P r o c . N a t i . A c a d . S c i .

US A
V o l . 8 5 , p p . 9 1 3 8 - 9 1 4 2 , D e c e m b e r 1 9 8 8
G e n e t i c s
F l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n w i t h h u m a n c h r o m o s o m e - s p e c i f i c
l i b r a r i e s : D e t e c t i o n o f t r i s o m y 2 1 a n d t r a n s l o c a t i o n s o f
c h r o m o s o m e 4
( t u m o r c y t o g e n e t i c s / p r e n a t a l d i a g n o s i s / a n e u p l o i d y / i n t e r p h a s e )
D . P I N K E L * , J . L A N D E G E N Tt , C . C O L L I N S , J . F US C O E t , R . S E G R A V E S , J . L UC A S , A N D J . G R A Y
B i o m e d i c a l S c i e n c e s D i v i s i o n , L a w r e n c e L i v e r m o r e N a t i o n a l L a b o r a t o r y , L i v e r m o r e , C A 9 4 5 5 0
C o m m u n i c a t e d b y R o b e r t T. S c h i m k e , J u l y 2 5 , 1 9 8 8
A B S TR A C T C h r o m o s o m e s c a n b e s p e c i f i c a l l y s t a i n e d i n
m e t a p h a s e s p r e a d s a n d i n t e r p h a s e n u c l e i b y i n s i t u h y b r i d i z a -
t i o n w i t h e n t i r e c h r o m o s o m e - s p e c i f i c D N A l i b r a r i e s . Un l a b e l e d
h u m a n g e n o m i c D N A i s u s e d t o i n h i b i t t h e h y b r i d i z a t i o n o f
s e q u e n c e s i n t h e l i b r a r y t h a t b i n d t o m u l t i p l e c h r o m o s o m e s .
Th e t a r g e t c h r o m o s o m e c a n b e m a d e a t l e a s t 2 0 t i m e s b r i g h t e r
p e r u n i t l e n g t h t h a n t h e o t h e r s . Tr i s o m y 2 1 a n d t r a n s l o c a t i o n s
i n v o l v i n g c h r o m o s o m e 4 c a n b e d e t e c t e d i n m e t a p h a s e s p r e a d s
a n d i n t e r p h a s e n u c l e i b y u s i n g t h i s t e c h n i q u e .
Th e a p p l i c a t i o n o f n o n r a d i o a c t i v e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n w i t h
c h r o m o s o m e - s p e c i f i c p r o b e s f o r c y t o g e n e t i c a n a l y s i s h a s
i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y i n r e c e n t y e a r s . Th i s h a s b e e n d u e t o
t h e t e c h n i c a l c o n v e n i e n c e o f t h e s e p r o c e d u r e s ( 1 - 3 ) a n d t o
t h e i n c r e a s e d a v a i l a b i l i t y o f r e p e t i t i v e p r o b e s t h a t h y b r i d i z e
i n t e n s e l y a n d s p e c i f i c a l l y t o s e l e c t e d c h r o m o s o m e s . S u c h
p r o b e s a r e n o w a v a i l a b l e f o r o v e r h a l f o f t h e h u m a n c h r o -
m o s o m e s . I n g e n e r a l , t h e s e b i n d t o r e p e a t e d s e q u e n c e s o n
c o m p a c t r e g i o n s o f t h e t a r g e t c h r o m o s o m e n e a r t h e c e n t r o -
m e r e . H o w e v e r , o n e p r o b e h a s b e e n r e p o r t e d t h a t h y b r i d i z e s
t o h u m a n c h r o m o s o m e 1 p 3 6 , a n d t h e r e a r e s e v e r a l p r o b e s
t h a t h y b r i d i z e t o h u m a n c h r o m o s o m e Yq ( r e f . 4 a n d c i t a t i o n s
t h e r e i n ) . H y b r i d i z a t i o n w i t h t h e s e p r o b e s p e r m i t s r a p i d
i d e n t i f i c a t i o n o f c h r o m o s o m e s i n m e t a p h a s e s p r e a d s , d e t e r -
m i n a t i o n o f t h e n u m b e r o f c o p i e s o f s e l e c t e d c h r o m o s o m e s i n
i n t e r p h a s e n u c l e i ( 5 - 7 ) , a n d d e t e r m i n a t i o n o f t h e r e l a t i v e
p o s i t i o n s o f c h r o m o s o m e s i n i n t e r p h a s e n u c l e i ( 4 - 6 , 8 - 1 1 ) .
I n t e r p h a s e a n a l y s i s i s e s p e c i a l l y p r o m i s i n g i n c l i n i c a l a p p l i -
c a t i o n s w h e r e r a p i d r e s u l t s a r e d e s i r a b l e ( e . g . , i n p r e n a t a l
d i a g n o s i s ) , w h e r e c e l l s a r e d i f f i c u l t t o c u l t u r e i n v i t r o , o r
w h e r e c o n c e r n e x i s t s a b o u t t h e a b i l i t y t o s t i m u l a t e a r e p r e -
s e n t a t i v e f r a c t i o n o f c e l l s i n t o p r o l i f e r a t i o n f o r m e t a p h a s e
a n a l y s i s ( e . g . , i n t u m o r s t u d i e s ) . H o w e v e r , m a n y a p p l i c a t i o n s
a r e s t i l l l i m i t e d b y t h e l a c k o f a p p r o p r i a t e p r o b e s . F o r e x -
a m p l e , p r o b e s w i t h s u f f i c i e n t s p e c i f i c i t y f o r p r e n a t a l d i a g n o s i s
a r e n o t a v a i l a b l e f o r c h r o m o s o m e 1 3 o r 2 1 . I n a d d i t i o n ,
r e p e t i t i v e p r o b e s a r e n o t v e r y u s e f u l f o r d e t e c t i o n o f s t r u c t u r a l
a b e r r a t i o n s s i n c e t h e p r o b a b i l i t y i s l o w t h a t t h e a b e r r a t i o n s
w i l l i n v o l v e t h e r e g i o n t o w h i c h t h e p r o b e h y b r i d i z e s .
Th e d e v e l o p m e n t o f p r o c e d u r e s t o c o n s t r u c t h i g h i n t e n s i t y
p r o b e s o f a n y d e s i r e d s p e c i f i c i t y w o u l d a d v a n c e a b r o a d
s p e c t r u m o f c y t o g e n e t i c s t u d i e s . O n e a p p r o a c h i s t o u s e
c o m p o s i t e p r o b e s m a d e f r o m n u m e r o u s s e q u e n c e s c l o n e d
f r o m t h e d e s i r e d t a r g e t r e g i o n . R e c o m b i n a n t D N A l i b r a r i e s
f o r e a c h o f t h e h u m a n c h r o m o s o m e s , a v a i l a b l e f r o m t h e
A m e r i c a n Ty p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , h a v e b e e n c o n s t r u c t e d b y
t h e N a t i o n a l L a b o r a t o r y G e n e L i b r a r y P r o j e c t ( 1 2 ) . Th e s e
c a n b e u s e d a s s t a r t i n g m a t e r i a l f o r c h r o m o s o m e - s p e c i f i c
c o m p o s i t e p r o b e s . Th e p r i n c i p a l d i f f i c u l t y o f u s i n g s u c h
l i b r a r i e s i s t h a t t h e y c o n t a i n c h r o m o s o m e - s p e c i f i c s e q u e n c e s
a n d s e q u e n c e s s h a r e d w i t h o t h e r c h r o m o s o m e s . Th e r e f o r e ,
t h e c h r o m o s o m e - s p e c i f i c s e q u e n c e s m u s t b e s e l e c t e d o r
h y b r i d i z a t i o n o f t h e n o n s p e c i f i c s e q u e n c e s m u s t b e b l o c k e d
( 1 3 ) . We r e p o r t h e r e t h a t c o m p e t i t i v e h y b r i d i z a t i o n u s i n g
e n t i r e c h r o m o s o m e - s p e c i f i c l i b r a r i e s f o r c h r o m o s o m e s 4 a n d
2 1 a s p r o b e s a n d h u m a n g e n o m i c D N A a s t h e c o m p e t i t o r
a l l o w s i n t e n s e a n d s p e c i f i c f l u o r e s c e n t s t a i n i n g o f h u m a n
c h r o m o s o m e s 4 a n d 2 1 i n m e t a p h a s e s p r e a d s a n d i n t e r p h a s e
n u c l e i . We c a l l t h i s g e n e r a l a p p r o a c h " c h r o m o s o m e p a i n t -
i n g . " Tr a n s l o c a t i o n s a n d a n e u p l o i d y i n v o l v i n g t h e s e c h r o -
m o s o m e s c a n b e s t r i k i n g l y v i s u a l i z e d . We a l s o p r e s e n t d a t a
o n h y b r i d i z a t i o n w i t h c o l l e c t i o n s o f u n i q u e s e q u e n c e p r o b e s
o n c h r o m o s o m e 4 .
