resposta do equipamentode medio.
Dentro da faixa de trabalho pode existir uma faixa de resposta linear e
dentro desta, a resposta do sinal ter uma relao linear como analito ou
valor da propriedade. A extenso dessa faixa pode ser estabelecida
durante a avaliao da faixa de trabalho.
Concentrao
rea
Como definir a faixa de trabalho?
Depende dos objetivos do mtodo.
Normalmente o mtodo indica o valor alvo de concentrao a ser
determinada. Este valor determinado como 100% (meio da curva) e
trabalha-se comas solues mais concentradas e diludas para obter os
outros pontos.
Faixas comuns:
90% a 110%
80% a 120%
50% a 150%
Nmero de
Replicatas
Matriz Objetivos e Procedimentos
Etapa 1: 7 Branco (gua reagente) com concentraes
variadas do analitoou;
Placebo da amostra com concentraes variadas
do analito;
Preparar diferentes concentraes de modo
independente e no a partir de uma soluo me.
Objetivo: Identificar a faixa linear aproximada
e os limites superior e inferior da faixa de
trabalho.
Graficar colocando no eixo X as concentraes e
no eixo y as respostas;
Ir para a etapa 2
Etapa 2: 7 Materiais de referncia de diferentes
concentraes na faixa linear ou;
Placebo da amostra com concentraes variadas
do analito na faixa linear
Objetivo: Determinar a faixa de trabalho e
confirmar a linearidade;
Graficar colocando no eixo X as concentraes e
no eixo y as respostas;
Verificar visualmente a existncia de pontos
dispersos que possam interferir na regresso;
Calcular o coeficiente de regresso linear;
Calcular e construir o grfico dos valores de
resduos. A distribuioaleatria em torno da
linha reta confirma a linearidade;
Ir para a etapa 3
Etapa 3: 7 Placebo da amostra com concentraes variada
do analito, prximas ao LD
Objetivo: Determinar o LQ (limite de
quantificao), que efetivamente forma o
limite mais baixo da faixa de trabalho
Expressar o LQ como a concentraomais baixa
do analito que pode ser determinada com um
nvel aceitvel de incerteza.
DETECTABILIDADE
A DETECTABILIDADE normalmente confundida em anlise instrumental com a SENSIBILIDADE
DETECTABILIDADE
1- o quanto o sistema de deteco do sistema analtico consegue enxergar
2- a quantidade mnima da espcie qumica emmassa que o sistema analtico consegue mensurar
3-Umequipamento possui alta detectabilidade, quando consegue enxergaruma quantidade
mnima da funo ou espcie emquesto.
A detectabilidadede um equipamentoque mede:
A__________________________________________B
0,1 g possui menor detectabilidadeque 0,01g
Exemplo de Detectabilidades de Instrumentos
(considerao geral, pois depende da molcula e do meio)
CFG/FID = 0,5 mg/litro
CFG/ECD = 0,1 g/litro
GC/MS/SIM = 5 g/litro
LC/MSMS = 0,1 ng/mL
ICP = 1 g/litro
HPLC = 0,1 mg/litro
1- Qual a detectabilidade do tolueno quando h deteco na anlise de 0,2 microlitros de uma
soluo aquosa a 0,5 mg/kg.
0,5mg/kg=0,5mg/litro=0,5g/mL=0,5ng/L. Como a detectabilidade foi para 0,2 L
0,5 ng 1L
x 0,2L x = 0,1 ng de detectabilidade
DETECTABILIDADE
2 - Se 0,5 L de amostra introduzida num GC/MS/SIM a massa detectada de 2,5 picogramas (pg)
Se o split for 1:50 a massa ser 0,05 pg = 50 fentogramas
Exemplos:
Limite de Deteco (LD)
Quando so realizadas medidas emamostras combaixos nveis do analito
ou de uma propriedade, como por exemplo, anlise de traos, importante
saber qual o menor valor de concentrao do analito ou da propriedade que
pode ser detectado pelo mtodo.
O limite de deteco para umprocedimento analtico pode variar emfuno
do tipo da amostra. fundamental assegurar-se de que todas as etapas de
processamento do mtodo analtico sejamincludas na determinao desse
limite de deteco.
Para a validao de ummtodo analtico, normalmente suficiente fornecer
uma indicao do nvel emque a deteco do analito pode ser distinguida
do sinal do branco/rudo.
Determinao de Limite de Deteco (LD)
Existemdiversas formas de se calcular o limite de deteco. Abaixo so apresentadas algumas
destas metodologias.
Matriz Clculos Observaes
Branco da amostra LD = X + t (n1) .s
sendo:
X = mdia dos valores dos brancos da amostra;
t a distribuio de Student, dependente do
tamanho da amostra e do grau de confiana e,
s =desvio-padro amostral dos
brancos da amostra.
A mdia e o desvio-padro amostral
dos brancos da amostra so
dependentes da Matriz. Vlido
somente quando os valores dos
brancos apresentarem um desvio
padroamostral diferentede zero.
Branco da amostra com a
menor concentrao
aceitvel de analito
LD = 0 + t (n1) .s
sendo:
t = distribuio de Student, dependente do
tamanho da amostra e do grau de confiana e,
s =desvio-padro amostral dos brancos da
amostra, com adio.
A menor concentrao aceitvel
aquela tida como a concentrao
mais baixa para a qual um grau
aceitvel de incertezapode ser
alcanado.
Branco da amostra e
Branco da amostra com
diferentes concentraes de
analito
LD = 3 x relao sinal/rudo calculado como sendo
correspondente concentrao que
produziria umvalor do sinal medido
3 vezes maior do que o nvel de
rudo mdio medido coma soluo
do branco.
No caso de mtodos instrumentais (HPLC, CG, absoro atmica), a estimativa do
limite de deteco pode ser feita combase na relao de 3 vezes o rudo da linha de
base. Pode ser determinado pela equao,
em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3
curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximas ao
suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido a partir da
curva de calibrao proveniente da anlise de umnmero apropriado de amostras do
branco; IC a inclinaoda curva de calibrao.
LD PARA A RE 899 - ANVISA
fundamental que avaliaes independentes sejam realizadas em
amostras comconcentraoigual ao limite de deteco determinado.
O nmero de replicatas muito elevado pode superestimar o limite de
deteco, por isto, este nmero (n) deve expressar a rotina do laboratrio.
recomendado um mnimo de 7 replicatas para a determinao do LD.
Por exemplo, no caso de se analisar 7 alquotas, temos 7-1 =6 graus de
liberdade de uma matriz de branco da amostra com adio da menor
concentrao aceitvel do analito. Para esses graus de liberdade, o valor de
t unilateral, para 99% de confiana 3,143. O LD ser igual a 3,143 vezes o
desvio padro amostral.
Valores de t
Nveis de confiana
Graus de
Liberdade (n-1)
75% 80% 85% 90% 95% 97.5% 99% 99.5% 99.75% 99.9% 99.95%
1 1.000 1.376 1.963 3.078 6.314 12.71 31.82 63.66 127.3 318.3 636.6
2 0.816 1.061 1.386 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925 14.09 22.33 31.60
3 0.765 0.978 1.250 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841 7.453 10.21 12.92
4 0.741 0.941 1.190 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604 5.598 7.173 8.610
5 0.727 0.920 1.156 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032 4.773 5.893 6.869
6 0.718 0.906 1.134 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707 4.317 5.208 5.959
7 0.711 0.896 1.119 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499 4.029 4.785 5.408
8 0.706 0.889 1.108 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355 3.833 4.501 5.041
9 0.703 0.883 1.100 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250 3.690 4.297 4.781
10 0.700 0.879 1.093 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169 3.581 4.144 4.587
DISTRIBUIO t DE STUDENT
Limite de Quantificao
Algumas vezes tambmdenominado Limite de Determinao. Na prtica,
corresponde normalmente ao padro de calibrao de menor concentrao
(excluindo o branco). Este limite, aps ter sido determinado, deve ser testado
com amostras independentes, para averiguar se a tendncia e a preciso
conseguidas so satisfatrias.
Matriz Determinao
Branco da amostra LQ =X + 5s ou LQ = X + 6s ou LQ = X + 10s
onde:
X = mdia dos valores dos brancos
s =desvio-padro amostral dos brancos
Branco com adio de
concentraes variadas do analito,
prximas ao LD
- Medir, uma vez cada replicata independente, a cada nvel de
concentrao.
- Calcular o desvio-padro amostral s do valor do analito, para
cada concentrao.
- Fazer o grfico concentrao versus s, e atribuir um valor para
o LQ, por inspeo.
O limite de quantificao estabelecido por meio da anlise de solues
contendo concentraes decrescentes do frmaco at o menor nvel
determinvel com preciso e exatido aceitveis. Pode ser expresso pela
equao:
emque: DPa o desvio padro do intercepto como eixo do Y de, no mnimo, 3
curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximas
ao suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido a
partir da curva de calibrao proveniente da anlise de umapropriado nmero
de amostras do branco; IC a inclinaoda curva de calibrao.
LQ PARA A RE 899 - ANVISA
IC
x DP
LQ
a
10
=
O mtodo analtico deve ser especificado e o LQ para
cada analito deve ser expresso nas unidades
apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo
analtico. A matriz da amostra usada para determinar o
LQ deve ser identificada.
Para a anlise emnvel de traos, recomendado adotar
o LQ como a concentrao mais baixa da curva analtica.
Os processos normalmente utilizados para avaliar a tendncia de um
mtodo so, entre outros:
uso de materiais de referncia certificados (MRC);
participaoemcomparaes interlaboratoriais;
realizao de ensaios de recuperao.
A tendncia, quando aplicada a uma srie de resultados de ensaio, implica
numa combinaode componentes de erros aleatrios e sistemticos.
A determinao da tendncia com relao aos valores de referncia
apropriados importante no estabelecimento da rastreabilidade aos padres
reconhecidos.
A tendncia pode ser expressa como recuperao analtica, definida como:
Tendncia/Recuperao
% 100 x
esperado valor
obtido valor
A exatido pode ser avaliada numericamente atravs da recuperao.
RECUPERAO
A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostras
fortificadas com quantidades conhecidas do mesmo (spike). As amostras
podem ser fortificadas com o analito em pelo menos trs diferentes
concentraes: baixa, mdia e alta, da faixa de uso do mtodo.
A limitao deste procedimento a de que o analito adicionado no est
necessariamente na mesma forma que a presente na amostra. A presena de
analitos adicionados em uma forma mais facilmente detectvel pode
ocasionar avaliaes excessivamente otimistas da recuperao.
A recuperao calculada segundo:
Sendo:
C1 = concentrao do analito na amostra fortificada,
C2 = concentrao do analito na amostra no fortificada,
C3 = concentrao do analito adicionada amostra fortificada.
% 100 (%) o Recupera
3
2 1
x
C
C C
|
|
.
|
\
|

