UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Alexandra A. C. Nascimen!
Enil"a Maria Es#rea$ic!
Maria L%isa Pa&' Lars!n
N(dia M!nesi
Nilce Maria Marine" R!ssi
Vanderlei R!dri)%es
Re*is+! ,- Eliana Val.ria Pa%ssi
M(rcia A. S. /ramin0a
Re*is+! 1- F(2i! M(rci! S3%ina
4!sane de Freias S!%sa
R!2er! R%ller
Valeria Valene
2003
I. CONCEITOS B5SICOS
,. Inr!d%&+!
A. a d.cada de 678 ! DNA era ! c!m#!nene cel%lar mais di$9cil de ser analisad!. S%a se3%:ncia de n%cle!9de!s de
en!rme aman0! e m!n!!nia 3%9mica era )eralmene analisada ara*.s de mei!s indire!s c!m! a se3%:ncia de
#r!e9nas e an(lise )en.ica. A #arir da d.cada de 67 n!*as ecn!l!)ias $!ram desen*!l*idas #ermiind! ! is!lamen! e
a #%ri$ica&+! de )enes es#ec9$ic!s n%m #r!cess! c0amad! de cl!na)em ):nica. Na *erdade8 m%ias desas .cnicas s+!
#r!*enienes da Micr!2i!l!)ia8 Bi!3%9mica8 Im%n!l!)ia e /en.ica Micr!2iana e #ermiiram 3%e a an(lise d! DNA
)an0asse %m n!*! en$!3%e. O DNA !rn!%;se en+!8 a m!l.c%la mais $(cil de ser analisada8 send! #!ss9*el is!lar
re)i<es es#ec9$icas8 !2:;las em )rande 3%anidade e deerminar a s%a se3=:ncia n%ma *el!cidade de mil0ares de
n%cle!9de!s #!r dia.
A Tecn!l!)ia d! DNA rec!m2inane8 c!m! se c!n*enci!n!% den!minar ese c!n>%n! de .cnicas8 em %ma am#la
a#lica&+!. Ela #!de ser %sada #ara es%dar mecanism!s de re#lica&+! e ex#ress+! ):nica8 na deermina&+! da se3=:ncia
de %m )ene e c!nse3=enemene da #r!e9na 3%e ele c!di$ica8 !% n! desen*!l*imen! de c%l%ras micr!2ianas ca#a"es
de #r!d%"ir s%2s?ncias @eis ais c!m! a ins%lina 0%mana8 0!rmAni! de crescimen!8 *acinas e en"imas ind%sriais em
)randes 3%anidades. S%a a#lica&+! c!mercial !% 2i!ecn!l')ica #arece er %m #!encial ines)!(*el.
C!m! c!nse3=:ncia d! desen*!l*imen! desa ecn!l!)ia . a%almene #!ss9*el reali"ar in*esi)a&+! de #aernidade e !
dia)n'sic! de d!en&as )en.icas e in$ecci!sas ara*.s da an(lise de DNA.
1. C!ncei! de cl!na)em m!lec%lar
A !ri)em d! erm! cl!na)em *em da /en.ica Baceriana 3%e c!nsidera %ma c!lAnia de 2ac.rias c!m! %m cl!ne
#!r3%e !d!s !s indi*9d%!s s+! )eneicamene id:nic!s B 2ac.ria inicial.
A .cnica cenral da me!d!l!)ia d! DNA rec!m2inane . a cl!na)em m!lec%lar8 a 3%al c!nsise n! is!lamen! e
#r!#a)a&+! de m!l.c%las de DNA id:nicas. A cl!na)em m!lec%lar c!m#reende #el! men!s d!is es()i!s im#!ranes.
Primeir!8 ! $ra)men! d! DNA de ineresse c0amad! de inserto . li)ad! a %ma !%ra m!l.c%la de DNA c0amada de
vetor #ara $!rmar ! 3%e se c0ama de DNA recombinante. Se)%nd!8 a m!l.c%la d! DNA rec!m2inane . inr!d%"ida
n%ma c.l%la 0!s#edeira c!m#a9*el8 n%m #r!cess! c0amad! de transformao. A c.l%la 0!s#edeira 3%e ad3%iri% a
m!l.c%la d! DNA rec!m2inane . a)!ra c0amada de transformante !% clula transformada.
Um @nic! rans$!rmane8 em c!ndi&<es ideais8 s!$re m%i!s cicl!s de di*is+! cel%lar8 #r!d%"ind! %ma c!lAnia 3%e
c!n.m mil0ares de c'#ias d! DNA rec!m2inane.
C. En"imas de Resri&+!
Em ,DEC $!i descri! %m esran0! $enAmen! n! 3%al a e$ici:ncia da re#lica&+! de %m 2aceri'$a)! F*9r%s de 2ac.riasG
de#endia da c.l%la 0!s#edeira na 3%al ele esa*a inserid!. Al)%m em#! de#!is #erce2e%;se 3%e a ina2ilidade de cer!s
$a)!s crescerem em deerminadas lin0a)ens 2acerianas era de*id! a #resen&a de n%cleases alamene es#ec9$icas 3%e
cli*a*am ! se% DNA. Is! #!de ser encarad! c!m! %m sisema de de$esa 2acerian! 3%e de)rada DNA 3%e l0e .
esran0! FrestrioG. A 2ac.ria #r!e)e se% #r'#ri! DNA desa de)rada&+! Hcam%$land!;!I ara*.s da meila&+! de
al)%mas 2ases es#ec9$icas FmodificaoG. C!m! c!nse3=:ncia8 ese sisema . $re3%enemene descri! c!m! $enAmen!
da resri&+!Jm!di$ica&+! e exise em %m )rande n@mer! de 2ac.rias.
As en"imas de resri&+! !% end!n%cleases de resri&+! s+! di*ididas em *(rias classes8 de#endend! da esr%%ra8 da
ai*idade e d!s s9i!s de rec!n0ecimen! e cli*a)em. As en"imas d! Ti#! II8 as mais im#!ranes na Tecn!l!)ia d! DNA
Rec!m2inane8 s+! #r!einas m!n!m.ricas !% dim.ricas e cli*am ! DNA n! mesm! s9i! d! se% rec!n0ecimen!. O
s9i! de rec!n0ecimen! dese i#! de en"ima . n!rmalmene %ma se3=:ncia palindrmica8 is! .8 ela em %m eix! de
simeria e a se3=:ncia de 2ases de %ma $ia . a mesma da $ia c!m#lemenar8 3%and! lida na dire&+! !#!sa FFi)%ra ,G.
Figura 1. Os d!is i#!s de cli*a)em $ei!s #!r en"imas de resri&+!. As seas indicam !s s9i!s de cli*a)em e as lin0as
#!nil0adas re#resenam ! cenr! de simeria da se3%:ncia.
,
a) Clivagem no eixo de simetria
Molculas com extremidades abruptas Molculas com extremidades coesivas
b) Clivagem simtricamente situada ao
redor do eixo de simetria
...TC GA...
...AG CT...
3
5 3
5
+
...GAA TTC...
...CTT AAG...
+
3
5 3
5
Esas en"imas rec!n0ecem se3=:ncias es#ec9$icas de K a L #ares de 2ase F#2G na m!l.c%la de DNA e $a"em d!is c!res8
%m em cada $ia. M( 1 i#!s disin!s de cli*a)ens- aG !s d!is c!res !c!rrem n! eix! de simeria da se3=:ncia es#ec9$ica8
)erand! exremidades a2r%#as8 !% 2G !s c!res s+! $ei!s simericamene8 #!r.m8 $!ra d! eix! de simeria8 )erand!
exremidades c!esi*as. Eses d!is i#!s de cli*a)ens e s%as c!nse3=:ncias es+! m!srad!s na Fi)%ra ,.
A%almene8 mais de ,777 en"imas de resri&+! >( $!ram ideni$icadas. A n!mencla%ra desen*!l*ida $!i 2aseada na
a2re*ia&+! d! n!me d! micr!r)anism! d! 3%al a en"ima $!i is!lada. A #rimeira lera re#resena ! ):ner! e as !%ras
d%as a es#.cie8 se)%id! de %m al)arism! r!man! F!% !%ra leraG 3%e indica a !rdem da desc!2era !% a lin0a)em da
3%al ela $!i is!lada. P!r exem#l!8 a en"ima de resri&+! den!minada de EcoRI . #%ri$icada de %ma Escherichia coli 3%e
carre)a %m $a!r de rans$er:ncia de resis:ncia RI8 en3%an! 3%e a Hind III . is!lada da Haemophilus influenzae,
lin0a)em d III.
A Ta2ela , m!sra a se3=:ncia #alindrAmica e ! l!cal de cli*a)em de al)%mas en"imas de resri&+!. N!e 3%e al)%mas
en"imas deixam ermina&<es c!esi*as en3%an! 3%e !%ras $a"em c!res a2r%#!s !% n+! c!esi*!s.
Tabela 1. Al)%mas end!n%cleases de resri&+!- !ri)em e s9i!s de cli*a)em. A sea indica ! l!cal de cli*a)em. P% e Pi
re$erem;se8 res#eci*amene8 a 3%al3%er #%rina e #irimidina.
O ineresse #!r esas en"imas de resri&+! a%men!% em ,D6C 3%and! se #erce2e% 3%e elas #!deriam ser %sadas #ara
$ra)menar ! DNA deixand! exremidades de $ias sim#les de DNA 3%e #ermiiam a li)a&+! d!s $ra)men!s. Is!
si)ni$ica*a 3%e a rec!m2ina&+! #!deria ser e$e%ada em %2!s de ensai!. Al.m dis!8 DNA 2acerian! #!deria
rec!m2inar c!m DNA 0%man! !% de 3%al3%er !%ra es#.cie8 a2rind! a #!ssi2ilidade de cl!nar )enes 0%man!s !% is!lar
#r!e9nas de c%l%ras 2acerianas.
Uma im#!rane c!nse3=:ncia da es#eci$icidade desas en"imas de resri&+! . 3%e ! n@mer! de cli*a)ens $ei! #!r cada
1
Microrganismo Enzima
Sequncia Alvo
EcoRI Escherichia coli
Bacillus amyloliquefaciens H
Haemophilus aegyptius
Haemophilus aegyptius
Haemophilus aegyptius
Providencia stuartii
Streptococcus albus G
Thermus aquaticus
Serratia marcescens
Brevibacterium albidium
Bacillus globigii
BamMI
BglII
PstI
BalI
SmaI
HaeIII
TaqI
SalI
HindIII
HaeII
G A A T T C
C T T A A G
G G A T C C
C C T A G G
A G A T C T
T C T A G A
P G C G C P i
P i C G C G P
u
y u
A A G C T T
T T C G A A
C T G C A G
G A C G T C
G T C G A C
C A G C T G
T G G C C A
A C C G G T
A G G C C T
T C C G G A
C C C G G G
G G G C C C
T C G A
A G C T
%ma delas n! DNA de 3%al3%er !r)anism! . de$inid! e #ermie ! is!lamen! de $ra)men!s dese DNA. P!ran!8 cada
en"ima de resri&+! )era %ma $am9lia @nica de $ra)men!s 3%and! cli*a %ma m!l.c%la de DNA es#ec9$ica. En"imas 3%e
rec!n0ecem s9i!s de resri&+! c!m#!s!s #!r K #ares de 2ases cli*am ! DNA em m.dia a cada 1EN n%cle!9de!s
FK
K
O1ENG. A3%elas 3%e rec!n0ecem s9i!s c!m N e L #2 cli*am ! DNA em m.dia a cada K7DN e NEECN #28
res#eci*amene. N! enan!8 esa m.dia #!de s!$rer *aria&<es si)ni$icai*as8 de#endend! #rinci#almene da
c!m#!si&+! de 2ases d! DNA analisad!. P!r exem#l!8 a en"ima otI rec!n0ece %m s9i! de resri&+! c!nend! L#28
incl%ind! n%cle!9de!s C#/8 3%e raramene !c!rre n! DNA de mam9$er!s.
A $am9lia de $ra)men!s )erad!s #!r di)es+! c!m en"ima de resri&+! . )eralmene deecada #ela se#ara&+! deses
$ra)men!s #!r eler!$!rese em )el de a)ar!se. Os $ra)men!s mi)ram em $%n&+! de se%s #es!s m!lec%lares send! 3%e
!s men!res mi)ram mais ra#idamene FFi)%ra 1G.
Figura 2. M!l.c%las de DNA de aman0!s di$erenes #!dem ser se#aradas #!r eler!$!rese. M!l.c%las men!res
m!*em;se mais ra#idamene 3%e m!l.c%las mai!res8 !rnand!;se #!ran! se#aradas em 2andas. O DNA . c!rad! c!m
2r!me! de e9di!8 %ma m!l.c%la 3%e $l%!resce 3%and! il%minada c!m l%" Ulra Vi!lea.
K. C!nsr%&+! d! DNA Rec!m2inane
Uma en"ima de resri&+! #aric%lar rec!n0ece s!mene %ma se3=:ncia @nica de 2ases. DNAs de !ri)ens di$erenes s!2 a
a&+! da mesma en"ima de resri&+! #r!d%"em $ra)men!s c!m ! mesm! c!n>%n! de exremidades $ias sim#les.
P!ran!8 $ra)men!s de d!is di$erenes !r)anism!s F#!r exem#l!8 2ac.ria e 0!memG #!dem ser li)ad!s #!r rena%ra&+!
das re)i<es de $ia sim#les. Al.m dis!8 se a li)a&+! $!r PseladaP c!m a en"ima DNA li)ase8 de#!is d! #areamen! de
2ases8 !s $ra)men!s ser+! li)ad!s #ermanenemene.
C
S
e
n
t
i
d
o

d
a

m
i
g
r
a

o
Pares de
base
A .cnica de DNA rec!m2inane em %m ineresse es#ecial se %ma das $!nes de DNA cli*ad! $!r %m #lasm9de!.
Figura 3. C!nsr%&+! de %ma m!l.c%la de DNA 092rida a #arir de $ra)men!s de di$erenes !r)anism!s !2id!s c!m !
%s! de en"ima de resri&+!.
A $i)%ra C m!sra %ma m!l.c%la de DNA de #lasm9de! 3%e em s!mene %m s9i! de cli*a)em #ara %ma deerminada
en"ima de resri&+!. A mesma en"ima . %sada #ara cli*ar DNA 0%man!. Se !s $ra)men!s de DNA 0%man! s+!
mis%rad!s c!m ! DNA #lasmidial lineari"ad!8 #ermiind! a li)a&+! enre eles8 %ma m!l.c%la de DNA #lasmidial
c!nend! DNA 0%man! #!de ser )erada. Ese #lasm9de! 092rid! #!de ser inserid! n%ma 2ac.ria ara*.s de
rans$!rma&+! e en+! ! inser! ser( re#licad! c!m! #are d! #lasm9de!. /eralmene8 ani2i'ic!s s+! acrescenad!s a!
mei! da c%l%ra #ara seleci!nar s!mene as lin0a)ens 3%e #!ram !s #lasm9de!s F! #lasm9de! %sad! #ara esa $inalidade #!ra resis:ncia
a #el! men!s %m ani2i'ic!G.
E. DNA li)ase
C!n$!rme menci!nad! aneri!rmene8 esa en"ima #r!m!*e a li)a&+! d!s $ra)men!s de DNA em *e!res #re*iamene cli*ad!s #!r
end!n%cleases de resri&+!. A DNA li)ase re3%er %m )r%#! OM li*re na exremidade CQ de %ma das cadeias de DNA e %m
)r%#! $!s$a! na exremidade EQ da !%ra cadeia FFi)%ra KG. A E!coli e ! $a)! TK c!di$icam %ma DNA li)ase ca#a" de
selar $ra)men!s de DNA c!m d%#la $ia. DNA li)ase is!lada de E!coli e de !%ras 2ac.rias re3%er NAD
R
8 en3%an!
3%e a is!lada d! 2aceri'$a)! T
K
re3%er ATP c!m! c!$a!r.
Figura 4. DNA li)ase caali"a a >%n&+! de d%as $ias de DNA 3%e s+! #ares da m!l.c%la da d%#la;0.lice.
E.,. Ti#!s de $ra)men!s de DNA 3%e s+! li)ad!s #ela DNA li)ase
aG Fra)men!s c!m exremidades c!esi*as
As exremidades c!esi*as #r!d%"idas #!r *(rias en"imas de resri&+! #ermiem 3%e d!is $ra)men!s de DNA se>am mais
$acilmene li)ad!s. Is! #!r3%e !c!rre inicialmene ! #areamen! das $ias sim#les das exremidades c!esi*as das d%as
di$erenes m!l.c%las8 ara*.s da $!rma&+! de #!nes de 0idr!):ni! #ela c!m#lemenariedade das 2ases. Finalmene8 a
li)a&+! c!*alene F$!s$!di.serG d!s $ra)men!s . reali"ada #ela DNA li)ase F*er $i)%ra KG.
K
Plasmdeo
de
E.coli
DNA humano
DNA ligase
Plasmdeo hbrido
Enzima Enzima
GCA T
T ACG
TGCA TGCA
ACGT ACGT
T
GCA
A
CGT
T
G
C
A


T
G
C
A
A
C
G
T
A
C
G
T
DNA DNA 3 OH
-
O O 5 P
O
-
O
DNA DNA 3 O O 5
O
P
-
O
+
DNA-Ligase
AP ou NAD
2G Fra)men!s c!m exremidade n+! c!esi*as
DNAs #!rand! exremidades n+! c!esi*as s+! li)ad!s c!m m%i! men!s e$ici:ncia 3%e a3%eles 3%e em exremidades
c!esi*as. Uma c!ncenra&+! m%i! mai!r de DNA li)ase e mesm! d!s DNAs en*!l*id!s . necess(ria #ara 3%e as
m!l.c%las c!m exremidades n+! c!esi*as s!$ram rea&+! de li)a&+!.
N! enan!8 a li)a&+! dese i#! de $ra)men! . $aciliada #ela rans$!rma&+! #r.*ia das exremidades n+! c!esi*as em
c!esi*as. Ese #r!cedimen! #!de ser $ei! ara*.s de d!is #r!cess!s-
aG Adi&+! de #!lides!xiadenina na exremidade CQ de %m $ra)men! de DNA e #!lides!xiimina na exremidade CQ de %m
!%r! $ra)men! de DNA8 ara*.s da en"ima des!xin%cle!idil;rans$erase;erminal !% sim#lesmene rans$erase. Esa
en"ima8 %ma DNA #!limerase inc!m%m8 adici!na n%cle!9de!s B exremidade CS;OM de $ra)men!s $ia sim#les
#r!eminenes de %ma cadeia de DNA. Para )erar ese i#! de exremidade #r!eminene a m!l.c%la . raada #re*iamene
c!m %ma ex!n%clease ES;es#ec9$ica #ara rem!*er al)%ns n%cle!9de!s erminais. A#'s a mis%ra d!s d!is i#!s de
$ra)men!s c!m#lemenares e anelamen! d!s mesm!s8 as m!l.c%las s+! %nidas #reenc0end!;se !s es#a&!s exisenes
c!m ! a%x9li! da DNA #!l I e seland!;!s c!m DNA li)ase FFi)%ra EG
2G Adi&+! de ada#ad!res Bs exremidades n+! c!esi*as. Os ada#ad!res s+! !li)!n%cle!9de!s sin.ic!s 3%e c!n.m
s9i!s de cli*a)em #ara %ma !% mais en"imas de resri&+!. Eles s+! %nid!s a! DNA c!m ! a%x9li! da DNA li)ase
FFi)%ra NG.
Alernai*amene8 n! l%)ar de m!di$icar a exremidade n+! c!esi*a8 #!de;se !#ar #ela %ili"a&+! de TK li)ase em
)rande c!ncenra&+!8 ! 3%e #ermiir( a li)a&+! enre m!l.c%las de DNA sem #r!emin:ncias.
N. Trans$!rma&+! 2aceriana
N.,.C!ncei! de rans$!rma&+! ind%"ida
O #r!cess! de rans$!rma&+! c!nsi%i %m e*en! de ala im#!r?ncia na .cnica de mani#%la&+! ):nica. A
rans$!rma&+! na%ral descria #!r /ri$$i08 em ,D1L8 e #!r A*erT e c!la2!rad!res8 em ,DKK8 . %m e*en! rar!. N!
enan!8 em ,D678 Mandel e Mi)a enc!nraram 3%e a E!coli !rn!%;se marcadamene c!m#eene #ara rans$!rma&+!
c!m DNA ex')en!8 3%and! a 2ac.ria $!i s%s#ensa em cl!re! de c(lci! )elad! e s%2meida a %m c%r! c0!3%e .rmic!
B K1
!
C. Eses mesm!s a%!res am2.m *eri$icaram 3%e as 2ac.rias crescidas a. a $ase l!) eram mais c!m#eenes d!
3%e a3%elas is!ladas de !%r!s es()i!s d! crescimen!.
Figura 5. Fra)men!s de DNA c!m exremidades n+! c!esi*as #!dem ser rans$!rmadas em c!esi*as #ela adi&+! de #!li FAG e #!li FTG.
E
5 5
5 5 3
3
AAAA TTTT
3
3
3
AAAA TTTT
3
3
3
5 ! Exonuclease espec"ica
Deoxinucleotdio trans"erase terminal
Espa#os preenchidos com DNA Pol $% DNA ligase
para completar a liga#&o
+dATP +dTTP
Figura 6. Fra)men!s de DNA c!m exremidades n+! c!esi*as #!dem ser rans$!rmad!s em c!esi*as #ela adi&+! de ada#ad!res e #!seri!r raamen! c!m
a en"ima de resri&+! 3%e rec!n0ece ! ada#ad!r.
O #r!cedimen! d! cl!re! de c(lci! 3%e . %sad! a. 0!>e #r!d%" %ma e$ici:ncia de rans$!rma&+! da !rdem de ,7
E
a
,7
6
rans$!rmanes #!r micr!)rama de DNA Fa e$ici:ncia de rans$!rma&+! . )eralmene ex#ressa c!m! ! n@mer! de
c.l%las rans$!rmadas8 !2id! a #arir de %m micr!)rama de DNA #lasmidial inac!G.
O aman0! e a c!n$!rma&+! da m!l.c%la d! DNA8 a$eam ! #r!cess! de rans$!rma&+!. Plasm9de!s #e3%en!s s+! mais
$acilmene inc!r#!rad!s #ela c.l%la 2aceriana c!m#eeneU DNA linear . #!2remene inc!r#!rad!8 al*e" #el! $a! de
s!$rer de)rada&+! #elas enx!n%cleases #resenes n! es#a&! #eri#lasm(ic!.
N.1. Mecanism!s de ca#a&+! d! DNA
O mecanism! de ca#a&+! da m!l.c%la d! DNA #ela 2ac.ria c!m#eene ainda . desc!n0ecid!. Uma 0i#'ese . 3%e as
m!l.c%las d! DNA #assam ara*.s de canais si%ad!s nas c0amadas "!nas de ades+!8 3%e s+! l!cais !nde a mem2rana
inerna e exerna da c.l%la 2aceriana %nem;se $!rmand! #!r!s. Eses #!r!s s' es+! #resenes d%rane ! crescimen!
2acerian! F$ase de crescimen! ex#!nencialG.
Em c!ndi&<es na%rais8 a ca#a&+! d! DNA !rna;se di$9cil de*id! a re#%ls+! eler!s(ica exisene enre as car)as
ne)ai*as da camada de $!s$!li#9de!s da mem2rana 2aceriana e d!s )r%#! $!s$a! da m!l.c%la d! DNA.
O #a#el d! c(lci! . ex#licad! #ela 0i#'ese de 3%e a 7
!
C a $l%ide" da mem2rana cel%lar . crisali"ada8 esa2ili"and! a
disri2%i&+! d!s $!s$a!s carre)ad!s. Os 9!ns Ca
R1
$!rmam %m c!m#lex! c!m ese )r%#amen!8 c!2rind! as car)as
ne)ai*as e assim $aciliand! a ara&+! eler!s(ica c!m as m!l.c%las d! DNA na "!na de ades+!. O c0!3%e .rmic!8
c!m#lemena ese #r!cess! de ca#a&+!8 #r!*a*elmene criand! %m des2alan&! .rmic! enre ! ineri!r e ! exeri!r da
c.l%la 2aceriana8 a%xiliand! ! 2!m2eamen! d! DNA ara*.s da "!na de ades+!. A $i)%ra 6 il%sra ese #r!cess!.
N
DNA a ser inserido
+
GAATTC
CTTAAG
Adaptador
Sinttico
T DNA !i"ase
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Eco#$
AATTC
G
G
CTTAA
GAATTC
CTTAAG
%etor
Eco#$
G AATTC
CTTAA G
Figura . Mecanism! m!lec%lar #r!#!s! #ara ex#licar a rans$!rma&+! de E! coli c!m %ma m!l.c%la de DNA
ex')en!.
II. VETORES DE CLONA/EM MOLECULAR
A#'s ! is!lamen! de %ma in$!rma&+! )en.ica8 #!r exem#l! %m $ra)men! de DNA !2id! #ela cli*a)em c!m en"imas
de resri&+!8 ese $ra)men! de*er( ser inserid! n%ma !%ra m!l.c%la de DNA di$erene8 ca#a" de am#li$icar a3%ela
in$!rma&+! )en.ica em cenenas de c'#ias. Ese #r!cess! de am#li$ica&+! . !2id! ara*.s d! %s! de m!l.c%las de
DNA 3%e s+! !s c0amad!s !e"#re$ %e &l#'age( (#le&ular.
A%almene8 !s i#!s 2(sic!s de *e!res %sad!s na me!d!l!)ia d! DNA rec!m2inane a#resenam caracer9sicas
es#eciais 3%e !s !rnam excelenes *e9c%l!s de cl!na)em em di$erenes si%a&<es.
A se)%ir8 *am!s a#resenar !s #rinci#ais i#!s de *e!res a%almene em %s! na 2i!l!)ia m!lec%lar.