MA TE R I A L S A N D ME TH O D S
C e l l s . Me t a p h a s e s p r e a d s f r o m h u m a n l y m p h o c y t e s w e r e
p r e p a r e d f r o m m e t h o t r e x a t e - s y n c h r o n i z e d c u l t u r e s b y u s i n g
t h e p r o c e d u r e o f H a r p e r e t a l . ( 1 4 ) . Th e s e a n d a l l o t h e r c e l l s
w e r e f i x e d i n m e t h a n o l / a c e t i c a c i d , 3 : 1 . O t h e r h u m a n l y m -
p h o c y t e c u l t u r e s w e r e i r r a d i a t e d w i t h 6 C o y - r a y s a n d s t i m -
u l a t e d w i t h p h y t o h e m a g g l u t i n i n . C o l c e m i d w a s a d d e d 4 8 h r
a f t e r s t i m u l a t i o n a n d m e t a p h a s e s p r e a d s w e r e p r e p a r e d 4 h r
l a t e r . Me t a p h a s e s p r e a d s a n d i n t e r p h a s e c e l l s f r o m l y m p h o -
b l a s t o i d c e l l s ( G M0 3 7 1 6 A ; H u m a n Mu t a n t C e l l R e p o s i t o r y ,
C a m d e n , N J ) c a r r y i n g t r i s o m y 2 1 w e r e p r e p a r e d a f t e r a 4 - h r
c o l c e m i d b l o c k . I n t e r p h a s e c e l l s f r o m t h e c e l l l i n e R S 4 ; 1 1
c a r r y i n g t ( 4 ; 1 1 ) a n d i s o c h r o m o s o m e 7 q w e r e h a r v e s t e d , f i x e d
i n m e t h a n o l / a c e t i c a c i d , a n d d r o p p e d o n t o s l i d e s ( 1 5 ) . S l i d e s
w e r e s t o r e d a t - 2 0 C i n p l a s t i c b a g s f i l l e d w i t h n i t r o g e n g a s .
P r o b e s . H u m a n c h r o m o s o m e - s p e c i f i c l i b r a r i e s p r o d u c e d
b y t h e N a t i o n a l L a b o r a t o r y G e n e L i b r a r y P r o j e c t ( 1 2 ) w e r e
t h e s o u r c e o f a l l p r o b e s .
C h r o m o s o m e 4 u n i q u e s e q u e n c e s . O n e h u n d r e d a n d
t w e n t y c l o n e s c a r r y i n g c h r o m o s o m e 4 - s p e c i f i c u n i q u e s e -
q u e n c e i n s e r t s s e l e c t e d f r o m t h e C h a r o n 2 1 A l i b r a r y
L L 0 4 N S 0 1 w e r e s u p p l i e d b y C . G i l l i a m ( H a r v a r d Un i v e r s i t y )
( 1 6 ) . Th e h u m a n i n s e r t s w e r e a l l =3 k i l o b a s e s ( k b ) i n l e n g t h ,
s o t h e r a t i o o f i n s e r t t o v e c t o r D N A w a s < 0 . 1 . To t a l p h a g e
D N A w a s p r o d u c e d f r o m e a c h c l o n e i n d i v i d u a l l y u s i n g
D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n s ( Wh a t m a n D E - 5 2 ) ( 1 7 ) . D N A
p o o l e d f r o m 3 o r a l l 1 2 0 c l o n e s w a s b i o t i n y l a t e d b y n i c k -
t r a n s l a t i o n w i t h b i o t i n - 1 1 - d UTP ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o -
r a t o r i e s ) a n d r e c o v e r e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f ==2 0 n g / , u l u s i n g
S e p h a d e x G - 5 0 s p i n c o l u m n s .
p B S - 4 . Th e e n t i r e c h r o m o s o m e 4 l i b r a r y L L 0 4 N S 0 2 w a s
s u b c l o n e d i n t o B l u e s c r i b e p l a s m i d s ( S t r a t a g e n e , L a J o l l a ,
C A ) t o f o r m t h e l i b r a r y p B S - 4 . Th e a v e r a g e i n s e r t t o v e c t o r
* To w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .
t P e r m a n e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f E x p e r i m e n t a l H e m a t o l o g y ,
L e i d e n Un i v e r s i t y Me d i c a l C e n t e r , P . O . B o x 9 6 0 0 , L e i d e n , Th e
N e t h e r l a n d s .
t P r e s e n t a d d r e s s : C e n t e r f o r E n v i r o n m e n t a l H e a l t h , U- 3 9 , Un i v e r -
s i t y o f C o n n e c t i c u t , S t o r r s , C T 0 2 6 2 8 .
9 1 3 8
Th e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g e
p a y m e n t . Th i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "
i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U. S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 5 ( 1 9 8 8 ) 9 1 3 9
D N A r a t i o i n p B S - 4 i s =1 . Th e p l a s m i d l i b r a r y w a s a m p l i f i e d
i n b u l k a n d t h e D N A w a s e x t r a c t e d a n d b i o t i n y l a t e d a s
d e s c r i b e d a b o v e . I n s o m e e x p e r i m e n t s , t h e b i o t i n y l a t e d D N A
w a s c o n c e n t r a t e d b y e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n t o a c h i e v e h i g h e r
p r o b e c o n c e n t r a t i o n s .
p B S - 2 1 . Th e e n t i r e c h r o m o s o m e 2 1 l i b r a r y L L 2 1 N S 0 2 w a s
s u b c l o n e d i n t o B l u e s c r i b e p l a s m i d s t o f o r m t h e l i b r a r y
p B S - 2 1 . Th i s l i b r a r y w a s a m p l i f i e d a n d b i o t i n y l a t e d a s d e -
s c r i b e d a b o v e .
H u m a n g e n o m i c D N A . P l a c e n t a l D N A ( S i g m a ) w a s
t r e a t e d w i t h p r o t e i n a s e K , e x t r a c t e d w i t h p h e n o l , a n d s o n i -
c a t e d t o a s i z e r a n g e o f 2 0 0 - 6 0 0 b a s e p a i r s ( b p ) .
I n S i t u H y b r i d i z a t i o n . Un i q u e s e q u e n c e h y b r i d i z a t i o n .