=
Exemplo: Sobre uma amostra de bolacha adicionou-se 1000 UI de palmitato de retinol.
Aps 5 anlises (extrao e quantificao) por HPLC encontrou-se a mdia de 800 UI.
Qual foi a % de Recuperao?
Recuperao =( 800/1000 ) x 100% = 80%
Pode-se utilizar:
1- Outra substncia para monitorar a extrao
2- Utilizar a tcnica de Padro Interno (relao de sinais) para minimizar o erro entre
analistas ou variaes na injeo.
1- Monitor de extrao
Neste caso instroduz-se uma substncia externa, com nica finalidade de acompanhar a extrao
RECUPERAO
2- Padro Interno ( relao de sinais)
Monitor
mesma
quantidade
analito
Sinal 1000 5000
Sinal 500 1000
Rel=1000/500=2=2,5 mg do ativo
Ativo
extrado
Sinal 500 2000
Rel=2000/500=4 =5 mg do ativo
1 mg do
Padro interno
5 mg do
ativo
Sinal 500 5000 Sinal 5000 5000
1 mg do
Padro
interno
PRECISO
PRECISO : a proximidade da concordncia (grau de
espalhamento) entre uma srie de medidas obtidas de
mltiplas amostragens de uma mesma amostra homognea
dentro de condies determinadas.
Qual a finalidade da Preciso?: garantir que as medidas no
foram realizadas ao acaso, que ela possa ser repetida e
reproduzida.
PRECISO
A Preciso sempre ter distores de medida, pois envolver sempre uma
variedade de fatores para gerar erros:
- corrente eltrica
- formao de base do analista na forma de operao e interpretao
- reagentes de lotes ou fabricantes diferentes
- estado emocional do analista
- iluminao do ambiente de trabalho
- variabilidade intrnseca do equipamento ( estabilidade ou tempo de estabilizao)
- necessidade analtica para obter a destreza do primeiro resultado
- diluies, derivaes, alquotas, temperatura ambiente e de armazenamento
- transportes envolvidos at a realizao da amostra
- limpeza do material analtico e de coleta
- contaminaes alfa ( no reconhecidas pelo uso constante )
- outras
Normalmente determinada para circunstncias especficas de medio e as
trs formas mais comuns de express-la so: por meio da repetitividade,
preciso intermediria e da reprodutibilidade, sendo usualmente expressas
pelo desvio padro e coeficientede variao.
O coeficiente de variao (CV, usualmente expresso em %), tambm
conhecido como desvio padro relativo (DPR), calculado da seguinte
forma:
Sendo:
DP =desvio-padro;
C
mdia
=concentrao mdia determinada
100 (%) x
C
DP
DRP CV
mdia
= =
Preciso
Repetitividade
As condies de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando:
Mesmo procedimento de medio;
Mesmo observador;
Mesmo instrumento usado sob mesmas condies;
Mesmo local, e
Repeties no menor espao de tempo possvel.
A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos da
caracterstica da disperso dos resultados e pode ser determinada por meio
da anlise de padres, material de referncia ou adio do analito a branco
da amostra, emvrias concentraes na faixa de trabalho.
Preciso intermediria
A preciso intermediria, de acordo coma ISO 5725-3, refere-se preciso
avaliada sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando
o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio, mas definindo exatamente quais
as condies a variar (uma ou mais), tais como:
Diferentes analistas;
Diferentes equipamentos;
Diferentes tempos.
Esta medida de preciso representa a variabilidade dos resultados em um
laboratrio.
Na maioria dos casos, o valor de preciso intermediria funo do nvel de
concentrao do ensaio e o seu clculo efetuado, preferencialmente, a partir
dos resultados obtidos, aps eliminao dos resultados discrepantes. A
visualizaogrfica dos valores tambmpode ser til para identific-los.
Dependendo do ensaio e do tipo de aplicao do estudo da preciso
intermediria, existem vrios mtodos para determinao e controle desse
parmetro, tais como:
Por meio de grfico de controle do desvio padro, que poder ser aplicados
para replicatas de amostras e para padres estveis ao longo do tempo;
Por meio de expresses matemticas que apresentemresultados numricos e
critrios de aceitaodefinidos.
Ummtodo simplificado para estimar a preciso intermediria baseia-se na
execuo de n medies (n 15), emcondies pr-definidas, sobre:
uma mesma amostra;
amostras supostamenteidnticas;
padres
A estimativa da preciso intermediria Si ( ), neste caso, dada por:
=
n
k
k k j
y y
n
Si
1
2
) , (
) ( .
1
1
em que Si (j,k) o desvio padro de preciso intermediria relativo a
esse grupo, onde os smbolos relativos s condies intermedirias de
preciso podemaparecer entre parntesis (Ex: Si (T.O) significa tempo e
operadores diferentes).
Sendo:
n =n de ensaios efetuados por amostra ou padro;
yk =cada resultado obtido;
y =representa a mdia aritmtica de cada resultado obtido.
EXATIDO
Na prtica, a Exatido tem por finalidade, garantir que o valor medido, esteja prximo
do valor declarado.
Na amostragem garantir que todo o ativo foi quantificado na extenso desejada.
EXATIDO : qualidade que exprime compatibilidade de valor aceito com valor de
referncia.
ACURCIA : o grau de proximidade de um determinado valor ao valor real ou
conhecido nominal em condies determinadas. Pode ser medido em relao ao
maior desvio.
Valor nominal
Espalhamento
Valor Mdio
Valor Distante
EXATIDO
Garantir a Exatido envolve situaes, hoje dispendiosas em tempo de resposta e ou
custo financeiro, como:
- PADRES ANALTICOS DE REFERNCIA CONFIVEIS