,. PLASMVDEO
Plasm9de!s s+! #e3%enas m!l.c%las de DNA d%#la $ia8 c!nend! !s elemen!s necess(ri!s #ara a s%a re#lica&+! e #el!
men!s %m )ene 3%e c!n$ere resis:ncia a ani2i'ic!. Eses elemen!s )en.ic!s exra cr!m!ss!mais *ariam de E a K77
Wil!2ases e c!m%mene es+! #resenes em d%as !% mais c'#ias #!r c.l%la. Os #lasm9de!s #resenes n%m )rande n@mer!
de c'#ias s+! %sad!s c!m! *e9c%l!s de cl!na)em desde 3%e ca#aciem a am#li$ica&+! d! se)men! d! DNA neles
cl!nad!.
Um #lasm9de! #ara ser %m 2!m *e!r de cl!na)em de*e c!ner as se)%ines #r!#riedades-
aG #!ss%ir %ma #rige( %e re)li&a*+# FOG8 !% se>a8 %ma se3=:ncia de DNA 3%e #ermia 3%e ! *e!r se>a re#licad! na
c.l%la 0!s#edeiraU
2G a#resenar d!is !% mais s9i!s @nic!s de cli*a)em #ara end!n%cleases de resri&+!. O c!n>%n! deses s9i!s8
den!minad! de M,l"i)l#$ -."i#$ %e Cl#'age( FMSCG8 . ! l!cal !nde ! inser! . inc!r#!rad! a! *e!r de cl!na)emU
cG #!ss%ir %m )ene 3%e c!di$ica %m #r!d%! 3%e disin)%e a c.l%la rans$!rmada da c.l%la n+! rans$!rmada. P!r
exem#l!8 m%i!s *e!res de cl!na)em carre)am ! )ene 3%e c!n$ere resis:ncia B am#icilina FAm#
R
G. As c.l%las
rans$!rmadas c!m ais *e!res s+! ca#a"es de crescer n%m mei! c!nend! ! ani2i'ic!8 en3%an! 3%e as c.l%las n+!
ran$!rmadas aca2am m!rrend!.
A $i)%ra a se)%ir il%sra as #rinci#ais caracer9sicas esr%%rais de %m #lasm9de!.
6
! !
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'ona de ades&o
Plasmdeo
(icamada lipdica
)interna)
(icamada lipdica
)externa)
*os"olipdeos
+on de c,lcio
Camada peptido
glucan
DNA gen-mico Clula
(acteriana
Figura /. Esr%%ra m!lec%lar de %m #lasm9de! 9#ic! %sad! em cl!na)em m!lec%lar. Es+! re#resenad!s ! )ene de
resis:ncia FAm#
R
G8 a re)i+! de m@li#l!s s9i!s de cl!na)em FMSCG e a !ri)em de re#lica&+! FOG.
Um d!s #ass!s $%ndamenais n! #r!cess! de cl!na)em m!lec%lar . ! %s! de en"ima de resri&+! 3%e #r!d%"
exremidades c!m#a9*eis d%rane a cli*a)em d! DNA a ser cl!nad! Finser!G e a d! DNA rece#!r F*e!rG.
Uma *e" 3%e ! DNA $!i li)ad! a! *e!r8 esa m!l.c%la 092rida de*er( ser inr!d%"ida n%ma c.l%la 0!s#edeira
)eralmene 2ac.rias8 #!r %m #r!cess! c0amad! de rans$!rma&+!8 #ara 3%e ! *e!r #!ssa s!$rer re#lica&<es e
c!nse3%enemene am#li$icar ! n@mer! de c'#ias d! inser!. A 2ac.ria rans$!rmada ser( $acilmene rec!n0ecida #ela
a3%isi&+! de %m n!*! $en'i#! dad! #el! #lasm9de!8 !% se>a8 ca#acidade de crescer em mei!s c!nend! ani2i'ic!.
1. FA/OS
Um d!s *e!res mais %ili"ad!s n!s #r!cess!s de cl!na)em m!lec%lar . ! den!minad! ba&"eri01ag# 8 ! 3%al c!m#!ra;
se c!m! %m *9r%s da E!coli! Anes de analisarm!s ! %s! dese elemen! c!m! *e9c%l! de cl!na)em m!lec%lar8 *am!s
m!srar res%midamene as s%as #r!#riedades 2i!l')icas e esr%%rais.
1., Bi!l!)ia d! $a)!
O $a)! . %m #arasia !2ri)a'ri! da E!coli8 ! 3%al necessariamene de*e in>ear ! se% DNA na 2ac.ria 0!s#edeira
#ara a s%a m%li#lica&+!. A#'s a in$ec&+! da E!coli ! )en!ma d! $a)! #!de se)%ir d%as *ias-
aG N! #rimeir! cas! den!minad! e$"a%# l."i&#8 ! DNA d! $a)! #ermanece na 2ac.ria c!m! %ma m!l.c%la
inde#endene8 0a*end! a ai*a&+! de al)%ns )enes d! $a)! e a c!nc!miane inai*a&+! de !%r!s8 denr! de %m
#r!)rama esriamene de$inid!. C!m! res%lad! ! cr!m!ss!m! d! $a)! . re#licad! ai*amene8 !c!rre a s9nese das
#r!e9nas da ca#a e da ca%da e $!rmam;se n!*as #ar9c%las *irais. Em a#r!ximadamene KE min%!s a#'s a in$ec&+! a
c.l%la 0!s#edeira . lisada 0a*end! a li2era&+! de cerca de ,77 n!*!s $a)!s.
2G A !%ra *ia 3%e ! cr!m!ss!m! d! $a)! #!de se)%ir . ! den!minad! e$"a%# li$#g2'i&#. Nese cas!8 ! DNA d! $a)! .
ine)rad! n! cr!m!ss!m! da 2ac.ria #assand! a ser c0amad! #r!$a)!. N! esad! lis!):nic!8 !d!s !s )enes d! #r!$a)!
es+! inai*!s c!m excess+! d! )ene 3%e #r!d%" a #r!e9na re#ress!ra. A 2ac.ria 0!s#edeira carre)and! ! #r!$a)!
m%li#lica;se e ese . re#licad! #assi*amene e disri2%9d! #ara as 2ac.rias descendenes.
Em c!ndi&<es na%rais a !#&+! enre se)%ir ! esad! l9ic! !% lis!):nic! de#ende das c!ndi&<es d! mei!.
Assim8 *ia de re)ra8 em mei! ric! em n%rienes ! esad! l9ic! . #re$erencial8 #!r exem#l! ! $a)! na 2ac.ria E!coli
inesinal. P!r !%r! lad!8 em mei! #!2re de n%rienes c!m! . ! cas! da E!coli n! s!l!8 ! $a)! #re$ere ! esad!
lis!):nic!. Em c!ndi&<es ex#erimenais8 ! esad! a ser se)%id! de#ende de %m 2alan&! enre !s $a!res d! mei! inra e
exra cel%lar e de $a!res )en.ic!s da 2ac.ria 0!s#edeira e d! 2aceri'$a)!.
1.1 /en!ma d! $a)!
O 2aceri'$a)! . %ma #ar9c%la *iral c!nsi%9da de a#r!ximadamene E7X de #r!e9nas e E7X de DNA. O DNA d!
$a)! 8 na $!rma c!m! ele . is!lad! da #ar9c%la *iral8 . %ma m!l.c%la linear c!m d%#la $ia de a#r!ximadamene
KL.E77 #ares de 2ases. As exremidades da m!l.c%la c!n:m %ma $ra&+! de DNA $ia sim#les c!m cerca de ,1
n%cle!9de!s8 !s 3%ais s+! c!m#lemenares na se3%:ncia de 2ases e ara*.s delas . 3%e ! DNA ass%me a $!rma circ%lar
3%and! ele . in>ead! na c.l%la 0!s#edeira. Esas exremidades s+! den!minadas de $."i#$ &#$. O )en!ma d! $a)!
c!di$ica #ara a#r!ximadamene E7 #r!e9nas8 c%>!s )enes em %m cr!n!)rama de ex#ress+! 2em de$inid!8 ! 3%e
deermina a insala&+! d! esad! l9ic! !% lis!):nic!.
As $i)%ras D e ,7 il%sram ! cicl! 2i!l')ic! d! $a)! em %ma c.l%la 0!s#edeira e ! )en!ma d! $a)! c!m al)%ns d!s
se%s #rinci#ais )enes8 res#eci*amene.
1.C C!nr!le de ex#ress+! d!s )enes d! $a)!
Se>a 3%al $!r a *ia a ser se)%ida #el! $a)! 8 !% se>a *ia l9ica !% lis!):nica8 a ex#ress+! d!s )enes en*!l*id!s neses
circ%i!s c!me&a #el!s #r!d%!s d!s )enes N e Cr#8 re)%lad!s #el!s #r!m!!res )L e )R res#eci*amene si%ad!s B
es3%erda F)LG e B direia F)RG d! )ene &I.
D%rane ! ransc%rs! da !ia l."i&a8 ! #r!d%! d! )ene &r# es( direamene relaci!nad! c!m a re#lica&+! d! )en!ma d!
$a)! 8 ara*.s da ind%&+! da ex#ress+! d!s )enes O3. P!r !%r! lad!8 ! #r!d%! d! )ene N es( direamene
relaci!nad! c!m a ex#ress+! d!s )enes da re)i+! de em#ac!amen!8 !% se>a )enes A e 48 res#!ns(*eis #ela s9nese das
L
Amp.
/
M0C
#r!e9nas da ca2e&a e da ca%da d! $a)! 8 c!m! am2.m da ex#ress+! d!s )enes - e R8 direamene en*!l*id!s c!m a
lise da c.l%la 0!s#edeira.
Figura 5. Re#lica&+! d! $a)! n! ineri!r da c.l%la 0!s#edeira. A#'s ads!r&+! F,G e in>e&+! F1G d! )en!ma d! $a)!
na 2ac.ria8 a *ia l9ica indicada #el!s n@mer!s C8 K e E le*a a $!rma&+! de n!*as #ar9c%las *irais. Alernai*amene8 a
*ia lis!):nica FNG #!de ser ai*ada le*and! B ine)ra&+! d! maerial )en.ic! *iral a! )en!ma da 2ac.ria 0!s#edeira.
Figura 10. Re#resena&+! es3%em(ica d! )en!ma d! $a)! .
D%rane a !ia li$#g2'i&a8 a ranscri&+! am2.m inicia;se #el!s #r!m!!res )L e )R c!!rdenand! a ex#ress+! d!s )enes
&II e &III. O #r!d%! deses d!is )enes c!!rdena a ex#ress+! d! )ene &I 3%e #r!d%" %ma #r!e9na re#ress!ra ini2ind! a
ex#ress+! d!s )enes res#!ns(*eis #el! em#ac!amen! e a lise. P!r !%r! lad!8 %m !%r! )ene im#!rane . ! i'"8 c%>!
#r!d%! relaci!na;se c!m a ine)ra&+! d! $a)! n! )en!ma 2acerian! esa2elecend! ! esad! lis!):nic!.
1.K O %s! d! $a)! c!m! *e!r de cl!na)em m!lec%lar
D%rane ! cicl! l9ic!8 !s )enes en*!l*id!s n! #r!cess! de lis!):nia s+! dis#ens(*eis e c!nse3%enemene a re)i+! de
ine)ra&+! d! )en!ma d! $a)! #!de ser !almene s%2si%9da #!r %m !%r! $ra)men! de DNA8 sem 3%e 0a>a 3%al3%er
alera&+! n!s #r!cess!s en*!l*id!s na *ia l9ica.
Uma das mai!res *ana)ens de %sar ! $a)! c!m! *e!r de cl!na)em . 3%e ! DNA inserid! n! $a)! . em#ac!ad! in
vitro. Em2!ra a e$ici:ncia de em#ac!amen! se>a cerca de ,7X8 %ma *e" 3%e !s $a)!s s+! em#ac!ad!s erem!s ,77X
de e$ici:ncia na in$ec&+! da E!coli 0!s#edeira. Ese #r!cess! . alamene e$iciene 3%and! c!m#arad! c!m ! da
rans$!rma&+! 2aceriana c!m #lasm9de!s. Nese cas!8 !s mel0!res res%lad!s si%am;se a! red!r de ,7
L
rans$!rmanes
#!r Y) de DNA ! 3%e si)ni$ica 3%e men!s de , em ,777 #lasm9de!s s+! inc!r#!rad!s na E!coli 0!s#edeira.
A%almene8 exisem *(ri!s deri*ad!s d! $a)! n!s 3%ais %m !% mais s9i!s de resri&+! $lan3%eiam a re)i+! de
rec!m2ina&+!8 $aciliand! a s%a s%2si%i&+! #!r %m !%r! DNA. Eses s+! !s c0amad!s !e"#re$ %e $ub$"i"ui*+#. Um
exem#l! 9#ic! deses *e!res . ! EMBL38 n! 3%al a re)i+! de rec!m2ina&+! . $lan3%eada #elas en"imas de resri&+!
EcoRI8 BamMI e SalI. Esse *e!r 3%and! 3%and! cli*ad! #!de rece2er $ra)men!s de DNA *ariand! de ,78K a 17 W28
c!m! m!sra a $i)%ra a2aix!.
O%r!s deri*ad!s d! $a)! s+! !s c0amad!s !e"#re$ %e i'$er*+#. Nese i#! de *e!r8 !s $ra)men!s de DNA 3%e
D
1
2
3
4
5
6
Empacotamento .ecombina#&o .egula#&o .eplica#&o 7ise
cos A 8
N Cro
p7 pr
%c$$$ c$ c$$ / P 0 .
int
#!dem ser inserid!s de*em er n! m(xim! a. 6W2 de aman0! #ara n+! alerar !s #r!cess!s de em#ac!amen! d!
)en!ma d! $a)!.
Os *e!res de inser&+! deri*ad!s d! $a)! mais 2em %ili"ad!s es#ecialmene na cl!na)em de cDNA8 s+! !s *e!res
),7 e ! ),,. Vam!s a se)%ir $a"er al)%mas c!nsidera&<es s!2re eses d!is i#!s de *e!res.
N! $a)! ),78 ! inser! )eralmene cDNA8 . inserid! n! s9i! da Ec!RI si%ad! n! )ene re#ress!r &I. O $a)!
rec!m2inane er( a)!ra ! )ene &I !2sr%9d! e c!nse3%enemene d%rane a c%l%ra #r!*!car( a lise das c!lAnias de
2ac.rias rans$!rmadas. Essas c!lAnias lisadas s+! *is%ali"adas c!m! c9rc%l!s c!m ! cenr! clar! F#lacas de liseG8
2asane disin!s das c!lAnias n+! rec!m2inanes8 3%e #!r #!ss%9rem ! )ene &I 9ne)r! n+! s+! lisadas e #ermanecem
c!m! c!lAnias %r*as.
Figura 11. Re#resena&+! es3%em(ica da cl!na)em de %m $ra)men! de DNA )enAmic! n! $a)! . As re)i<es
indicadas #!r a c!n.m !das as in$!rma&<es necess(rias #ara re#lica&+! em E! coli e em#ac!amen! in vitro. Os
di$erenes $ra)men!s !2id!s da di)es+! d! DNA de ineresse c!m en"ima a#r!#riada es+! indicad!s #elas leras b e
&8 !nde s!mene & #!ss%i aman0! ade3%ad! #ara ! em#ac!amen!.
P!r !%r! lad!8 ! $a)! ),, c!n:m %m s9i! de resri&+! EcoRI l!cali"ad! n%m )ene c0amad! "acZ8 a EC n%cle!9de!s
d! c'd!n de .rmin! da en"ima c!di$icada #!r esse )ene F;)alac!sidaseG. Essa en"ima8 c%>a ex#ress+! #!de ser
ind%"ida #!r IPT/ Fis!#r!#il;;D;)alac!s9de!G8 de)rada ! s%2sra! [;)al #r!d%"ind! %m #reci#iad! de c!r a"%l.
P!ran!8 c!lAnias de 2ac.rias carre)and! ! DNA d! $a)! c!m ! )ene LacZ inac! Fsem inser!G8 na #resen&a d!
ind%!r IPT/ e d! s%2sra! [;)al8 $icar+! a"%is. En3%an! 3%e8 a3%elas #!ran! ! DNA ! $a)! 3%e inc!r#!r!% !
inser! n! s9i! de EcoRI8 n+! ex#ressam a ;)alac!sidade e #ermanecem de c!r 2ranca8 ! 3%e $acilia a ideni$ica&+!
,7
Eco.$
Eco.$
ligase
empacotamento
in vitro
a
a
b
b
b
b
c
DNA bacteri9"ago
DNA camundongo
bacteri9"ago
contendo
genes do
camundongo
in"orma#:es
desnecess,rias
& replica#&o
c
d!s cl!nes rec!m2inanes.
C. COSMVDEO
A cl!na)em de $ra)men!s de DNA n! $a)! a#resena %ma limia&+!8 #!is ! $ra)men! a ser cl!nad! n+! #!de ser
mai!r d! 3%e cerca de ,EW2 FFi)%ra ,1G. Na mai!ria das *e"es8 esa dimens+! . s%$iciene #ara c!ner %m )ene
c!m#le!8 incl%ind! as se3%:ncias $lan3%ead!ras. Enrean!8 m%i!s )enes a#resenam dimens<es da !rdem de CE a K7
W2 e neses cas!s8 a .cnica %sada #ara a cl!na)em dese i#! de $ra)men! . a c0amada &l#'age( e( &#$(.%e#$.
Os c!sm9de!s8 s+! #lasm9de!s 3%e c!n:m %m $ra)men! de DNA d! $a)! 3%e incl%i ! s9i! &#$. Eses c!sm9de!s
#!dem ser %sad!s c!m! *e9c%l!s de cl!na)em m!lec%lar em#re)and! ! sisema de em#ac!amen! in vitro 3%e
rec!nsi%i a esr%%ra d! $a)! Fca2e&a e ca%daG e assim . %sad! #ara in$ecar a c.l%la 0!s#edeira.
As en"imas d! sisema de em#ac!amen! d! $a)! rec!n0ecem !s d!is s9i!s &#$ si%ad!s de CE a KD W2 de dis?ncia e
nese cas!8 s!mene $ra)men!s desa !rdem de aman0! ser+! c!n*enienemene em#ac!ad!s.
O DNA )enAmic! de ineresse . cli*ad! c!m %ma en"ima de resri&+! 3%e #r!d%" )randes $ra)men!s de DNA8 !s 3%ais
ser+! li)ad!s a! c!sm9de!8 am2.m cli*ad! c!m a mesma en"ima.
A si%a&+! ideal . 3%e cada $ra)men! d! DNA )enAmic! a#resene %m s9i! &#$ nas s%as exremidades. D%rane !
em#ac!amen!8 as en"imas d! sisema rec!n0ecem !s s9i!s &#$ si%ad!s a %ma dis?ncia denr! de KD\28 cli*am eses
s9i!s e em#ac!am esas m!l.c%las.
O DNA d! c!sm9de! . in>ead! n! ineri!r da c.l%la 0!s#edeira8 circ%lari"a i)%al a! DNA d! $a)! e re#lica c!m! %m
#lasm9de! n!rmal8 sem ex#ress+! de 3%al3%er $%n&+! d! $a)!. As c.l%las in$ecadas ser+! seleci!nadas c!m 2ase na
resis:ncia ad3%irida a %m deerminad! ani2i'ic!. A $i)%ra ,1 il%sra %m 9#ic! #r!cess! de cl!na)em em c!sm9de!.
Figura 12. Es3%ema de cl!na)em em c!sm9de!.
K. VVRUS
,,
"ragmentos de restri#&o
de 46 a 5; <b
Amp
. 0tio alvo de restri#&o
cos
DNA circulariza
ap9s in"ec#&o
sele#&o de
clones resistentes
a ampicilina
A 2i!l!)ia m!lec%lar d!s *9r%s de DNA e RNA $!i exensi*amene es%dada anes d! ad*en! da me!d!l!)ia
d! DNA rec!m2inane. O !.ru$ -6407 is!lad! de c.l%las %m!rais de macac!s8 $!i %m d!s #rimeir!s sisemas *irais
%ili"ad!s #ara inr!d%"ir )enes em c.l%las de mam9$er!s. O DNA d! SVK7 a#resena E.177 #ares de 2ases e #!de ser
di*idid! em d%as re)i<es 3%an! a ex#ress+! ):nica *iral. Esas re)i<es s+! c0amadas de re)i+! )re&#&e e re)i+!
"ar%ia.
A re)i+! #rec!ce . ex#ressa ara*.s d! cicl! l9ic!8 en3%an! 3%e a ex#ress+! d!s )enes da re)i+! ardia !c!rre
s!mene a#'s ! in9ci! da re#lica&+! d! DNA *iral. Enre esas d%as re)i<es si%a;se a !ri)em de re#lica&+! d! DNA d!
*9r%s.
Um #r!d%! de ex#ress+! da re)i+! #rec!ce . ! a'".ge'# T7 ! 3%al . res#!ns(*el #ela rans$!rma&+! mali)na
de c.l%las n+! #ermiss9*eis Fc.l%las nas 3%ais ! *9r%s n+! c!m#lea a s%a re#lica&+!G8 c!m! am2.m #el! in9ci! da
re#lica&+! *iral em c.l%las #ermiss9*eis. Os #r!d%!s de ex#ress+! c!di$icad!s #ela re)i+! ardia c!rres#!ndem Bs
#r!e9nas 3%e $!rmam ! &a)$.%e# da #ar9c%la *iral. A $i)%ra ,C il%sra ! )en!ma d! *ir%s SVK7.
Figura 13. O DNA d! *ir%s SVK7
K.,. Cl!na)em n! *9r%s SVK7
A #r!d%&+! de DNA rec!m2inane n! *9r%s SVK78 #!de ser reali"ada ara*.s da s%2si%i&+! d! se)men! de ex#ress+!
)re&#&e !% d! se)men! de ex#ress+! "ar%ia.
N! #rimeir! cas!8 ! *9r%s rec!m2inane n+! #r!d%" ! a'".ge'# T8 a! #ass! 3%e na se)%nda !#&+! n+! 0a*er( #r!d%&+!
das )r#"e.'a$ %# &a)$.%e#. Enrean!8 esas $%n&<es deleadas #!dem ser s%#rimidas c!m! *erem!s a se)%ir.
K.,.,. Cl!na)em n! SVK7 #ela s%2si%i&+! da re)i+! ardia
]%and! a re)i+! ardia d! SVK7 . s%2si%9da c!m !%r! DNA8 #erde;se a ex#ress+! das #r!e9nas d! ca#s9de! F$%n&<es
ardiasG. Para 3%e ! sisema de cl!na)em $%nci!ne ade3%adamene #!de;se reali"ar a in$ec&+! sim%l?nea c!m %m !%r!
*9r%s SVK7 3%e em %ma dele&+! n!s )enes da re)i+! #rec!ce8 mas a re)i+! ardia inaca. Nas c.l%las c!;in$ecadas as
#r!e9nas da re)i+! #rec!ce ser+! #r!d%"idas #el! *9r%s rec!m2inane e as #r!e9nas d! ca#s9de! #el! *9r%s delead!.
C!m! res%lad!8 erem!s a #r!d%&+! de %ma #!#%la&+! de #ar9c%las *irais misas8 !% se>a8 *9r%s delead! e *9r%s
rec!m2inane. A $i)%ra ,K il%sra ese #r!cedimen!.
,1
o
Express&o
precoce
Express&o
tardia
0=5;
>enoma do 0=5;
Figura 14. Cl!na)em n! SVK7 #ela s%2si%i&+! da re)i+! ardia
K.,.1. Cl!na)em n! SVK7 #ela s%2si%i&+! da re)i+! #rec!ce
]%and! a cl!na)em n! SVK7 . $eia na re)i+! #rec!ce8 a #r!d%&+! de #ar9c%las *irais de#ende d! s%#rimen!8 #!r %ma
!%ra $!ne8 das #r!e9nas c!di$icadas #ela re)i+! #rec!ce Fan9)en! TG. Para e*iar %ma in$ec&+! misa c!m %m *9r%s
SVK7 delead!8 %sa;se %ma lin0a)em cel%lar8 as c.l%las COS as 3%ais8 a#resenam %ma #!r&+! d! )en!ma d! SVK7
ine)rad! a! se% #r'#ri! cr!m!ss!m!. Esa lin0a)em cel%lar #r!d%" a #r!e9na *iral den!minada an9)en! T8 a 3%al li)a;
se na !ri)em de re#lica&+! d! *9r%s e ind%" a s%a re#lica&+!. A $i)%ra ,E il%sra ese i#! de cl!na)em.
A#esar dese sisema *iral er sid! %sad! c!m! *e!r de ex#ress+! em m%ias esra.)ias de cl!na)em8 exisem al)%mas
des*ana)ens de se% %s!. Uma delas . 3%e ! )ene a ser cl!nad! n+! #!de ser )rande8 a !%ra . 3%e as c.l%las 0!s#edeira
s' #!dem ser c.l%las de macac!s e $inalmene8 ! )en!ma da c.l%la 0!s#edeira #!de s!$rer rearran>ad!s !% dele&<es.
A%almene8 d!is !%r!s sisemas *irais mais *ers(eis es+! em %s!8 s+! eles ! !.ru$ %a !a&i'a e ! Ba&ul#!.ru$8 !s
3%ais #!dem aceiar )enes 2em mai!res d! 3%e a3%eles acei!s #el! SVK7. Um inc!n*eniene #ara eses d!is sisemas
*irais . 3%e am2!s a#resenam %m )rande )en!ma e ! )ene a ser cl!nad! s' #!de ser inserid! #!r #r!cess!s de
rec!m2ina&+! denr! das c.l%las8 ! 3%al . 2asane len! em rela&+! a!s #r!cess!s radici!nais em %s! na me!d!l!)ia
d! DNA rec!m2inane.
Finalmene8 %m sisema *iral 2asane #r!miss!r s+! !s re"r#!.ru$ 3%e s+! *9r%s c%>! maerial )en.ic! . ! RNA e
a#resenam %m cicl! 2asane di$erene d!s menci!nad!s aneri!rmene 3%e s+! cicl!s l9ic!s. Os rer!*9r%s in$ecam
%ma )rande *ariedade de c.l%las de mam9$er!s e ! se% RNA . ranscri! re*ersamene #ara DNA ! 3%al . inc!r#!rad!
a! )en!ma da c.l%la 0!s#edeira. Nese esad! ele #r!d%" c!nin%amene n!*as #ar9c%las *irais8 >%namene c!m !
