P r o c . N a t i . A c a d . S c i .

US A
V o l . 7 5 , N o . 1 0 , p p . 5 1 9 0 - 5 1 9 4 , O c t o b e r 1 9 7 8
N e u r o b i o l o g y
E v i d e n c e t h a t c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t i n t o c h r o m a f f i n v e s i c l e s i s
c o u p l e d t o v e s i c l e m e m b r a n e p o t e n t i a l
( s e c r e t o r y v e s i c l e s / n e u r o t r a n s m i t t e r / H + e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t )
RO N A LD W. H O LZ*
La b o r a t o r y o f De v e l o p m e n t a l N e u r o b i o l o g y , N a t i o n a l I n s t i t u t e o f C h i l d H e a l t h a n d H u m a n De v e l o p m e n t , N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , B e t h e s d a , M a r y l a n d
2 0 0 1 4 ;
a n d De p a r t m e n t
o f
P h a r m a c o l o g y , Un i v e r s i t y
o f
M i c h i g a n
M e d i c a l S c h o o l ,
A n n
A r b o r , M i c h i g a n
4 8 1 0 9
C o m m u n i c a t e d b y J u l i u s A x e l r o d , J u l y 1 0 , 1 9 7 8
A B S TRA C T Th e e f f e c t s o f A TP , M g 2 + , a n d v a r i o u s a g e n t s
o n p H g r a d i e n t , m e m b r a n e p o t e n t i a l , a n d c a t e c h o l a m i n e
t r a n s p o r t a c r o s s m e m b r a n e s o f i n t a c t b o v i n e c h r o m a f f i n v e s i c l e s
w e r e i n v e s t i g a t e d . M e t h y l a m i n e a n d t h i o c y a n a t e ( S C N - ) d i s -
t r i b u t i o n s a c r o s s t h e v e s i c l e m e m b r a n e w e r e u s e d t o e s t i m a t e
t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t a n d m e m b r a n e p o t e n t i a l , r e -
s p e c t i v e l y . Th e H + c o n c e n t r a t i o n r a t i o ( i n t r a v e s i c u l a r : m e d i u m )
e q u a l s 1 6 w h e n t h e m e d i u m p H i s 6 . 9 a n d i s u n a l t e r e d b y A TP
a n d M g 2 + . I n t h e a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + , t h e s t e a d y - s t a t e
i n t r a v e s i c u l a r S 1 4 C N - c o n c e n t r a t i o n i s l o w e r t h a n t h e m e d i u m
c o n c e n t r a t i o n . A TP a n d
M g e +
c a u s e a n i n c r e a s e d i n f l u x a n d a
d e c r e a s e d e f f l u x o f S C N - t h a t r e s u l t s i n S C N - b e i n g c o n c e n -
t r a t e d i n t h e v e s i c l e s 6 - t o 8 - f o l d o v e r t h e m e d i u m . Th e f i n d i n g s
a r e c o n s i s t e n t w i t h a n A TP , M g 2 + - i n d u c e d p o t e n t i a l o f a p -
p r o x i m a t e l y 5 0 m V ( i n t r a v e s i c u l a r s i d e p o s i t i v e ) . C a r b o n y l c y -
a n i d e p - t r i f l u o r o m e t h o x y p h e n y l h y d r a z o n e ( F C C P ) , a H +
t r a n s l o c a t e r , a n d N - e t h y l m a l e i m i d e ( N E M ) , a s u l f h y d r y l r e -
a g e n t , d e c r e a s e t h e S C N - r a t i o a n d , t h u s , t h e m e m b r a n e p o -
t e n t i a l i n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d
M g e + .
Th e h a v e n o e f f e c t
o n t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t . Th e r a t e o f c a t e c h o l a m i n e
u p t a k e i n t o v e s i c l e s i s i n c r e a s e d 4 - t o 6 - f o l d b y A TP a n d
M e + .