H y b r i d i z a t i o n w a s a c c o m p l i s h e d b y u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f
t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y P i n k e l e t a l . ( 5 ) . Th e s l i d e -
m o u n t e d c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h R N a s e ( 1 0 0 , u g / m l i n 0 . 3 M
N a C l / 3 0 m M s o d i u m c i t r a t e a t 3 7 TC f o r 1 h r ) , d e h y d r a t e d i n
a 7 0 % / 8 5 % / 1 0 0 % e t h a n o l s e r i e s , t r e a t e d w i t h p r o t e i n a s e K
( 0 . 3 - 0 . 6
g g / m l
i n 2 0 m M Tr i s / 2 m M C a C l 2 , p H 7 . 5 , f o r 7 . 5
m i n a t 3 7 0 C ) , a n d f i x e d [ 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e i n p h o s p h a t e -
b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ; i n g / l i t e r , K C I , 0 . 2 ; K H 2 P O 4 , 0 . 2 ;
N a C l , 8 ; N a 2 H P O 4 7 H 2 O , 2 . 1 6 ) p l u s 5 0 m M Mg C l 2 f o r 1 0 m i n
a t r o o m t e m p e r a t u r e ] . Th e D N A i n t h e t a r g e t c e l l s w a s
d e n a t u r e d b y i m m e r s i o n i n 7 0 % o f o r m a m i d e / 0 . 3 M N a C l / 3 0
m M s o d i u m c i t r a t e , p H 7 , f o r 2 m i n a t 7 0 C . Th e h y b r i d i z a t i o n
m i x t u r e [ 1 0 , l t o t a l v o l u m e c o n s i s t i n g o f 5 0 % o f o r m a m i d e , 0 . 3
M N a C l / 3 0 m M s o d i u m c i t r a t e ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) , 1 0 %
d e x t r a n s u l f a t e , 5 0 , g o f s o n i c a t e d h e r r i n g D N A p e r m l , a n d
3 - 6 n g o f b i o t i n y l a t e d c h r o m o s o m e 4 u n i q u e s e q u e n c e s ( 4 0 -
8 0 n g o f t o t a l p h a g e D N A ) ] w a s t h e n d e n a t u r e d ( 7 0 C f o r 5
m i n ) a n d a p p l i e d . H y b r i d i z a t i o n w a s a t 3 7 C o v e r n i g h t ( 1 6
h r ) . S l i d e s w e r e w a s h e d i n t h r e e c h a n g e s o f 5 0 o f o r m a m i d e /
0 . 3 M N a C l / 3 0 m M s o d i u m c i t r a t e ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) , p H
7 , a t 4 5 C f o r 5 m i n e a c h a n d o n c e i n P N b u f f e r ( a m i x t u r e o f
0 . 1 M N a H 2 P O 4 a n d 0 . 1 M N a 2 H P O 4 t o g i v e p H 8 / 0 . 1 %
N o n i d e t P - 4 0 ) . Th e s l i d e s w e r e t h e n t r e a t e d w i t h a l t e r n a t i n g
l a y e r s o f f l u o r e s c e i n a t e d a v i d i n a n d b i o t i n y l a t e d g o a t a n t i -
a v i d i n , b o t h a t 5 , g / m l i n P N M b u f f e r ( P N b u f f e r / 5 % n o n - f a t
d r y m i l k / 0 . 0 2 % s o d i u m a z i d e , c e n t r i f u g e d t o r e m o v e s o l i d s ) ,
f o r 2 0 m i n e a c h a t r o o m t e m p e r a t u r e u n t i l t h r e e l a y e r s o f
a v i d i n w e r e a p p l i e d . Th e a v i d i n a n d g o a t a n t i - a v i d i n t r e a t -
m e n t s w e r e s e p a r a t e d b y t h r e e w a s h e s o f 3 m i n e a c h i n P N
b u f f e r [ a v i d i n ( D C S g r a d e ) a n d a n t i - a v i d i n f r o m V e c t o r
L a b o r a t o r i e s ( B u r l i n g a m e , C A ) ] . A f t e r t h e f i n a l a v i d i n t r e a t -
m e n t , a f l u o r e s c e n c e a n t i f a d e s o l u t i o n ( 1 8 ) c o n t a i n i n g 1 , u g o f
4 ' , 6 - a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e o r p r o p i d i u m i o d i d e p e r m l w a s
a p p l i e d t o s t a i n d o u b l e - s t r a n d e d D N A ( 1 . 5 / l / c m 2 u n d e r a
n o . 1 c o v e r s l i p ) .
Wh o l e L i b r a r y H y b r i d i z a t i o n . H y b r i d i z a t i o n w a s a s a b o v e
e x c e p t t h a t R N a s e , p r o t e i n a s e K , a n d p a r a f o r m a l d e h y d e
w e r e n o t u s e d . Th e a m o u n t o f p r o b e a n d g e n o m i c D N A i n t h e
h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e a n d t h e l e n g t h o f t h e h y b r i d i z a t i o n
v a r i e d a s d e s c r i b e d i n R e s u l t s . A l l p r o b e c o n c e n t r a t i o n s r e f e r
t o t h e h u m a n i n s e r t D N A u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d . D N A
c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y f l u o r o m e t r i c a n a l y s i s
( H o e f f e r S c i e n t i f i c I n s t r u m e n t s , S a n F r a n c i s c o ) . I n c u b a t i o n
o f h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e p r i o r t o h y b r i d i z a t i o n f o l l o w e d t w o
d i f f e r e n t p r o t o c o l s . P r o t o c o l I . Th e h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e ( 1 0
, u l ) c o n t a i n e d 1 0 - 1 5 0 n g o f b i o t i n y l a t e d h u m a n D N A ( 2 0 - 3 0 0
n g o f t o t a l p l a s m i d D N A ) a n d 0 - 1 0 , g o f u n l a b e l e d g e n o m i c
D N A . Th e m i x t u r e w a s h e a t e d t o d e n a t u r e t h e D N A a n d
i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r a t i m e t b e f o r e i t w a s a d d e d t o t h e s l i d e .
H y b r i d i z a t i o n t i m e s r a n g e d f r o m 2 t o 1 1 0 h r . P r o t o c o l I I . Th i s
w a s i d e n t i c a l t o p r o t o c o l I e x c e p t t h a t a n a d d i t i o n a l a l i q u o t o f
f r e s h l y d e n a t u r e d g e n o m i c D N A w a s a d d e d t o t h e h y b r i d -
i z a t i o n m i x t u r e a f t e r a n i n c u b a t i o n t i m e t . Th e m i x t u r e w a s
t h e n i n c u b a t e d a n a d d i t i o n a l t i m e t p r i o r t o s t a r t i n g t h e
h y b r i d i z a t i o n . Th e v o l u m e o f t h e h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e w a s
i n c r e a s e d < 2 0 % o b y t h e a d d i t i o n a l g e n o m i c D N A .
Mi c r o s c o p y . Q u a n t i t a t i v e f l u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s
w e r e p e r f o r m e d u s i n g a v i d e o c a m e r a o n t h e m i c r o s c o p e a n d
a d i g i t a l i m a g e p r o c e s s i n g s y s t e m ( 4 ) . Th e c o m b i n a t i o n o f r e d
p r o p i d i u m i o d i d e a n d g r e e n - y e l l o w f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a -
n a t e f l u o r e s c e n c e a p p e a r s a s y e l l o w i n t h e p h o t o g r a p h s .
R E S UL TS
Wh o l e L i b r a r y H y b r i d i z a t i o n . F i g . l a s h o w s h y b r i d i z a t i o n
o f p B S - 4 t o a h u m a n m e t a p h a s e s p r e a d w i t h a p r o b e c o n -
c e n t r a t i o n o f 1 n g / , u l . N o g e n o m i c D N A w a s u s e d a n d t h e
h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e w a s a p p l i e d i m m e d i a t e l y a f t e r d e n a -
t u r a t i o n . A l l c h r o m o s o m e s a r e s t a i n e d , e x c e p t n e a r m a n y
c e n t r o m e r e s , w i t h t h e t w o c o p i e s o f c h r o m o s o m e 4 b e i n g
s t a i n e d m o s t h e a v i l y . Th e i n c l u s i o n o f u n l a b e l e d t o t a l h u m a n
D N A i n t h e h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e s u b s t a n t i a l l y i n c r e a s e d t h e
s p e c i f i c i t y o f h y b r i d i z a t i o n t o c h r o m o s o m e 4 . F i g . 1 b a n d c
s h o w t h e r e s u l t o f a p r o t o c o l I h y b r i d i z a t i o n [ 0 . 8 n g o f p r o b e
p e r / t l a n d 2 4 n g o f g e n o m i c D N A p e r d u l ( Q = 2 , s e e
D i s c u s s i o n ) ; 1 - h r p r o b e i n c u b a t i o n a n d 1 1 0 - h r h y b r i d i z a t i o n ] .
Th i s p r o b e c o n c e n t r a t i o n c o r r e s p o n d s t o =0 . 5 x 1 0 - 2
p g / t k l
p e r k i l o b a s e o f u n i q u e s e q u e n c e , a s s u m i n g t h a t 3 0 % o f t h e
c h r o m o s o m a l D N A i s u n i q u e . Q u a n t i t a t i v e i m a g e a n a l y s i s
s h o w s t h a t t h e i n t e n s i t y p e r u n i t l e n g t h o f c h r o m o s o m e 4 i s
- 2 0 t i m e s t h a t o f t h e o t h e r c h r o m o s o m e s . Th i s i s r e f e r r e d t o
a s t h e c o n t r a s t r a t i o . Tw o l a y e r s o f a v i d i n - f l u o r e s c e i n i s o -
t h i o c y a n a t e h a v e b e e n u s e d h e r e t o m a k e t h e n o n - t a r g e t
c h r o m o s o m e s s u f f i c i e n t l y b r i g h t t o b e m e a s u r e d a c c u r a t e l y .
H o w e v e r , t h e n u m b e r 4 c h r o m o s o m e s c a n b e r e c o g n i z e d
e a s i l y a f t e r a s i n g l e l a y e r .