#r!d%! d! )ene nele cl!nad!. De*id! a s%a *ersailidade8 !s rer!*9r%s s+! a%almene !s *e!res elei!s #ara %s! em
,C
0=5;
gene
cotrans"ec#&o
partculas =irais
0=5;
.egi&o "uncional
tardia
.egi&o
"uncional
precoce
/
da
globina
0=5;!globina
empacotamento e lise
era#ia ):nica.
E. BACTERI^FA/O M,C
O 2aceri'$a)! M,C . %m $a)! $ilamen!s! da E! coli e c!n.m %ma @nica $ia de DNA en*!l*ida #!r #r!e9nas
*irais. D%rane ! se% cicl!8 a c.l%la 0!s#edeira . in$ecada #ela $ia FRG a 3%al ser*ir( c!m! m!lde #ara a s9nese da !%ra
$ia F;G. A d%#la $ia den!minada de 1#r(a re)li&a"i!a7 #ermanece n! ineri!r da c.l%la 0!s#edeira e . am#li$icada a.
177 c'#ias #!r c.l%la8 3%and! en+! a $ia ne)ai*a n+! mais se re#lica e a $ia #!sii*a c!nin%a a ser sinei"ada8
ad3%ire as #r!e9nas da c(#s%la *iral e sai da c.l%la 0!s#edeira ara*.s de #r!cess! n+! l9ic! FFi)%ra ,NG.
Figura 15. Es3%ema de cl!na)em n! SVK7 #ela s%2si%i&+! da re)i+! #rec!ce.
Figura 16. Re#lica&+! d! 2aceri!$a)! M,C.
E.,. Cl!na)em n! 2aceri'$a)! M,C
A )rande %ilidade dese sisema de cl!na)em . a s%a $acilidade na #r!d%&+! de DNA $ia sim#les8 $acilmene
rec%#er(*el d! s!2renadane de %ma c%l%ra l93%ida da E!coli in$ecada c!m ese *e!r. C!m! *erem!s $%%ramene8 ese
DNA $ia sim#les . 2asane @il n! #r!cess! de se3%enciamen! d! DNA #el! m.!d! desen*!l*id! #!r San)er e
c!la2!rad!res F,D66G.
Para $aciliar ! se% %s! es#ecialmene em esra.)ias de se3=enciamen!8 $!ram desen*!l*id!s *e!res da s.rie
M13()7 !s 3%ais c!n.m ! MSC inserid! n! )ene 3%e ex#ressa a ;)alac!sidase.
M%a&<es $!ram reali"adas de al m!d! 3%e a en"ima s' . ai*a 3%and! ! *e!r es( na c.l%la 0!s#edeira8
c!n*enienemene #re#arada. Ese #r!cess! den!mina;se de al$ac!m#lemena&+!. A incl%s+! d! m@li#l! s9i! de
,K
0=5;
gene
Partcula =iral
/
da
.egi&o "uncional
tardia
.egi&o
"uncional
precoce
0=5;!?a
hemaglutinina )?a)
co!trans"ec#&o
0=5;
mutante
empacotamento
e lise
0=5; mutante
integrado ao
genoma da clula C/0
antgeno replica#&o
+ + +
+
+
-
M14
E.coli
cl!na)em n! )ene da )alac!sidade *isa a ideni$ica&+! d!s #!ss9*eis rec!m2inanes 3%and! na #resen&a de %m
s%2sra! cr!m!):nic! ! [;)al !% Bl%!)al FE;2r!m!;K;cl!r!;ind!lil;;D;)alac!s9de!G e ! ind%!r IPT/. ]%and! !
*e!r es( inac! Fn+! rec!m2inaneG8 a en"ima . $%nci!nal e $rene a! s%2sra! cr!m!):nic! ese . cli*ad! #r!d%"ind!
#lacas de c!r a"%l. P!r !%r! lad!8 3%and! %m $ra)men! de DNA . inserid! n! m@li#l! sii! de cl!na)em8 a ex#ress+!
da en"ima . s%#rimida8 #!ran! as c.l%las s+! inca#a"es de mea2!li"ar ! s%2sra! cr!m!):nic! $!rmand! #lacas
inc!l!res.
E.1. Esra.)ia de cl!na)em em *e!res da s.rie M,Cm#
A %ili"a&+! de *e!res c!m di$erenes !riena&<es d! m@li#l! s9i! de cl!na)em8 ais c!m! M,Cm#L e !
M,Cm#D8 $acilia a inser&+! de %m $ra)men! de DNA em am2as as !riena&<es. C!m! *erem!s adiane8 esa esra.)ia
a#resena )rande a#lica&+! n! #r!)rama de se3%enciamen! de %m DNA #el! m.!d! de San)er.
A $i)%ra ,6 il%sra a inser&+! de %m $ra)men! de DNA cli*ad! c!m as en"imas Pst, F3G e EcoRI FEG n!s
*e!res M,Cm#L e M,Cm#D8 am2!s cli*ad!s c!m as mesmas en"imas. Esa cl!na)em !rienada #ermie a inser&+! d!
$ra)men! de DNA na !riena&+! EQCQ n! *e!r M,Cm#L e na !riena&+! CQEQ n! *e!r M,Cm#D.
Figura 1. Cl!na)em de %m $ra)men! de DNA n!s *e!res M,Cm#L e M,Cm#D cli*ad!s
c!m as en"imas EcoRI FEG e PstI FPG.
N. FA/!MVDEOS
A#esar d! 2aceri'$a)! M,C a#resenar )rande a#lica2ilidade es#ecialmene n!s #r!cess!s de se3=enciamen! de DNA8
$!ram desen*!l*idas !%ras )era&<es de $a)!s8 !s 3%ais re%nem as *ana)ens d! $a)! M,C e a d! #lasm9de!. Os
#rimeir!s $!ram !s *e!res da s.rie #EMBL e mais arde !s #lasm9de!s #TZ8 #Bl%escri# e #/EM FRJ;G. Eses *e!res
s+! c0amad!s de 1a$(.%e#$ !% 1ag#(.%e#$ e a#resenam as se)%ines caracer9sicas #rinci#ais-
$a)!m9de! a#resena %m *ers(il MSC8 #ermiind! a cl!na)em de )randes inser!s sem mai!res di$ic%ldades8 al.m de
3%e8 as en"imas si%adas nese s9i! $!ram !rdenadas de al m!d! a #ermiir %ma alernai*a ineressane d%rane !
#r!cess! de se3%enciamen!.
%ili"and! %ma c!m2ina&+! esra.)ica de d%as en"imas de resri&+!8 . #!ss9*el criar ermina&<es EQ e CQ #r!eminenes8
!rnand! a)!ra %ma exremidade Fa d! inser!G s%sce#9*el B a&+! da Ex!n%clease III. Esa esra.)ia8 #ermie a
!2en&+! #r!)ressi*a e c!nr!lada de *(ri!s $ra)men!s delead!s d! inser!8 !s 3%ais a#'s a recirc%lari"a&+! !rnam;se
a#r!#riad!s #ara ! se3%enciamen!. Ese #r!cedimen!8 $acilia ! se3=enciamen! de %m )rande inser! de DNA8 sem a
necessidade de m@li#las s%2cl!na)ens c!m! . %s%al n! sisema M,C !% a s9nese de *(ri!s !li)!n%cle!9de!s inern!s8
%sad!s c!m! iniciad!res n! #r!cess! de se3=enciamen!.
N.,. Cl!na)em n! $a)!m9de!
Vam!s %ili"ar c!m! exem#l!8 ! $a)em9de! ZAP 3%e . #aric%larmene @il #ara cl!na)em de cDNA. Ese *e!r8
inc!r#!ra a 2i!l!)ia d! $a)! M,C de al m!d! 3%e %m cDNA cl!nad! nese *e!r #!de ser a%!maicamene excisad! d!
$a)! #ara %m $a)!m9de! den!minad! #Bl%escri#.
Basicamene8 3%al3%er DNA cl!nad! n! MSC inai*a ! )ene "acZ8 #r!d%"ind! %ma #r!e9na de $%s+! 3%and! na
!riena&+! c!rrea8 #!dend! assim am2.m ser rasreada c!m anic!r#!s.
]%and! %ma ce#a da E!coli 8F9: . in$ecada c!m ! $a)! rec!m2inane e s%#erin$ecada c!m ! $a)! a%xiliar8 esse #r!d%"
as #r!e9nas d! sisema M,C. Essas #r!e9nas rec!n0ecem !s sinais de inicia&+! e .rmin! da s9nese de DNA d! $a)!
a%xilar F$,G 3%e es+! $lan3%eand! ! #Bl%escri#8 3%e #!r s%a *e" es( inc!r#!rad! n! $a)! ZAP e carre)a ! inser!.
,E
P
6@ 4@
P E
E
P
E
E P
P
E
M14 mpA M14 mpB
C!m a cli*a)em desas d%as se3=:ncias8 ! DNA . a%!maicamene circ%lari"ad! na 2ac.ria #ara !ri)inar a $!rma
rec!m2inane d! #lasm9de! Bl%escri# S\FM,CG.
O inser! cl!nad! n! Bl%escri# . $lan3%ead! #!r #r!m!!res #ara as RNA #!limerases d!s $a)!s TC e T6. Nese
senid!8 a#'s ! *e!r ser c!n*enienemene lineari"ad!8 c'#ias d! RNA relai*! a! inser!8 #!dem ser !2idas em am2as
as dire&<es ara*.s d! %s! das RNA #!limerases TC e T6.
6. VETORES PARA TRANSFORMA_O DE LEVEDURAS
O )rande ineresse exisene n! es%d! das le*ed%ras Saccharomyces cerevisiae e Schizosacharomyces pombe de*e;se
a! $a! de 3%e raam;se de !r)anism!s e%cari!!s in$eri!res e c!m! ais #!ss%em !r)ani"a&+! cel%lar similar B de
e%cari!!s s%#eri!res. Al.m diss!8 m%ias #r!e9nas de le*ed%ras s+! similares esr%%ral e $%nci!nalmene Bs s%as
0!m'l!)as em mam9$er!s. A %ili"a&+! de le*ed%ras c!m! %m m!del! de es%d! ra" as se)%ines *ana)ens-
em#! de crescimen! red%"id! 3%e #ermie a !2en&+! de )randes 3%anidades de le*ed%ras em #!%c! em#!.
)en!ma de #e3%en! aman0!8 cerca de 177 *e"es men!r 3%e ! )en!ma de mam9$er!s8 ! 3%e sim#li$ica an(lises
m!lec%lares e )en.icas.
#!ssi2ilidade de maner as le*ed%ras c!m! c.l%las 0a#l'ides !% di#l'ides8 ! 3%e #ermie a !2en&+! de m%a&<es
recessi*as em c.l%las 0a#l'ides8 2em c!m! a reali"a&+! de ex#erimen!s de c!m#lemena&+! )en.ica. As c.l%las de
mam9$er!s s+! di#l'ides ! 3%e !rna im#!ss9*el a deec&+! de m%a&<es recessi*as.
Exisem di$erenes marcad!res de sele&+! 3%e s+! %ili"ad!s em le*ed%ras. A mai!r #are d!s )enes marcad!res
%ili"ad!s em le*ed%ras s+! )enes en*!l*id!s na 2i!ss9nese de amin!(cid!s e n%cle!9de!s. Um d!s marcad!res
$re3%enemene %ili"ad!s . ! )ene de le*ed%ra "E#$ 3%e c!di$ica #ara %ma das en"imas da *ia de s9nese da le%cina8 a
en"ima ;is!#r!#ilmala! de0idr!)enase. A lin0a)em m%ane de le*ed%ra8 leu$8 n+! cresce em mei! de c%l%ra 3%e n+!
c!n.m le%cina. Assim 3%and! ! )ene "E#$ . %ili"ad! na rans$!rma&+! da lin0a)em leu $, as c.l%las desa lin0a)em
3%e ad3%iriram ! )ene "E#$ ser+! ca#a"es de crescer em mei! de c%l%ra de$iciene n! amin!(cid! le%cina. Esa
esra.)ia . semel0ane a resis:ncia B am#icilina ad3%irida #!r 2ac.rias 3%e $!ram rans$!rmadas c!m #lasm9de!s 3%e
c!n.m ! )ene 3%e #r!m!*e a resis:ncia B am#icilina.
A a2ela a se)%ir lisa al)%ns d!s marcad!res de sele&+! c!m%mene %ili"ad!s em le*ed%ra.
/ENE ENZIMA SELE_O
H%S& Imida"!l )licer!l$!s$a! desidraase Misidina
"E#$ ;Is!#r!#ilmala! desidr!)enase Le%cina
"'S$ ;Amin!adi#a! red%ase Lisina
T(P) N;FEQ;$!s$!ri2!silG; anranila! is!merase Tri#!$an!
#(*& Or!idina;EQ$!s$a! decar2!xilase Uracil
Tabela 2. Ge'e$ (ar&a%#re$ %e $ele*+# e( le!e%ura. Os mei!s de c%l%ra %ili"ad!s em )eral c!n.m !d!s !s
amin!(cid!s necess(ri!s B man%en&+! da le*ed%ra c!m exce&+! de %m. Assim8 #!r exem#l!8 c.l%las rans$!rmadas
c!m ! )ene H%S C s+! seleci!nadas em mei! de c%l%ra de$iciene em 0isidina.
Os *e!res %ili"ad!s na rans$!rma&+! de le*ed%ras s+! ca#a"es de se #r!#a)ar an! em E! coli 3%an! em le*ed%ra. A
mani#%la&+! deses *e!res Fcl!na)em8 m%a):nese8 se3=enciamen!8 ecG . reali"ada em 2ac.ria c!m! #ara 3%al3%er
#lasm9de! c!n*enci!nal e en+! ! mesm! . rans$erid! #ara le*ed%ra8 !r)anism! !nde !s ensai!s de ineresse s+!
reali"ad!s. Tais *e!res s+! den!minad!s *e!res d! i#! #!ne FHs0%le *ec!rsIG e c!n:m enre !%r!s elemen!s
!ri)ens de re#lica&+! de 2ac.ria e le*ed%ra 2em c!m! )enes marcad!res 3%e $%nci!nam #ara a sele&+! n!s d!is
!r)anism!s.
Di$erenes i#!s de *e!res s+! %ili"ad!s na rans$!rma&+! de le*ed%ras-
6e"#re$ %e i'"egra*+#; ais *e!res c!n:m !ri)em de re#lica&+! de 2ac.rias e )enes marcad!res #ara sele&+! em
2ac.ria e le*ed%ra. Nese cas! ! #lasm9de! n+! . ca#a" de re#licar de m!d! a%An!m! na le*ed%ra. O m!d! #el! 3%al
ese i#! de *e!r . #r!#a)ad! e . ca#a" de ex#ressar ! marcad!r de sele&+! . ara*.s da ine)ra&+! em %m d!s
cr!m!ss!m!s de le*ed%ra.
6e"#re$ <ue re)li&a( e( le!e%ura; ais *e!res am2.m c!n.m !ri)em de re#lica&+! de 2ac.ria e )enes marcad!res
#ara sele&+! em 2ac.ria e le*ed%ra. D!is i#!s de !ri)ens de re#lica&+! de le*ed%ra s+! em#re)adas neses #lasm9de!s.
O #rimeir! i#! c!nsise na !ri)em de re#lica&+! d! #lasm9de! de 1 m8 3%e . de !c!rr:ncia na%ral em le*ed%ra. O
se)%nd! c!nsise de !ri)ens de re#lica&+! is!ladas de DNA cr!m!ss!mal den!minadas ARS FA%!n!m!%slT
Re#licain) -e3%ence8 se3%:ncias de re#lica&+! a%An!maG. Plasm9de!s c!nend! a !ri)em de re#lica&+! d! #lasm9de!
de 1m !% se3%:ncias i#! ARS re#licam em m@li#las c'#ias em le*ed%ra FFi)%ra ,LG. Uma *ariane dese i#! de *e!r
incl%i8 al.m da se3%:ncia ARS8 %ma se3%:ncia i#! cenr!m.rica8 den!minada CEN8 3%e )arane 3%e a re#lica&+! deses
#lasm9de!s se>a es(*el8 !c!rrend! %ma @nica *e" #!r cicl! cel%lar e 3%e eles se>am se)re)ad!s de m!d! #recis! d%rane
a mi!se e mei!se. Ve!res c!nend! se3%:ncias i#! CEN s+! manid!s em c'#ia @nica na le*ed%ra FFi)%ra ,LG.
=AC$; F=eas Ari$icial C0r!m!s!me8 cr!m!ss!m! ari$icial de le*ed%raG s+! %ma *aria&+! de %m *e!r de c'#ia @nica8
3%e c!n:m se3%:ncias cenr!m.ricas FCENG e se3%:ncias el!m.ricas8 3%e s+! se3%:ncias das exremidades d!s
cr!m!ss!m!s. A #resen&a de se3%:ncias el!m.ricas neses *e!res #ermie 3%e se>am re#licad!s c!m! m!l.c%las
lineares8 c!m c!m#!ramen! semel0ane a! d! DNA cr!m!ss!mal. `ACs n+! s+! %ili"ad!s de r!ina em ex#erimen!s
,N
de cl!na)em8 enrean!8 :m se m!srad! %ma $erramena *ali!sa na caraceri"a&+! de )randes se)men!s )enAmic!s na
medida em 3%e . #!ss9*el cl!nar em %m `AC $ra)men!s 3%e *+! de ,77 a 1777 W2 FFi)%ra ,DG.
Figura 1/. 6e"#re$ %e le!e%ura. C!n:m se3%:ncias de #lasm9de! Fa3%i de #UC,,LG 3%e #ermiem a #r!#a)a&+! e d+!
resis:ncia a am#icilina em E!coli8 ! )ene de sele&+! em le*ed%ra Fnese cas! "E# $G e s9i!s @nic!s de resri&+!.
+etores multic,pias- Eses #lasm9de!s exisem na $!rma circ%lar na le*ed%ra. Al)%ns deses *e!res em#re)am a
!ri)em de re#lica&+! d! #lasm9de! de 1 m8 !%r!s %ili"am !ri)ens de re#lica&+! is!ladas de cr!m!ss!m!s 3%e s+!
den!minadas ARS. 1m e ARS #ermiem a re#lica&+! d! #lasm9di! em m@li#las c'#ias. +etores c,pia .nica- Ve!res
3%e c!n.m !ri)ens de re#lica&+! i#! ARS #!dem ser manid!s esa*elmene ara*.s da adi&+! de se3%:ncias
cenr!m.ricas8 CEN. A exis:ncia de se3%:ncias i#! CEN asse)%ra 3%e ! #lasm9de! se>a manid! em , !% 1 c'#ias na
le*ed%ra e se)re)ad! de m!d! #recis! d%rane a di*is+! cel%lar.
/LOSS5RIO
AR-; Fa%!n!m!%s re#licai!n se3%ence8 se3%:ncia de re#lica&+! a%An!maG. Se3%:ncia 3%e $%nci!na c!m! %ma !ri)em
de re#lica&+! em cr!m!ss!m!s de le*ed%ra.
BAC; F2acerial ari$icial c0r!m!s!me8 cr!m!ss!m! ari$icial de 2ac.riaG. Ve!r %ili"ad! na cl!na)em de DNA
)enAmic!8 2asead! n! $a!r F de #lasm9de! 3%e asse)%ra 3%e ! #lasm9de! se>a manid! em #e3%en! n@mer! de c'#ias
na 2ac.ria.
Ce'"r>(er#; re)i+! d! cr!m!ss!m! 3%e a#resena %ma c!nsric&+! e B 3%al li)a;se ! $%s! mi'ic! d%rane a mei!se !%
mi!se. a necess(ria #ara a man%:n&+! da esa2ilidade e se)re)a&+! c!rrea d!s cr!m!ss!m!s d%rane a di*is+! cel%lar.
Orige( %e re)li&a*+#; re)i+! !nde . iniciada a s9nese de DNA em %m dad! $ra)men! de DNA.
Tel>(er#; exremidade d! cr!m!ss!m! 3%e c!n.m se3%:ncias re#eii*as de DNA sinei"adas #ela en"ima el!merase
e im#!ranes na man%en&+! da ine)ridade cr!m!ss!mal.
=AC; FTeas ari$icial c0r!m!s!me8 cr!m!ss!m! ari$icial de le*ed%raG. Sisema de cl!na)em em le*ed%ra 3%e c!nsise
de %m *e!r linear 3%e em ca#acidade de re#lica&+! a%An!ma e 3%e c!n.m %m cenr!m:r! de le*ed%ra e d%as
se3%:ncias el!m.ricas em s%as exremidades.
Figura 15. =AC$; C!n:m %m cenrAmer!8 d!is elAmer!s8 )eneFsG marcad!res #ara sele&+! em le*ed%ra e %ma
se3=:ncia i#! ARS. De*id! B #resen&a desas se3=:ncias !s `ACs s+! re#licad!s c!m! #e3%en!s cr!m!ss!m!s
lineares na le*ed%ra.
III. CONSTRU_O E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE
A !2en&+! de %ma m!l.c%la de DNA rec!m2inane8 ara*.s da li)a&+! de %m $ra)men! de DNA de ineresse c!m !
DNA de %m *e!r8 . %m #r!cess! dire! e relai*amene sim#les. Enrean!8 #r!2lemas es#eciais s%r)em 3%and! !
$ra)men! de ineresse c!nsi%i %ma $ra&+! #e3%ena d! DNA !al. Ese . ! cas! enc!nrad! c!m%mene 3%and! !
,6
LEU2
LEU2
A.0
A.0
Puc11B
Puc11B
DNA 7evedura
DNA 7evedura
C9pia Cnica
CEN
Multic9pias
Amp
.
TRP1
A.01
CEN5
Eco.$
URA4
DE7 DE7
?$ Bam
EAC
!2>ei*! . ! is!lamen! de )enes #resenes em %ma @nica c'#ia n%m )en!ma c!m#lex!8 !% 3%and! ! !2>ei*! . !
is!lamen! de cl!nes #!rad!res d! DNA c!m#lemenar B RNA mensa)eir! rar!. Dese m!d!8 . clar! 3%e 3%and!
3%erem!s cl!nar %m deerminad! )ene !% ! DNA c!m#lemenar da mensa)em !% mensa)ens #!r ele c!di$icad!FsG .
necess(ri! B !2en&+! de c!le&<es de cl!nes rec!m2inanes8 #!rad!res de m!l.c%las re#resenanes de !d! ! )en!ma8
!% de c!le&<es de cl!nes de cDNAs deri*ad!s de !da a #!#%la&+! de mensa)eir!s da c.l%la !% ecid! de ineresse.
Essas c!le&<es de cl!nes de DNA rec!m2inane s+! c0amadas de 2i2li!ecas- Bibli#"e&a Ge'>(i&a8 n! cas! d!s cl!nes
erem sid! !2id!s a #arir d! DNA )enAmic! !% Bibli#"e&a %e &DNA7 n! cas! d!s cl!nes erem sid! c!nsr%9d!s a
#arir de DNA c!m#lemenar.
O DNA de !r)anism!s s%#eri!res . 2asane c!m#lex!- #!r exem#l!8 ! )en!ma 0a#l'ide de mam9$er! . c!m#!s! de
a#r!ximadamene Cx,7
D
#ares de 2ases F#2G. P!ran!8 se ! $ra)men! de ineresse i*er C777 #28 ele c!m#reender(
s!mene , #are em ,7
N
de %ma #re#ara&+! d! DNA !al. De m!d! similar8 %ma es#.cie de RNAm #aric%larmene
rara #!de c!m#reender s!mene , #are em ,7
E
!% ,7
N
da $ra&+! de RNA mensa)eir!s de %ma c.l%la. Dese m!d!8 #ara
3%e se>a )aranida a #resen&a na 2i2li!eca de #el! men!s %ma *ers+! de !das as se3=:ncias da #!#%la&+! al*!8 %m d!s
#!n!s #rinci#ais na c!nsr%&+! de 2i2li!ecas @eis . a !2en&+! de )randes 3%anidades de cl!nes. Em2!ra a s!l%&+!
dese #r!2lema en*!l*a esra.)ias es#ec9$icas n! #re#ar! d! DNA al*! e na esc!l0a d! *e!r de cl!na)em8 em lin0as
)erais a c!nsr%&+! de 2i2li!ecas )enAmicas e de cDNAs se)%e %m #r!cedimen! 2(sic! 2asane semel0ane. N!s d!is
cas!s8 ! DNA )enAmic! !% !s cDNAs s+! #re#arad!s #ara a inser&+! n! *e!r esc!l0id!. O *e!r e ! DNA al*! s+!
li)ad!s e inr!d%"id!s em E! coli ara*.s de in$ec&+! !% em al)%ns cas!s8 #!r rans$!rma&+! direa FFi)%ra 17G.