Th e
A TP , M g e + - s t i m u l a t e d
u p t a k e i s i n h i b i t e d b y F C C P a n d
N E M o v e r t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n r a n g e s t h a t r e d u c e t h e S C N -
d i s t r i b u t i o n ( m e m b r a n e p o t e n t i a l ) . F C C P i n c r e a s e s a n d N E M
d e c r e a s e s v e s i c u l a r m e m b r a n e A TP a s e a c t i v i t y . Th u s , c a t e -
c h o l a m i n e u p t a k e i s c o r r e l a t e d t o a n i n s i d e - p o s i t i v e m e m b r a n e
p o t e n t i a l , a n d n o t t o A TP a s e a c t i v i t y . I f c a t e c h o l a m i n e u p t a k e
i s c o u p l e d t o m e m b r a n e p o t e n t i a l , t h e n a c h a r g e d s p e c i e s m u s t
b e i n v o l v e d i n t h e t r a n s p o r t m e c h a n i s m . Re s e r p i n e a n d r o t e n o n e
i n h i b i t c a t e c h o l a m i n e i n f l u x b u t h a v e n o e f f e c t o n t h e H +
e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t ; t h e y p r o b a b l y a c t a t a s t e p b e f o r e
c o u p l i n g t o t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l ( o r t h e H + e l e c t r o c h e m i c a l
g r a d i e n t ) . A t r a c t y l o s i d e , a n i n h i b i t o r o f n u c l e o t i d e t r a n s p o r t ,
h a s n o e f f e c t s o n c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t o r t h e H + e l e c t r o -
c h e m i c a l g r a d i e n t .
C h r o m a f f i n v e s i c l e s a r e t h e c a t e c h o l a m i n e r g i c s t o r a g e v e s -
i c l e s i n a d r e n a l m e d u l l a r y c e l l s . Th e y a r e i n t i m a t e l y i n v o l v e d
i n b o t h s e c r e t i o n ( v i a e x o c y t o s i s ) a n d i n t r a c e l l u l a r s y n t h e s i s o f
c a t e c h o l a m i n e s . C a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t i n t o v e s i c l e s i s i m -
p o r t a n t f o r b o t h t h e s e p r o c e s s e s . B e c a u s e t h e i n v i t r o r a t e o f
u p t a k e o f c a t e c h o l a m i n e s i n t o c h r o m a f f i n v e s i c l e s i s i n c r e a s e d
s e v e r a l f o l d b y A TP a n d m a g n e s i u m ( 1 ) , i t h a d b e e n t h o u g h t
t h a t t h e M g 2 + - d e p e n d e n t A TP a s e a s s o c i a t e d w i t h t h e v e s i c l e
m e m b r a n e i s a c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t e n z y m e . A l t h o u g h
p a r t i a l c o r r e l a t i o n s h a v e b e e n o b t a i n e d b e t w e e n A TP a s e a c -
t i v i t y a n d c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t ( 2 , 3 ) , l a c k o f a s i m p l e
q u a n t i t a t i v e c o r r e l a t i o n s u g g e s t s t h a t t h e A TP a s e m a y b e i n -
d i r e c t l y r a t h e r t h a n d i r e c t l y i n v o l v e d .
E l e m e n t s o f a c h e m i o s m o t i c s y s t e m i n v o l v i n g t h e H + e l e c -
t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a r e p r e s e n t i n c h r o m a f f i n v e s i c l e s ( F i g .
1 ) . Th e r e i s a H + e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a c r o s s t h e v e s i c l e
m e m b r a n e ( 4 - 6 ) . Th e r e i s a l s o a m e c h a n i s m f o r c r e a t i n g t h i s
g r a d i e n t , t h e m e m b r a n e A TP a s e ( 6 , 7 ) . Th e s e f i n d i n g s r a i s e t h e
C h r o m o f f i n V e s i c l e
H *P u m p A TP a s e M e m b r a n e
[ H + ]
H i g h
[ H + ]
Lo w
M e m b r a n e P o t e n t i a l C a t e c h o l a m i n e
w i t h o u t A TP , M g + + - S t o r a g e
. . ~ C o m p l e x
C a t e c h o l a m i n e Tr a n s p o r t
M e m b r a n P o t e n C o u p l e d
t o H E l e c t r o c h e m i c a l
M e m b r a n e P o t e n t i a / G r a d i e n t ?
w i t h A TP , M g t + +
r a i e t
F I G . 1 . C h e m i o s m o t i c s y s t e m i n a c h r o m a f f i n v e s i c l e .