- ENSAIOS INTERLABORATORIAIS DA METODOLOGIA
- COMPARAES EM ENSAIOS DE PROFICINCIA
- RECONHECIMENTO POR ORGOS CONSIDERADOS COMO
GUARDIES DA CONFIABILIDADE
Robustez
A robustez de ummtodo analtico a medida de sua capacidade emresistir
a pequenas e deliberadas variaes dos parmetros analticos. Indica sua
confianadurante o uso normal.
Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliao
da robustez. Constatando-se a susceptibilidade do mtodo variaes nas
condies analticas, estas devero ser controladas e precaues devem
ser includas no procedimento.
Testes de Robustez de Acordo com a RE899 - ANVISA
Preparo das Amostras
Estabilidade das solues analticas
Tempo de extrao
Espectrofotometria
Variao do pH da soluo
Temperatura
Diferentes fabricantes de solventes
CromatografiaLquida
Variao do pH da fase mvel
Variao na composio da fase mvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Fluxo da fase mvel
CromatografiaGasosa
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Velocidade do gs de arraste
Definidos os Parmetros de Validao necessrio planejar o estudo de
Validao de Metodologia Analtica.
Um estudo dividido em3 etapas:
1. Plano ou Protocolo de Estudo
2. Etapa Experimental
3. Relatrio Final
O contedo de um plano de estudo e relatrio final depende da finalidade ao
qual o estudo se destina.
Ex: Se for parte integrante de um estudo maior com finalidade de registro de
um produto agro ao IBAMA, deve obedecer a norma BPL (Boas Prticas de
Laboratrio). No Brasil regida pela NIT DICLA 035 do INMETRO.
Se for parte de um estudo de Equivalncia Farmacutica para registro de um
frmaco junto ANVISA, deve obedecer s normas e resolues dessa
agncia.
PLANO OU PROTOCOLO DE ESTUDO
Todo estudo deve ser planejado antes de seu incio e esse
planejamento deve ser descrito em POP (Procedimento Operacional
Padro), contendo todos os itens necessrios para a conduo da
etapa experimental, orientando os analistas, e tambmpara atender os
requerimentos dos organismos de avaliao dos registros.
O plano de estudo deve ser aprovado atravs de assinatura datada do
Diretor de Estudo e verificado quanto conformidade comas BPLs pelo
pessoal da Garantia da Qualidade
a) Emendas ao plano de estudo devemser justificadas e aprovadas por
assinatura datada do Diretor de Estudo e mantida junto como plano de
estudo.
b) Desvios ao plano de estudo devem ser descritos, explicados, dada
cincia e datados prontamente pelo Diretor de Estudo e mantido comos
dados brutos do estudo.
O plano de estudo deve conter, mas no estar limitado, s seguintes
informaes:
1. Identificao do Estudo, da Substncia Teste e da Substncia de
Referncia
a) Ttulo descritivo;
b) Declarao da natureza e do propsito do estudo;
c) Identificao da substnciateste por cdigo ou nome (IUPAC, nmero
do CAS, etc.);
d) Substncia de referncia a ser utilizada.
Contedo do Plano de Estudo
2 - Informaes referentes ao Patrocinador e Unidade Operacional
a) Nome e endereo do patrocinador;
b) Nome e endereo da(s) instalao(es) de teste(s) e unidade(s)
teste(s)envolvida(s);
c) Nome e endereo do Diretor de Estudo;
3. Datas
a) A data de aprovao do plano de estudo por assinatura do
Diretor de Estudo. A data de aprovao do plano de estudo por
assinatura da gerncia da instalao de teste e do patrocinador, se
requerido pelo rgo regulador ou fiscalizador no pas onde o
estudo est sendo conduzido.
b) As datas propostas para incio e trmino do experimento.
4. Mtodo
Refernciaao mtodo na qual a vidao de baseia, se aplicvel.
5. Outros aspectos (onde aplicveis)
Informaes detalhadas do desenho experimental, incluindo uma
descrio da cronologia do estudo, todos os mtodos, materiais e
condies, tipo e freqncia de anlises, medidas, observaes e
exames a seremrealizados e mtodos estatsticos a seremutilizados
(sehouver).
6. Registros
Uma lista dos registros a seremarquivados, incluindo os dados brutos
originais.
ANEXO 1 MODELO DE PLANO DE ESTUDO
ANEXO 2 MODELO DE RELATRIO FINAL
PADRES
VALIDADE DO PADRO
Alguns fornecedores indicam a validade.
Em alguns casos necessrio consultar.
PADRO PRIMRIO
Obtidos a partir do melhor lote de fabricao.
Comercializados por empresas respeitadas ou
referenciadas. Rastreabilidade das anlises e
produtos de origem.
PADRO SECUNDRIO
Obtidos a partir do padro primrio
1- PADRO DE ESPCIE MAJ ORITRIA
2- PADRO POR HISTRICO
3- PADRO RASTREVEL (CERTIFICADO OU REFERENCIADO)
RASTREABILIDADE RASTREABILIDADE
a capacidade de reconstruir um estudo a qualquer tempo, a
partir dos registros analticos (dados brutos, clculos), dos
certificados de calibrao / qualificao dos instrumentos
utilizados, dos registros de utilizao dos equipamentos, dos
registros de treinamento do pessoal envolvido, plano de estudo,
relatrio final, desvios, emendas, anlise crtica, e demais
documentos que compe o trabalho.
ARREDONDAMENTOS E ALGARISMOS
SIGNIFICATIVOS
Arredondamentos manuais
Uso de planilhas eletrnicas
Pode haver diferenas
Ex: Arredondar para 2 casas decimais:
12,238
12,233
12,235
Minicursos CRQ-IV 2010 Validao e protocolos em anlises qumicas
Apoio Caixa Econmica Federal
Exemplo de plano de estudo de validao de metodologia analtica por HPLC/UV
em formulado farmacutico na forma de p estril injetvel pela tcnica de hplc/uv
para o ativo dacarbazina