,. Bi2li!eca de CDNA
A desc!2era da en"ima ranscri#ase re*ersa8 %ma DNA #!limerase de#endene de RNA enc!nrada
#red!minanemene em *9r%s de RNA de %m!r8 !rn!% #!ss9*el a s9nese in vitro de DNA %sand!;se c!m! m!lde
RNAm. O DNA #r!d%! dessa rea&+! . ! DNA c!m#lemenar !% &0)ia %a (e'$age(8 a2re*iadamene c0amad! de
cDNA. A s9nese e #!ss9*el cl!na)em de cDNAs c!nri2%9ram #ara )randes a*an&!s na an(lise da esr%%ra e ex#ress+!
de )enes de e%cari!!s e #r!#iciaram %ma re*!l%&+! ecn!l')ica nas ind@srias $armac:%ica e de alimen!s. Esses
cl!nes s+! c!m%mene is!lad!s de 2i2li!ecas de cDNA8 c!nsr%9das a #arir da #!#%la&+! de RNAm is!lada da c.l%la
!% d! ecid! de ineresse. P!ran!8 em c!m#ara&+! c!m 2i2li!ecas d! )en!ma !al essas 2i2li!ecas s+! enri3%ecidas
c!m se3=:ncias ):nicas. Uma *e" 3%e ! cDNA . c'#ia da mensa)em8 ele n+! c!n.m inr!ns e a#resena
si)ni$icai*amene #!%cas se3=:ncias 3%e n+! c!di$icam #ara #r!e9nas FFi)%ra 1,G. A a%s:ncia de inr!ns #ermie 3%e
cDNAs relai*!s a c.l%las de e%cari!!s s%#eri!res se>am direamene ranscri!s e rad%"id!s em 2ac.rias e em !%r!s
micr!!r)anism!s8 #ermiind! assim a #r!d%&+! em )rande escala de #!li#e#9di!s im#!ranes an! na (rea de #es3%isa
c!m! na (rea a#licada. A a%s:ncia de inr!ns am2.m $acilia a deermina&+! direa da se3=:ncia da mensa)em e
s%2se3=ene ded%&+! da se3=:ncia de amin!(cid!s da #r!e9na #!r ela c!di$icada. Iss! em res%lad! na ideni$ica&+! da
se3=:ncia de %ma en!rme 3%anidade de #r!e9nas8 al)%mas *e"es mesm! anes de erem sid! ideni$icadas )en.ica !%
2i!3%imicamene.
Figura 20. Pass!s en*!l*id!s na c!nsr%&+! de Bi2li!ecas de cDNA e Bi2li!ecas )enAmicas.
,L
Escolha do
=etor
m.NA
ecido
DNA
cDNA
Digerir o DNAF
*racionar por tamanho
DNA clon,vel
itula#&o e caracteriza#&o
da (iblioteca
7igar DNA a um vetor
$ntroduzir o produto
da liga#&o em E.coli
Parcial ou completamente
Figura 21. Dia)rama re#resenand! de $!rma sim#li$icada as di$eren&as enre %m $ra)men! de DNA )enAmic! e d!
cDNA relai*! a ele.
De m!d! res%mid!8 ! #r!cedimen! #ara a s9nese8 cl!na)em e is!lamen! de cDNAs es#ec9$ic!s en*!l*e K ea#as-
,G S9nese in vitro de cDNAs de $ia d%#la a #arir de RNAs mensa)eir!s is!lad!s d! ecid! de ineresse.
1G Pre#ar! d!s cDNAs #ara a li)a&+! c!m ! *e!r esc!l0id!.
CG Inr!d%&+! d!s cDNA rec!m2inanes nas c.l%las 0!s#edeiras8 !nde ser+! re#licad!s. Is! res%lar( na am#li$ica&+!
d!s rec!m2inanes e de#endend! d! *e!r %ili"ad!8 na ex#ress+! das #r!e9nas c!di$icadas #elas mensa)ens 3%e deram
!ri)em a!s cDNAs.
KG Ideni$ica&+! d!s cl!nes de ineresse ara*.s de %m #r!cess! de ria)em d!s cl!nes rec!m2inanes.
,.,. S9nese de cDNAs de $ia d%#la
A c!nsr%&+! de %ma 2i2li!eca de cDNA inicia;se c!m ! is!lamen! d! RNA !al d! ecid! e s%2se3=ene sele&+! da
$ra&+! de RNA #!liFAGR8 3%e c!m#reende a mai!ria das mensa)ens #resenes na c.l%la. O is!lamen! de RNA #!liFAGR
de 2!a 3%alidade . essencial8 %ma *e" 3%e 3%al3%er de)rada&+! d! RNAm a$ear( a re#resenai*idade das se3=:ncias
na 2i2li!eca.
Uma *e" !2ida a $ra&+! de RNA #!liFAGR8 #r!cede;se B s9nese d!s cDNAs ara*.s de %ma s.rie de rea&<es en"im(icas
FFi)%ra 11G. N!s @lim!s de" an!s $!ram descri!s *(ri!s m.!d!s #ara s9nese de cDNA8 cada %m a#resenand!
*ana)ens e des*ana)ens #aric%lares. C!m! exem#l!8 a#resenam!s a se)%ir %m #r!cedimen! am#lamene %sad! #ara
esse $im-
aG S9nese da $ia de DNA c!m#lemenar a! RNAm FcDNAG ara*.s da en"ima ranscri#ase re*ersa. Essa en"ima .
ca#a" de caalisar in vitro a #!limeri"a&+! de DNA a #arir RNA e re3%er %m P#rimerP c!m a exremidade CQOM li*re
#ara iniciar a s9nese. Na mai!ria das *e"es8 a m!l.c%la %ili"ada c!m! P#rimerP . %m !li)! FdTG8 3%e se anela na ca%da
#!li FAGR d! RNA.
2G A#'s a s9nese dessa $ia de cDNA8 ! RNAm . #arcialmene rem!*id!8 #el! %s! da RNase A #ara c!rar #eda&!s d!
RNA da m!l.c%la 092rida RNA;DNA.
cG Uili"and! c!m! P#rimerP !s $ra)men!s de RNA n+! di)erid!s #ela RNaseA8 a DNA #!limerase de E! coli s%2si%i
e$icienemene ! RNA #!r DNA8 res%land! em %ma m!l.c%la de cDNA de $ia d%#la.
dG O cDNA $ia d%#la . raad! c!m TK #!limerase. Ara*.s da ai*idade CQ;EQ ex!n%cle(sica dessa en"ima rem!*e;se
#!ss9*eis n%cle!9de!s exras nas exremidades CQ.
eG O #r!d%! $inal desse c!n>%n! de rea&<es . %ma m!l.c%la de DNA de $ia d%#la8 c'#ia exaa da mensa)em.
,.1. Pre#ar! d!s cDNAs #ara a li)a&+! c!m ! *e!r
Uma *e" !2id! ! cDNA8 ! #r'xim! #ass! . #re#ar(;l! #ara a inser&+! em %m *e!r de cl!na)em FFi)%ra. 11G. Para iss!
am2.m exisem *(ri!s m.!d!s dis#!n9*eis8 3%e di$erem enre si de#endend! d! i#! de *e!r esc!l0id!- #lasm9di! !%
$a)!. O $a)! em sid! ! *e!r de esc!l0a #ara a c!nsr%&+! de 2i2li!ecas de cDNA. A ra"+! 2(sica desa #re$er:ncia
. a e$ici:ncia. Em c!m#ara&+! c!m #lasm9di!s8 ! $a)! re3%er cerca de ,N *e"es men!s cDNA #!r ) d! *e!r #ara
#r!d%"ir n@mer! e3%i*alene de cl!nes rec!m2inanes. Al.m diss!8 2i2li!ecas em $a)! s+! mais $(ceis de serem
mani#%ladas d! 3%e 2i2li!ecas em #lasm9di!s. Enrean!8 %ma des*ana)em d!s *e!res . 3%e n+! s+! $a*!r(*eis
#ara #r!cedimen!s de se3=enciamen! d! DNA e de m%a):nese diri)ida. Mais recenemene8 !%r! i#! de *e!r $!i
ideali"ad! #ara s%#rir essas de$ici:ncias. Essa classe de *e!res c!m#reende !s $a)em9di!s 3%e8 c!m! ! #r'#ri! n!me
s%)ere8 s+! #lasm9di!s c!nend! #!r&<es d! )en!ma de $a)! e 3%e re@nem *ana)ens desses d!is *e!res.
,D
Figura 22. S9nese de cDNA $ia d%#la.
Para dar %ma n!&+! d!s #ass!s im#licad!s na cl!na)em d! cDNA relaam!s a se)%ir %m #r!cedimen! ad!ad!
#ara a cl!na)em de cDNA em $a)! .
meila&+! d!s s9i!s de EcoRI ara*.s d! raamen! d! cDNA c!m EcoRI8 na #resen&a de S;aden!sil mei!nina. Esse
#ass! . essencial #ara #r!e)er !s s9i!s EcoRI 3%e #!ssam exisir n! cDNA c!nra a a&+! da EcoRI em di)es+! a ser
reali"ada s%2se3=enemene n! #r!cess! de cl!na)em.
adi&+! de ada#ad!res8 c!m ! s9i! EcoRI8 nas d%as exremidades d! cDNA. Essa rea&+! res%la em m!l.c%las de
cDNA c!m ada#ad!res m@li#l!s li)ad!s nas d%as #!nas F*er $i)%ra 1CG.
%m @nic! s9i! de EcoRI . #r!d%"id! em cada #!na d! cDNA #ela di)es+! c!m EcoRI8 li2erand! ! excess! de
ada#ad!res li)ad!s na m!l.c%la. A meila&+! #r.*ia d! cDNA )arane 3%e n+! 0a>a di)es+! inerna d! cDNA.
anes de ser inserid! n! *e!r8 ! cDNA . se#arad! d! excess! de m!l.c%las de ada#ad!res. Iss! . $ei! ara*.s de
$ilra&+! em c!l%nas de Se#0adex.
as m!l.c%las de cDNA s+! li)adas a! *e!r8 ara*.s de rea&+! c!m TK li)ase.
! #r!d%! da li)a&+! . em#ac!ad! c!m as #r!e9nas $!rmad!ra d! ca#s9de! d! $a)!.
!s $a)!s !2id!s s+! %ili"ad!s #ara in$ecar 2ac.ria de lin0a)em 3%e $a*!rece ! crescimen! d!s rec!m2inanes.
a#'s a in$ec&+! da 2ac.ria c!m !s cDNA rec!m2inanes em!s c!m! #r!d%! %ma 2i2li!eca de cDNA8 3%e de*e
c!ner c'#ias de !da as se3=:ncias de RNAm da #!#%la&+! !ri)inal. Essa 2i2li!eca #!de ser es!cada na )eladeira8 !%
s%2meida a %ma ria)em em 2%sca d! cl!ne de ineresse.
1. Bi2li!eca )enAmica
Para se !2er in$!rma&<es s!2re a esr%%ra m!lec%lar de %m )ene de e%cari!!s . necess(ri! ! is!lamen! da #!r&+! d!
DNA )enAmic! 3%e c!nen0a !da a %nidade de ranscri&+!8 mais as re)i<es $lan3%ead!ras !nde se l!cali"am !s
elemen!s c!nr!lad!res da ex#ress+! desse )ene. O m!d! mais e$iciene #ara se c!nse)%ir is!lar essa #!r&+! d! DNA .
ara*.s d! %s! de %ma 2i2li!eca )enAmica8 3%e de*e c!ner cl!nes #!rand! $ra)men!s de DNA re#resenanes de !d!
! )en!ma d! !r)anism! em 3%es+!. Dese m!d!8 ! as#ec! #rinci#al c!nsiderad! na c!nsr%&+! de %ma 2i2li!eca
)enAmica es( na !2en&+! de %m n@mer! )rande de cl!nes #!rand! $ra)men!s d! )en!ma8 !2id!s alea!riamene. O
aman0! necess(ri! de %ma 2i2li!eca )enAmica8 #ara 3%e %m dad! $ra)men! de ineresse ese>a enre !s $ra)men!s
cl!nad!s8 . deerminad! #el! aman0! d! $ra)men! cl!nad! e #el! aman0! d! )en!ma. Dese m!d!8 a esra.)ia
2(sica na c!nsr%&+! de 2i2li!ecas )enAmicas 2%sca minimi"ar ! n@mer! de cl!nes necess(ri!s ara*.s da cl!na)em de
$ra)men!s de DNA de mai!r aman0! #!ss9*el8 e maximi"ar a e$ici:ncia da cl!na)em8 ara*.s da %ili"a&+! de *e!res
2asead!s n! $a)! . Basicamene8 a c!nsr%&+! da 2i2li!eca )enAmica en*!l*e !s se)%ines #ass!s-
is!lamen! de DNA de al! #es! m!lec%lar8 3%e . #!seri!rmene 3%e2rad! de m!d! a #r!d%"ir $ra)men!s de aman0!
17
c!m#a9*el c!m ! *e!r de cl!na)em.
li)a&+! desses $ra)men!s n! *e!r e inr!d%&+! d!s rec!m2inanes !2id!s nas c.l%las 0!s#edeiras.
Figura 23. Cl!na)em de cDNA em $a)! .
Denre esses #ass!s8 ! m!d! de #re#ar! d!s $ra)men!s a serem cl!nad!s Finser!sG merece ser disc%id! criicamene
dada s%a im#!r?ncia na re#resenai*idade da 2i2li!eca.
1.,. Pre#ar! d! DNA d! inser!
A re#resenai*idade de %ma 2i2li!eca )enAmica de#ende )randemene da alea!riedade c!m 3%e !s $ra)men!s a
serem cl!nad!s s+! )erad!s8 #ara 3%e n+! 0a>a excl%s+! sisem(ica de nen0%ma se3=:ncia. O $raci!namen! mec?nic!
d! DNA . ! mei! de se !2er c!m#lea alea!riedade na $ra)mena&+! d! DNA. Enrean!8 esse m.!d! n+! .
c!m%mene ad!ad! de*id! B ra2al0!sa mani#%la&+! necess(ria #ara 3%e !s $ra)men!s assim !2id!s #!ssam ser
inserid!s n! *e!r. C!m 2!m sens! e c%idad! . #!ss9*el c!nse)%ir $ra)mena&+! s%$icienemene alea'ria ara*.s de
di)es<es #arciais d! DNA c!m en"imas de resri&+!. Uma *ana)em em se %ili"ar a di)es+! #arcial d! DNA . a
#r!d%&+! de $ra)men!s c!m #!nas c!esi*as e 3%e8 #!ran!8 #!dem ser direamene li)ad!s a! *e!r. Para )aranir 3%e
a di)es+! ain>a !d! ! )en!ma s+! %ili"adas en"imas de resri&+! 3%e c!ram $re3=enemene ! DNA e 3%e n+!
a#resenam des*i!s de disri2%i&+! de s9i!s. A en"ima SauCA I8 3%e rec!n0ece ! s9i! de K 2ases /ATC8 e 3%e )era
$ra)men!s c!m#a9*eis c!m s9i!s de cl!na)em de *(ri!s $a)!s e c!sm9di!s8 em #r!*ad! ser 2asane @il na #r!d%&+!
de 2i2li!ecas de DNA )enAmic! di)erid! #arcialmene. A#'s a di)es+! #arcial8 !s $ra)men!s )erad!s #recisam ser
$raci!nad!s anes de serem li)ad!s a! *e!r. Sem esse $raci!namen!8 $ra)men!s #e3%en!s #!der+! li)ar;se enre si
#r!d%"ind! $als!s rec!m2inanes. Fra)men!s m%i! )randes 3%e n+! #ermiem ! crescimen! d! $a)! #!der+! li)ar;se
a!s 2ra&!s d! $a)!8 alerand! a rela&+! enre as 3%anidades de DNA de inser! e *e!r.
Um m.!d! de $raci!namen! $re3=enemene ad!ad! . ! de cenri$%)a&+! em )radiene de sacar!se. A#'s a di)es+!
1,
1
6 3
2 4
5
G B A
Me
Me
Metila#&o do cDNA para proteger
os stios internos de .$ Eco
7iga#&o dos adaptadores .$
com o cDNA
Eco
Digest&o com .$ para
gerar stios coesivos .$
Eco
Eco
0epara#&o do cDNA do excesso de
adaptadores
cDNA puri"icado
7iga#&o do cDNA dos bra#os
do "ago lambda
Empacotamento dos recombinantes
com as protenas "ormadoras da
partcula viral
$n"ec#&o da bactria hospedeira
o "ago recombinante
PlaHueamento dos recombinantes
#arcial8 a s!l%&+! de DNA . a3%ecida #ara 3%e #!ss9*eis $ra)men!s a)re)ad!s se diss!ciem8 e en+!8 . a#licada s!2re
%m )radiene de sacar!se de ala salinidade. A#'s a cenri$%)a&+!8 s+! c!leadas $ra&<es desse )radiene. Essas $ra&<es
s+! analisadas #!r eler!$!rese em %m )el de a)ar!se. As $ra&<es c!nend! !s $ra)men!s de DNA de aman0!
a#r!#riad! s+! %ili"adas #ara a li)a&+! c!m ! *e!r. A $i)%ra a2aix! il%sra esse #r!cedimen!.
Figura 24. M.!d! #ara $raci!namen! d! DNA #!r cenri$%)a&+! em )radiene de sacar!se. O )radiene . as#irad!8 de
2aix! #ara cima8 c!m a>%da de %ma 2!m2a #eris(lica. A #!r&+! mais densa d! )radiene c!nend! ! DNA de mai!r
#es! m!lec%lar8 . as#irada #rimeir!.
Uma *e" )aranida a alea!riedade d!s $ra)men!s cl!nad!s8 . 2asane ra"!(*el se #ensar 3%e a #r!2a2ilidade de %ma
dada se3=:ncia de ineresse esar #resene em %ma 2i2li!eca )enAmica #!ssa ser esimada esaisicamene8 c!m 2ase na
disri2%i&+! de P!iss!n. Es#eci$icamene8 ! n@mer! de cl!ne inde#endenes FNG 3%e #recisam ser riad!s #ara %ma
#r!2a2ilidade FPG de se is!lar %ma se3=:ncia es#ec9$ica . dada #!r-
N ? l'81@3:A l'B1@8IAG:C
!nde I . ! aman0! m.di! d!s $ra)men!s cl!nad!s8 em #ares de 2ase8 e / . ! aman0! d! )en!ma8 em #ares de 2ase.
Dese m!d!8 #recisam!s riar cerca de ND7.777 cl!nes de %ma 2i2li!eca 3%e %sa c!m! *e!r %m $a)! 8 #ara erm!s
DDX de c0ance de is!lar 3%al3%er dada se3=:ncia #resene em %ma @nica c'#ia em %m )en!ma 9#ic! de mam9$er!.
N ? l'81@0755:Al'B1@ 82D10
4
A3D10
5
:C? 650.000
1.1. Ve!res %ili"ad!s na c!nsr%&+! 2i2li!eca )enAmica
Fa)!s e c!sm9de!s s+! c!m%mene %sad!s na c!nsr%&+! de 2i2li!ecas )enAmicas. N!s d!is cas!s8 $ra)men!s
)randes de DNA )erad!s #!r $ra)mena&+! alea'ria s+! li)ad!s c!m ! DNA d! *e!r #ara $!rmar c!nca?mer!s 3%e
#!dem en+! ser em#ac!ad!s em #ar9c%las de $a)! . As 2i2li!ecas c!nsr%9das em *e!res s+! arma"enadas e
#r!#a)adas na $!rma de $a)!s rec!m2inanes. N! cas! de cl!na)em em c!sm9di!s8 enrean!8 essas #ar9c%las *irais
ser*em meramene c!m! *e9c%l!s #ara inr!d%"ir ! DNA rec!m2inane denr! da 2ac.ria. Uma *e" denr! da 2ac.ria !
c!sm9di! se c!m#!ra c!m! %m #lasm9di! )rande.
Os c!sm9di!s #!dem aceiar inser!s de a#r!ximadamene KEW28 3%ase d%as *e"es ! aman0! d!s inser!s cl!n(*eis em
$a)! . Dese m!d!8 %sand!;se ! c!sm9di! c!m! *e!r8 . necess(ri! )erar s!mene CE7.777 rec!m2inanes #ara ain)ir
DDX de #r!2a2ilidade de %ma se3=:ncia de c'#ia @nica esar re#resenada em %ma 2i2li!eca )enAmica de mam9$er!.
Enrean!8 2i2li!ecas em c!sm9di!s s+! mais di$9ceis de se c!nsr%ir e maner d! 3%e as 2i2li!ecas de $a)!s.
C!sm9di!s s+! en+! %sad!s 3%and! ! )ene de ineresse . m%i! )rande !% 3%and! %ma re)i+! exensa d! DNA
cr!m!ss!mal . dese>ada. N! cas! de is!lamen! r!ineir! de se)men!s de )enes !% em circ%ns?ncias !nde a 2i2li!eca
ser( %sada m%ias *e"es8 ! %s! de *e!res . mais rec!mendad!.
Na $i)%ra a2aix! a#resenam!s %m dia)rama da esr%%ra de %m *e!r i#! 8 2asane %ili"ad! na c!nsr%&+! de
2i2li!ecas )enAmicas.
Figura 25. Esr%%ra d! *e!r EMBLC. BEO2ra&! es3%erd!U BDO2ra&! direi!U s%$$erO $ra)men! cenralU SOSalIU
11
5'
5' 3'
3'
BE
BE=bra#o esHuerdo BD=bra#o direito
B B
S E E S
BD
*ragmento central cos
cos
1
ubo de pl,stico
ubo capilar
ubos de coleta
(omba
>radiente de
sacarose
2 3 4 5
BOBamMIU EOEcoRI.
C!n$!rme indicad! n! dia)rama ese *e!r a#resena %m $ra)men! cenral $lan3%ead! #!r d!is $ra)men!s essenciais
Fdirei! e es3%erd!G. O $ra)men! B es3%erda8 c0amad! de 2ra&! es3%erd!8 c!di$ica #ara as #r!e9nas d! ca#s9de! e !
$ra)men! B direia8 c0amad! de 2ra&! direi!8 c!n.m a !ri)em de re#lica&+! d! $a)! e #r!m!!res de !%r!s )enes
essenciais. Enre ! $ra)men! cenral e !s d!is 2ra&!s enc!nram;se !s s9i!s de resri&+! %ili"ad!s na cl!na)em ; SalI8
BamMI8 EcoRI ; em !riena&+! in*ersa.
C!m! !d! $a)! 8 a exremidade de cada 2ra&! a#resena %m se)men! de $ia sim#les Fc!sG. Esses se)men!s s+!
c!m#lemenares enre si e #ermiem a recirc%lari"a&+! da m!l.c%la8 e a c!nse3=ene re#lica&+! d! DNA d! $a)! denr!
da c.l%la 0!s#edeira.
Esse i#! de *e!r . c0amad! de *e!r de s%2si%i&+! #!r 3%e n! #r!cess! de cl!na)em a #are cenral d! DNA d! $a)!
. s%2si%9da #el! $ra)men! de DNA a ser cl!nad!8 !ri)inand! a m!l.c%la rec!m2inane.
Mais recenemene !%r!s *e!res c!m ca#acidade #ara )randes inser!s $!ram desen*!l*id!s. Os &r#(#$$#(#$
ar"i1i&iai$ %e le!e%ura 8=AC$: s+! m!l.c%las lineares de DNA c%>a ar3%ie%ra mimei"a a esr%%ra de %m
cr!m!ss!m! a%:nic! FFi)%ra 1NG. Os `ACs rec!m2inanes s+! criad!s #ela li)a&+! de $ra)men!s )randes de DNA
)enAmic! ex')en! Fa. 1777 W2G c!m !s d!is P2ra&!sP d! *e!r `AC e ! #r!d%! da li)a&+! . inr!d%"id! na le*ed%ra
#!r rans$!rma&+!. N!s `ACs rec!m2inanes8 ! se)men! de DNA )enAmic! ex')en! . $lan3%ead! de %m lad! #!r %m
cenrAmer!8 %ma !ri)em de re#lica&+! e %ma marca de sele&+! e #el! !%r! lad!8 #!r %ma se)%nda marca de sele&+!. As
le*ed%ras rans$!rmanes c!m cr!m!ss!m! ari$icial s+! seleci!nadas c!m! c!lAnias em mei! c!m as dr!)as de sele&+!.
Os &r#(#$$#(#$ ar"i1i&iai$ %e ba&"Eria$ FBACG s+! m!l.c%las de DNA circ%lares 3%e carre)am %ma marca de sele&+!
a ani2i'ic!. Os se)men!s de DNA )enAmic! ex')en! s+! cl!nad!s n! *e!r BAC in vitro e ! #r!d%! da rea&+! de
li)a&+! . inr!d%"id! #!r eler!#!ra&+! em ce#as de E! coli, !nde . manid! c!m! %m #lasm9di! de c'#ia @nica. Os
*e!res BACs carre)am marcad!res 3%e #ermiem a discrimina&+! d!s cl!nes *a"i!s e c0ei!s. A m.dia de aman0! d!s
cl!nes de BACs . ,17 W28 mas al)%ns cl!nes #!dem c0e)ar C77W2.
Os *e!res de ba&"eri01ag# 31 ac!m!dam $ra)men!s )enAmic!s de 67 a ,77\2. Nese sisema8 as m!l.c%las lineares
rec!m2inanes )eradas a #arir de se3=:ncias d! *e!r e d! )en!ma s+! em#ac!adas in *ir! em 2aceri'$a)! P,. A#'s
a in>e&+! em E! coli, as m!l.c%las se !rnam circ%lares #ela ai*idade de %ma rec!m2inase8 3%e #r!m!*e a
rec!m2ina&+! de se3=:ncias es#ec9$icas #resenes n! *e!r. Eses *e!res carre)am marca de sele&+! #ara ani2i'ic!8
marca de sele&+! #!sii*a #ara sele&+! d!s cl!nes c!m inser! de DNA )enAmic! ex')en! e %ma !ri)em de re#lica&+!
#lasm9dial P,8 3%e man.m %ma !% d%as c'#ias d!s #lasm9di!s rec!m2inanes na c.l%la. Uma se)%nda !ri)em de
re#lica&+! #!de ser ai*ada #ara am#li$ica&+! d!s #lasm9di!s anes d! is!lamen! d! DNA.
1C
Figura 26. C!nsr%ind! %m cr!m!ss!m! ari$icial de le*ed%ra F`ACG. O *e!r `AC carre)a %ma !ri)em de re#lica&+!
FORIG8 %m cenrAmer! FCENG8 d!is elAmer!s e marcas de sele&+! F[ e `G. Le0nin)er8 Princi#les !$ Bi!c0emisrT.
Fi)%ra 1D;,N8 #. ,,CD.
Os &r#(#$$#(#$ ar"i1i&iai$ 31 c!m2inam as caracer9sicas d!s 2aceri'$a)!s P, e d!s BACs8 incl%ind! a marca de
sele&+! #!sii*a e as !ri)ens de re#lica&+! d! 2aceri'$a)! P,. Os cl!nes circ%lares rec!m2inanes de PACs )erad!s
d%rane a rea&+! de li)a&+! in *ir! s+! inr!d%"id!s em E.coli #!r eler!#!ra&+! e manid!s c!m! %m #lasm9di! de
c'#ia @nica na c.l%la. Os inser!s da 2i2li!eca de DNA d! )en!ma 0%man! em PACs *ariam de N7W2 a ,E7W2.