p o s s i b i l i t y t h a t c a t e c h o l a m i n e u p t a k e i s c o u p l e d t o t h e H +
e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t . Th e r e h a v e b e e n s o m e c o r r e l a t i o n s
b e t w e e n t h e H + e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a n d c a t e c h o l a m i n e
t r a n s p o r t i n t o i n t a c t c h r o m a f f i n v e s i c l e s . J o h n s o n e t a l . ( 8 )
d e m o n s t r a t e d t h a t c a t e c h o l a m i n e i n f l u x w a s c o r r e l a t e d t o t h e
H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t i n t h e a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 +
w h e n i n f l u x i s s m a l l . M e m b r a n e p o t e n t i a l w a s n o t m e a s u r e d
i n t h e s e s t u d i e s , a n d m e m b r a n e p o t e n t i a l c h a n g e s m a y h a v e
o c c u r r e d c o n c o m i t a n t w i t h c h a n g e s i n t h e H + c o n c e n t r a t i o n
g r a d i e n t . B a s h f o r d e t a l . ( 9 ) u s e d a f l u o r e s c e n t p r o b e t o d e m -
o n s t r a t e t h a t A TP a n d M g 2 + " e n e r g i z e " c h r o m a f f i n v e s i c l e s .
Th e p r e c i s e e f f e c t o n t h e H + e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t w a s
u n c l e a r .
I n t h e p r e s e n t s t u d y o n i n t a c t c h r o m a f f i n v e s i c l e s , I h a v e
i n v e s t i g a t e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e 4 - t o 6 - f o l d e n -
h a n c e m e n t o f c a t e c h o l a m i n e i n f l u x b y A TP a n d M g 2 + a n d
A TP , M g 2 + - i n d u c e d c h a n g e s i n t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t
a n d t h e t r a n s v e s i c u l a r m e m b r a n e e l e c t r i c a l p o t e n t i a l . I h a v e
f o u n d t h a t t h e s t i m u l a t i o n o f c a t e c h o l a m i n e i n f l u x i s c o r r e l a t e d
w i t h t h e c r e a t i o n o f a n i n s i d e p o s i t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l
u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h t h e r e a r e n o a l t e r a t i o n s i n t h e H +
c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t . Th e d a t a s u g g e s t t h a t c a t e c h o l a m i n e
i n f l u x i s c o u p l e d t o t h e v e s i c u l a r m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d n o t
d i r e c t l y t o A TP a s e a c t i v i t y .
M A TE RI A LS A N D M E TH O DS
C h r o m a f f i n v e s i c l e s w e r e p u r i f i e d f r o m b o v i n e a d r e n a l m e -
d u l l a e b y u s i n g a s u c r o s e / F i c o l l / 2 H 2 0 d i s c o n t i n u o u s g r a d i e n t
a c c o r d i n g t o Tr i f a r o a n d Dw o r k i n d ( 1 0 ) . C a t e c h o l a m i n e
t r a n s p o r t w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o H a s s e l b a c h a n d Ta u g n e r
( 3 ) a t 3 1 i n 2 8 5 m M s u c r o s e / 1 0 m M K 2 S O 4 / 1 0 m M s o d i u m
p h o s p h a t e i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f A TP a n d M g S O 4 , p H
7 . 0 .
Th e s t e a d y s t a t e u p t a k e o f [ ' 4 C ] m e t h y l a m i n e w a s u s e d t o
m e a s u r e t h e h y d r o g e n i o n c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t a c r o s s t h e
c h r o m a f f i n v e s i c l e m e m b r a n e ( 4 , 1 1 ) . M e m b r a n e p o t e n t i a l w a s
c a l c u l a t e d f r o m t h e s t e a d y - s t a t e [ ' 4 C ] t h i o c y a n a t e ( S 1 4 C N - )
Th e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e
c h a r g e p a y m e n t . Th i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d -
v e r t i s e m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U. S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e
t h i s f a c t .
5 1 9 0
A b b r e v i a t i o n s : N E M , N - e t h y l m a l e i m i d e ; F C C P , c a r b o n y l c y a n i d e
p - t r i f l u o r o m e t h o x y p h e n y l h y d r a z o n e .