F i g . l d d e m o n s t r a t e s d e t e c t i o n o f a r a d i a t i o n - i n d u c e d
t r a n s l o c a t i o n i n v o l v i n g c h r o m o s o m e 4 i n h u m a n l y m p h o -
c y t e s [ p r o t o c o l I , 1 n g o f p r o b e p e r / u l a n d 7 6 n g o f g e n o m i c
D N A p e r / u l ( Q = 5 , s e e D i s c u s s i o n ) ; 1 - h r p r o b e i n c u b a t i o n
a n d 1 6 - h r h y b r i d i z a t i o n ] . Th e c o n t r a s t r a t i o w a s - 5 . F i g . l e
s h o w s t h a t t h e n o r m a l a n d t w o d e r i v a t i v e c h r o m o s o m e s
r e s u l t i n g f r o m t h e t ( 4 ; 1 1 ) i n c e l l l i n e R S 4 ; 1 1 c a n b e d e t e c t e d
i n i n t e r p h a s e n u c l e i a s t h r e e d i s t i n c t d o m a i n s [ p r o t o c o l I , 1 3 . 5
n g o f p r o b e p e r , u l a n d 8 0 0 n g o f g e n o m i c D N A p e r u l ( Q =
5 , s e e D i s c u s s i o n ) ; 1 - h r p r o b e i n c u b a t i o n a n d 1 6 - h r h y b r i d -
i z a t i o n ] . Th e i n c r e a s e d p r o b e c o n c e n t r a t i o n r e s u l t e d i n
b r i g h t e r s i g n a l s r e l a t i v e t o F i g . i d . A p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e
c e l l s c l e a r l y s h o w t h e p r e s e n c e o f t h r e e n u c l e a r d o m a i n s .
H y b r i d i z a t i o n o f p B S - 2 1 t o a m e t a p h a s e s p r e a d f r o m a c e l l
l i n e w i t h t r i s o m y 2 1 i s s h o w n i n F i g . l f [ p r o t o c o l I I , 4 n g o f
p r o b e p e r
/ 4 a n d 2 5 0 n g o f g e n o m i c D N A p e r / l ; 3 - h r
i n c u b a t i o n , a d d i t i o n a l 2 5 0 n g o f g e n o m i c D N A p e r / u l ( Q = 1
+ 1 , s e e D i s c u s s i o n ) ; 3 - h r p r o b e i n c u b a t i o n a n d 1 6 - h r
h y b r i d i z a t i o n ] . A s m a l l a m o u n t o f h y b r i d i z a t i o n i s v i s i b l e
n e a r t h e c e n t r o m e r e s o f t h e o t h e r a c r o c e n t r i c s . F i g . l g s h o w s
t w o i n t e r p h a s e n u c l e i f r o m t h i s s a m e h y b r i d i z a t i o n . Th e s e
c l e a r l y s h o w t h e t h r e e c h r o m o s o m e 2 1 d o m a i n s . H y b r i d i z a -
t i o n w i t h p r o b e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o p r o t o c o l I r e s u l t e d i n
h i g h e r r e l a t i v e i n t e n s i t y o f t h e s h a r e d s i g n a l s o n t h e D - a n d
G - g r o u p c h r o m o s o m e s , a n d c o n s e q u e n t l y i t w a s m o r e d i f f i -
c u l t t o d e t e r m i n e t h e n u m b e r o f n u m b e r 2 1 c h r o m o s o m e s i n
i n t e r p h a s e ( n o t s h o w n ) . I n c r e a s i n g s t r i n g e n c y b y u s i n g a
h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e w i t h 5 5 % f o r m a m i d e a n d 0 . 1 5 M
N a C l / 1 5 m M s o d i u m c i t r a t e , w h i c h l o w e r s t h e m e l t i n g
t e m p e r a t u r e a b o u t 8 C , d i d n o t r e d u c e t h e u n w a n t e d h y b r i d -
i z a t i o n . A d d i t i o n o f u n l a b e l e d p A r i b o s o m a l D N A ( 1 9 ) a l s o
w a s i n e f f e c t i v e a t i n c r e a s i n g s p e c i f i c i t y .
Un i q u e S e q u e n c e H y b r i d i z a t i o n . H y b r i d i z a t i o n w i t h a p o o l
o f t h r e e c h r o m o s o m e 4 u n i q u e s e q u e n c e s w a s c o n d u c t e d a t
a t o t a l p h a g e c o n c e n t r a t i o n o f 2 n g / / l p e r c l o n e , c o r r e s p o n d -
i n g t o 5 0 p g / / l p e r k i l o b a s e o f h u m a n i n s e r t . I n d i v i d u a l
h y b r i d i z a t i o n s i t e s c o u l d b e l o c a t e d t o w i t h i n a f r a c t i o n o f t h e
w i d t h o f a c h r o m a t i d ( F i g . l h ) a f t e r o v e r n i g h t h y b r i d i z a t i o n
( 1 6 h r ) a n d a p p l i c a t i o n o f t h r e e l a y e r s o f a v i d i n . A n a l y s i s
o f
4 5 s p r e a d s i n t w o e x p e r i m e n t s s h o w e d 2 6 5 f l u o r e s c e n t s p o t s
G e n e t i c s : P i n k e l e t a l .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 5 ( 1 9 8 8 )
I ~ ~ ~ ~ I I
F I G . 1 . ( a ) H y b r i d i z a t i o n o f p B S - 4 D N A w i t h n o c o m p e t i n g g e n o m i c D N A t o a h u m a n m e t a p h a s e s p r e a d . B o t h c o p i e s o f c h r o m o s o m e 4 ,
w h i c h a r e b r i g h t e r t h a n t h e o t h e r s , a r e i n d i c a t e d b y l a r g e a r r o w s . S m a l l a r r o w s i n d i c a t e r e g i o n s t h a t a r e u n s t a i n e d w i t h t h e p r o b e . ( b )
H y b r i d i z a t i o n o f p B S - 4 t o a h u m a n m e t a p h a s e s p r e a d w i t h Q
= 2 o f g e n o m i c D N A . C h r o m o s o m e 4 i s y e l l o w ; o t h e r s a r e r e d d u e t o t h e p r o p i d i u m
i o d i d e c o u n t e r s t a i n . ( c ) S a m e s p r e a d a s b b u t u s i n g a f i l t e r t h a t p a s s e s o n l y t h e f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e f l u o r e s c e n c e . ( d ) D e t e c t i o n o f a
r a d i a t i o n - i n d c e i - p d t r a n s l o c a . t i o n ( a q r r o w s , ) i n v o l v i n g c h r o m o s o m e 4 i n a h u m a n m e t a p h a s e s p r e a d . ( e ) R e p r e s e n t a t i v e n u c l e i f r o m c e l l l i n e R S 4 ; 1 1
t h a t h o m o g e n e o u s l y c o n t a i n t ( 4 ; 1 1 ) . ( f ) H y b r i d i z a t i o n o f p B S - 2 1 t o a m e t a p h a s e s p r e a d o f a t r i s o m y 2 1 c e l l l i n e . ( g ) A s i n f b u t i n t e r p h a s e
n u c l e i .
( h ) H y b r i d i z a t i o n o f t h r e e u n i q u e s e q u e n c e p r o b e s f r o m c h r o m o s o m e 4 t o a h u m a n m e t a p h a s e s p r e a d .
9 1 4 0 G e n e t i c s : P i n k e l e t a l .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 5 ( 1 9 8 8 ) 9 1 4 1
o n c h r o m o s o m e 4 o u t o f t h e 5 4 0 p o s s i b l e ( 3 t a r g e t s i t e s p e r
c h r o m a t i d x 4 c h r o m a t i d s p e r m e t a p h a s e x 4 5 m e t a p h a s e s ) ,
i n d i c a t i n g a h y b r i d i z a t i o n e f f i c i e n c y o f - 5 0 % . Th e t o t a l
n u m b e r o f s p o t s o n a l l c h r o m o s o m e s w a s 5 6 8 ( 2 6 5 o n c h r o -
m o s o m e 4 p l u s 3 0 3 o n o t h e r c h r o m o s o m e s ) , g i v i n g a h y b r i d -
i z a t i o n s p e c i f i c i t y o f - 5 0 % . A n a l y s i s o f 3 s p r e a d s f r o m a 1 6 - h r
h y b r i d i z a t i o n w i t h t h e c o m p l e t e c o l l e c t i o n o f 1 2 0 u n i q u e
s e q u e n c e p r o b e s a t a t o t a l p r o b e c o n c e n t r a t i o n t h e s a m e a s f o r
t h e g r o u p o f 3 ( r e s u l t i n g i n - 1 . 5 p g f l ~ d p e r k i l o b a s e o f h u m a n
i n s e r t ) s h o w e d 2 2 2 f l u o r e s c e n t s p o t s o u t o f t h e 1 4 4 0 p o s s i b l e
o n t h e n u m b e r 4 c h r o m o s o m e s ( 1 2 0 t a r g e t s i t e s p e r c h r o m a t i d
x 4 c h r o m a t i d s p e r m e t a p h a s e x 3 m e t a p h a s e s ) . Th u s t h e
h y b r i d i z a t i o n e f f i c i e n c y w a s 1 5 % . E i g h t h u n d r e d f o u r t e e n
t o t a l s p o t s w e r e f o u n d o n a l l o f t h e c h r o m o s o m e s , g i v i n g a
s p e c i f i c i t y o f 2 7 % . Th e s e e x p e r i m e n t s i n d i c a t e t h a t s u b s t a n t i a l
h y b r i d i z a t i o n c a n o c c u r w i t h u n i q u e s e q u e n c e p r o b e s a t l o w
p r o b e c o n c e n t r a t i o n s .