IV. Deec&+! e AN5LISE DO CLONE RECOMBINANTE
Um #ass! cr%cial na Tecn!l!)ia d! DNA rec!m2inane . enc!nrar ! cl!ne c!rre! na mis%ra de cl!nes 3%e $!i criada
d%rane !s #r!cedimen!s da c!n$ec&+! da 2i2li!eca )enAmica !% de cDNA. Em2!ra se>a relai*amene $(cil seleci!nar
as c!lAnias 3%e a2ri)am !s *e!res de cl!na)em %sand! !s marcad!res de resis:ncia a ani2i'ic!s 3%e es+! #resenes
n!s *e!res FFi)%ra 16AG8 . m%i! mais di$9cil seleci!nar ! cl!ne 3%e c!nen0a ! )ene de ineresse. N!e 3%e n! cas! d!
*e!r ser %m #lasm9di! de*er+! ser examinadas mil0ares de c!lAnias de 2ac.rias crescidas em #lacas de #eri c!nend!
a)ar8 #ara a deec&+! da3%elaFsG c!lAniaFsG 3%e #r!d%"aFmG #e3%enas 3%anidades da #r!e9na ex#ressa #el! )ene de
ineresse !% en+! 3%e #!ss%aFmG ! )ene de ineresse sem 3%al3%er ex#ress+! #r!.ica 3%e ! caraceri"e FFi)%ra 16BG.
Ser( disc%ida inicialmene a si%a&+! na 3%al a #r!e9na . ex#ressa n! 0!s#edeir!. Em se)%ida ser( disc%ida a si%a&+!
mais c!m%m !nde a #r!e9na n+! . ex#ressa e a an(lise ser( $eia ara*.s da #r'#ria #resen&a d! DNA de ineresse n!
$a)! !% na 2ac.ria.
,. ]%and! ! )ene de ineresse . ex#ress! n! 0!s#edeir!
Se ! )ene de ineresse . ca#a" de se ex#ressar na c.l%la 0!s#edeira #!de;se ideni$icar ! cl!ne 3%e carre)a ese )ene
#ela #resen&a desa #r!e9na enre as c!lAnias rec!m2inanes. Para is!8 ! 0!s#edeir! n+! de*e #r!d%"ir esa #r!e9na8 a
men!s 3%e ele carre)%e ! cl!ne 3%e a #r!d%"a. Se esa #r!e9na $!r #r!d%"ida n!rmalmene #ela c.l%la 0!s#edeira8 ser(
en+! necess(ri! ! %s! de %ma c.l%la 0!s#edeira de$eci*a !% m%ane #ara ! )ene de ineresse. ]%and! ese )ene $!r
inc!r#!rad! ele #!de ser deecad! #!r c!m#lemena&+! da3%ela $%n&+!. Se a #r!e9na a ser deecada $!r es#ec9$ica de
mam9$er!8 #!r exem#l!8 a c.l%la 0!s#edeira >( ser( na%ralmene de$eci*a. Se a #r!e9na $!r %ma en"ima 3%e caalisa
%ma rea&+! mens%r(*el #!de ser #!ss9*el riar as c!lAnias #!r s%a ai*idade en"im(ica.
Se a #r!e9na de ineresse n+! $!r %ma en"ima c!m $%n&+! deec(*el8 %ma !%ra esra.)ia ser( necess(ria #ara a
1K
ideni$ica&+! d! cl!ne c!rre!8 c!m! #!r exem#l!8 ! %s! de %m anic!r#! es#ec9$ic! #ara a #r!e9na de ineresse.
Anic!r#! . %ma #r!e9na d! s!r! #r!d%"ida #el!s mam9$er!s 3%e se c!m2ina c!m ala es#eci$icidade c!m !%ra
#r!e9na8 ! an9)en!. Nese cas!8 a #r!e9na de ineresse . ! an9)en!. C!m! ! anic!r#! se c!m2ina es#eci$icamene
c!m ! an9)en!8 se ! an9)en! esi*er #resene em %ma !% mais c!lAnias de %ma #laca de #eri8 a ideni$ica&+! desas
c!lAnias #!der( ser $eia !2ser*and!;se a rea&+! an9)en!;anic!r#!.
Figura 2. Em A8 esr%%ra d! #lasm9di! #BRC118 %m 9#ic! *e!r de cl!na)em. Em B8 m.!d! da inai*a&+!
inserci!nal #ara is!lar #lasm9di!s c!nend! DNA ex')en!. A inser&+! d! DNA ex')en! n! #lasm9di! #BRC11 ca%sa
inai*a&+! da resis:ncia B eraciclina8 #ermiind! ! is!lamen! de rans$!rmanes c!nend! ! $ra)men! de DNA
cl!nad! FBG. Le0nin)er8 Princi#les !$ Bi!c0emisrT. Fi)%ra 1D;N8 #. ,,1N.
Para 3%e ! an9)en! se>a #r!d%"id! na c.l%la 0!s#edeira a 2i2li!eca de cDNA er( de ser c!nsr%9da n%m vetor de
expresso. Nese cas! !s cDNAs s+! inserid!s neses *e!res em re)i<es 3%e #r!m!*am s%a ex#ress+! em E!coli8
n!rmalmene em #r!m!!res 3%e #!ssam ser re)%lad!s. Esa #r!e9na ani):nica ser( ex#ressa c!m! %ma protena de
fuso8 !% se>a8 ser( sinei"ada s%2se3=ene a al)%ns amin!(cid!s #erencenes B #r!e9na d! *e!r 2acerian!. Esas
#r!e9nas de $%s+! s+! )eralmene mais es(*eis 3%e a c!rres#!ndene #r!e9na de e%cari!! #r!d%"ida em 2ac.ria e8
#!ran! #!dem ser !2idas em )rande 3%anidade. Para *is%ali"ar a #r!d%&+! desas #r!e9nas8 %ma #are d!s $a)!s de
cada #laca de lise F!% 2ac.riasG rec!m2inanes desen*!l*id!s n%ma #laca de Peri s+! rans$erid!s Fc!m! %m carim2!G
#ara %ma mem2rana de nir!cel%l!se8 raad!s #ara ex#!r s%as #r!e9nas e en+! s%2meid!s a %ma s!l%&+! c!nend! %m
anic!r#! es#ec9$ic! #ara a #r!e9na dese>ada. De#!is 3%e !s anic!r#!s li*res s+! rem!*id!s8 %m se)%nd! anic!r#! .
adici!nad! #ara l!cali"ar a #!si&+! d! #rimeir!. O se)%nd! anic!r#! . n!rmalmene radi!ai*! e #!de ser ideni$icad!
#!r a%!radi!)ra$ia %ili"and!;se %m $ilme de rai! [. Se %ma c!lAnia radi!ai*a esi*er #resene8 %ma manc0a n! $ilme
de rai!s;[ ser( !2ser*ada de#!is 3%e ! $ilme $!r re*elad! FFi)%ra 1LG. A l!cali"a&+! desa manc0a n! $ilme
c!rres#!nde B l!cali"a&+! da c!lAnia 3%e #r!d%"i% a3%ela #r!e9na8 na #laca de #eri !ri)inal. Esa c!lAnia ser( en+!
rec%#erada da #laca !ri)inal e c%li*ada.
Uma limia&+! dese #r!cedimen! . 3%e ! anic!r#! %ili"ad! nesa ria)em #recisa ser es#ec9$ic! #ara a #r!e9na de
1E
ineresse. A #r!d%&+! de anic!r#!s #!de ser !2ida #ela in>e&+! da #r!e9na Fan9)en!G em %m animal. N! enan!8 esa
#r!e9na in>eada de*e ser #%ra8 cas! c!nr(ri! mais 3%e %m anic!r#! ser( $!rmad!.
1 O %s! de s!ndas m!lec%lares de (cid!s n%cl.ic!s #ara ideni$icar ! )ene de ineresse
C!m! #!de ser deecad! %m )ene de ineresse enre as c!lAnias da 2i2li!eca )enAmica !% de cDNA8 se ese )ene n+! .
ex#ress!b
]%and! ! DNA em s!l%&+! a3%!sa . a3%ecid! B ,77C8 !% ex#!s! B #M al!8 as 2ases c!m#lemenares 3%e
n!rmalmene se)%ram as d%#las 0.lices >%nas s+! diss!ciadas em d%as $ias sim#les. Ese #r!cess! . c0amad! de
desnaturao. Esas mesmas $ias sim#les #!der+! se reass!ciar se $!rem c!nser*adas B NEC8 #!r l!n)!s #er9!d!s8 n%m
#r!cess! c0amad! de renaturao 8!% hibridao8 3%and! a ass!cia&+! !c!rre enre (cid!s n%cl.ic!s de di$erenes
!ri)ensG. Rea&<es de 0i2rida&+! !c!rrem enre 3%ais3%er d%as cadeias de (cid!s n%cl.ic!s de $ia sim#les FDNA-DNA8
RNA-DNA !% RNA-RNAG desde 3%e en0am se3=:ncias de n%cle!9de!s c!m#lemenares.
1N
Promotor
Eco.$ lac
!>alactosidase
g"ll
Eco.$
Eco.$
Eco.$
Eco.$
lin<er
cDNA
Proteina de *us&o
Empacotamento dos "agos
e plaHueamento em
camada bacteriana
in vitro
Membrana de
nitrocelulose
Placas de lise
Nitrocelulose
sobre as placas
de lise
.emo#&o da
membrana
Protenas se ligam
a nitrocelulose
$ncuba membrana com
anticorpo prim,rio
7ava membrana
$ncuba membrana com
anticorpo secund,rio
anticorpo secund,rio
anticorpo prim,rio
*ilme de raio!I
J
J
Figura 2/. Tria)em de 2i2li!ecas de ex#ress+! c!m anic!r#!s. Se ! inser! esi*er na !riena&+! c!rrea e na a#r!#riada se3=:ncia a2era de lei%ra .
rad%"id! em #r!e9na de $%s+! Fan9)en!G. Os anic!r#!s ideni$icam as #lacas de lise es#ec9$icas deses an9)en!s.
Ese #rinc9#i! da 0i2rida&+! m!lec%lar . $%ndamenal #ara caraceri"ar DNAs rec!m2inanes 3%and! ! )ene de ineresse
n+! . ex#ress!. S!ndas de (cid!s n%cl.ic!s F$ra)men!s de (cid! n%cl.ic! marcad!s radi!ai*amene8 )eralmene c!m
C1
PG s+! %ili"adas #ara l!cali"ar cl!nes8 n%ma 2i2li!eca )enAmica !% de cDNA8 3%e carre)%em %ma se3=:ncia de DNA
de ineresse. A#'s a c!n$ec&+! da 2i2li!eca )enAmica F!% de cDNAG !s $a)!s carre)and! DNA rec!m2inane s+!
es#al0ad!s >%namene c!m %ma s%s#ens+! de 2ac.rias n%ma #laca de #eri c!nend! mei! de c%l%ra s'lid!. Uma *e"
*is%ali"ada as #lacas de lise F!% as c!lAnias8 n! cas! d! *e!r ser %m #lasm9di!G . #re#arada %ma r.#lica de cada #laca
de #eri c!m %ma mem2rana de n(il!n !% de nir!cel%l!se. Ese #r!cess! #ermie a rans$er:ncia de %ma #!r&+! de
$a)!s de cada #laca de lise F!% de 2ac.rias de cada c!lAniaG #ara a mem2rana8 de al maneira 3%e ! #adr+! das #lacas
de lise da #laca de #eri !ri)inal se>a manid! na mem2rana. Para ideni$icar 3%al das #lacas de lise #!ra ! )ene de
ineresse esa mem2rana . raada #ara ex#!r e desna%rar ! DNA das c!lAnias ali #resenes e inc%2ad!s c!m %ma
s!l%&+! de DNA !% RNA $ia sim#les8 marcada radi!ai*amene e c!m#lemenar a! )ene de ineresse #ara #ermiir a
0i2rida&+!. D!is #!lin%cle!9di!s sim#les $ias s!mene ir+! se 0i2ridar se $!rem c!m#lemenares. A l!cali"a&+! da
#laca de lise 3%e se 0i2rid!% B s!nda . deerminada a#'s a ex#!si&+! da mem2rana a %m $ilme de Rai!s;[
Fa%!radi!)ra$iaG e a c!m#ara&+! dese $ilme c!m a dis#!si&+! das c!lAnias na #laca de #eri !ri)inal FFi)%ra 1DG.
Esa s!nda m!lec%lar radi!ai*a #!de ser #are de %m )ene >( cl!nad! #ara ! 3%al se #r!c%ra ! )ene !al8 #!de ser !
DNA de %m )ene *i"in0! a! )ene de ineresse8 #!de ser ! RNA de )enes 3%e s+! ex#ress!s em ecid!s es#ec9$ic!s !%
em es()i!s es#ec9$ic!s d! cicl! cel%lar8 !% mesm! ! )ene de %ma !%ra es#.cie 3%e c!di$ica #ara a mesma #r!e9na.
Nese @lim! cas!8 a rea&+! de 0i2rida&+! #!de ser reali"ada em 2aixa em#era%ra FK1
7
C a! in*.s de NE
7
CG e em 2aixa
c!ncenra&+! de sal F2aixa esrin):nciaG #ara #ermiir a 0i2rida&+! mesm! enre DNAs 3%e en0am al)%mas 2ases n+!
c!m#lemenares.
16
Figura 25. Tria)em de %ma 2i2li!eca )enAmica !% de cDNA8 c!nsr%9das n! $a)! 8 c!m %ma s!nda m!lec%lar #ara
enc!nrar %m cl!ne de ineresse. Esa ria)em . $eia es#al0and!;se !s $a)!s #re*iamene inc%2ad!s n%ma c%l%ra de
2ac.rias8 em *(rias #lacas de a)ar. De#!is 3%e as #lacas de lise !rnam;se *is9*eis8 s+! $eias as r.#licas em mem2rana
de nir!cel%l!se8 se% DNA . ex#!s! e 0i2ridi"ad! c!m a s!nda m!lec%lar. A #!si&+! d! cl!ne rec!m2inane de
ineresse . ideni$icada ara*.s de a%!radi!)ra$ia. O DNA . is!lad! d!s $a)!s #resenes na #laca de lise #!sii*a8
ideni$icada na #laca de #eri !ri)inal e s%2meida a an(lises #!seri!res.
/enes 3%e res#!ndem a %m mesm! mecanism! de re)%la&+! #!dem ser ideni$icad!s n%ma 2i2li!eca de cDNA #!r
0i2rida&+! di$erencial. Is! .8 )enes ex#ress!s em ecid!s es#ec9$ic!s8 em es()i!s es#ec9$ic!s d! desen*!l*imen! !% d!
cicl! cel%lar e )enes re)%lad!s #!r $a!res de crescimen! s+! ade3%ad!s #ara serem analisad!s #!r ese i#! de
a2!rda)em. Para esa ideni$ica&+! . necess(ri! #r!d%"ir d%as #!#%la&<es cel%lares F!% exrair mRNA de d!is di$erenes
1L
Membrana de
nitrocelulose
Placas de lise
*agos absorvem a
nitrocelulose
Placa mestra
Membrana rplica
0onda de ,cido
nucleico marcada
com 42p
0onda ?ibridiza
DNA ligado ao "iltro
7avagem das sondas
n&o incorporadas
0onda hibridiza ao DNA do "ago
Hue contem a seHuKncia complementar
*ilme de raio!I
Placa mestra
DNA lambda
isolado da placa de
lise
DNA clonado
Clone lambda puri"icado
ecid!sG %ma na 3%al eles n+! se ex#ressam e !%ra na 3%al eles se ex#ressam. S%#!n0a #!r exem#l!8 3%e %ma 2i2li!eca
de cDNA se>a #re#arada %sand! ! mRNA is!lad! de c.l%las raadas c!m $a!res de crescimen!. Esa 2i2li!eca .
#la3%eada e rans$erida #ara d!is c!n>%n!s de mem2ranas de nir!cel%l!se. Um c!n>%n! . ensaiad! c!m DNA marcad!
radi!ai*amene #re#arad! #!r ranscri&+! re*ersa d! RNA das c.l%las raadas c!m !s $a!res de crescimen!. O !%r!
c!n>%n! de $ilr!s . 0i2ridad! c!m cDNA #re#arad! de c.l%las n+! raadas. Cl!nes #!sii*!s ideni$icad!s #!r
0i2ridi"ar mais $!remene c!m a #rimeira s!nda c!di$icam mRNAs ind%"9*eis #el!s $a!res de crescimen! FFi)%ra C7G.
]%and! ! DNA a ser cl!nad! ex#ressa %ma #r!e9na c%>a se3=:ncia . c!n0ecida #!de;se in$erir a se3=:ncia de %m
rec0! de DNA 3%e l0e de% !ri)em e sinei"ar !li)!n%cle!9de!s 3%e l0e se>am c!m#lemenares #ara serem %ili"ad!s
c!m! s!ndas m!lec%lares. Eses n%cle!9de!s de*em er #el! men!s ,6 a 17 n%cle!9de!s de c!m#rimen! #ara ser
es#ec9$ic! #ara a se3=:ncia #r!c%rada. Um #r!2lema en$renad! #ara sinei"ar eses !li)!n%cle!9de!s . a
de)enerec:ncia d! c'di)! )en.ic!. Al)%ns amin!(cid!s s+! c!di$icad!s #!r 3%ar! !% mesm! seis di$erenes c'd!ns e8
#!ran! mesm! %m #e3%en! #!li#e#9di! #!de er sid! c!di$icad! #!r *(rias se3=:ncias de DNA. Para c!n!rnar ese
#r!2lema as s!ndas !li)!n%cle!9dicas s+! al)%mas *e"es sinei"adas c!m! %ma mis%ra de !das as #!ss9*eis
c!m2ina&<es d!s c'd!ns 3%e s+! rad%"idas na3%ela se3=:ncia #r!.ica FFi)%ra C,G. Uma desas se3=:ncias . c!rrea e
ir( 0i2ridar c!m ! cl!ne de ineresse8 mas a #!ss9*el 0i2rida&+! d!s !%r!s !li)!n%cle!9de!s c!m se3=:ncias sem
ineresse #!de le*ar a !2en&+! de cl!nes $als!s #!sii*!s.
Uma *aria&+! dese m.!d! . %ili"ar ! men!r n@mer! #!ss9*el de !li)!n%cle!9de!s c!m! s!nda8 esc!l0end! a re)i+!
da #r!e9na 3%e c!n.m ! men!r n@mer! #!ss9*el de c'd!ns de)enerad!s F#!r exem#l!8 mei!nina . s!mene c!di$icada
#el! c'd!n AU/G. De*e;se le*ar em c!na am2.m 3%al . ! c'd!n de %s! mais $re3=ene #ara cada amin!(cid!8 na
es#.cie 3%e es( send! analisada.
1D
AAAAA AAAAA
AAAAA AAAAA
AAAAA
AAAAA AAAAA
AAAAA AAAAA
Clulas com "atores
de crescimento
Clulas Luiescentes
Cresce em 4 hs
$sola o m.NA poli)A)
$sola o m.NA
poli)A)
m.NA induzido pelos
"atores de crescimento
/ligo)dt)
ranscritase
.eversa
42p!dNPA
hibrida#&o
/ligo)dt)
ranscritase
.eversa
42p!dNPA
hibrida#&o
Prepara bibliotca
de cDNA com "ago
lambda e in"ecta Ecoli
Placa mestra
.plica em membrana de nitrocelulose
Autoradiogr,"ia
Autoradiogr,"ia
*ilme
de raio!I
*ilme
de raio!I
cDNA
comum
Clone de cDNA
indusvel por
"atores de
crescimento $sola o clone
do "ago
Placa mestra
?ibrida#&o
negligenciavel
Figura 30. Cl!na)em de )enes re)%lad!s #!r $a!res de crescimen! ara*.s de 0i2rida&+! di$erencial. Esa esra.)ia .
%ili"ada #ara cl!nar %ma $am9lia de )enes 3%e s+! ind%"idas 3%and! c.l%las 3%iescenes s+! esim%ladas a crescer #ela
adi&+! d!s $a!res de crescimen!.
Figura 31. Desen0! de s!ndas !li)!n%cle!9dicas 2aseadas na se3=:ncia #r!.ica. C!m! a mai!ria d!s amin!(cid!s .
es#eci$icada #!r d!is !% mais c'd!ns eses !li)!n%cle!9de!s s+! sinei"ad!s %sand!;se %ma mis%ra d!s n%cle!9de!s
das #!si&<es am29)%as. A se3=:ncia c!rrea esar( re#resenada enre !s !li)!s. Uma !%ra #!ssi2ilidade . %sar %ma
s!nda enai*a c%>a esc!l0a . 2aseada na $re3=:ncia de %s! d! c'd!n na es#.cie em es%d!. Nese cas! #areamen!s
inc!m#le!s #!dem !c!rrer.
C An(lise d! DNA e RNA #!r eler!$!rese em )el e H2l!in)I
V(rias .cnicas $!ram desen*!l*idas 2aseadas nas #r!#riedades de 0i2rida&+! d!s (cid!s n%cl.ic!s *isand! a ria)em e
is!lamen! de se3=:ncias es#ec9$icas desas m!l.c%las. A mai!ria desas .cnicas8 c!n$!rme >( menci!nad!8 ra2al0a
C7
TG -ATG-GA -GA -ATG-AA -AG -AA -ATT
T
C
C
T
A
G
A
G
A
G
C
T
A
C
CG
A
C
G
T
TGTATGGATGAAATGAA
TGTATGGACGAAATGAA
TGCATGGACGAAATGAA
TGCATGGATGAAATGAA
TGTATGGATGAGATGAA
TGTATGGATGAGATGAA
TGCATGGACGAGATGAA
TGCATGGATGAGATGAA
TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC
TGCATGGACGAAATGAA
TGCATGGACGA ATGAAGCGCAA ATC
---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG---
---ACGTACCTGCT TACTTCGCGTT TAG---
5&
5&
5&
3&
3&
3&
G C
T
A
!s-Me"-As#-$lu-Me"-%!s-Arg-Asn-&le
0eHuKncia Parcial
de Amino,cidos
0eHuKncias Possveis
do DNA
Parte da seHuKncia com
pouca ambigMidade
0ondas contendo
todas as possveis combina#:es
de condons de parte
da seHuKncia
0onda tentativa
?ibrida#&o com cDna
c!m %ma r.#lica d! DNA de ineresse im!2ili"ad! n%m s%#!re s'lid! al c!m! %ma mem2rana de n(il!n !% de
nir!cel%l!se. Um deses m.!d!s8 desen*!l*id! na d.cada de 67 #!r E. M. S!%0ern8 !rn!%;se c!n0ecid! #!r
PSouthern blottingP. Nesa .cnica ! DNA . di)erid! c!m %ma !% mais en"imas de resri&+! e !s $ra)men!s res%lanes
se#arad!s #!r eler!$!rese n%m )el de a)ar!se. Os $ra)men!s de DNA d%#la $ia s+! *is%ali"ad!s #!r c!l!ra&+! c!m
2r!me! de e9di!8 desna%rad!s Qin si%Q c!m 0idr'xid! de s'di! e rans$erid!s #ara %ma mem2rana #!r ca#ilaridade8
c!m ! a%x9li! de %ma s!l%&+! de ala c!ncenra&+! salina. Tais c!ndi&<es #ermiem 3%e ! DNA se>a reid! na
mem2rana n! #!n! de c!nac! enre ! )el e a mem2rana8 criand! %ma r.#lica d! )el. O DNA . c!*alenemene li)ad!
B mem2rana %sand!;se cal!r !% l%" %lra*i!lea. S!ndas de (cid!s n%cl.ic!s FDNA !% RNA marcad!s radi!ai*ameneG
#!dem ser %ili"adas #ara 0i2ridar c!m ! DNA $ixad! na mem2rana e a #!si&+! na 3%al a li)a&+! es#ec9$ica !c!rrer
#!de ser deecada #!r a%!radi!)ra$ia da mem2rana FFi)%ra C1G. O #adr+! de 0i2rida&+! #!de ser c!m#arad!
direamene c!m a re)i+! n! )el !ri)inal 3%e c!n.m a se3=:ncia de DNA de ineresse. S!%0ern 2l!in) . %ma .cnica
+! #!der!sa 3%e #ermie 3%e as in$!rma&<es !2idas se>am %ili"adas #ara a c!nsr%&+! de %m ma#a de resri&+! de
%ma deerminada #are d! DNA cl!nad!8 #!r exem#l!8 #ara ideni$icar a re)i+! 3%e c!n.m ! )ene de ineresse. Esa
.cnica #!ssi2ilia am2.m 3%e as s!ndas de (cid!s n%cl.ic!s se>am %ili"adas #ara dia)n'sic!s de dis@r2i!s )en.ic!s8
ensaiand!;se ! DNA )enAmic! d!s indi*9d%!s a$ead!s e de se%s $amiliares. De m!d! an(l!)!8 m!l.c%las de RNA
am2.m #!dem ser ideni$icadas a#'s serem se#aradas #!r eler!$!rese8 rans$eridas #ara nir!cel%l!se8 s!$rerem
0i2rida&+! c!m s!ndas de DNA !% RNA. Esa .cnica de analisar RNA8 #!r anal!)ia a! S!%0ern 2l!in)8 rece2e% !
n!me de Northern blotting. Esa .cnica . @il c!m! a%xiliar na an(lise de cl!nes de cDNA #!r3%e8 ! aman0! d!
mRNA es#ec9$ic! #!de ser c!m#arad! c!m ! aman0! d!s cDNAs cl!nad!s8 re*eland! a ine)ridade d!s cl!nes. Al.m
dis!8 esa .cnica #ermie indicar em 3%al ecid! !% i#! cel%lar %m deerminad! )ene . ex#ress! !% 3%ais s+! !s $a!res
3%e re)%lam a s%a ex#ress+!.