*
C u r r e n t a d d r e s s : Un i v e r s i t y o f M i c h i g a n M e d i c a l S c h o o l .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 5 ( 1 9 7 8 ) 5 1 9 1
c o n c e n t r a t i o n r a t i o a c r o s s t h e v e s i c l e m e m b r a n e b y u s i n g t h e
N e r n s t e q u a t i o n ( 5 ) . V e s i c l e s w e r e s e p a r a t e d f r o m s o l u t i o n b y
c e n t r i f u g i n g f o r 3 m i n i n a n E p p e n d o r f 5 4 1 2 m i c r o c e n t r i f u g e .
Th e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t 3 1 0 i n 1 . 5 m l o f t h e s a m e
s o l u t i o n u s e d i n t h e c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t e x p e r i m e n t s . I n -
t r a v e s i c u l a r v o l u m e s w e r e d e t e r m i n e d ( 4 , 1 1 ) i n q u a d r u p l i c a t e
w i t h 3 H 2 0 a n d [ 1 4 C ] d e x t r a n u n d e r c o n d i t i o n s i d e n t i c a l t o t h o s e
u s e d t o d e t e r m i n e t h e m e t h y l a m i n e a n d S C N - d i s t r i b u t i o n s .
N e i t h e r m e t h y l a m i n e n o r S C N - , a t c o n c e n t r a t i o n s u s e d i n
d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s , a l t e r e d c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t i n t o
t h e v e s i c l e s .
A TP a s e a c t i v i t y o f i n t a c t v e s i c l e s w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g
t o H a s s e l b a c h a n d Ta u g n e r ( 3 ) i n s o l u t i o n b u f f e r e d b y 1 0 m M
p i p e r a z i n e - N , N ' - b i s ( 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i d ) ( P i p e s ) a t p H 6 . 9 .
C a t e c h o l a m i n e s w e r e m e a s u r e d b y t h e f l u o r o m e t r i c m e t h o d
o f E u l e r a n d F l o d i n g ( 1 2 ) . P r o t e i n s w e r e m e a s u r e d b y t h e
m e t h o d o f Lo w r y e t a l . ( 1 3 ) w i t h b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s a
s t a n d a r d . P r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d f r o m c a t e c h o l a m i n e s b y
p r e c i p i t a t i o n o f t h e p r o t e i n i n 5 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . C a r b o n y l
c y a n i d e p - t r i f l u o r o m e t h o x y p h e n y l h y d r a z o n e ( F C C P ) w a s a
g i f t f r o m P . G . H e y t l e r , d u P o n t , Wi l m i n g t o n , DE . Dr u g s w e r e
a d d e d f r o m c o n c e n t r a t e d e t h a n o l s o l u t i o n s . C o n t r o l s a l w a y s
c o n t a i n e d t h e e q u i v a l e n t a m o u n t o f e t h a n o l , w h i c h n e v e r e x -
c e e d e d 0 . 5 % . Th e d a t a a r e e x p r e s s e d a s t h e m e a n + S E M . S i g -
n i f i c a n c e w a s t e s t e d b y S t u d e n t ' s t t e s t .
RE S ULTS
E f f e c t o f A TP a n d M g 2 + o n t h e M e t h y l a m i n e a n d S C N -
C o n c e n t r a t i o n Ra t i o s . A TP a n d M g 2 + s t i m u l a t e d t h e r a t e o f
c a t e c h o l a m i n e i n f l u x 4 - t o 6 - f o l d i n t h i s p r e p a r a t i o n . B e c a u s e
t h e r e i s s t r o n g e v i d e n c e t h a t t h e m e m b r a n e - b o u n d A TP a s e i s
a H + p u m p , t h e e f f e c t s o n t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t w e r e
i n v e s t i g a t e d . I n b o t h t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f A TP a n d
M g S O 4 , t h e m e t h y l a m i n e c o n c e n t r a t i o n r a t i o w a s 1 6 w i t h t h e
m e d i u m p H e q u a l t o 6 . 9 0 ( Ta b l e 1 ) . Th u s , t h e i n t r a v e s i c u l a r
p H w a s u n a l t e r e d b y A TP a n d M g 2 + ; t h e i n t r a v e s i c u l a r p H w a s
5 . 7 .