D I S C US S I O N
C o m p e t i t i v e H y b r i d i z a t i o n . Th i s p a p e r d e s c r i b e s t h e u s e o f
u n l a b e l e d g e n o m i c D N A t o c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t h y b r i d i z a -
t i o n o f t h o s e s e q u e n c e s i n a c h r o m o s o m e - s p e c i f i c l i b r a r y t h a t
a r e s h a r e d w i t h o t h e r c h r o m o s o m e s . D e v e l o p m e n t o f t h e s e
p r o t o c o l s r e q u i r e d o p t i m i z a t i o n o f a n u m b e r o f f a c t o r s ,
i n c l u d i n g t h e a m o u n t s o f p r o b e a n d b l o c k i n g D N A , t h e p r o b e
i n c u b a t i o n t i m e ( s ) p r i o r t o h y b r i d i z a t i o n , a n d t h e t i m e a n d
c o n d i t i o n s o f h y b r i d i z a t i o n . Th e f o l l o w i n g s e c t i o n s p r e s e n t a
s e m i q u a n t i t a t i v e d i s c u s s i o n o f t h e c o n s i d e r a t i o n s t h a t l e d t o
t h e p r o t o c o l s r e p o r t e d i n t h i s p a p e r ( m a t h e m a t i c a l d e t a i l s a r e
a v a i l a b l e f r o m t h e a u t h o r s ) . P r e h y b r i d i z a t i o n o f t h e t a r g e t
c e l l s w i t h g e n o m i c D N A w a s a l s o e x p l o r e d , b u t s u f f i c i e n t
c o n t r a s t r a t i o c a n b e o b t a i n e d w i t h o u t i t .
H y b r i d i z a t i o n w i t h o u t g e n o m i c D N A . F i g . l a d e m o n -
s t r a t e s t h e h y b r i d i z a t i o n o f p B S - 4 D N A t o a h u m a n m e t a -
p h a s e s p r e a d . A l l o f t h e c h r o m o s o m e s a r e s t a i n e d a l o n g m o s t
o f t h e i r l e n g t h s d u e t o s e q u e n c e s i n t h e p r o b e t h a t a r e s h a r e d
w i t h o t h e r c h r o m o s o m e s . Un s t a i n e d r e g i o n s , n o t e d b y a r -
r o w s , s h o w l o c a t i o n s f o r w h i c h h o m o l o g o u s s e q u e n c e s a r e
n o t p r e s e n t i n p B S - 4 . Th e s e a r e m o s t l y i n t h e c e n t r o m e r i c
r e g i o n s a n d t h e l o n g a r m o f t h e Y c h r o m o s o m e , w h e r e b l o c k s
o f r e p e t i t i v e D N A s p e c i f i c t o t h o s e s i t e s a r e k n o w n t o e x i s t .
Th e v i s i b l e c o n t r a s t o n c h r o m o s o m e 4 i s t h e r e s u l t o f t h e
i n t e r a c t i o n o f s e v e r a l f a c t o r s . ( i ) A l l o f t h e D N A i n c h r o m o -
s o m e 4 i s p o t e n t i a l t a r g e t f o r s e q u e n c e s i n t h e p r o b e , w h e r e a s
o n l y t h o s e s e q u e n c e s o n t h e o t h e r c h r o m o s o m e s t h a t a r e
s h a r e d w i t h c h r o m o s o m e 4 c a n b i n d p r o b e . ( i i ) Th e h y b r i d -
i z a t i o n t i m e a n d p r o b e c o n c e n t r a t i o n w e r e h i g h e n o u g h t o
a l l o w s i g n i f i c a n t b i n d i n g o f t h e s p e c i f i c s e q u e n c e s . ( i i i ) Th e
r a t i o o f p r o b e t o t a r g e t s e q u e n c e s i s h i g h e r f o r t h e s p e c i f i c
s e q u e n c e s t h a n f o r t h e s h a r e d s e q u e n c e s . [ Te n n a n o g r a m s o f
c h r o m o s o m e 4 D N A w a s h y b r i d i z e d t o - 2 0 0 n g o f h u m a n
D N A t a r g e t ( 4 x 1 0 4 c e l l s ) , 1 3 n g o f w h i c h i s c h r o m o s o m e 4 .
Th u s , t h e r a t i o o f p r o b e t o t a r g e t f o r t h e s p e c i f i c s e q u e n c e s
w a s - 1 , w h e r e a s f o r t h e s h a r e d s e q u e n c e s i t w a s
=0 . 0 5 . 1
Th e c o n t r a s t c a n b e i n c r e a s e d b y a l l o w i n g t h e p r o b e D N A
t o p a r t i a l l y r e h y b r i d i z e p r i o r t o a d d i n g i t t o t h e s l i d e . Th i s
p r e f e r e n t i a l l y d e p l e t e s t h e h i g h - c o p y ( p r e d o m i n a n t l y t h e
s h a r e d ) s e q u e n c e s i n t h e p r o b e ( 2 0 ) . A s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n
s t a i n i n g s p e c i f i c i t y r e s u l t i n g f r o m p r o b e r e h y b r i d i z a t i o n w a s
o b s e r v e d e x p e r i m e n t a l l y f o r c h r o m o s o m e 4 u s i n g a h y b r i d -
i z a t i o n m i x t u r e w i t h 1 n g o f p r o b e p e r
g l
a n d a 2 4 - h r
i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C ( n o t s h o w n ) . L i k e w i s e , h y b r i d i z a t i o n a f t e r
a 2 4 - h r i n c u b a t i o n o f 4 n g o f c h r o m o s o m e 2 1 p r o b e p e r
g l
r e s u l t e d i n a s u b s t a n t i a l c o n t r a s t r a t i o . Th i s i n d i c a t e s t h a t a t
t h e s e c o n c e n t r a t i o n s t h e c h r o m o s o m e - s p e c i f i c s e q u e n c e s
r e m a i n s u b s t a n t i a l l y s i n g l e s t r a n d e d f o r t i m e s o n t h e o r d e r o f
d a y s i n t h e h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e . I t a l s o d e m o n s t r a t e s t h a t
o t h e r m e c h a n i s m s t h a t m i g h t i n a c t i v a t e t h e p r o b e a r e n o t
s i g n i f i c a n t d u r i n g t h e i n c u b a t i o n .
P r o t o c o l I h y b r i d i z a t i o n . Th e a d d i t i o n o f u n l a b e l e d g e -
n o m i c D N A t o t h e h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e i n c r e a s e s t h e
c o n c e n t r a t i o n o f t h e s h a r e d s e q u e n c e s b y a l a r g e r f a c t o r t h a n
i t i n c r e a s e s t h e c o n c e n t r a t i o n o f c h r o m o s o m e - s p e c i f i c s e -
q u e n c e s . Th i s e n h a n c e s t h e p r e f e r e n t i a l d e p l e t i o n o f t h e
l a b e l e d c o p i e s o f t h e s h a r e d s e q u e n c e s a n d i n c r e a s e s t h e
c o n t r a s t r a t i o . To s e e t h i s , f i r s t c o n s i d e r o n e o f t h e s e -
q u e n c e s , r e p e a t o r u n i q u e , t h a t i s s p e c i f i c f o r t h e i t h c h r o -
m o s o m e i n a h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e c o n t a i n i n g a m a s s m p
o f
p r o b e D N A f r o m t h e i t h c h r o m o s o m e l i b r a r y a n d m b o f
u n l a b e l e d g e n o m i c D N A . Th e n u m b e r o f l a b e l e d c o p i e s o f t h e
s e q u e n c e i s p r o p o r t i o n a l t o
m p .