Figura 32. S!%0ern 2l!in). Um $ra)men! de DNA es#ec9$ic! #!de ser ideni$icad! se#arand!;se a mis%ra de
$ra)men!s #!r eler!$!rese8 rans$erind!;se #ara nir!cel%l!se e 0i2ridi"and!;se c!m %ma s!nda m!lec%lar
c!m#lemenar B se3=:ncia e marcada c!m
C1
P.
4. C#(# #$ ge'e$ &l#'a%#$ $+# u"iliFa%#$G
O cl!ne de ineresse #!de ser ex#l!rad! s!2 *(ri!s as#ec!s. Ele #!de ser se3=enciad! e c!m#arad! c!m !%ras
se3=:ncias >( descrias8 ser %ili"ad! n! es%d! da ex#ress+! ):nica d!FsG )eneFsG c!nid!FsG n! cl!ne8 ser alerad!
es#eci$icamene #!r m%a):nese s9i! diri)ida !% ser %sad! #ara )erar %m #r!d%! de ineresse c!mercial. Para is!
3%ase sem#re ser( necess(ri! rans$erir ! cl!ne8 !% #are dese #ara %m *e!r mais a#r!#riad! #ara ain)ir !s !2>ei*!s
dese>ad!s. A rans$er:ncia de #are d! DNA cl!nad! #ara %m n!*! *e!r . c!n0ecida c!m! s%2 cl!na)em. Al)%mas
desas a#lica&<es ser+! a2!rdadas n!s ca#9%l!s se)%ines.
5. Ma)a %e re$"ri*+#
O ma#a de resri&+! d! DNA cl!nad! !% de #e3%enas m!l.c%las de DNAs de $a)!s8 #lasm9di!s !% mi!cAndrias #!de
ser 2asane @il na caraceri"a&+! da m!l.c%la. Esa .cnica en*!l*e a se#ara&+! #!r eler!$!rese d!s $ra)men!s de
DNA !2id!s a#'s di)es+! d! DNA !al c!m deerminada en"ima de resri&+!. A !rdem d!s $ra)men!s na m!l.c%la
#!de ser desc!2era c!m ! %s! de !%ras en"imas de resri&+!8 em d%#las di)es<es eJ!% #!r di)es<es se3=enciais
%sand! 1 en"imas. Assim cada $ra)men! !2id! a#'s di)es+! c!m a en"ima x . rem!*id! d! )el e s%2meid! B
di)es+! c!m a en"ima T e *ice;*ersa FFi)%ra CCG.
In$!rma&<es s!2re ! ma#a de resri&+! de %m $ra)men! de DNA s+! %ili"adas8 #!r exem#l!8 #ara s%2cl!nar #ares
dese $ra)men! #ara ! se3=enciamen!. O ma#a de resri&+! d! DNA mi!c!ndrial *em send! @il na caraceri"a&+! de
lin0a)ens eJ!% es#.cies de *(ri!s !r)anism!s8 a%xiliand! em es%d!s ax!nAmic!s e e*!l%i*!s.
C,
trans"erKncia
do DNA por
JblottingJ%
0onda de DNA
marcada com
P
4 2
autoradiogra"ia
papel
de
nitrocelulose
autoradiograma
eletro"orese
gel de
agarose
Figura 33. Ma#a de resri&+! d! DNA d! $a)! #ara *(rias end!n%cleases. As 2arras *ericais indicam !s l!cais de
cli*a)em de cada en"ima e !s n@mer!s n! al! indicam ! aman0! da m!l.c%la em %nidades de E777 #ares de 2ases.
Esa m!l.c%la #!ss%i n! !al KLE71 #ares de 2ases.
6. REAHIO EM CADEIA DA 3OLIMERA-E 83CR:
A rea&+! em cadeia da #!limerase #!ssi2ilia a am#li$ica&+! de %ma se3=:ncia rara de DNA a #arir de %ma mis%ra
c!m#lexa8 sem a necessidade de cl!na)em m!lec%lar. Esa .cnica . am#lamene %ili"ada em #es3%isa 2(sica8 em
medicina $!rense e n! dia)n'sic! de d!en&as )en.icas e in$ecci!sas.
Inicialmene8 . necess(ria a c!nsr%&+! #!r s9nese 3%9mica de d!is !li)!n%cle!9de!s de DNA Finiciad!resG
c!m#lemenares as exremidades de cada $ia de DNA8 $lan3%eand! a re)i+! de ineresse. Eses !li)!n%cle!9de!s
ser*em c!m! iniciad!res da s9nese de DNA in *ir!8 3%e . caalisada #ela DNA #!limerase.
Um cicl! de PCR c!me&a c!m a desna%ra&+! #!r cal!r FDECG8 3%e #r!m!*e a se#ara&+! da $ia d%#la de DNA. A
rea&+! . res$riada na #resen&a de %m excess! d!s d!is !li)!n%cle!9de!s8 #!ssi2iliand! a 0i2ridi"a&+! d!s d!is
iniciad!res c!m a se3=:ncia c!m#lemenar #resene n! DNA al*!. Em se)%ida8 a rea&+! . inc%2ada #ara ai*idade da
DNA #!limerase8 #r!d%"ind! n!*as $ias de DNAs a #arir d!s iniciad!res e %ili"and! ! 3%ar! des!xirri2!n%cle!9di!s
FdATP8 dCTP8 d/TP e dTTPG FFi)%ra CKG.
Figura 34. As C ea#as d! cicl! de PCR F0#-JJallser*.r%).ac.2eJca*iersrJindex.0mlG.
A cada n!*! cicl! da rea&+! inicia;se c!m ! a3%ecimen! #ara desna%ra&+! da d%#la $ia de DNA8 se)%id! de
res$riamen! #ara 0i2rida&+! d!s iniciad!res e s9nese de %ma n!*a $ia #ela DNA #!limerase a #arir d!s iniciad!res8
C1
send! 3%e as $ias de DNA rec.m sinei"adas ser*em de m!lde n! cicl! se)%ine. P!ran!8 em cada cicl! . sinei"ad! !
d!2r! d! DNA #r!d%"id! n! cicl! aneri!r FFi)%ra CEG. Us%almene8 s+! reali"ad!s de 17 a C7 cicl!s #ara am#li$ica&+!
de %m se)men! de DNA es#ec9$ic! denr! de %m )en!ma.
Nas #rimeiras iniciai*as #ara am#li$icar $ra)men!s de DNA %ili"a*a;se a en"ima DNA #!limerase da Escherichi coli8
3%e #!ss%i ai*idade m(xima a C6C. Esa en"ima de*eria ser adici!nada a cada cicl! #!is ! #ass! de desna%ra&+!
inai*a a en"ima. Um im#!rane a*an&! !c!rre% c!m a desc!2era da en"ima Ta3 DNA #!limerase FSaiWi e al8 ,DLLG
!ri%nda da 2ac.ria Thermus aquaticus. A Ta3 DNA #!limerase #!ss%i ai*idade 'ima a 61C e #ermanece
ra"!a*elmene es(*el mesm! a DEC e c!m is!8 a en"ima . adici!nada s!mene n! inici! d! #r!cess! .
Figura 35. Os #rimeir!s K cicl!s de %m PCR em deal0es.N! erceir! cicl!8 d%as d%#las $ias 3%e a#resenam ! aman0!
c!rre! s+! c!#iadas Fas d%as $ias c!m ! mesm! aman0!G. N! 3%ar! cicl!8 L d%#las $ias 3%e a#resenam ! aman0!
s+! c!#iadas F0#-JJ allser*.r%).ac.2eJ ca*iersrJindex.0mlG.
Al.m de ser %ili"ada #ara a am#li$ica&+! de %m se)men! es#ec9$ic! de DNA denr! de %m )en!ma8 a me!d!l!)ia de
PCR #!de ser %ili"ada #ara am#li$icar %m se)men! !% !da a se3=:ncia de %m #r!d%! ):nic!. Iss! #!de ser $ei! a
#arir da #!#%la&+! de RNA de %ma deerminada c.l%la !% ecid!. Enrean!8 c!m! a P!limerase %ili"ada na
me!d!l!)ia de PCR . %ma DNA P!limerase de#edene de DNA8 ela n+! #!de %sar RNA direamene c!m! m!lde #ara
a am#li$ica&+!. Assim8 inicialmene . reali"ada %ma rea&+! de ranscri&+! re*ersa8 !nde #ela a&+! da ranscri#ase
re*ersa ! RNA . %ili"ad! c!m! m!lde #ara )era&+! de cDNA8 3%e . en+! %ili"ad! c!m! m!lde em %ma PCR
s%2se3%ene. Essa a2!rda)em den!minada de RT;PCR FRe*erse Transcri#i!n and P!limerase C0ain Reaci!nG . m%i!
@il #ara se analisar de maneira r(#ida a ex#ress+! de )enes de ineresse8 #!is %ma *e" 3%e a PCR . reali"ada a #arir de
cDNA8 ! $ra)men! c!rres#!ndene a! )ene de ineresse s' ser( am#li$icad! na3%elas c.l%las !% ecid!s !nde ! )ene .
ex#ress!. Esa .cnica #!de ser %ili"ada #ara cl!na)em de %m cDNA de ineresse8 desde 3%e >( se en0a al)%ma
in$!rma&+! de s%a se3=:ncia8 sem a necessidade de se c!nsr%ir %ma 2i2li!eca de cDNA #ara is!l(;l!.
VI. SE]dENCIAMENTO DE DNA
A #arir d! $inal da d.cada de 67 !rn!%;se #!ss9*el a deerminar a se3=:ncia n%cle!9dica de $ra)men!s de DNA. O
desen*!l*imen! da me!d!l!)ia descria #!r San)er e c!ls ass!ciad! a a*an&!s ecn!l')ic!s8 #ermie 3%e 0!>e
)en!mas ineir!s se>am se3=enciad!s.
O #rinc9#i! d! m.!d! de ermina&+! da cadeia #ara se3=enciamen! de DNA 2aseia;se na s9nese de DNA in vitro
reali"ada na #resen&a dides!xirri2!n%cle!9de!s. Um DNA #%ri$icad! #!de ser sinei"ad! in vitro em %ma mis%ra 3%e
c!n.m m!l.c%las de $ia @nica de DNA8 en"ima DNA #!limerase8 %m DNA iniciad!r 3%e #!ssi2ilia a #!limerase
iniciar a s9nese de DNA %ili"and! !s des!xirri2!n%cle!9di!s. Alernai*amene8 na #resen&a de
dides!xirri2!n%cle!9de!s FddATP8 ddCTP8 dd/TP e ddTTPG na rea&+!8 ! el!n)amen! da cadeia de DNA . 2l!3%ead!
#ela inc!r#!ra&+! d! n%cle!9de! sem %m )r%#! OM na #!si&+! CQ.
CC
N! m.!d! !ri)inalmene desen*!l*id! #!r San)er #ara se3=enciamen! de DNA8 %ma $ia c!m#lemenar . sinei"ada
%ili"and! %m mis%ra de des!xirri2!n%cle!9de!s8 %m deles marcad! c!m P
C1
!% S
CE
. S+! reali"adas K rea&<es
inde#endenes8 c!nend! %ma #e3%ena 3%anidade de %m i#! de dides!xirri2!n%cle!9di! em cada %ma das rea&<es.
Cada rea&+! #r!d%" %m c!n>%n! de c'#ias d! DNA inicial 3%e erminam em di$erenes #!n!s da s%a se3=:ncia. Os
#r!d%!s desas 3%ar! rea&<es s+! se#arad!s #!r eler!$!rese8 %ili"and! 3%ar! raias #aralelas em %m )el de
#!liacrilamida e !s $ra)men!s s+! deecad!s ara*.s da marca&+! radi!ai*a. Em cada %m das raias8 as 2andas
re#resenam $ra)men!s 3%e $!ram erminad!s em dad! n%cle!9de! em di$erenes #!si&<es d! $ra)men! inicial de
DNA. Pela an(lise da !rdem das 2andas8 c!me&and! #el! $inal d! )el ara*.s das 3%ar! raias8 #!de;se deerminar a
se3=:ncia d! DNA rec.m sinei"ad! FFi)%ra CNG.
Ese m.!d! ainda . am#lamene %ili"ad!8 send! 3%e *(ri!s a*an&!s !rnaram ! se3=enciamen! de DNA %ma .cnica
sim#les e r(#ida. Os #rinci#ais a*an&!s $!ram a ada#a&+! da PCR a! m.!d! de ermina&+! da cadeia e a %ili"a&+! de
dides!xirri2!n%cle!9de!s marcad!s c!m di$erenes c!ranes $l%!rescenes F$l%!r!cr!m!sG. A %ili"a&+! de $l%!r!cr!m!s
#ermie 3%e !das as 3%ar! rea&<es se>am reali"adas em %m @nic! %2! e ! #r!d%! da rea&+! de se3=enciamen! se>a
se#arad! em %ma @nica raia d! )el.
Figura 36. Se3=enciamen! de n%cle!9de!s #el! m.!d! d! .rmin! d! crescimen! da cadeia. Le0nin)er8 Princi#les !$ Bi!c0emisrT. Fi)%ra ,7;CN8 #. CE1.
A%almene8 !d! ! #r!cess! de se3=enciamen! de DNA #!de ser reali"ad! em se3=enciad!res a%!m(ic!s. Neses
e3%i#amen!s ! #r!d%! da rea&+! de se3=enciamen! . se#arad! #!r eler!$!rese em )el !% em ca#ilar8 !s
$l%!r!cr!m!s s+! exciad!s #!r %m $eixe laser8 !s sinais $l%!rescenes s+! am#li$icadas e deecad!s #!r %2!s
$!!m%li#licad!res !% n!s m!del!s mais m!dern!s #!r c?maras CCD. An(lises c!m#%aci!nais ideni$icam cada
n%cle!9de! #el! c!m#rimen! de !nda de emiss+! es#ec9$ic! de cada $l%!r!cr!m!. As 2ases s+! ideni$icadas de ac!rd!
c!m a $!rma d! #ic! $l%!rescene e a dis?ncia enre #ic!s s%cessi*!s FFi)%ra C6G.
Figura 3. O #r!d%! da rea&+! de se3=enciamen! . s%2meid! B eler!$!rese em %ma raia de )el. e medida 3%e !s $ra)men!s #assam #el! $eixe
de laser8 !s $l%!r!cr!m!s s+! exciad!s e a l%" emiida . deecada #!r %m $!!m%li#licad!r. Esa in$!rma&+! . rad%"ida na $!rma de se3=:ncia
ara*.s de %m c!m#%ad!r.
CK
6II. ED)re$$+# %e )r#"e.'a$ Je"er0l#ga$
1. I'"r#%u*+#
A desc!2era de #r!m!!res e re#ress!res es#ec9$ic!s d! )en!ma de E! coli8 de %ma *ariedade de *9r%s de E! coli e de
c.l%las e%cari'icas #ermii% a mani#%la&+! da ex#ress+! de #r!e9nas e a cl!na)em de )enes s!2 ! c!nr!le de %m dad!
#r!m!!r8 c%>a ex#ress+! #!de ser ind%9*el !% c!n9n%a. O #rimeir!8 e mais c!m%mene %sad!8 sisema de ex#ress+! de
#r!e9nas 0eer'l!)as em E! coli . 2asead! n! !#er!n lac FFi)%ra CLG. Nese sisema8 ! DNA de ineresse . cl!nad! em
$a)! Fn! cas! de 2i2li!eca de cDNA de ex#ress+!G !% #lasm9de! c!nend! ! lac% Fre#ress!rG8 lacP F#r!m!!rG e lac/
F)ene esr%%ral ranscri! #ara mRNA da ;)alac!sidaseG. A ind%&+! da ranscri&+! . !2ida #ela adi&+! de %m an(l!)!
de lac!se sin.ic! e n+! de)rad(*el Fis!#r!#ili!;;D;)alac!s9de!8 IPT/G8 ! 3%al se ass!cia a! re#ress!r e ini2e;!8
deixand! ! #r!m!!r li*re #ara a inera&+! c!m a RNA #!limerase e c!nse3%ene ranscri&+! d! )ene.
Figura 3/. Es3%ema il%srand! ! $%nci!namen! d! !#er!n lac. FaG Na a%s:ncia de ind%!r. F2G Na #resen&a de ind%!r.
O sisema mais c!m%mene %ili"ad! #ara ex#ress+! de #r!e9nas 0eer'l!)as . ! 3%e %ili"a E! coli c!m! c.l%la
0!s#edeira. Ese sisema . am#lamene di$%ndid! de*id! B $acilidade e 2aix! c%s! de se c%li*ar E! coli8 e #ela
re#r!d%i2ilidade e a2%nd?ncia de #r!e9na 3%e #r!d%". Al.m diss!8 m!di$ica&<es n!s *e!res e lin0a)ens de E! coli s+!
$re3%enemene $eias n! senid! de a%menar a e$ici:ncia e *ersailidade d! sisema !ri)inal. C!m is!8 e c!m ! ad*en!
de n!*!s sisemas de ex#ress+! em c.l%las de e%cari!!s Fle*ed%ra8 inse!s8 mam9$er!G8 a ex#ress+! de #r!e9nas
cl!nadas !rn!%;se %ma a2!rda)em #!der!s9ssima 3%e *em re*!l%ci!nand! !s es%d!s de esr%%ra8 $%n&+!8 #%ri$ica&+!
e ideni$ica&+! de n!*as #r!e9nas. Neses !%r!s sisemas8 ! rec!m2inane a ser inr!d%"id! n! 0!s#edeir! al*! #!de ser
$acilmene c!nsr%9d! e am#li$icad! em E! coli. P!r iss! !s #lasm9de!s de le*ed%ra8 mam9$er!8 ec. s+! c!nsr%9d!s #!r
$%s+! de %ma #!r&+! de %m #lasm9de! de E! coli F!ri)em de re#lica&+! e resis:ncia a %m ani2i'ic!G c!m se3=:ncias
es#ec9$icas #ara se !2er ex#ress+! em c.l%la e%cari'ica8 c!n$!rme *erem!s adiane.
2. ED)re$$+# %e )r#"e.'a$ Je"er0l#ga$ e( Ecoli
O %s! de E! coli #ara a !2en&+! de #r!e9na em 3%anidade s%$iciene #ara ! es%d! da esr%%ra e $%n&+! da mesma !%
#ara a#lica&<es cl9nicas !% ind%sriais . 0!>e disseminad! e c!nsi%i;se em %m marc! na 0is'ria d! n!ss!
c!n0ecimen! de esr%%ra de #r!e9nas. Ese '#ic! #reende s!2re%d! descre*er !s #ass!s 2(sic!s en*!l*id!s na
c!nsr%&+! de rec!m2inanes e ex#ress+!8 em 2ac.ria8 de %ma #r!e9na cl!nada.
2.1 -ub&l#'age( e( )la$(.%e#$ %e eD)re$$+#
O #r!cedimen! de cl!na)em de %m $ra)men! de DNA #ara ex#ress+! . exaamene i)%al a 3%al3%er cl!na)em8 n!
CE
>ene estrutural
>ene estrutural
transcri#&o
enan!8 de*e se er em mene 3%e ! #r!#'si! ser( !2er a #r!e9na c!rrea. Para an!8 . necess(ri! res#eiar ! $i'al %e
"ra%u*+# %e ge'e$ )r#&ari0"i&#$ Fsinal de S0ine;Dal)arn!G8 em !%ras #ala*ras8 ! DNA de*e ser cl!nad! de maneira
3%e s%a $ase de lei%ra c!rrea $i3%e em $ase c!m ! AT/ iniciad!r FFi)%ra CDG. Al.m diss!8 %m *e!r #ara ex#ress+! em
E! coli de*e a#resenar as se)%ines caracer9sicas-
!ri)em de re#lica&+!
marcad!r #ara sele&+!- )ene 3%e c!n$ere resis:ncia a ani2i'ic!s c!m! am#icilina8 eraciclina8 cl!ran$enic!l8
ne!micina. Ex. ! )ene da ;lacamase 3%e c!n$ere resis:ncia a am#icilina.
%m #r!m!!r #ara ranscri&+!- c!m! !s *e!res de ex#ress+! s+! n!rmalmene #r!>ead!s n! senid! de #r!d%"ir
#r!e9na em a2%nd?ncia8 ! DNA c!di$icane #ara %ma dada #r!e9na de*e ser c!l!cad! s!2 ! c!mand! de %m #r!m!!r
$!re Fexem#l!s- lac/8 tac FtrpRlac/G8 0p
(
8 0p
"
8 p
)1
d! 2aceri'$a)! T6G e re)%l(*el8 is! .8 c!nend! %m re#ress!r
#ara maner !s n9*e9s 2asais de ex#ress+! d! )ene insi)ni$icanes a. a ind%&+!8 ! 3%e se $a" )eralmene #!r adi&+! de
IPT/8 n! cas! #!r ex. d! re#ress!r lacI8 !% c0!3%e .rmic!8 n! cas! d! re#ress!r cIsLE6.
sinal de ermina&+! da ranscri&+!
se3%:ncias #ara c!nr!le da rad%&+!8 c!m! #!r ex.8 %m s9i! de li)a&+! a! ri2!ss!m! #ara a inicia&+! da rad%&+!
FS0ine;Dal)arn!G e %m AT/ iniciad!r. Um sinal de ermina&+! da rad%&+! Fc'd!n de ermina&+!G am2.m de*e esar
#resene n! *e!r !% n! inser! a ser cl!nad!8 !% de*e ser adici!nad!.
%m MSC #ara $aciliar a inser&+! d! )ene de ineresse na !riena&+! c!rrea.

Figura 35. Pr!cedimen!s #ara cl!na)em de %m $ra)men! de DNA em $ase de lei%ra c!rrea em %m #lasm9de! de
ex#ress+!.
CN
Uma *e" c!nsr%9d!8 ! *e!r de ex#ress+! c!nend! a se3%:ncia c!di$icad!ra da #r!e9na de ineresse . inr!d%"id! em
E!coli #!r rans$!rma&+!.
A! #lane>ar %ma s%2cl!na)em #ara a ex#ress+! de #r!e9na8 al.m de se res#eiar a $ase de lei%ra c!rrea8 de*e;se
am2.m enar na medida d! #!ss9*el $a"er a cl!na)em %nidireci!nal d! inser!. Na cl!na)em %nidireci!nal %ili"am;se
d%as en"imas de resri&+! #ara di)erir ! *e!r e ! DNA inser!. Na 2idireci!nal %ili"a;se %ma @nica en"ima8 de m!d!
3%e as #!nas s+! i)%ais8 #ermiind! a inser&+! d! $ra)men! em am2as as !riena&<es. Assim8 em %ma cl!na)em
2idireci!nal 0( E7X de #r!2a2ilidade de se !2er !s rec!m2inanes na !riena&+! c!rrea Fsens!G e E7X na !riena&+!
in*erida Fani;sens!G.
2.2 A'Kli$e %#$ )la$(.%e#$ e $ele*+# %#$ $ub&l#'e$ &#rre"#$
A an(lise de DNA #lasmidial #ara a sele&+! d!s s%2cl!nes c!rre!s . $eia #!r di)es+! c!m en"imas de resri&+! e
c!n$irmada #!r se3%enciamen! se >%l)ar necess(ri!. A an(lise de resri&+! . %m #r!cedimen! 2asane sim#lesU
enrean! de*e ser $ei! c!m ca%ela e aen&+!. Se% !2>ei*! . seleci!nar ! cl!ne rec!m2inane c!rre! 3%an! a!
aman0! d! inser! e s%a !riena&+!.
C!m! re)ra a #rimeira di)es+! de*e ser $eia c!m aFsG en"imaFsG %ili"adaFsG #ara a cl!na)emU is! #r!d%"ir( d!is
$ra)men!s- #lasm9de! linear R inser!8 e #ermiir( a*aliar se !s s9i!s de cl!na)em $!ram rec%#erad!s inac!s. Se a
li)a&+! $!r reali"ada enre exremidades ce)as8 #reenc0idas #ela a&+! da \len!f #!limerase8 *eri$ica;se em %m ca(l!)!
de en"imas de resri&+! se 0a*er( a $!rma&+! de %m n!*! s9i!8 ! 3%al #!der( ser cli*ad! #ara an(lise. O%ra alernai*a
c!nsise em cli*ar em s9i!s #r'xim!s a! da cl!na)em em am2as as exremidades.
A se)%nda di)es+!8 n! cas! da cl!na)em 2idireci!nal8 de*e ser #lane>ada #ara deerminar a !riena&+! d! inser!.
De*e;se esc!l0er %m s9i! @nic! e n+! cenrali"ad! n! inser! e %m s9i! n! MSC 3%e se>a a%sene n! inser!8
#r!d%"ind! de #re$er:ncia d!is $ra)men!s de aman0!s $acilmene disin)=9*eis n! )el. Calc%lar #re*iamene !
aman0! d!s $ra)men!s es#erad!s #ara am2as as !riena&<es. A di)es+! c!m#lea . $%ndamenal #ara a c!rrea
iner#rea&+! d!s res%lad!s. A Fi)%ra K7 es3%emai"a %m #r!>e! de s%2cl!na)em de %m )ene e a an(lise de resri&+!
d!s s%2cl!nes !2id!s c!m ! !2>ei*! de- aG seleci!nar !s rec!m2inanes8 2G seleci!nar ! rec!m2inane c!rre!.
3. 3r#%u*+# %e )r#"e.'a$ Je"er0l#ga$ e( E coli
3.1. 3r#%u*+# %e )r#"e.'a$ J.bri%a$
De maneira ideal8 3%and! se #ensa em ex#ress+! 0eer'l!)a8 es#era;se 3%e a #r!e9na de ineresse se>a es(*el8 n+!