ESTUDO / ATIVO

Dacarbazina
PATROCINADOR

xxxxxxxxxxxxxxxxx
RESPONSVEL

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
ENDEREO

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
CDIGO DO ESTUDO

xxxx-R00

REALIZAO
(UNIDADE OPERACIONAL)

Analtica Comrcio e Anlises Qumicas Ltda

ENDEREO

Rua J os da Silva, 12 Pinheiros So
Paulo/SP CEP 05409-011

INCIO DO ESTUDO

23/ 04/ 2010
DATAS PREVISTAS

INCIO DOS ENSAIOS 23/ 04/ 2010
TRMINO DOS ENSAIOS 24/ 04/ 2010
TRMINO DO ESTUDO

26/ 04/ 2010
DIRETOR DE ESTUDO

xxxxxxxxxxxxx
ENDEREO


ANALISTA PRINCIPAL

xxxxxxxxxxx
GERENTE DA UNIDADE
DA GARANTIA DA QUALIDADE

xxxxxxxxxxxx

1-Objetivo: Validao de metodologia analtica para a determinao de teor de
Dacarbazina, pela tcnica de Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (HPLC) com deteco no ultravioleta (UV) em formulado
farmacutico.

2-Princpio do Mtodo: A amostra diluda e o ativo quantificado por HPLC em modo
fase reversa e deteco na regio espectral do ultravioleta (UV).

3-Identidade Qumica: Dacarbazina
Frmula molecular: C
6
H
10
N
6
O

Peso molecular: 182,18 g/mol

4-Materiais:
Balana analtica

Pipetador automtico 1,0 mL e 5,0 mL

Cmara de Luz

Cmara de Fluxo Laminar

Estufa

pHmetro

Banho ultra-snico

Membrana de 0,45 micras

Cromatgrafo Lquido

Bales volumtricos 10 mL



5-Reagentes:
Acetonitrila

Fosfato de Potssio Monobsico

cido Fosfrico

6-Solues Preparadas:
Hidrxido de Sdio

cido Clordrico

Tampo Fosfato de Potssio Monobsico

Perxido de Hidrognio

7-Padro de Referncia:
Padro Fabricante
Cdigo
T&E
Pureza Lote
Validade
(ms/ano)
Dacarbazine USP G-3878 100 % H
Corrente na
abertura

8- Amostra
Amostra Fabricante Lote
Fabricao
(ms/ano)
Validade
(ms/ano)
Dacarbazina 200 mg
P Estril Injetvel
xxxx xxxxx 10/2009 10/2011
Receber, identificar e armazenar as substncias de acordo com os procedimentos TE TC AM
001, TE TC AM 002 e TE TC AM 003.
Manusear as substncias com segurana. Em caso de dvida consultar a ficha de MSDS.
Solicitar, ao patrocinador, caso esteja indisponvel. Manter o frasco sempre bem fechado.

9-Condies Analticas:
Coluna: CLV 09 Luna C-18 (2) 100
A
(250 X 4,6 mm) 5 m
Fase Mvel:
A Tampo pH 3,0 60 %
B Acetonitrila grau HPLC 40 %
Diluente: Tampo - Fase Mvel - A
Vazo: 1,0 mL/min.
Volume de injeo: 10 L
Deteco: Ultravioleta a 323 nm
Temperatura: 30 C
Tempo de Reteno Aproximadamente 2,6 minutos
Tempo de corrida 10 minutos
Observao Durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato coma luz.

10-Experimental:
10.1 Preparo da soluo estoque

a) Pesar aproximadamente 20 mg de padro de ativo em um balo de 50 mL;
b) Adicionar ao balo volumtrico cerca de 20 mL do Diluente deixando em banho
ultra-snico por dez minutos;
c) Completar o volume como diluente e homogeneizar.

10.2 Preparo das solues de trabalho

Aliquotar as solues de trabalho em balo volumtrico de 10 mL para os pontos
correspondentes da curva conforme tabela 01:

Tabela 01: Preparo das solues de trabalho
Padro Alquota (mL) Volume Final (mL) Concentrao (mg/mL)
50 % 0,50 10 0,02
75 % 0,75 10 0,03
100 % 1,00 10 0,04
125 % 1,25 10 0,05
150 % 1,50 10 0,06

10.3 Obteno da Curva de Resposta

a) Filtrar e injetar as solues de trabalho em HPLC nas condies analticas descritas;
b) Plotar a curva de resposta coma concentrao (mg/mL) versus rea do sinal analtico;
c) Trabalhar com coeficiente de correlao (r) no inferior a 0,99.

10.4 Preparo da Soluo Amostra

a) Realizar o peso mdio da amostra;
b) Pesar aproximadamente 0,24 g da amostra em um balo volumtrico de 25 mL;
c) Adicionar cerca de 10 mL de diluente. Deixar em banho ultra-snico por dez minutos,
completar o volume comDiluente e homogeneizar;
d) Aliquotar desta soluo 0,5 mL e transferir para um balo volumtrico de 50 mL;
e) Completar o volume comdiluente, homogeneizar, filtrar e injetar.