A TP a n d M g 2 + h a d d r a m a t i c e f f e c t s o n t h e S C N - d i s t r i b u -
t i o n . I n t h e a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + , t h e s t e a d y - s t a t e i n t r a -
v e s i c u l a r S 1 4 C N - c o n c e n t r a t i o n w a s l e s s t h a n t h e m e d i u m
c o n c e n t r a t i o n ( F i g . 2 ) . Th e c o m b i n a t i o n o f A TP a n d M g 2 + w a s
r e q u i r e d t o o b t a i n s i g n i f i c a n t a c c u m u l a t i o n o f S C N - w i t h i n
t h e v e s i c l e . I n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + , i n t r a v e s i c u l a r
S C N - a t t a i n e d a s t e a d y - s t a t e c o n c e n t r a t i o n i n 1 0 - 2 0 m i n ( F i g .
2 ) t h a t w a s 6 - t o 8 - f o l d g r e a t e r t h a n t h e m e d i u m c o n c e n t r a t i o n .
S i m i l a r b u t s m a l l e r a c c u m u l a t i o n s w e r e o b t a i n e d b y P o l l a r d
e t a l . ( 5 ) i n e x p e r i m e n t s d o n e a t 0 4 ' . Th e s a m e d i s t r i b u t i o n
r a t i o w a s o b t a i n e d o v e r a 5 0 - f o l d r a n g e o f m e d i u m S C N -
c o n c e n t r a t i o n ( 4 - 2 0 0 , u M ) . I f t h e d i s t r i b u t i o n o f S C N - i s a
m e a s u r e o f m e m b r a n e p o t e n t i a l , t h e n i n t h e a b s e n c e o f A TP
a n d M g 2 + t h e i n t r a v e s i c u l a r p o t e n t i a l w a s n e g a t i v e . A TP a n d
M g 2 + c r e a t e d a n a p p r o x i m a t e l y 5 0 - m V i n s i d e - p o s i t i v e p o t e n -
t i a l . Th i s p o t e n t i a l c h a n g e i n c r e a s e s t h e H + e l e c t r o c h e m i c a l
g r a d i e n t .
Ta b l e 1 . E f f e c t o f F C C P o n t h e m e t h y l a m i n e d i s t r i b u t i o n
[ C H 3 N H i ] / [ C H 3 N H 3 o
0 A TP , 0 M g S O 4 5 m M A TP , 5 m M M g S O 4
C o n t r o l 1 6 . 6 0 . 9 3 1 6 . 6 1 . 2 2
F C C P ( 1 A M )
1 6 . 1 0 . 5 2 1 5 . 9 0 . 7 1
C h r o m a f f i n v e s i c l e s ( 2 . 1 m g o f p r o t e i n ) w e r e e q u i l i b r a t e d w i t h
[ 1 4 C ] m e t h y l a m i n e ( C H 3 N H 2 ) a t 3 1 f o r 1 0 m i n i n t h e p r e s e n c e o r
a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + ( i a n d o , i n s i d e a n d o u t s i d e ) . F C C P w a s
p r e s e n t f r o m t h e b e g i n n i n g o f t h e i n c u b a t i o n . M e d i u m p H w a s 6 . 9 0 .
Th e r e w e r e f o u r s a m p l e s p e r g r o u p .
I f S C N - i s a c t e d u p o n b y a n i n s i d e - p o s i t i v e p o t e n t i a l t h a t i s
c r e a t e d b y A TP a n d M g 2 + , t h e n t h e e f f l u x o f S C N - f r o m
c h r o m a f f i n v e s i c l e s s h o u l d b e s l o w e d b y A TP a n d M g 2 + .
C h r o m a f f i n v e s i c l e s w e r e p r e i n c u b a t e d w i t h S 1 4 C N - i n t h e
p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + a n d t h e n p e l l e t e d . Th e s u p e r n a t a n t
w a s r e m o v e d a n d t h e v e s i c l e s w e r e r e s u s p e n d e d f o r 1 m i n i n
e i t h e r t h e p r e s e n c e o r t h e a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + . Th e e f f l u x
o f S C N - w a s d e t e r m i n e d b y r e p e l l e t i n g t h e v e s i c l e s a n d m e a -
s u r i n g t h e r a d i o a c t i v i t y r e m a i n i n g i n t h e p e l l e t . Th e f r a c t i o n
o f S C N - r e m a i n i n g i n t h e p e l l e t a t 1 m i n w a s 0 . 3 9 6
k
0 . 0 2 ( n
=
6 ) i n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + a n d 0 . 2 4 5 + 0 . 0 1 9 i n t h e
a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + ( n
=
6 ; P < 0 . 0 0 1 c o m p a r e d t o t h e
p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + ) . Th e c o m b i n a t i o n o f A TP a n d
M g 2 + a c t s o n S C N - i n f l u x ( r a t e i n c r e a s e s ) a n d e f f l u x ( r a t e d e -
c r e a s e s ) i n a m a n n e r c o n s i s t e n t w i t h i t s c r e a t i n g a n i n w a r d
p o s i t i v e p o t e n t i a l a c r o s s t h e c h r o m a f f i n v e s i c l e m e m b r a n e .