'xica #ara a 2ac.ria8 s!l@*el8 #r!d%"ida em )rande 3%anidade e #!ssa ser $acilmene #%ri$icada. Um #r!cedimen!
m%i! %ili"ad! . ! de ex#ressar a #r!e9na de ineresse em $%s+! c!m %m Ha)I es#ec9$ic! 3%e #ermia a $(cil
#%ri$ica&+! da mesma ara*.s de cr!ma!)ra$ia #!r a$inidade em resinas Bs 3%ais se enc!nram ac!#ladas li)anes8 a!s
3%ais ! Ha)I #!ssa se li)ar es#eci$icamene. Uma !%ra *ana)em '2*ia de se #r!d%"ir %ma #r!e9na 092rida8 !% de
$%s+!8 . n! cas! da ex#ress+! de #!li#e#9de!s #e3%en!s !% mesm! #e#9de!s8 !s 3%ais8 sem $%s+!8 seriam ins(*eis e
ra#idamene de)radad!s na c.l%la.
C6
M0C
Bam?$ Bam?$
Bam?$ Bam?$
P
1<b
4<b
Hind$$$
Hind$$$
Hind$$$
.ecombinante
Esperado
)senso)
.ecombinante
$nvertido
)anti!senso)
$nserto senso
Hind$$$
P
Eliminada
.etida
0epara#&o
C7$=A>EM
)prote9lise)
7avagem Elu#&o
EIP.E00N/
)$NDOPN/)
P7M
C7/NA>EM
)a)
pMA7c
Proteina de
interesse
PO.$*$CAPN/
P/.
A*$N$DADE
*ator Ia
Figura 40. S%2cl!na)em de %m $ra)men! de DNA em #lasm9de! de ex#ress+! e an(lise de resri&+! de d!is
rec!m2inanes !2id!s.
N!a - Os cl!nes , e 1 $!ram di)erid!s c!m BamMI e Hind III8 se#aradamene.
Res#!nda- ]%al d!s d!is cl!nes em ! inser! na !riena&+! c!rrea Fsens!G #ara a ex#ress+! da #r!e9nab
Em )eral #r!>ea;se ainda %m s9i! sens9*el a %ma deerminada #r!ease Fex- $a!r [a8 r!m2inaG8 inserid! imediaamene
acima d! s9i! de cl!na)em8 de maneira 3%e a #r!e9na 092rida #!ssa ser cli*ada li2erand! a #r!e9na cl!nada 3%e #!de
en+! ser $acilmene #%ri$icada %ili"and!;se a mesma c!l%na de a$inidade. A c!l%na reer( a #r!e9na de $%s+! e
eliminar( n! P*!idP a #r!e9na de ineresse. Um exem#l! de #r!e9na 092rida !2ida #!r cl!na)em n! *e!r #MAL .
dad! na Fi)%ra K,.
O #r!cedimen! de #r!e'lise . relai*amene ra2al0!s! e nem sem#re e$iciene8 #!r iss! 3%and! a #r!e9na de $%s+!
n+! iner$ere se %ili"a a #r'#ria #r!e9na 092rida8 #!r exem#l!8 #ara ex#erimen!s $%nci!nais8 #r!d%&+! de anic!r#!s8
ec. N!e 3%e nese cas! #!de ser esra.)ic! er ! mesm! DNA cl!nad! em d!is sisemas de $%s+! di$erenes. Is!
#ermiir( 3%e anic!r#!s #r!d%"id!s c!nra %ma #r!e9na 092rida se>am #%ri$icad!s #!r a$inidade c!nra a !%ra8
#%ri$icand!;se assim a#enas anic!r#!s c%>!s e#i!#!s l!cali"am;se na #r!e9na cl!nada.
Denre !s *e!res %ili"ad!s c!m s%cess! #ara a #r!d%&+! de #r!e9nas 092ridas #!dem!s ciar-
)GEL- a#resena a )l%ai!na;S;rans$erase de Schistosoma 2aponicum F1N WDaG c!m! #r!e9na de $%s+!8 #ermiind! a
#%ri$ica&+! da #r!e9na de $%s+! em c!l%na de a)ar!se;)l%ai!na
)MAL- a#resena a #r!e9na li)ane de mal!se FPLMG de 2ac.ria FK1 WDaG c!m! $%s+!8 #ermiind! a #%ri$ica&+! da
#r!e9na de $%s+! em c!l%na c!m amil!se ac!#lada
)ME- a#resena %m Ha)I de N res9d%!s de 0isidina c!m! $%s+! e #ermie a #%ri$ica&+! das #r!e9nas de $%s+! em
c!l%nas 3%elanes de Ni
1R
)NR- c%>a $%s+! . %m $ra)men! da ;)alac!sidase
A #r!d%&+! de #r!e9nas 092ridas . )eralmene m%i! sim#les8 e$iciene e de 2aix! c%s! $inanceir!8 #!dend! s%#rir de
imedia! necessidades da #es3%isa 2(sica8 ais c!m!8 #r!d%&+! de anic!r#!s e #%ri$ica&+! deses #!r a$inidade8 s!ndas
em ex#erimen!s *ariad!s e #ara es%d!s $%nci!naisJesr%%rais da #r!e9na ex#ressa. Permie8 am2.m8 a ex#ress+! em
)rande escala8 #ara $ins ind%sriais !% cl9nic!s de en"imas8 0!rmAni!s8 anic!r#!s8 ec.8 3%and! a ai*idade da #r!e9na .
#reser*ada. Al.m dis!8 . #!ss9*el se !2er8 #!r m%a):nese8 #r!e9na c!m a ai*idade de ineresse #!enciada e li*re de
e$ei!s ad*ers!s !% ai*idades indese>adas.
F2G
Figura 41. aG Es3%ema il%srand! !s #ass!s #ara
a ex#ress+!8 #%ri$ica&+! e cli*a)em de %ma
#r!e9na de $%s+!. 2G /el de #!liacrilamida;SDS
de $ra&<es da #%ri$ica&+! da #r!e9na de $%s+!
PLM;#arami!sina. Em A s+! m!srad!s !s
exra!s de c.l%las n+! ind%"idas F,G e de c.l%las
ind%"idas F1G. Em B8 #r!e9na de $%s+! PLM;
#arami!sina a#'s el%i&+! da c!l%na de amil!se
#!r adi&+! de mal!se F,G8 a#'s cli*a)em #!r
$a!r [a F1G e $ra&+! c!leada n! P*!idPa#'s
#assa)em na c!l%na #ara a reen&+! da PLM FCG.
CL
a im#!rane esar alera de 3%e a si%a&+! ideal ex#!sa acima nem sem#re . ain)ida. Na realidade8 na )rande mai!ria
das *e"es8 #r!e9nas de e%cari!! #r!d%"idas em 2ac.ria n+! s+! s!l@*eisU Bs *e"es #!dem ser 'xicas #ara a c.l%laU
al)%mas s+! ex#ressas em 2aix!s n9*eisU al)%mas iner$erem c!m a s%a $%s+! ini2ind!;a de se li)ar B resina de a$inidade
e !rnand! a #%ri$ica&+! men!s e$icieneU !%ras $!rmam a)re)ad!s exremamene ins!l@*eis mesm! na #resen&a de
SDSJ;merca#!ean!lU al)%mas :m a s%a ai*idade 2i!l')ica #lenamene rec%#erada8 #!r.m !%ras s+! inai*as.
Assim8 denre !s #r!2lemas mais c!m%ns 3%e !c!rrem c!m a #r!d%&+! de #r!e9nas 0eer'l!)as em E! coli8 #!dem!s
ciar-
3r#"e.'a$ "0Di&a$; al)%mas #r!e9nas s+! 'xicas #ara a c.l%la 0!s#edeira. Nese cas!8 #!de;se #r!ceder a secre&+!.
Uma alernai*a B #r!d%&+! de #r!e9na ci!#lasm(ica8 . a #r!d%&+! de #r!e9nas 3%e s+! secreadas. Para an! 2asa
cl!nar ! DNA c!di$icane em $%s+! c!m %ma se3=:ncia c!di$icane #ara %m #e#9de! sinal de #r!cari!!. Ese #e#9de!
. cli*ad! #ela #e#idase sinal 3%and! a #r!e9na . secreada #ara ! #eri#lasma. Em2!ra ese m.!d! $re3=enemene
ra)a #r!2lemas c!m ! rendimen! !% a cli*a)em d! #e#9de! sinal8 0( *ana)ens em al)%ns cas!s- n! cas! de #r!e9nas
'xicas #ara a 2ac.riaU al)%mas #r!e9nas de)radadas #!r #r!ease n! ci!#lasma s+! es(*eis n! #eri#lasmaU al)%mas
3%e s+! inai*as 3%and! #r!d%"idas inracel%larmene s+! ai*as 3%and! secreadasU a #r!e9na #r!d%"ida >( em a s%a
mei!nina N;erminal #r!cessada. Um exem#l! de s%cess! . a ex#ress+! d! 0!rmAni! $a!r de crescimen! e#idermal
0%man! F0E/FG s!2 ! c!mand! d! #r!m!!r da $!s$aase alcalina Fpho*G e c!m a se3=:ncia sinal desa. A ind%&+! .
!2ida s!2 #ri*a&+! de $!s$a! d! mei!.
3r#"e.'a$ i'$"K!ei$; is! #!de ser res!l*id! red%"ind!;se a em#era%ra de crescimen! !% m%dand!;se #ara %ma
lin0a)em de 2ac.ria de$iciene em %ma !% mais #r!eases. Mesm! assim . c!m%m se !2er al)%m n9*el de
$ra)mena&+! da #r!e9na ex#ressa F*er Fi). CD 28 raia ,G.
BaiD#$ '.!ei$ %e eD)re$$+#; #!de !c!rrer #elas ra"<es acima denre !%ras8 c!m!8 #!r exem#l!8 insa2ilidade d!
mRNA8 .rmin! #rema%r! da mensa)em8 rad%&+! ine$iciene.
3r#"e.'a$ i'$#l,!ei$; #r!e9nas de e%cari!!s #r!d%"idas em 2ac.ria s+! )eralmene #reci#iadas na $!rma de c!r#!s
de incl%s+! e re3%erem #r!cedimen!s adici!nais de desna%ra&+! #ara s!l%2ili"(;las e de rena%ra&+! #ara man:;las
s!l@*eis e $%nci!nais. Is! nem sem#re . %m #r!2lema8 #!is a $!rma&+! de c!r#!s de incl%s+! #!de #r!e)er a #r!e9na
c!nra a de)rada&+! #!r #r!eases 2acerianas e am2.m $aciliar a #%ri$ica&+!8 %ma *e" 3%e s+! c!r#!s dens!s8
#reci#iad!s B 2aixa *el!cidade de cenri$%)a&+!8 en3%an! a mai!r #are das #r!e9nas 2acerianas #ermanecem n!
s!2renadane. Mas al)%mas *e"es n+! se c!nse)%e rena%ra&+! ade3%ada da #r!e9na #%ri$icada. Nese cas! de*e;se
enar aen%ar a $!rma&+! de c!r#!s de incl%s+! alerand! as c!ndi&<es de ex#ress+!8 #!r exem#l!8 crescend!;se a
c%l%ra a em#era%ra mais 2aixa a#'s a ind%&+! !% %ili"and! %m #r!m!!r mais $rac!.
3.2. 3r#%u*+# %e )r#"e.'a$ i'"a&"a$
A *ana)em de se #r!d%"ir #r!e9na inaca sem $%s+! . 3%e ela #!der( ser %ili"ada sem a #re!c%#a&+! de 3%e !
se)men! de $%s+! ese>a iner$erind! em s%a esr%%ra e ai*idade. A #rinci#al des*ana)em . 3%e nem sem#re se
enc!nra %m m.!d! e$ica" #ara a #%ri$ica&+! da mesma. C!n%d! 0( exem#l!s dem!nsrand! 3%e #ara es%d!s
$%nci!nais e de esr%%ra . #re$er9*el in*esir na #r!d%&+! de #r!e9na inaca.
V(ri!s *e!res enc!nram;se dis#!n9*eis n! mercad! #ara a ex#ress+! de #r!e9nas sem $%s+! em E!coli. Os mais
re$erid!s s+! da s.rie #ET F#lasmid $!r ex#ressi!n 2T T6 RNA #!limeraseG8 c%>a ex#ress+! es( s!2 ! c!nr!le d!
#r!m!!r de ranscri&+! )1 e d!s sinais de inicia&+! de rad%&+! s)1 da #r!e9na d! )ene ,7 Fa #rinci#al #r!e9na d!
ca#s9de!G d! 2aceri'$a)! T6. A )rande *ana)em dese *e!r . 3%e ele . ranscri! #ela T6 RNA #!limerase8 a 3%al .
m%i! selei*a e ai*a8 send! ca#a" de el!n)ar cadeias de RNA a#r!ximadamene E *e"es mais r(#id! 3%e a RNA
#!limerase de E! coli. Al)%ns *e!res da s.rie #ET a#resenam ! #r!m!!r T6;lac8 c!l!cand! a ex#ress+! da #r!e9na
s!2 ! c!nr!le lac e red%"ind! #!ran! ! 2acW)r!%nd de ex#ress+! da #r!e9na al*! na a%s:ncia de IPT/.
4. ED)re$$+# %e )r#"e.'a$ Je"er0l#ga$ e( #rga'i$(#$ eu&ari#"#$
A! se esc!l0er %m sisema de ex#ress+!8 de*e;se sem#re c!nsiderar a a#lica&+! $inal da #r!e9na a ser ex#ressa. Em2!ra
! sisema de ex#ress+! de #r!e9nas 0eer'l!)as em E! coli se>a 2asane di$%ndid!8 n! cas! de #r!e9nas e%cari'icas
c!m#lexas !rna;se8 as *e"es8 necess(ri! lan&ar;se m+! de sisemas de ex#ress+! em c.l%las e%cari'icas #ara se
#r!d%"ir #r!e9nas na s%a $!rma nai*a8 #!is eses sisemas #ermiem m!di$ica&<es #'s;rad%ci!nais essenciais #ara a
$%n&+! de deerminadas #r!e9nas8 c!m!8 #!r exem#l!8 )lic!sila&+!. C!nsiderarem!s al)%ns deses sisemas a se)%ir.
4.1. ED)re$$+# e( &Elula$ %e (a(.1er#$
Os *e!res #ara ex#ress+! em mam9$er!s c!n.m se3%:ncias #ara $aciliar a #r!#a)a&+! em 2ac.ria F!ri)em de
re#lica&+! e %m marcad!r #ara sele&+!G8 2em c!m! se3=:ncias es#ec9$icas #ara se !2er ex#ress+! em c.l%las
e%cari'icas.
Assim8 %m *e!r #ara ex#ress+! em c.l%las de mam9$er!s de*e a#resenar as se)%ines caracer9sicas-
!ri)em de re#lica&+! #ara c.l%las e%cari'icas- #!r exem#l! a d! *9r%s SVK7
#r!m!!r- c!m!8 #!r exem#l!8 d! SVK7 !% d! ci!me)al!*9r%s FCMVG. Exisem am2.m *e!res c!m #r!m!!res
ind%"9*eis c!m!8 #!r exem#l!8 ! da eraciclina e ! res#!nsi*! B ecdis!na.
sinais #ara ! .rmin! da ranscri&+! e #ara a #!liadenila&+! d! ranscri!
marcad!r #ara sele&+!- c!m! #!r exem#l! ! )ene 3%e c!di$ica a amin!)lic!s9de! $!s$!rans$erase8 c!n$erind!
CD
resis:ncia B )eneicina F%m an(l!)! de ne!micinaG.
se3%:ncia #ara li)a&+! a! ri2!ss!m! Fse3%:ncia de \!"aWG
Os sisemas de ex#ress+! em c.l%las de mam9$er!s #!dem ser di*idid!s em d!is i#!s- aG a3%eles en*!l*end! ex#ress+!
ransi'ria da #r!e9na em 3%es+! F,;K dias a#'s a inr!d%&+! d! DNAGU 2G a3%eles en*!l*end! a ex#ress+! es(*el e
3%e re3%erem8 #!ran!8 a ine)ra&+! d! )ene n! DNA cr!m!ssAmic!.
4.2 ED)re$$+# e( 1u'g#$
F%n)!s s+! e%cari!!s %nicel%lares #!encialmene ca#a"es de reali"ar !das as m!di$ica&<es #'s;rad%ci!nais
!2ser*adas em c.l%las de mam9$er!s. A $acilidade de c%li*! em lar)a escala e ! $a! de S! cerevisiae ser %m
micr!r)anism! se)%r!8 le)almene %sad! na ind@sria de alimen!s e $armac:%ica8 s+! caracer9sicas adici!nais 3%e
!rnam a ex#ress+! 0eer'l!)a de #r!e9nas nese sisema #aric%larmene arai*a e c!m #er#eci*as #ara %s!8 #!r
exem#l!8 n! desen*!l*imen! de *acinas !rais ara*.s da im!2ili"a&+! de an9)en!s na s%#er$9cie dese micr!r)anism!.
Exem#l!s da ex#ress+! de #r!e9nas 0eer'l!)as em $%n)!s enc!nram;se descri!s n!s 9ens 6.,.1 e 6.1.
5. -i$"e(a %e eD)re$$+# e( &Elula$ %e i'$e"# u"iliFa'%# Ba&ul#!.ru$ &#(# !e"#r
a %m d!s sisemas de ex#ress+! em c.l%las e%cari'icas mais #!der!s!s e *ers(eis. O )en!ma d! Bac%l!*9r%s . m%i!
)rande #ara #ermiir a inser&+! direa de )enes 0eer'l!)!sU #!r iss!8 eses s+! cl!nad!s em *e!res de rans$er:ncia8 !s
3%ais c!n.m se3%:ncias $lan3%ead!ras 3%e s+! 0!m'l!)as FES e CS a! inser! dese>ad!G a! )en!ma d! Bac%l!*9r%s.
Pr!cede;se8 en+!8 B c!;rans$ec&+! d! *e!r de rans$er:ncia c!nend! ! )ene de ineresse cl!nad! e d! DNA
lineari"ad! d! *9r%s *utographa californica FAcNPVG em c.l%las d! inse! Spodoptera frugiperda FS$G. Nesas c.l%las
!c!rre rec!m2ina&+! 0!m'l!)a8 c!m rans$er:ncia d! )ene 0eer'l!)! d! *e!r #ara ! DNA d! AcNPV. A in$ec&+! das
c.l%las S$ c!m ! DNA d! *9r%s res%la na #arada !al da ex#ress+! das #r!e9nas d! 0!s#edeir!8 #ermiind! ala
#r!d%&+! d! mRNA e da #r!e9na rec!m2inanes.
Uma *ariedade de *e!res de rans$er:ncia $!ram c!nsr%9d!s #ara %ili"a&+! nese sisema. Cada *e!r c!nem -
%ma !ri)em de re#lica&+! de E!coli
%m marcad!r de resis:ncia B am#icilina
! #r!m!!r da #!li0edrina !% da #,7 F#r!e9nas d! 2ac%l!*9r%sG- #r!m!!res $!res.
%m MSC #ara #ermiir inser&+! d! )ene de ineresse
se3%:ncias $lan3%ead!ras #erencenes a! )en!ma d! *9r%s #ara $aciliar a rec!m2ina&+! 0!m'l!)a
6a'"age'$ %e$"e $i$"e(a %e eD)re$$+#;
M!di$ica&<es #'s;rad%ci!nais
O2en&+! de #r!e9nas s!l@*eis e $%nci!nalmene ai*as
Al9ssim!s n9*eis de ex#ress+!
Ca#acidade #ara )randes inser!s
Ex#ress+! sim%l?nea de *(ri!s )enes- *(ri!s #lasm9de!s c!m #r!m!!res m@li#l!s enc!nram;se dis#!n9*eis
c!mercialmene8 #ermiind! a ex#ress+! de d%as !% mais #r!e9nas n%ma @nica c.l%la in$ecada.
Facilidade de #%ri$ica&+!- *e!res a#resenand! Ha)sI de NxMis e /ST #ermiem a #%ri$ica&+! #!r a$inidade das
#r!e9nas rec!m2inanes.
Facilidade de m!ni!ramen! da ex#ress+!- *e!res Bi!c!l!rs #ermiem a !2en&+! da #r!e9na de ineresse em $%s+!
c!m /FP F)reenG8 BFP F2l%eG !% `FP FTell!fG8 #ermiind! ! m!ni!ramen! da ex#ress+! sem a necessidade da
%ili"a&+! de anic!r#!s.
6. ED)re$$+# e( &Elula$ %e D!"S"#$%&A
C!m2ina al)%mas das mel0!res caracer9sicas d!s sisemas de ex#ress+! em c.l%las de mam9$er! c!m a3%eles em
c.l%las de inse!s %ili"and! 2ac%l!*9r%s. a %m sisema mais 2ara! e e$iciene 3%e ex#ress+! em c.l%las de mam9$er!s e
mais r(#id! 3%e ex#ress+! %ili"and! 2ac%l!*9r%s. Ese sisema %ili"a *e!res #lasmidiais #ara ex#ress+! ransi'ria !%
es(*el da #r!e9na de ineresse. Enc!nram;se dis#!n9*eis c!mercialmene *e!res #ara ex#ress+!- aG c!nsi%i*a
F#r!m!!r da acinaG8 2Gind%"9*el F#r!m!!r da meal!i!ne9na8 ex#ress+! ind%"ida #ela adi&+! de c!2re !% c(dmi!G e cG
ind@"i*el e c!m secre&+! da #r!e9na #ara ! mei!. T!d!s !s *e!res a#resenam Ha)sI de NxMis n! C;erminal8
$aciliand! a #%ri$ica&+! #!r a$inidade da #r!e9na de ineresse.
. EL3RE--IO DE 3ROTEONA- PETERQLOGA-; A3LICAHRE- E 3ER-3ECTI6A-
.1@ Bibli#"e&a$ %e eD)re$$+# e i%e'"i1i&a*+# %e '#!a$ )r#"e.'a$ a"ra!E$ %e a'"i&#r)#$ #u #u"r#$ liga'"e$ e$)e&.1i&#$
.1.1@ -i$"e(a &#'!e'&i#'al @ eD)re$$+# %e bibli#"e&a %e &DNA e( E coli
V!c:s >( *iram em ca#9%l!s aneri!res 3%e %ma 2i2li!eca de cDNA #!de ser c!nsr%9da em *e!r de ex#ress+! F$a)! !%
#lasm9de!G. Para essa $inalidade8 %m d!s *e!res mais %ili"ad!s a%almene8 #ela s%a *ersailidade8 . ! ZAP e !
0!s#edeir! mais %sad! . E! coli. ]%and! se cl!na %m dad! $ra)men! de DNA #!de;se #lane>ar #re*iamene se dese>a;
se %ma cl!na)em %ni !% 2idireci!nal. ]%and! se sinei"a %ma 2i2li!eca de ex#ress+! . %s%al 3%e se !#e #ela
cl!na)em %nidireci!nal. Para iss! 2asa di)erir ! *e!r c!m d%as en"imas 3%e )eram #!nas inc!m#a9*eis e #re#arar !
inser! c!m ada#ad!res 3%e )eram #!nas c!m#a9*eis c!m as d! *e!r8 de al maneira 3%e a !riena&+! se>a a c!rrea
F$ia sense8 senid! EQCQ8 a #arir d! #r!m!!rG #ara a ex#ress+! de #r!e9na. A 2i2li!eca . am#li$icada c!m! 3%al3%er
!%ra e a ex#ress+! de #r!e9na . ind%"ida #ela adi&+! de IPT/U %ma r.#lica da #laca de ()ar c!nend! as #lacas de lise
K7
. !2ida em %m $ilr! de nir!cel%l!se c!l!cad! s!2re a mesma #!r %m cer! em#! #ara 3%e as #r!e9nas se>am
aderidas. Ese $ilr! . em se)%ida raad! c!m! em %m gesern 2l! #ara a deec&+! de #r!e9na8 c!m anic!r#! !% %m
!%r! li)ane es#ec9$ic! #ara a #r!e9na de ineresse. O sisema ZAP . ineressane #!r3%e a#'s ! is!lamen! d! cl!ne !
$a)!m9de! #!de ser $acilmene !2id! #!r excis+! in vivo #!r c!;in$ec&+! c!m $a)! $ilamen!s! a%xiliar FFi)%ra K1G.
Figura 42. Es3%ema d! $a)! ZAP8 is!lamen! d! cl!ne e excis+! d! $a)em9de! #Bl%escri# #!r c!in$ec&+! c!m $a)!
$ilamen!s! a%xiliar.
A #r!e9na cl!nada #!de en+! ser ex#ressa e s%as #r!#riedades es%dadas8 incl%si*e #!de ser #r!namene #%ri$icada
#ara a in>e&+! em c!el0!s a $im de )erar anic!r#!s. Eses #!dem ser %sad!s c!m! c!nra;#r!*a da cl!na)em e c!m!
s!ndas im#!ran9ssimas #ara dia)n'sic!8 im%n!ci!3%9mica8 ec. M( am2.m a #!ssi2ilidade de se c!nsr%ir a
2i2li!eca em %m ZAP m!di$icad! 3%e c!n.m ! #r!m!!r de ci!me)al!*9r%s FCMVG e !%r!s elemen!s necess(ri!s
#ara a ex#ress+! d! )ene cl!nad! em c.l%las e%cari'icas.