10.5 Clculos

10.5.1 Clculo da concentrao do ativo sobre soluo amostra (mg/mL)

A concentrao do ativo sobre a soluo amostra foi calculada utilizando-se a equao da reta,
obtida pela injeo de cinco padres (tabela 1), de acordo com a seguinte equao:

a
b rea
Ativo Conc

.

Onde:
Conc. Ativo =concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL);
rea = rea correspondente ao ativo no cromatograma;
b =coeficiente linear da curva de calibrao;
a =coeficiente angular da curva de calibrao

10.5.2 Clculo da concentrao final sobre a amostra (mg/Frasco)

A concentrao final do ativo sobre a amostra foi calculada utilizando a equao:

Massa
PM dil Ativo Conc
Amostra Conc

.
.
Onde:
Conc. Amostra = concentrao do ativo na amostra (mg/Frasco);
dil =Diluio da amostra (mL)
PM =peso mdio da amostra (g)
Massa =massa amostra pesada (g)
Frasco =Frasco Ampola

10.5.3 Clculo da porcentagem de teor

A porcentagem de teor do ativo foi calculada utilizando-a equao:

Espec
Amostra Conc
Teor
100 .
(%)

Onde:

Espec = especificao declarada de ativo na amostra (P estril injetvel - mg/Frasco)
Teor (%) = % de ativo

11-Validao:
Os conceitos de validao aqui aplicados expressamos seguintes valores:
11.1 Especificidade/ Seletividade
11.2 Linearidade
11.3 Preciso
11.3.1 Repetibilidade (intra-corrida)
11.3.2 Intermediria (inter-corrida)
11.4 Recuperao
11.5 Intervalo
11.6 Robustez

11.1 Especificidade/Seletividade
A especificidade ser realizada atravs da anlise do padro 100 % de cada ativo, da fase mvel,
do diluente, da amostra e pela recuperao do ativo em soluo composta de padro e amostra
na proporo de 1:1. Esta soluo composta ser preparada adicionando-se soluo padro do
ponto equivalente ao de 100% da curva da linearidade sobre soluo amostra. As amostras sero
submetidas s condies de estresse para avaliao da especificidade / seletividade e sero
apresentados os resultados em forma de tabelas, como o exemplo abaixo:

Tabela - Condies Estresse
Agente Condies
Hidrlise
alcalina
Adio de 0,1 mL de sol. de NaOH 0,1 M/mL de soluo de amostra na
concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas
Hidrlise cida
Adio de 0,1 mL de soluo de HCl 0,1 M/mL de soluo de amostra de
Oxidante
Adio de 0,1 mL de soluo H
2
O
2
0,75 % (v/v)/mL de soluo de amostra
de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas
Luz
Exposio da embalagem primria Luz Fluorescente comum/24 horas e
Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga-20W/24 horas
(simultaneamente)
Temperatura Exposio da embalagem primria 60 C/24 horas (estufa comum)

A Especificidade/Seletividade ser adequada se no apresentar interferncias detectveis de
outros compostos no tempo mdio de eluio do ativo nas amostras para o branco, placebo e
aps a aplicao dos agentes de estresse.

11.2 Linearidade
Determinar a linearidade em duplicata pelo coeficiente de correlao linear, entre as reas do
ativo nos padres e as concentraes correspondentes do composto na curva de resposta.
O critrio de aceitao a ser considerado r 0,99.
As faixas de linearidade a serem ensaiadas esto descritas no item 10.
Utilizar a equao da reta do primeiro dia para o clculo da especificidade / seletividade, da
preciso (repetibilidade) e da exatido.
Para os clculos da preciso intermediria, robustez e teor, utilizar a equao da reta obtida por
um segundo analista, em uma segunda ocasio.

11.3 Preciso
Avaliar a preciso atravs do coeficiente de variao, determinando a proximidade dos
resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla (determinao de teor
em seis preparaes de amostras, na concentrao 100 %), em duas ocasies.


Obteno dos resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista e mesma
instrumentao. Este analista prepara e ensaia seis solues de amostras na concentrao de 100
% da curva de calibrao e calcular o CV com os seis resultados obtidos. A preciso ser
considerada adequada para repetibilidade (intra-corrida) da amostra se apresentar coeficiente de
variao inferior a 5,0 % segundo RE 899/03 [2].

11.3.2 Intermediria (inter-corridas)
Concordncia entre os resultados obtidos com analistas diferentes para doze determinaes a
100 %, em duas diferentes ocasies. Um segundo analista prepara e ensaia mais seis solues de
amostras na concentrao de 100 % da curva de calibrao no dia seguinte. Os clculos para
obteno do CV (%) so realizados com os resultados dos doze ensaios combinados A preciso
Intermediria (inter-corrida) da amostra ser considerada adequada se apresentar coeficiente de
variao inferior a 5,0 % segundo RE 899/03 [2].

11.4 Recuperao
Para avaliao deste parmetro, determinar os valores das recuperaes, verificados a partir de
nove determinaes contemplando o intervalo linear do mtodo analtico, ou seja, trs
concentraes: baixa (ponto inferior da curva), mdia (100 %) e alta (ponto superior da curva).
Preparar solues em triplicata, a partir de soluo estoque da substncia referncia nas
concentraes 50, 100 e 150 % sobre a soluo amostra nas mesmas concentraes
respectivamente na proporo de 1:1. Para o clculo utilizar a seguinte equao:
100
oTerica Concentra
oObtida Concentra
O RECUPERA

A recuperao ser considerada adequada se apresentar valores entre 90 e 110 %.

11.5 Intervalo
O intervalo ser definido pela faixa de linearidade determinada pelo mtodo e
confirmado pela preciso e exatido. Caso os parmetros estejam aceitveis, reportar a faixa de
linearidade como o intervalo estabelecido.

11.6 Robustez
Realizar alteraes em dois parmetros aplicveis ao mtodo.
Nota: Os resultados de robustez no so avaliados como critrios para estabelecimento da validade
de um mtodo analtico. Eles so apenas uma indicao de que o mtodo susceptvel ou no s
modificaes introduzidas. Para este estudo os parmetros a serem alterados sero o fluxo da fase
mvel de 1,0 mL/min. para 0,8 mL/min. e a temperatura, de 30C para 32C e para que o mtodo
seja robusto os resultados de recuperao devero estar dentro da faixa estabelecida para a exatido
do mtodo.

12-Arquivamento:
Folha de registro de amostras e anlises a efetuar;
Cpia do oramento aprovado;
Documentao de informaes do patrocinador;
Dados brutos, inclusive cromatogramas e os registros necessrios para que se componha a
rastreabilidade do estudo;
Plano de estudo;
Cpia do relatrio de estudo;
Outros documentos que o D.E. julgar necessrios

13-Substituies:
Nome Cargo / Funo Substituto
Analista de Laboratrio
Farmacutica Responsvel
Gerente da Qualidade

14-Etapas Crticas:
1) Preparo dos padres e amostras;
2) Injees dos padres e amostras.