H o w e v e r , t h e n u m b e r o f
u n l a b e l e d c o p i e s i s p r o p o r t i o n a l t o h i m b , w h e r e f i i s t h e
f r a c t i o n o f g e n o m i c D N A c o n t a i n e d o n t h e i t h c h r o m o s o m e .
Th u s , Q , t h e r a t i o o f u n l a b e l e d t o l a b e l e d c o p i e s o f e a c h o f t h e
s e q u e n c e s s p e c i f i c f o r t h e t a r g e t c h r o m o s o m e , i s f i m b / m p .
F o r h u m a n c h r o m o s o m e s , 0 . 0 1 6 <
f i
< 0 . 0 8 ( 2 1 ) . F o r t h e
w o r k r e p o r t e d i n t h i s p a p e r , f 4 = 0 . 0 6 6 a n d f 2 l
= 0 . 0 1 6 . N o w
c o n s i d e r a s h a r e d s e q u e n c e t h a t i s d i s t r i b u t e d m o r e - o r - l e s s
u n i f o r m l y o v e r t h e g e n o m e . Th e n u m b e r o f l a b e l e d c o p i e s i s
p r o p o r t i o n a l t o
m p ,
w h e r e a s t h e n u m b e r o f u n l a b e l e d c o p i e s
i s p r o p o r t i o n a l t o m b . Th u s , t h e r a t i o o f u n l a b e l e d t o l a b e l e d
c o p i e s i s
m b / m p
= Q / f i >> Q . Th i s i s t r u e f o r a l l u n i f o r m l y
d i s t r i b u t e d s e q u e n c e s , r e g a r d l e s s o f c o p y n u m b e r . Th u s
a d d i n g g e n o m i c D N A i n c r e a s e s t h e c o n c e n t r a t i o n o f e a c h
s p e c i f i c s e q u e n c e b y t h e f a c t o r 1 + Q , w h e r e a s e a c h u n i -
f o r m l y d i s t r i b u t e d s e q u e n c e i s i n c r e a s e d b y t h e l a r g e r f a c t o r
1 +
Q f t .
A l t h o u g h u s e o f s o m e g e n o m i c D N A i s n e c e s s a r y t o
g e n e r a t e a h i g h c o n t r a s t r a t i o , u s e o f t o o m u c h w i l l d e c r e a s e
t h e i n t e n s i t y o f t h e s p e c i f i c s t a i n i n g t o u n a c c e p t a b l e l e v e l s .
Th i s i s d u e t o r e a s s o c i a t i o n o f t h e l a b e l e d s p e c i f i c s e q u e n c e s
i n t h e p r o b e a n d c o m p e t i t i o n o f t h e l a b e l e d a n d u n l a b e l e d
c o p i e s f o r h y b r i d i z a t i o n s i t e s . I t c a n b e s h o w n t h a t r o u g h l y
h a l f o f t h e b e n e f i c i a l e f f e c t o f g e n o m i c D N A o n r e l a t i v e
r e n a t u r a t i o n r a t e s i s a c h i e v e d w h e n Q = 1 , a n d , b y Q = 5 ,
t h e r e i s e s s e n t i a l l y n o m o r e b e n e f i t t o b e g a i n e d . Th u s , o u r
p r o t o c o l I h y b r i d i z a t i o n s k e e p Q < 5 .
R e s u l t s a l s o i m p r o v e i f t h e h y b r i d i z a t i o n t i m e i s s u f f i c i e n t l y
l o n g t o g i v e t h e s p e c i f i c s e q u e n c e s t h e o p p o r t u n i t y t o f i n d
t h e i r b i n d i n g s i t e s . S i n c e t h e r e a r e m o r e b i n d i n g s i t e s a v a i l -
a b l e f o r t h e h i g h - c o p y ( s h a r e d ) s e q u e n c e s t h a n f o r t h e
s p e c i f i c s e q u e n c e s , s t a i n i n g o f t h e n o n - t a r g e t c h r o m o s o m e s
o c c u r s m o r e r a p i d l y . Th u s c o n t r a s t i m p r o v e s a s h y b r i d i z a -
t i o n t i m e i s e x t e n d e d . A l t h o u g h w e h a v e n o d i r e c t e v i d e n c e
c o n c e r n i n g t h e t y p e o f s e q u e n c e p r e d o m i n a n t l y r e s p o n s i b l e
f o r t h e c h r o m o s o m e - s p e c i f i c s i g n a l s , F i g . l h i n d i c a t e s t h a t w e
d o h a v e t h e s e n s i t i v i t y t o d e t e c t u n i q u e s e q u e n c e h y b r i d i z a -
t i o n s o f 3 - k b t a r g e t s i t e s . H o w e v e r , l o w - c o p y c h r o m o s o m e -
s p e c i f i c r e p e a t s ( 2 2 , 2 3 ) m a y c o n t r i b u t e t o t h e h y b r i d i z a t i o n
a s w e l l . I f t h e u n i q u e s e q u e n c e s a r e p r e d o m i n a n t l y r e s p o n -
s i b l e f o r t h e s p e c i f i c s i g n a l s , t h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f e a c h
s e q u e n c e i n o u r c h r o m o s o m e 4 h y b r i d i z a t i o n s i s a b o u t 1 0 -
1 0 0 t i m e s l o w e r t h a n t h a t u s e d w i t h t h e g r o u p o f 1 2 0
c h r o m o s o m e 4 u n i q u e s e q u e n c e s . Th u s o n e m i g h t e x p e c t t h a t
h y b r i d i z a t i o n t i m e s >1 6 h r w o u l d b e b e n e f i c i a l .
F i g . 1 b a n d c i l l u s t r a t e t h a t v e r y h i g h c o n t r a s t c a n b e
a c h i e v e d b y f o l l o w i n g t h e s e g u i d e l i n e s . A c o n t r a s t r a t i o o f
- 2 0 o n c h r o m o s o m e 4 w a s o b t a i n e d b y u s i n g 1 n g o f p r o b e
p e r
I L ,
Q = 2 o f g e n o m i c D N A , a 1 - h r p r o b e i n c u b a t i o n , a n d
a 1 1 0 - h r h y b r i d i z a t i o n . We a k e r , b u t s t i l l a d e q u a t e , s i g n a l s
w i t h a c o n t r a s t r a t i o o f =5 a r e a c h i e v e d w i t h a 1 6 - h r
h y b r i d i z a t i o n u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . V e r y b r i g h t s i g n a l s c a n
b e a c h i e v e d w i t h a 1 6 - h r h y b r i d i z a t i o n u s i n g 1 3 . 5 n g o f p r o b e
p e r 1 d a n d Q = 5 ( F i g . l e ) . Th e c o n t r a s t i s r e d u c e d r e l a t i v e
t o t h a t a c h i e v e d i n F i g . l b , b u t i t i s m o r e t h a n a d e q u a t e .
E x p e r i m e n t s w i t h i n c r e a s i n g a m o u n t s o f c a r r i e r D N A i n d i -
c a t e t h a t r e s u l t s b e c o m e w o r s e a s t h e t o t a l D N A c o n c e n t r a -
t i o n a p p r o a c h e s 1
A g / I A ,
s o o u r p r o t o c o l s s t a y b e l o w t h i s
l i m i t .
G e n e t i c s : P i n k e l e t a l .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 5 ( 1 9 8 8 )
P r o t o c o l l I h y b r i d i z a t i o n . H y b r i d i z a t i o n w i t h p B S - 2 1 D N A
u s i n g p r o t o c o l I p r e s e n t s a p r o b l e m n o t e n c o u n t e r e d w i t h
c h r o m o s o m e 4 . Th i s D N A h y b r i d i z e s t o c h r o m o s o m e 2 1 a n d
t o t h e c e n t r o m e r i c r e g i o n s o f t h e D - a n d G - g r o u p c h r o m o -
s o m e s . Th e s e r e g i o n s c o n t a i n r i b o s o m a l ( 1 9 ) a n d a l p h a
s a t e l l i t e ( 2 4 ) s e q u e n c e s a n d p e r h a p s o t h e r s . Th e s e a r e r e l a -
t i v e l y l o w - c o p y s e q u e n c e s s h a r e d w i t h o n l y a f e w c h r o m o -
s o m e s , s o p r o t o c o l I i s n o t v e r y e f f e c t i v e a t s u p p r e s s i n g t h e m
r e l a t i v e t o t h e c h r o m o s o m e 2 1 - s p e c i f i c s e q u e n c e s . I n a d d i -
t i o n , t h e s e s e q u e n c e s a r e c l u s t e r e d o n t h e c h r o m o s o m e s , s o
t h a t e v e n m u c h r e d u c e d h y b r i d i z a t i o n i s c l e a r l y v i s i b l e . Th i s
i s e s p e c i a l l y d i s t r a c t i n g i n a n a l y s i s o f i n t e r p h a s e n u c l e i .