.1.2. N#!#$ $i$"e(a$ )ara a %e"e&*+# %e re&e)"#re$ #u )r#"e.'a$ liga'"e$
A ideni$ica&+! de m!l.c%las 3%e inera)em c!m %ma dada #r!e9na8 is! . #e#9de!s li)anes8 #r!e9nas li)anes !%
rece#!res8 . $%ndamenal #ara ! ma#eamen! da *ia de a&+! de %ma dada #r!e9na na c.l%la. O sisema c!n*enci!nal de
Pscreenin)P Fsele&+!G descri! acima #!de ser %ili"ad!. Mas8 n!*!s sisemas c!me&am a a#arecer c!m ! !2>ei*! de
seleci!nar li)anes !% anic!r#!s. Um deses . a cl!na)em d! DNA F2i2li!eca de cDNA c!m%m !% 2i2li!ecas
c!m2ina!riais de #e#9de!s sin.ic!sG em $%s+! c!m %ma #r!e9na 3%e $!rma a ca#a d! $a)! lam2da FFelici e al.8
,DD,G. Is! em #ermiid! is!lar li)anes de %ma 2i2li!eca c!m#lexa #!r #assa)em das #ar9c%las de $a)! s!2re
deerminad! li)ane es#ec9$ic! im!2ili"ad! em %ma mari". Uma e*!l%&+! dese sisema 3%e #arece ser #r!miss!ra . a
cl!na)em da 2i2li!eca de cDNA de ineresse em $%s+! c!m %ma #r!e9na da #arede 2aceriana8 de al maneira 3%e as
#r!e9nas ex#ressas $icar+! ex#!sas rec!2rind! a s%#er$9cie da 2ac.ria8 a 3%al #!der( en+! ser inc%2ada c!m %m
li)ane marcad! #!r $l%!resc:ncia 3%e marcar( a3%ela c.l%la 3%e ex#ressar ! rece#!r !% li)ane es#ec9$ic!. A c.l%la
marcada #!der(8 en+!8 ser seleci!nada Fis!ladaG #!r %m a#arel0! de sele&+! de c.l%las8 PFl%!rescen Assised Cell
S!rersP8 c!m%mene re$erid! c!m! FACS. Para a an(lise de mil0<es de 2ac.rias8 enrean!8 ser( necess(ri! !
desen*!n*imen! de FACS mais s!$isicad!s. A Fi)%ra KC exem#li$ica es3%emaicamene %ma #r!e9na Fanic!r#!8
nese cas!G ex#ressa na s%#er$9cie de %ma 2ac.ria FLile e al.8 ,DDCG. Ese sisema em sid! c!nsiderad! #r!miss!r
#ara a #r!d%&+! de *acinas !rais e Wis #ara dia)n'sic!.
K,
Figura 43. Es3%ema il%srand! a a#resena&+! na s%#er$9cie 2aceriana de %ma #r!e9na 0eer'l!)a ex#ressa em $%s+!
c!m %ma #r!e9na da #arede 2aceriana. Ese cas! dem!nsra a ex#ress+! d!s d!m9ni!s *ari(*eis de %m anic!r#!
%nid!s #!r %m #e#9de! Pc!nec!rP em $%s+! c!m a li#!#r!e9na ass!ciada a #e#9de!)lican! FPALG. F!i #r!>ead! #ara
#reser*ar a c!n$!rma&+! nai*a da re)i+! *ari(*el d! anic!r#! de maneira a maner s%as #r!#riedades li)anes inacas.
Al.m d!s exem#l!s ciad!s acima8 ! Psisema de d!is 092rid!sP FFields h S!n)8 ,DLDG8 #ara ex#ress+! em le*ed%ra8 em
sid! 2asane %ili"ad! #ara a deec&+! e ideni$ica&+! de #r!e9nas ca#a"es de inera)ir c!m %ma deerminada #r!e9na
FFi)%ra KKG. Nese sisema d!is #lasm9de!s s+! c!nsr%9d!s #ara #!seri!r c!;rans$ec&+! e ex#ress+! d!s 092rid!s. O
#rimeir! 092rid! FiscaG . a #r!e9na c!n0ecida FDG em $%s+! c!m ! d!m9ni! li)ane de DNA d! $a!r de ranscri&+!
/ALKU ! se)%nd! s+! )enes desc!n0ecid!s de %ma 2i2li!eca de %m deerminad! ecid! !% es#.cie F#r!e9na SG em
$%s+! c!m ! d!m9ni! da /ALK ai*ad!r da ranscri&+!. a %m #r!cess! en)en0!s!8 c%>a l')ica 2aseia;se n! $a! de 3%e a
/ALK8 c!m! a mai!ria d!s $a!res de ranscri&+!8 . %ma #r!e9na c!m d!is d!m9ni!s 2em de$inid!s F%m li)ane de
DNA e ! !%r! ai*ad!r da ma3%inaria de ranscri&+!G8 am2!s indis#ens(*eis #ara ! e$ei! $inal de ai*a&+! da
ranscri&+! de )enes si%ad!s s!2 se% c!nr!le Fc!nr!le d! #r!m!!r /ALG. ]%and! se ex#ressa eses d!m9ni!s
se#aradamene8 a #r!e9na ser( inai*a8 exce! se !s d!is #!li#e#9de!s se ass!ciarem de al maneira 3%e enc!nrar;se;+!
>%n!s na re)i+! #r!m!!ra #ara exercerem se% #a#el de ai*a&+! da ranscri&+!. ]%and! se ex#ressam eses 092rid!s em
%ma lin0a)em de le*ed%ra8 c%>! deerminad! )ene marcad!r de selec+! es( s!2 ! c!mand! de /ALK e8 c%li*am;se as
c.l%las na a%s:ncia de %m n%riene essencial sinei"ad! #el! )ene marcad!r8 a ai*a&+! dese )ene !rna;se essencial
#ara a s!2re*i*:ncia das c.l%las. Um )ene c!m%mene %ili"ad! c!m! marcad!r de sele&+! nese sisema . ! H%S&8 c%>!
#r!d%! . %ma en"ima da *ia de 2i!ss9nese de 0isidinaU nese cas!8 as c.l%las s+! ca#a"es de crescer em mei! c!m
0isidina8 mas s+! inca#a"es na s%a a%s:ncia8 a men!s 3%e a ranscri&+! d! )ene H%S& se>a ai*ada #el! $a!r /ALK
Hrec!nsi%9d!I Fai*!G. Is! si)ni$ica 3%e n! ineri!r das c.l%las 3%e s!2re*i*eram enc!nram;se d!is 092rid!s 3%e
$!rmam %m c!m#lex!U is! .8 a #r!e9na c!n0ecida D inera)e c!m %ma #r!e9na desc!n0ecida S8 a 3%al #!de ser en+!
ideni$icada #!r se3%enciamen! de se% cDNA e caraceri"ada. Merece desa3%e ! $a! de 3%e a inera&+! enre as
#r!e9nas D e S8 #!r ese #r!cess!8 !c!rre n! ineri!r de %ma c.l%la e%cari'ica *i*a8 send!8 #!r iss!8
#r!*a*elmene mais c!n$i(*el 3%e !%r!s m.!d!s %ili"ad!s #ara ! es%d! de inera&<es enre #r!e9nas.
K1
conec"or
ca'eia
#esa'a
ca'eia
leve
Por()o
vari*vel
'o
an"icor#o
mem+rana
e,"erna
PA-E.E
E%/%A-
mem+rana
e,"erna
ci"o#lasma
gene que
co'i0ica #ara
o an"icor#o
PA%
Figura 44. Esra.)ia #ara deecar #r!e9nas li)anes %ili"and! ! sisema de d!is 092rid!s.
.2. A u"iliFa*+# %a "e&'#l#gia %# DNA re&#(bi'a'"e '# &#'Je&i(e'"# %e re&e)"#re$ %e (e(bra'a
Para in$!rma&<es es#ec9$icas em cl!na)em de rece#!res de s%#er$9cie cel%lar8 incl%ind! a2!rda)ens 3%e *isam
desc!2rir !% #r!>ear n!*as dr!)as e$ei*as direci!nadas a esses rece#!res8 c!ns%le a re*is+! de L%Ten h LeTsen
F,DDCG. Eses a%!res en$ai"am 3%e a ex#ress+! 0eer'l!)a de rece#!res cl!nad!s #r!#!rci!na %ma $!ne rica8
re#r!d%9*el8 inexa%r9*el e 2araa de s%2i#!s de rece#!res 0%man!s. Esses rece#!res ex#ress!s #!dem ser %ili"ad!s
n! Hscreenin)I de dr!)as e am2.m #ara ! Hdesi)nI de n!*as dr!)as ara*.s de %m mel0!r enendimen! da rela&+!
esr%%ra;$%n&+!8 *is! 3%e a cl!na)em m!lec%lar desses rece#!res re*el!% %ma a2%nd?ncia de s%2i#!s8 2em c!m!
m!del!s esr%%rais d!s mesm!s FFi)%ra KEG. A)!ra8 %ma n!*a era #!de er l%)ar8 em 3%e as dr!)as c!me&am a ser
#r!>eadas e c!nsr%9das c!m 2ase na esr%%ra de se% al*! n! !r)anism! FB%)) e al.8 ,DDKG.
Exem#l!s da %ili"a&+! da ecn!l!)ia d! DNA rec!m2inane nese cas! incl%em a ex#ress+! 0eer'l!)a de rece#!res
ac!#lad!s a #r!e9na / n!s $%n)!s Saccharomyces cerevisae8 Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris8 *isand!
es%d!s esr%%rais e $%nci!nais. C.l%las de S! cerevisiae ex#ressand! ! rece#!r de s!ma!saina de ra! $!ram %sadas
c!m s%cess! n! Hscreenin)I de an(l!)!s de s!ma!saina e 2i2li!ecas c!m2ina!riais #ara ideni$icar a)!nisas e
ana)!nisas selei*!s #ara s%2i#!s c!m #!enes e$ei!s in vivo FM. M. Pa%sc08 ,DD6G.
KC
I
I
E
E
)a)
>A75 nativa
)b)
?brido com domnio ligante de DNA da >A75
)c)
?brido com domnio da >A75 ativador da transcri#&o
)d) $ntera#&o entre hbridos reconstituindo a atividade da >A75
>ene ?$04
>ene ?$04
>ene ?$04
>ene ?$04
transcri#&o
ranscri#&o
Figura 45. M!del!s esr%%rais de $am9lias de rece#!res de s%#er$9cie cel%lar. Os d!m9ni!s rans;mem2rana e al)%ns
d!m9ni!s $%nci!nais s+! re#resenad!s. O enr!lamen! da cadeia #r!eica . 0i#!.ic!8 #!is ! @nic! 3%e e*e s%a
esr%%ra deerminada #!r crisal!)ra$ia a. ! m!men! $!i ! d!m9ni! exracel%lar d! rece#!r de 0!rmAni! de
crescimen!.
.3. ED)re$$+# %e )r#"e.'a$ )ara i'"er!e'*+# "era)2u"i&a
P!dem!s di"er 3%e 0( d%as maneiras )erais de se $a"er era#:%ica #!r ex#ress+! de #r!e9nas-
aG a ex#ress+! 0eer'l!)a de %ma #r!e9na 0%mana em 2ac.ria !% c.l%la e%cari'ica #ara a #r!d%&+! em )rande escala8
#%ri$ica&+! e %ili"a&+! desa #ara in>e&+! em #acienes- ! exem#l! mais c!n0ecid! . #r!*a*elmene ! da ins%lina
FBris!f8 ,DDCG8 a 3%al $!i ! #rimeir! #r!d%! c!mercial !2id! #ela ecn!l!)ia d! DNA rec!m2inane e a#r!*ad! #ara
%s! em 0%man!s em ,DL1 #ela U.S.FDA FF!!d and Dr%) Adminisrai!nG. A Fi)%ra KN m!sra as esra.)ias
em#re)adas #ara a #r!d%&+! de ins%lina #ara $ins era#:%ic!sU a 2!*ina e a s%9na sem m!di$ica&<es 3%9micas s+! men!s
e$icienes. A ins%lina #r!d%"ida #ela ecn!l!)ia d! DNA rec!m2inane a#resena a *ana)em de eliminar a #!ssi2ilidade
de c!naminanes !% a)enes in$ecci!s!s 3%e #!dem esar #resenes nas #r!e9nas #%ri$icadas de animais. Uma das
mai!res ex#ecai*as nese cam#! . a #!ssi2ilidade de se !2er m%anes c!m ai*idade m%i! s%#eri!r a! da #r!e9na
nai*a e sem cer!s e$ei!s ad*ers!s. O%r!s exem#l!s de #r!d%!s !2id!s #ela ecn!l!)ia d! DNA rec!m2inane e
%ili"ad!s c!m $inalidade era#:%ica s+! ! anic!a)%lane TPA Fai*ad!r de #lasmin!):ni! i#! ecid%alG8 ! $a!r VIII
de c!a)%la&+! e a erir!#!ieina F0!rmAni! 3%e esim%la a #r!d%&+! de erir'ci!sG.
A deermina&+! e caraceri"a&+! re$inada da esr%%ra de #r!e9nas c!me&a a )an0ar mai!r im#ac! #ela #!ssi2ilidade de
ex#ress+!J#%ri$ica&+! de #r!e9na em lar)a escala e m%a)enisadas. Al.m de n!s #r!#!rci!nar a sais$a&+! de se
c!n0ecer %ma n!*a esr%%ra8 esse c!n0ecimen! n!s #ermie #r!>ear dr!)as e #ensar em !%ras esra.)ias era#:%icas8
KK
ais c!m!8 ex#ressar a#enas %m d!m9ni! ai*! da #r!e9na.
P!r exem#l!8 !s d!m9ni!s *ari(*eis de anic!r#!s #!dem ser ex#ress!s c!m! %ma @nica cadeia #!li#e#9dica ai*a.
P!de;se #ensar am2.m na ex#ress+! de rece#!res s!l@*eis F!% d!m9ni!s ai*!s desesG #ara %m dad! *9r%s8 n! senid!
de ini2ir a s%a inera&+! c!m ! rece#!r da c.l%laU %m exem#l! seria a ex#ress+! d! rece#!r CDK #ara ! *9r%s da AIDS.
Uma id.ia es#eac%lar 3%e c!me&a a emer)ir a #arir d! n!ss! c!n0ecimen! da esr%%ra aAmica e $%n&+! de $a!res de
ranscri&+!8 . a #!ssi2ilidade da s9nese de dr!)as 3%e ini2iriam !% ai*ariam es#eci$icamene %m dad! $a!r de
ranscri&+! FFi)%ra K6G.
Figura 46. Re#resena&+! es3%em(ica de esra.)ias %sadas #ara #r!d%"ir ins%lina #ara $ins era#:%ic!s.
Um !%r! exem#l! da #!encial a#lica&+! da ex#ress+! de #r!e9nas 0eer'l!)as em iner*en&+! era#:%ica seria a
#r!d%&+! de )randes 3%anidades de anic!r#!s em #lanas8 *isand! se% %s! em im%n!era#ia. As #lanas s+! ca#a"es de
sinei"ar e m!nar *ir%almene 3%al3%er i#! de m!l.c%la de anic!r#!8 desde $ra)men!s a. cadeias c!m#leas e
mesm! anic!r#!s m%lim.ric!s. Ma h Ben F,DDEG descre*eram a ex#ress+! e m!na)em em #lanas da m!l.c%la de
I)A8 3%e . a $!rma #red!minane de im%n!)l!2%lina em secre&<es de s%#er$9cies m%c!sas c!m! ! ra! )rasr!inesinal.
A. en+! a #r!d%&+! de I)A em sisemas 0eer'l!)!s in0a sid! $r%sane de*id! a c!m#lexidade desa m!l.c%la.
Anic!r#!s #r!d%"id!s em #lanas #!dem *ir a ser #aric%larmene @eis #ara im%n!era#ia '#ica. N! cas!8 #!r
exem#l!8 de c(ries8 Ma e al. F,DD7G m!sraram 3%e a a#lica&+! '#ica de anic!r#!s m!n!cl!nais c!nra %ma #r!e9na
da s%#er$9cie Fde ades+!G d! Streptococcus mutans em denes 0%man!s c!n$eri% #r!e&+! a l!n)! #ra"! c!nra esse
micr!r)anism! em ad%l!s.
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E.coli E.coli E.coli
leve'ura
ca'eia A ca'eia 1 Pr2-insulina
3umana
Precurssor
'e insulina
&nsulina 4umana
5cr+6
&nsulina 4umana
5em#6
&nsulina su7na
&nsulina suina
#8ncreas
su7no
&nsulina +ovina
#8ncreas
+ovino
&nsulina 4umana
5#r+6
&nsulina 4umana
5#r!6
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Figura 4. M!del!s 0i#!.ic!s da a&+! de dr!)as 3%e #!deriam ser e$ei*as em era#:%ica a%and! s!2re %m $a!r de
ranscri&+!.
2G a era#ia ):nica #!r rans$ec&+! de c.l%las reiradas d! #r'#ri! #aciene c!m rer!*9r%s8 !% !%r!s i#!s de *9r%s8 c!m
! in%i! de re#!r %m )ene m%ane !% #ara ! raamen! de d!en&as m%li;$a!riais c!m! c?ncer e d!en&as card9acas. A
#rimeira era#ia ):nica reali"ada #ara s%2si%ir %m )ene m%ane @nic!8 iniciada em ,DD78 $!i a era#ia #ara a
de$ici:ncia da aden!sina desaminase FADAG8 a 3%al c!nsise em im#lanar lin$'ci!s T rans$ecad!s c!m rer!*9r%s
ex#ressand! a #r!e9na a%sene n!s #!rad!res desa d!en&a. Esa em sid! c!nsiderada ! #r!'i#! das era#ias ):nicas
e em sid! 2em s%cedida F*er ! ari)! de F. gas!n8 ,DDCG.
6III. A'Kli$e %e ED)re$$+# A"ra!E$ %e Mi&r#arra'T#$ %e %'a
C!m! *im!s a. a)!ra8 a ecn!l!)ia d! DNA rec!m2inane *em #ermiind! )randes a*an&!s na ideni$ica&+! e
caraceri"a&+! de )enes es#ec9$ic!s. C!m rela&+! a!s es%d!s de ex#ress+! ):nica8 a2!rda)ens am#lamene %ili"adas8
c!m! N!r0ern 2l! e RT;PCR8 s+! 2asane sens9*eis e #recisas8 #!r.m #ermiem ! es%d! de %m !% #!%c!s )enes de
cada *e". Os Pr!>e!s /en!ma8 al.m de erem )erad! in$!rma&+! s!2re as se3%:ncias d!s )en!mas de di*ers!s
!r)anism!s8 im#%lsi!naram %m )rande desen*!l*imen! ecn!l')ic! 3%e res%l!% n! a#arecimen! de n!*as
me!d!l!)ias de an(lises )en.icas. Uma dessas n!*as me!d!l!)ias8 !s micr!arran>!s de cDNA8 #ermie n+! s' a
an(lise de ex#ress+! de )enes es#ec9$ic!s mas de #adr<es de ex#ress+! caracer9sic!s de cer!s i#!s cel%lares8 es()i!s
de desen*!l*imen!8 c!ndi&<es #a!l')icas e m%i! mais. C!m a %ili"a&+! dessa n!*a me!d!l!)ia . #!ran! #!ss9*el
analisar a ex#ress+! de mil0ares de )enes sim%laneamene8 deerminand!;se 3%ais deles s+! ex#ress!s em i#!s
cel%lares es#ec9$ic!s8 em m!men!s e c!ndi&<es #aric%lares8 sem#re ara*.s da c!m#ara&+! de d%as si%a&<es
di$erenes.
C!m! n! cas! d! N!r0ern 2l!8 a me!d!l!)ia de micr!arran>!s 2aseia;se na #r!#riedade de 0i2rida&+! d!s (cid!s
n%cl.ic!s. Mas a! c!nr(ri! d! N!r0ern8 !nde ! RNA !al de deerminadas c.l%las !% ecid!s es( im!2ili"ad! em %ma
mem2rana de nTl!n e ! $ra)men! c!rres#!ndene a! )ene de ineresse . marcad! #ara a 0i2rida&+!U n! micr!arran>!8 !s
mil0ares de $ra)men!s de DNA 3%e re#resenam )enes es#ec9$ic!s es+! im!2ili"ad!s n%m s%#!re s'lid!8 3%e #!de ser
%ma mem2rana de nTl!n8 !% %ma l?mina de *idr! e ! RNA !al . 3%e . marcad! anes de 0i2ridar c!m !s $ra)men!s
):nic!s im!2ili"ad!s.
KN
Domnio de ativa#&o
Domnio
de
dimeriza#&o
Domnio de
liga#&o ao
DNA
DNA
Droga inibe
domnio de
ativa#&o
Droga inibe
domnio de
dimeriza#&o
Droga inibe
domnio de
liga#&o ao
DNA
A me!d!l!)ia 3%e %sa a l?mina de *idr! c!m! s%#!re . a 3%e #ermie a an(lise de mai!r n@mer! de )enes. Na $i)%ra
KL #!dem!s *er %m es3%ema re#resenand! !s #rinci#ais #ass!s de %m ex#erimen! c!m micr!arran>!s de DNA.
Figura 4/. Es3%ema da #re#ara&+! e an(lise de micr!arran>!s de DNA.
Primeiramene8 !s $ra)men!s re#resenand! )enes es#ec9$ic!s Fderi*ad!s8 #!r exem#l!8 de %ma 2i2li!eca de cl!nes de
cDNAG s+! am#li$icad!s #!r PCR e a#licad!s s!2re a l?mina #!r %m r!2A 3%e a%!maicamene $ixa B lamina !s
$ra)men!s de DNA em min@sc%l!s c9rc%l!s c!m di?mer! da !rdem de 78, mm !% men!s8 $!rmand! !s spots. Cada
spot na l?mina c!n.m mil0ares de c'#ias d! $ra)men! de DNA 3%e re#resena %m deerminad! )ene e s%a #!si&+!
exaa $ica re)israda. En+!8 ! RNA !al de c.l%las em d%as di$erenes c!ndi&<es . is!lad! e marcad! c!m d!is
$l%!r!cr!m!s Fc!rane $l%!resceneG disin!s. A marca&+! d! RNA )eralmene !c!rre ara*.s da s9nese de cDNA
%ili"and! a ranscri#ase re*ersa8 !nde %m d!s n%cle!9de!s $!rnecid!s es( c!n>%)ad! c!m ! c!rane $l%!rescene. Para
! RNA exra9d! de c.l%las na c!ndi&+! ,8 a s9nese de cDNA . $eia $!rnecend!;se %m d!s n%cle!9de!s marcad! c!m
%m $l%!r!cr!m! *ermel0! e #ara ! RNA exra9d! de c.l%las na c!ndi&+! 18 a ranscri&+! re*ersa . $eia na #resen&a de
%m n%cle!9de! marcad! c!m %m $l%!r!cr!m! *erde. Os d!is cDNAs marcad!s s+! mis%rad!s e inc%2ad!s s!2re a
l?mina c!nend! ! micr!arran>!8 #ara 3%e #!ssa !c!rrer a 0i2rida&+! enre ! cDNA marcad! e !s $ra)men!s de )enes
na l?mina. Os spots c!rres#!ndenes a3%eles )enes 3%e $!rem ex#ress!s na c!ndi&+! ,8 $icar+! marcad!s de *ermel0!8
#!is 0a*ia RNA c!rres#!nde a ele na am!sra da c!ndi&+! , 3%e $!i c!n*erid! em cDNA marcad! c!m ! $l%!r!cr!m!
*ermel0!. A3%eles 3%e $!rem ex#ress!s na c!ndi&+! 1 $icar+! marcad!s de *erde. Os )enes 3%e $!rem ex#ress!s em
3%anidades e3%i*alenes nas d%as c!ndi&<es $icar+! amarel!s8 dada a s!2re#!si&+! de marca&+! c!m !s cDNAs de
am2as as si%a&<es. Eses res%lad!s s+! !2id!s ara*.s da %ili"a&+! de #r!)ramas de c!m#%ad!r 3%e analisam a
ima)em d! micr!arran>! 0i2ridi"ad! e 3%ani$icam a inensidade d! sinal de cada spot.
Ese i#! de a2!rda)em es( send! am#lamene %ili"ad! #ara ! m!ni!ramen! de #adr<es de ex#ress+! ):nica
caracer9sic!s de di$erenes si%a&<es8 c!m! #!r exem#l!8 le*ed%ras crescend! na #resen&a de )lic!se versus le*ed%ras
crescend! na #resen&a de (lc!!l !% c.l%las de di$erenes i#!s de c?ncer em rela&+! a c.l%las n!rmais. Is! . #!ss9*el
de*id! a dis#!ni2ili"a&+! da se3=:ncia )enAmica d!s !r)anism!s8 n! cas! da le*ed%ra #!r exem#l!8 $!ram analisad!s
micr!arran>!s de DNA c!nend! cerca de N777 cl!nes ! 3%e re#resena #raicamene !d!s !s )enes desse !r)anism!.
Nesses ex#erimen!s !2ser*!%;se 3%e 3%and! as le*ed%ras #assam de %ma c!ndi&+! de $ermena&+! de )lic! se #ara
crescimen! em mei! c!m ean!l8 se% #adr+! de ai*idade ):nica se alera *isi*elmene8 send! 3%e cerca de D77 )enes
s+! ranscri!s mais ai*amene e !%r!s ,177 :m s%a ai*idade dimin%9da.
Os res%lad!s de ex#erimen!s c!m micr!arran>!s de DNA n!rmalmene re*elam %m )rande n@mer! de )enes 3%e em
s%a ex#ress+! alerada 3%and! se m%da de %ma c!ndi&+! #ara !%ra. M%i!s deles s+! n!rmalmene )enes de $%n&+!
desc!n0ecida e a an(lise d! micr!arran>! #!de re*elar %m )r%#! de )enes c!m !s 3%ais eles se relaci!nam ara*.s d!
#adr+! de ex#ress+!8 ! 3%e #!de a>%dar 2asane na #redi&+! da #!ss9*el $%n&+! desses )enes. Esa an(lise . $eia
%sand!;se %ma .cnica c0amada de clustering8 ara*.s da 3%al )r%#!s de )enes 3%e :m ex#ress+! re)%lada de maneira
c!!rdenada #!dem ser ideni$icad!s. Os res%lad!s dessa an(lise s+! !r)ani"ad!s e m!srad!s em ima)ens criadas #!r
K6
#r!)ramas de an(lise 3%e #ermiem a $(cil *is%ali"a&+! desses )r%#!s e $!rnecem am2.m a in$!rma&+! s!2re ! n9*el de
ex#ress+! d!s mesm!s em cada %ma das si%a&<es. /enes 3%e s+! ai*ad!s !% re#rimid!s sim%laneamene n%ma dada
circ%ns?ncia #!dem c!m#aril0ar $%n&<es8 $a"end! #are de %ma mesma ma3%inaria m%li;#r!.ica !% a%and! em
#r!cess!s cel%lares c!m%ns. Esa .8 #!ran!8 %ma a2!rda)em de )rande %ilidade #ara ! a%al m!men! da ci:ncia8 a
$ase #'s;)enAmica !% d! )en!ma $%nci!nal.
I[. REFERiNCIAS BIBLIO/R5FICAS
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KD