Nota:
necessrio que seja monitorada a temperatura do laboratrio de 25C 5C pela equipe
responsvel e durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato com a luz, pois estas
observaes se tratam de etapas crticas no estudo.

15 - Referncias Bibliogrficas:
[1] - Leite, Flvio; Validao em Anlise Qumica Editora tomo 4
a
edio.
[2] - Resoluo RE 899, de 29 de maio de 2003, ANVISA.
[3] - Merck Index - 13
th
Ed., 2001.

16 Assinaturas

_________________________ ___/___/____
XXXXXXXXXXX
Diretora de Estudo
CRF/SP XXXXXXX

_________________________ ___/___/____
XXXXXXXXXXX
Analista Principal
CRQ/SP XXXXXXX

_________________________ ___/___/___
XXXXXXXXXXXX
CREA/SP XXXXXXX

Exemplo de relatrio final de validao de metodologia analtica por HPLC/UV em
formulado farmacutico na forma de p estril injetvel pela tcnica de hplc/uv para o ativo
dacarbazina

ESTUDO / ATIVO

Dacarbazina
PATROCINADOR

xxxxxxxxxxxxxxxxx
RESPONSVEL

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
ENDEREO

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
CDIGO DO ESTUDO

xxxx-R00

REALIZAO
(UNIDADE OPERACIONAL)

Analtica Comrcio e Anlises Qumicas Ltda

ENDEREO


INCIO DO ESTUDO

23/ 04/ 2010
DATAS PREVISTAS

INCIO DOS ENSAIOS 23/ 04/ 2010
TRMINO DOS ENSAIOS 27/ 04/ 2010
TRMINO DO ESTUDO

28/ 04/ 2010
DIRETOR DE ESTUDO

xxxxxxxxxxxxx
ENDEREO


ANALISTA PRINCIPAL

xxxxxxxxxxx
GERENTE DA UNIDADE
DA GARANTIA DA QUALIDADE

xxxxxxxxxxxx


1-Objetivo: Validao de metodologia analtica para a determinao de teor de
Dacarbazina, pela tcnica de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
(HPLC) com deteco no ultravioleta (UV) no formulado farmacutico
Dacarzin 200 mg P Estril Injetvel.

2-Princpio do Mtodo: A amostra diluda e o ativo quantificado por HPLC em modo fase reversa
e deteco na regio espectral do ultravioleta (UV).

3-Identidade Qumica: Dacarbazina
Frmula Molecular: C
6
H
10
N
6
O
Peso Molecular: 182,18 g/mol

4-Materiais:

Material Fabricante TAG
Calibrao
(ms/ano)
Validade
(ms/ano)
Balana analtica Shimadzu BA-14 11/2009 11/2010
Pipetador automtico Transferpette PP-VAL-01 06/2009 06/2010
Pipetador automtico Transferpette PP-VAL-02 08/2009 08/2010
Cmara de Luz T&E Analtica CDG-01 03/2010 03/2011
Cmera de Fluxo Laminar Grupo Veco FXL 04 10/2009 04/2010
pHmetro Digmed PH 04 07/2009 07/2010
Estufa Faber-Primar ES-8 04/2009 04/2010
Banho ultra-snico Sonitech US-04 N/A N/A
Membrana de 0,45 micras Millipore N/A N/A N/A
Cromatgrafo Lquido Shimadzu HPLC-23 05/2009 05/2010
Bales volumtricos
de 10 mL
Laborglas F1604 08/12/09 08/12/10
Laborglas F1619 07/12/09 07/12/10
Laborglas E7520 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7021 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7008 14/12/09 14/12/10
Laborglas E7658 14/12/09 14/12/10
Laborglas F9240 14/12/09 14/12/10
Laborglas E7608 14/12/09 14/12/10
Laborglas F1568 17/07/09 17/07/10
Laborglas G7982 22/05/09 22/05/10
Laborglas E7440 14/12/09 14/12/10
Laborglas E7520 14/12/09 14/12/10
Laborglas E7457 14/12/09 14/12/10
Laborglas E0004 14/12/09 14/12/10
Laborglas E0030 14/12/09 14/12/10

Laborglas F0645 14/12/09 14/12/10
Laborglas F0705 14/12/09 14/12/10
Bales volumtricos
de 25 mL
Laborglas F7094 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7195 14/12/09 14/12/10
Laborglas 1567 11/12/09 11/12/10
Laborglas L2524 14/12/09 14/12/10
Laborglas E6399 08/12/09 08/12/10
Laborglas G4446 05/11/09 05/11/10
Laborglas D5548 07/12/09 07/12/10
Laborglas D8332 04/09/09 04/09/10
Laborglas F7216 14/12/09 14/12/10
Laborglas F0705 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7216 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7248 14/12/09 14/12/10
Masterlabor 5269 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7125 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7137 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7094 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7108 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7248 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7195 14/12/09 14/12/10
Laborglas F7171 14/12/09 14/12/10
Bales volumtricos
de 50 mL
L. M. H1268 14/12/09 14/12/10
Laborglas H0399 19/05/09 19/05/10
Laborglas H0426 28/04/09 28/04/10
Laborglas H0376 28/04/09 28/04/10
Laborglas H0329 28/04/09 28/04/10
Laborglas H0364 28/04/09 28/04/10
Laborglas H0535 19/05/09 19/05/10
Laborglas H0412 28/04/09 28/04/10
Laborglas H0398 19/05/09 19/05/10
Laborglas H0410 28/04/09 28/04/10
Laborglas H0442 28/04/09 28/04/10
Laborglas H1268 21/05/09 21/05/10
Laborglas F5664 14/07/09 14/07/10
Laborglas H 1460 08/03/10 08/03/11
Laborglas H 1667 08/03/10 08/03/11
Laborglas H 8093 08/03/10 08/03/11
Laborglas F5605 14/07/09 14/07/10
Laborglas H1147 19/01/10 19/01/11
Laborglas H1241 22/07/09 22/07/10
Laborglas H1351 21/08/09 21/08/10
Laborglas H1266 21/08/09 21/08/10
Laborglas H1401 21/08/09 21/08/10
Laborglas H1280 21/08/09 21/08/10
Laborglas H1383 21/08/09 21/08/10
Hexis Cientifica 62470 14/12/09 14/12/10
Hexis Cientfica 62478 02/12/09 02/12/10
N/A =No se aplica

5-Reagentes:

Reagente Fabricante
Cdigo
T&E
Lote
Validade
(ms/ano)
Acetonitrila Tedia L 103 911288R 11/2014
Fosfato de Potssio Monob. Ecibra L 72 18112 07/2012
cido Fosfrico Ecibra L 54 18042 05/2012

6-Solues Preparadas:

Soluo
Cdigo
T&E
Data de
Preparo
(ms/ano)
Validade
(ms/ano)
Preparado
por
Hidrxido de Sdio 0,1 M EQ -1745 12/2009 08/2010 Patrcia
cido Clordrico 0,1 M PE-2766 11/2009 05/2010 Priscila
Tampo Fosf. Pot. Monob. 6,25 mM V-596 04/2010 05/2010 Vanessa
Perxido de Hidrognio 0,75 % V-566 02/2010 08/2010 Vanessa

7-Padro de referncia:

Padro Fabricante
Cdigo
T&E
Pureza Lote
Validade
(ms/ano)
Dacarbazine USP G-3878 100 % H Corrente na abertura

8-Identificao da Amostra:

Amostra Fabricante Lote
Fabricao
(ms/ano)
Validade
(ms/ano)
Dacarbazina 200 mg
P Estril Injetvel
xxxx xxxxx 10/2009 10/2011

9-Condies Analticas Cromatografia Lquida:

Coluna: CLV 09 Luna C-18 (2) 100
A
(250 X 4,6 mm) 5 m
Fase Mvel:
A Tampo pH 3,0 60 %
B Acetonitrila grau HPLC 40 %
Diluente: Tampo - Fase Mvel - A
Vazo: 1,0 mL/min.
Volume de injeo: 10 L
Deteco: Ultravioleta a 323 nm
Temperatura: 30 C
Tempo de Reteno Aproximadamente 2,6 minutos
Tempo de corrida 10 minutos
Observao Durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato coma luz.

10-Procedimentos:

10.1 Preparo da soluo estoque

a) Pesar aproximadamente 20 mg de padro de ativo em um balo de 50 mL;
b) Adicionar ao balo volumtrico cerca de 20 mL do Diluente deixando em banho ultra-snico por
dez minutos;
c) Completar o volume como diluente e homogeneizar.

10.2 Preparo das solues de trabalho

Aliquotar as solues de trabalho em balo volumtrico de 10 mL para os pontos correspondentes da curva.

Tabela 01: Preparo das solues de trabalho
Padro Alquota (mL) Volume Final (mL) Concentrao (mg/mL)
50 % 0,50 10 0,02
75 % 0,75 10 0,03
100 % 1,00 10 0,04
125 % 1,25 10 0,05
150 % 1,50 10 0,06

10.3 Obteno da Curva de Resposta

a) Filtrar e injetar as solues de trabalho em HPLC nas condies analticas descritas;
b) Plotar a curva de resposta coma concentrao (mg/mL) versus rea do sinal analtico;
c) Trabalhar com coeficiente de correlao (r) no inferior a 0,99.
10.4 Preparo da Soluo Amostra

a) Realizar o peso mdio da amostra;
b) Pesar aproximadamente 0,24 g da amostra em um balo volumtrico de 25 mL;
c) Adicionar cerca de 10 mL de diluente. Deixar em banho ultra-snico por dez minutos, completar o
volume com Diluente e homogeneizar;
d) Aliquotar desta soluo 0,5 mL e transferir para um balo volumtrico de 50 mL;
e) Completar o volume comdiluente, homogeneizar, filtrar e injetar.

10.5 Clculos

10.5.1 Clculo da concentrao do ativo sobre soluo amostra (mg/mL)

A concentrao do ativo sobre a soluo amostra foi calculada utilizando-se a equao da reta, obtida pela
injeo de cinco padres (tabela 1), de acordo com a seguinte equao:

a
b rea
Ativo Conc

.

Onde: Conc. Ativo =concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL);
rea =rea correspondente ao ativo no cromatograma;
b =coeficiente linear da curva de calibrao;
a =coeficiente angular da curva de calibrao

10.5.2 Clculo da concentrao final sobre a amostra (mg/Frasco)

A concentrao final do ativo sobre a amostra foi calculada utilizando a equao:

Massa
PM dil Ativo Conc
Amostra Conc

.
.

Onde: Conc. Amostra =concentrao do ativo na amostra (mg/Frasco);
dil =Diluio da amostra (mL)
PM =peso mdio da amostra (g)
Massa =massa amostra pesada (g)
Frasco =Frasco Ampola

10.5.3 Clculo da porcentagem de teor

A porcentagem de teor do ativo foi calculada utilizando-a equao:

Espec
Amostra Conc
Teor
100 .
(%)

Onde:

Espec = especificao declarada de ativo na amostra (P estril injetvel - mg/Frasco)
Teor (%) = % de ativo
11-Validao:

Os conceitos de validao aqui aplicados expressamos seguintes valores:
11.1 Especificidade/ Seletividade
11.2 Linearidade
11.3 Preciso
11.3.2 Intermediria (inter-corrida)
11.4 Recuperao
11.5 Intervalo
11.6 Robustez

11.1 Especificidade/Seletividade

A especificidade foi verificada atravs da anlise do padro 100% do ativo, da fase mvel, diluente, amostra
e pela recuperao do ativo emsoluo composta de padro e amostra. Esta soluo composta foi preparada
na proporo de 1:1, adicionando-se soluo padro do ponto equivalente ao de 100% da curva da
linearidade sobre soluo amostra. Tal adio resultou em um valor mdio de recuperao de 98,3%. Os
cromatogramas obtidos pelas injees da fase mvel e diluente no mostraram sinais analticos no tempo de
reteno referente ao pico do ativo. A amostra foi submetida as condies de estresse para avaliao da
especificidade / seletividade e os resultados so apresentados na Tabela 02.

Tabela 02: Resultados obtidos para os ensaios de estresse
Agente Condies
Diferena de
quantificao
(%)
Hidrlise
alcalina
Adio de 0,1 mL de sol. de NaOH 0,1 M/mL de soluo de amostra na
-0,6
Hidrlise cida
Adio de 0,1 mL de soluo de HCl 0,1 M/mL de soluo de amostra
de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas
-1,1
Oxidante
Adio de 0,1 mL de soluo H
2
O
2
0,75 % (v/v)/mL de soluo de
amostra de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24
horas
-1,1
Luz
Exposio da embalagem primria Luz Fluorescente comum/24 horas
e Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga-20W/24 horas
simultaneamente.
-7,5
Temperatura Exposio da embalagem primria 60 C/24 horas (estufa comum) -10,1

A partir dos resultados para o ativo, conclui-se pela ausncia de interferncias detectveis de outros
compostos no tempo mdio de eluio dos ativos aps a aplicao dos agentes de estresse.
O que mais se pode concluir?

11.2 Linearidade

A linearidade foi determinada em duplicata pelo coeficiente de correlao linear, entre as reas do ativo nos
padres e as concentraes correspondentes do composto na curva de resposta, mostrados na Tabela 03 e na
Figura 01. Para a elaborao da curva conjugada foram utilizadas as reas individuais de injees em
duplicata. O critrio de aceitao considerado foi r 0,99, segundo RE 899/03 [2].