C a l c u l a t i o n s i n d i c a t e t h a t a d d i t i o n o f s e v e r a l a l i q u o t s o f
f r e s h l y d e n a t u r e d g e n o m i c D N A p e r i o d i c a l l y d u r i n g t h e
i n c u b a t i o n ( p r o t o c o l I I ) s h o u l d i n c r e a s e t h e s t a i n i n g s p e c i -
f i c i t y . F i g . i f s h o w s a p r o t o c o l I I h y b r i d i z a t i o n , u s i n g t w o
a l i q u o t s o f g e n o m i c D N A , t o a m e t a p h a s e s p r e a d f r o m a
t r i s o m y 2 1 c e l l l i n e . I n t e n s e h y b r i d i z a t i o n t o t h e t h r e e n u m b e r
2 1 c h r o m o s o m e s i s c l e a r l y v i s i b l e a n d h y b r i d i z a t i o n t o t h e
o t h e r D - a n d G - g r o u p c h r o m o s o m e s h a s b e e n r e d u c e d t o a n
a c c e p t a b l e l e v e l . F i g . l g s h o w s t h a t h y b r i d i z a t i o n t o c h r o -
m o s o m e s o t h e r t h a n c h r o m o s o m e 2 1 i s s u f f i c i e n t l y l o w t h a t
t h e t h r e e c h r o m o s o m e 2 1 d o m a i n s a r e c l e a r l y v i s i b l e i n
i n t e r p h a s e n u c l e i . I n p r a c t i c e , t h e m o s t c o n v e n i e n t p r o c e d u r e
f o r s u p p r e s s i n g t h e s h a r e d a c r o c e n t r i c h y b r i d i z a t i o n m i g h t b e
i n c l u s i o n o f u n l a b e l e d D N A f r o m o n e o f t h e o t h e r D - o r
G - g r o u p c h r o m o s o m e l i b r a r i e s ( o r u n l a b e l e d c l o n e d D N A
f r o m j u s t t h e s e s e q u e n c e s , i f a v a i l a b l e ) a s a d d i t i o n a l c o m -
p e t i t o r . Th e u s e o f l i b r a r i e s f r o m n o n - t a r g e t c h r o m o s o m e s a s
c o m p e t i t o r f o r a p r o b e m a y i n g e n e r a l i m p r o v e c o n t r a s t . Th e
s p e c i f i c s e q u e n c e s i n t h e p r o b e w i l l h a v e n o c o m p e t i t i o n ( Q
= 0 ) n o m a t t e r h o w m u c h c o m p e t i t o r f o r t h e s h a r e d s e -
q u e n c e s i s a d d e d .
A b e r r a n t C h r o m o s o m e D e t e c t i o n . D e t e c t i o n o f n u m e r i c a l
a n d s t r u c t u r a l a b e r r a t i o n s w i t h c o m p o s i t e p r o b e s s h o u l d
f a c i l i t a t e m a n y a r e a s o f c y t o g e n e t i c s . S t a i n i n g w i t h t h e
c o m p o s i t e p r o b e f o r c h r o m o s o m e 4 p e r m i t s r a p i d i d e n t i f i c a -
t i o n o f t r a n s l o c a t i o n s i n m e t a p h a s e s p r e a d s ( F i g . l d ) . Th e
h y b r i d i z a t i o n i n t e n s i t y a n d s p e c i f i c i t y a r e s u c h t h a t e v e n v e r y
s m a l l p o r t i o n s o f t h e i n v o l v e d c h r o m o s o m e c a n b e d e t e c t e d .
Th i s t e c h n i q u e s h o u l d b e e s p e c i a l l y u s e f u l f o r a p p l i c a t i o n s
w h e r e h i g h - q u a l i t y b a n d i n g i s d i f f i c u l t ( e . g . , i n t u m o r c y t o -
g e n e t i c s ) o r w h e r e s p e e d o f a n a l y s i s i s t h e p r e d o m i n a n t
c o n c e r n ( e . g . , f o r d e t e c t i o n o f l o w - f r e q u e n c y - i n d u c e d c h r o -
m o s o m a l a b e r r a t i o n s ) . F i g . l e d e m o n s t r a t e s t h e d e t e c t i o n o f
a h o m o g e n e o u s l y o c c u r r i n g t r a n s l o c a t i o n i n v o l v i n g c h r o m o -
s o m e 4 i n i n t e r p h a s e n u c l e i f r o m a l e u k e m i a c e l l l i n e ( 1 5 )
c a r r y i n g t h e t r a n s l o c a t i o n t ( 4 ; 1 1 ) . A p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e
n u c l e i o f t h i s c e l l l i n e s h o w e d t h r e e b r i g h t l y f l u o r e s c e n t
d o m a i n s , p r e s u m a b l y p r o d u c e d b y t h e t w o p o r t i o n s o f t h e
i n v o l v e d c h r o m o s o m e 4 a n d t h e i n t a c t n o r m a l c h r o m o s o m e .
Th e d o m a i n s i n t h e o t h e r n u c l e i m a y h a v e b e e n o b s c u r e d b y
t h e n u c l e a r o r i e n t a t i o n i n t h e s e t w o - d i m e n s i o n a l v i e w s , b y
n u c l e a r d i s t o r t i o n t h a t o c c u r r e d d u r i n g s l i d e p r e p a r a t i o n , o r
b e c a u s e t h e d o m a i n s w e r e t o o c l o s e t o e a c h o t h e r t o b e
d i s t i n g u i s h e d . H y b r i d i z a t i o n u s i n g p r o c e d u r e s t h a t p r e s e r v e
t h r e e - d i m e n s i o n a l m o r p h o l o g y m a y r e s o l v e t h e s e i s s u e s a n d
a l s o p e r m i t g e n e r a l s t u d i e s o f c h r o m o s o m a l d o m a i n s i n
i n t e r p h a s e n u c l e i ( r e f . 4 ; u n p u b l i s h e d ) .
P r e n a t a l s c r e e n i n g f o r d i s e a s e - l i n k e d c h r o m o s o m e a b e r r a -
t i o n s ( e . g . , t r i s o m y 2 1 ) w o u l d b e e n h a n c e d b y t e c h n i q u e s t h a t
a l l o w m o r e r a p i d d e t e c t i o n o f s u c h a b e r r a t i o n s . F i g . 1 f a n d
g s h o w t h a t c o m p e t i t i v e h y b r i d i z a t i o n w i t h p B S - 2 1 D N A
a l l o w s d e t e c t i o n o f t r i s o m y 2 1 i n m e t a p h a s e s p r e a d s a n d i n
i n t e r p h a s e n u c l e i . I n t e r p h a s e a n e u p l o i d y a n a l y s i s i s p a r t i c u -
l a r l y e x c i t i n g s i n c e i t w i l l y i e l d r a p i d r e s u l t s ( c e l l c u l t u r e i s n o t
n e c e s s a r y ) . Wh e t h e r t h e h y b r i d i z a t i o n p a t t e r n s a r e s u f f i -
c i e n t l y r e l i a b l e f o r r o u t i n e p r e n a t a l d i a g n o s i s r e m a i n s t o b e
d e t e r m i n e d . C o m p l i c a t i o n s m a y r e s u l t f r o m c l u s t e r i n g , o v e r -
l a p , a n d / o r d i s t o r t i o n o f t h e f l u o r e s c e n t d o m a i n s . H o w e v e r ,
t h e s e p r e l i m i n a r y r e s u l t s a r e e n c o u r a g i n g .
C h r o m o s o m e - s p e c i f i c l i b r a r i e s f o r a l l o f t h e h u m a n c h r o -
m o s o m e s a r e n o w a v a i l a b l e , s o t h a t p r o d u c t i o n o f a k i t o f
r e a g e n t s c a p a b l e o f s t a i n i n g e a c h o f t h e h u m a n c h r o m o s o m e s
s h o u l d b e s t r a i g h t f o r w a r d . Th e p r o c e d u r e a l s o s h o u l d w o r k
f o r o t h e r s p e c i e s w h o s e g e n o m e s h a v e t h e s a m e g e n e r a l
f e a t u r e s a s t h e h u m a n . S t a i n i n g o f s u b c h r o m o s o m a l s e g m e n t s
s h o u l d b e p o s s i b l e u s i n g l i b r a r i e s c o n t a i n i n g t h o s e s e -
q u e n c e s . L a r g e i n s e r t l i b r a r i e s , c o s m i d s a n d e v e n t u a l l y y e a s t
a r t i f i c i a l c h r o m o s o m e s , a r e b e i n g p r o d u c e d f o r t h e h u m a n
c h r o m o s o m e s . Th e s e w i l l f a c i l i t a t e s e l e c t i o n o f p r o b e s f o r
c h r o m o s o m a l s e g m e n t s s i n c e s i n g l e c l o n e s f r o m t h e s e l i b r a r -
i e s c a n b e h y b r i d i z e d t o h u m a n c h r o m o s o m e s a n d n u c l e i w i t h
e f f i c i e n c i e s a p p r o a c h i n g 1 0 0 % ( r e f . 1 3 ; J . L a n d e g e n t , u n p u b -
l i s h e d d a t a ) .
We a r e g r a t e f u l t o D r . C . G i l l i a m f o r p r o v i d i n g t h e 1 2 0 c h r o m o -
s o m e 4 - s p e c i f i c u n i q u e s e q u e n c e s , D r . R . S c h m i c k e l f o r t h e r i b o -
s o m a l c l o n e p A , a n d D r . J . K e r s e y f o r t h e R S ( 4 ; 1 1 ) c e l l l i n e . We
t h a n k C . L o z e s f o r p r e p a r i n g m a n y o f t h e c e l l s a n d c h r o m o s o m e s
u s e d i n t h i s w o r k a n d D r s . M. A n d r e e f f a n d J . H a i m i f o r t h e n u c l e i
f r o m t h e R S ( 4 ; 1 1 ) c e l l s . Th i s w o r k w a s p e r f o r m e d u n d e r t h e a u s p i c e s
o f t h e U. S . D e p a r t m e n t o f E n e r g y b y t h e L a w r e n c e L i v e r m o r e
N a t i o n a l L a b o r a t o r y u n d e r C o n t r a c t W- 7 4 0 5 - E N G - 4 8 w i t h s u p p o r t
f r o m U. S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e G r a n t s H D 1 7 6 5 5 a n d C A 4 5 9 1 9 .
1 . L a n g e r - S a f e r , P . , L e v i n e , M. & Wa r d , D . ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t l . A c a d .
S c i . US A 7 9 , 4 3 8 1 - 4 3 8 5 .
2 . L a n d e g e n t , J . , J a n s e n i n d e Wa l , N . , B a a n , R . , H o e i j m a k e r s , J . &
v a n d e r P l o e g , M. ( 1 9 8 4 ) E x p . C e l l . R e s . 1 5 3 , 6 1 - 7 2 .
3 . H o p m a n , A . H . N . , Wi e g a n t , J . & v a n D u i j n , P . ( 1 9 8 7 ) E x p . C e l l
R e s . 1 6 9 , 3 5 7 - 3 6 8 .
4 . Tr a s k , B . , v a n d e n E n g h , G . , P i n k e l , D . , Mu l l i k i n , J . , Wa l d m a n , F . ,
v a n D e k k e n , H . & G r a y , J . W. ( 1 9 8 8 ) H u m . G e n e t . 7 8 , 2 5 1 - 2 5 9 .
5 . P i n k e l , D . , S t r a u m e , T. & G r a y , J . W. ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .
US A 8 3 , 2 9 3 4 - 2 9 3 8 .
6 . P i n k e l , D . , G r a y , J . W. , Tr a s k , B . , v a n d e n E n g h , G . , F u s c o e , J . &
v a n D e k k e n , H . ( 1 9 8 6 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . 5 1 ,
1 5 1 - 1 5 7 .
7 . C r e m e r , T. , L a n d e g e n t , J . , B r u c k h e r , A . , S c h o l l , H . P . , S c h a r d i n ,
M. , H a g e r , H . D . , D e v i l e e , P . , P e a r s o n , P . & v a n d e r P l o e g , M.
( 1 9 8 6 ) H u m . G e n e t . 7 4 , 3 4 6 - 3 5 2 .
8 . Ma n u e l i d i s , L . ( 1 9 8 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 1 , 3 1 2 3 - 3 1 2 7 .
9 . R a p p o l d , G . A . , C r e m e r , T. , H a g e r , H . D . , D a v i e s , K . E . , Mu l l e r ,
C . R . & Ya n g , T. ( 1 9 8 4 ) H u m . G e n e t . 6 7 , 3 1 7 - 3 2 5 .
1 0 . S c h a r d i n , M. , C r e m e r , T. , H a g e r , H . D . & L a n g , M. ( 1 9 8 5 ) H u m .
G e n e t . 7 1 , 2 8 2 - 2 8 7 .
1 1 . Ma n u e l i d i s , L . ( 1 9 8 5 ) H u m . G e n e t . 7 1 , 2 8 8 - 2 9 3 .
1 2 . V a n D i l l a , M. A . , D e a v e n , L . L . , e t a l . ( 1 9 8 6 ) B i o t e c h n o l o g y 4 , 5 3 7 -
5 5 2 .
1 3 . L a n d e g e n t , J . E . , J a n s e n i n d e Wa l , N . , D i r k s , R . W. , B a a s , F . &
v a n d e r P l o e g , M. ( 1 9 8 7 ) H u m . G e n e t . 7 7 , 3 6 6 - 3 7 0 .
1 4 . H a r p e r , M. E . , Ul l r i c h , A . & S a u n d e r s , G . F . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t d .
A c a d . S c i . US A 7 8 , 4 4 5 8 - 4 4 6 0 .
1 5 . S t o n g , R . C . , K o r s m e y e r , S . J . , P a r k i n , J . L . , A r t h u r , D . C . &
K e r s e y , J . H . ( 1 9 8 5 ) B l o o d 6 5 , 2 1 - 3 1 .
1 6 . G i l l i a m , C . , H e a l e y , S . , Mc D o n a l d , M. , S t e w a r t , G . , Wa s m u t h , J . ,
Ta n z i , R . , R o y , J . & G u s e l l a , J . ( 1 9 8 7 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 5 , 1 4 4 5 -
1 4 5 8 .
1 7 . H e l m s , C . , G r a h a m , M. Y. , D u t c h i k , J . E . & O l s o n , M. V . ( 1 9 8 5 )
D N A 4 , 3 9 - 4 9 .
1 8 . J o h n s o n , G . D . & N o g u e r i a , J . G . M. ( 1 9 8 1 ) J . I m m u n o l . Me t h o d s
4 3 , 3 4 9 - 3 5 0 .
1 9 . E r i k s o n , J . M. , R u s h f o r d , C . L . , D o r n e y , D . J . , Wi l s o n , G . N . &
S c h m i c k e l , R . D . ( 1 9 8 1 ) G e n e 1 6 , 1 - 9 .
2 0 . C a n t o r , C . R . & S c h i m m e l , P . R . ( 1 9 8 0 ) B i o p h y s i c a l C h e m i s t r y : Th e
B e h a v i o r o f B i o l o g i c a l Ma c r o m o l e c u l e s ( F r e e m a n , S a n F r a n c i s c o ) ,
P a r t 3 , p . 1 2 2 8 .
2 1 . Me n d e l s o h n , M. , Ma y a l l , B . , B o g a r t , D . , Mo o r e , D . , I I , & P e r r y ,
B . ( 1 9 7 3 ) S c i e n c e 1 7 9 , 1 1 2 6 - 1 1 2 9 .
2 2 . N a k a m u r a , Y. , L e p p e r t , M. , O ' C o n n e l l , P . , Wo l f f , R . , H o l m , T. ,
C u l v e r , M. , Ma r t i n , C . , F u j i m o t o , E . , H o f f , M. , K u m l i n , E . &
Wh i t e , R . ( 1 9 8 7 ) S c i e n c e 2 3 5 , 1 6 1 6 - 1 6 2 2 .
2 3 . B a r d o n i , B . , G u i o l i , S . , R a i m o n d i , E . , H e i l i g , R . , Ma n d e l , J . L . ,
O t t o l e n g h i , S . & C a m e r i n o , G . ( 1 9 8 7 ) C y t o g e n e t . C e l l G e n e t . 4 6 ,
5 7 5 .
2 4 . C h o o , K . H . , V i s s e l , B . , B r o w n , R . , F i l b y , R . G . & E a r l e , E . ( 1 9 8 8 )
N u c l e i c A c i d s R e s . 1 6 , 1 2 7 3 - 1 2 8 4 .
0 1 4 2 G e n e t i c s : P i n k e l e t a l .