Tabela 03: Resultados obtidos para linearidade 1 Analista
Padro Conc. (mg/mL) rea
50 % 0,02
1283116
1287473
75 % 0,03
1897316
1897412
100 % 0,04
2496944
2495128
125 % 0,05
3080158
3076033
150 % 0,06
3628063
3628915
Coeficiente de correlao (r) 0, 9998
Equao da Reta y =58090301,98x +130207,60

Figura 01: Grfico da curva da Linearidade
Linearidade 1dia
y =58090301,98x +130207,60
0
2000000
4000000
0,015 0,025 0,035 0,045 0,055
Concentrao
r
e
a

O coeficiente de correlao obtido foi considerado adequado por apresentar R>0,99.

A equao da reta apresentada na Tabela 03 foi utilizada para o clculo da especificidade / seletividade, da
preciso (repetibilidade) e da exatido. Para os clculos da preciso intermediria, estabilidade e estresse
utilizaram-se a equao da reta obtida por um segundo analista, em uma segunda ocasio:

Equao da reta obtida na segunda ocasio: y =57832881,19x +119107,0
Coeficiente de correlao obtido na segunda ocasio: (r) =0, 9999

Concluso?

11.3 Preciso

A preciso foi avaliada atravs do coeficiente de variao, determinando-se a proximidade dos resultados
obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla (determinao de teor em seis preparaes de
amostras, na concentrao 100 %), em duas ocasies.

11.3.1 Repetibilidade (intra-corrida) - Obteno dos resultados dentro de um curto perodo de tempo com o
mesmo analista e mesma instrumentao.

Tabela 04: Resultados obtidos para repetibilidade - 1 Analista
Replicata rea
Concentrao
(mg/Frasco)
% Teor CV (%)
1 2545998 190,89 95,4
2,1
2 2550004 200,88 100,4
3 2546411 200,75 100,4
4 2542426 201,21 100,6
5 2545806 201,55 100,8
6 2539551 200,21 100,1

Concluso?


11.3.2 Intermediria (inter-corridas) - Concordncia entre os resultados obtidos com analistas diferentes para
doze determinaes a 100 %, em duas diferentes ocasies.

Tabela 05: Resultados obtidos para preciso intermediria
Replicata rea
Concentrao
(mg/Frasco)
% Teor CV (%)
1
a
Analista
1 2545998 190,89 95,4
2,1
2 2550004 200,88 100,4
3 2546411 200,75 100,4
4 2542426 201,21 100,6
5 2545806 201,55 100,8
6 2539551 200,21 100,1
2 Analista
1 2570259 203,82 101,9
2 2574695 204,85 102,4
3 2572018 205,04 102,5
4 2562369 204,89 102,4
5 2569479 206,07 103,0
6
2564940
206,19 103,1

Concluso?

11.4 Recuperao

Para avaliao deste parmetro, foram determinados os valores das recuperaes, verificados a partir de
nove determinaes contemplando o intervalo linear do mtodo analtico, ou seja, trs concentraes: baixa
(50 %), mdia (100 %) e alta (150 %). As recuperaes foram preparadas a partir de soluo estoque da
substncia referncia nas concentraes 50, 100 e 150 % sobre a soluo amostra. Para o clculo foi
utilizada a seguinte equao:

100
oTerica Concentra
oObtida Concentra
O RECUPERA

Tabela 06: Resultados obtidos para exatido
Nvel de
Concentrao
Concentrao
Terica
(mg/mL)
rea
Concentrao
Obtida
(mg/mL)
Recuperao
(%)
Mdia das
Recuperaes
(%)
Baixa 0,02
1268002 0,02 97,0
97,2 1269094 0,02 97,1
1273525 0,02 97,4
Mdia 0,04
2521473 0,04 101,9
101,9 2523750 0,04 102,0
2520053 0,04 101,8
Alta 0,06
3670360 0,06 100,6
100,6 3667522 0,06 100,5
3672960 0,06 100,6

Concluso?

11.5 Intervalo

O intervalo foi estabelecido atravs da faixa de linearidade determinada pelo mtodo e confirmada pela
preciso e recuperao, sendo de 0,02 a 0,06 mg/mL.

11.6 Robustez

Para verificao da robustez, foram realizadas modificaes no fluxo da fase mvel de 1,0 mL/min. para 0,8
mL/min. e na temperatura, de 30C para 32C, com avaliao dos resultados obtidos para a amostra e padro
nas concentraes de 100 %. Os resultados obtidos so apresentados na Tabela 07:

Tabela 07: Resultados obtidos para robustez
Alteraes Amostra
Concentrao
Terica
(mg/Frasco)

reas

Concentrao Obtida
(mg/Frasco)
Recuperao
(%)
Fluxo 0,8
mL/min.
1
203,82
3152871 191,48 93,9
2 3201222 194,42 95,4
Temperatura
32 C
1 2556107 193,07 94,7
2 2559015 193,29 94,8

Aps a verificao das modificaes realizadas no mtodo analtico, Diminuindo o fluxo da fase mvel de
1,0 mL/min para 0,8 mL/min. e na temperatura, de 30C para 32C.
Concluso?

12-Sumrio dos parmetros de aceitao
Parmetros Critrios de Aceitao Resultados para o Analito
Especificidade
Ausncia de interferncias
detectveis no tempo de reteno
para o analito na anlise
cromatogrfica
Ausncia de interferncias
detectveis no tempo de reteno
para o analito na anlise
cromatogrfica
Linearidade r 0,99
r =0,9998 (1dia)
r =0,9999 (2dia)
Preciso
(Repetibilidade da amostra)
CV <5,0 % CV =2,1 %
Preciso Intermediria CV <5,0 % CV =2,1 %
Recuperao
Recuperao
90 % a 110 %
Baixa: 97,2 %
Mdia: 101,9 %
Alta: 100,6 %

13-Consideraes gerais:

Consideram-se os seguintes fatores para validao total ou parcial:

a) Fatores que levam revalidao total:
Uso desta condio analtica para outro analito ou outro frmaco de mesmas caractersticas com
formulao indisponvel ou no conhecida.
Uso desta condio analtica para analisar um novo analito introduzido na formulao.
b) Fatores que levam revalidao parcial:
Alteraes no sistema analtico

14-Concluso:

Com os valores para os parmetros de validao determinados, a metodologia analtica est validada para a
anlise de teor de Dacarbazina na amostra de Dacarbazin 200 mg P Estril Injetvel, no intervalo de
0,02 a 0,06 mg/mL para Dacarbazina.

15 - Referncias Bibliogrficas:

[1] - Leite, Flvio; Validao em Anlise Qumica Editora tomo 4
a
edio.
[2] - Resoluo RE 899, de 29 de maio de 2003, ANVISA.
[3] - Merck Index - 13
th
Ed., 2001.

16 - Assinaturas:

_________________________ ___/___/____
XXXXXXXXXXXXX
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_________________________ ___/___/____
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Analista Principal
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Validacao Protocolos Analises Quimicas 2010

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