E f f e c t s o f F C C P o n C a t e c h o l a m i n e Tr a n s p o r t , M e t h y l -
a m i n e C o n c e n t r a t i o n Ra t i o , a n d S C N - C o n c e n t r a t i o n Ra t i o .
F C C P i s a H + c a r r i e r a n d a n u n c o u p l e r o f m i t o c h o n d r i a l o x i -
d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n . I n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + ,
F C C P ( 1 , u M ) i n h i b i t e d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x 7 0 % w i t h o u t
s i g n i f i c a n t e f f e c t o n c a t e c h o l a m i n e e f f l u x ( F i g . 3 B ) . F C C P d i d
n o t i n c r e a s e t h e r e l e a s e o f i n t r a v e s i c u l a r p r o t e i n o r c a t e c h o l -
a m i n e i n t o t h e m e d i u m , w h i c h i n d i c a t e s t h a t F C C P d i d n o t
i n d u c e l y s i s . Th e - s m a l l i n f l u x t h a t o c c u r s i n t h e a b s e n c e o f A TP
a n d M g 2 + ( 2 0 % o f t h e i n f l u x i n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + )
i s i n h i b i t e d o n l y 2 0 % b y F C C P ( F i g . 3 A ) . F C C P , t h e r e f o r e , h a s
i t s m a j o r i n h i b i t o r y e f f e c t o n t h e A TP , M g 2 + - s t i m u l a t e d c a t e -
c h o l a m i n e i n f l u x . B e c a u s e F C C P i s a H + c a r r i e r , i t w a s i m -
p o r t a n t t o d e t e r m i n e i t s e f f e c t s o n t h e H + g r a d i e n t a c r o s s t h e
c h r o m a f f i n v e s i c l e m e m b r a n e . F C C P ( 1 , u M )
h a d n o e f f e c t o n
t h e m e t h y l a m i n e r a t i o a n d , t h e r e f o r e , o n t h e H + g r a d i e n t i n
t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + ( Ta b l e 1 ) . B e c a u s e
F C C P a c t s i n a r e l a t i v e l y s p e c i f i c m a n n e r a s a H + c a r r i e r , t h e
r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e c h r o m a f f i n v e s i c l e m e m b r a n e i s i m -
p e r m e a b l e t o t h e o t h e r i o n s p r e s e n t . Th e r e c o u l d b e n o n e t e x i t
o f H + b e c a u s e t h e r e w a s n o c a t i o n i t c o u l d e x c h a n g e w i t h a n d
n o i n t r a v e s i c u l a r a n i o n t h a t c o u l d a c c o m p a n y i t o u t o f t h e
v e s i c l e . Th e i m p e r m e a b l e n a t u r e o f t h e c h r o m a f f i n v e s i c l e
m e m b r a n e i s a l s o s u g g e s t e d b y t h e e x p e r i m e n t s o f J o h n s o n a n d
S c a r p a ( 4 , 1 1 ) .
I f t h e s e n o t i o n s a r e c o r r e c t , t h e n F C C P s h o u l d b e i n c r e a s i n g
t h e H + c o n d u c t a n c e o f t h e m e m b r a n e . B e c a u s e t h e i n t r a v e s i -
c u l a r H + c o n c e n t r a t i o n i s o v e r 1 0 - f o l d g r e a t e r t h a n t h e m e d i u m
H + c o n c e n t r a t i o n , t h e m e m b r a n e s h o u l d b e d e p o l a r i z e d , e v e n
i n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + . Th i s s h o u l d b e r e f l e c t e d b y
l o 1
0
- i
u z
C . _ )
Z 5
z
A TP
M g 2 +
y
2 0 4 0 6 0
M i n u t e s
F I G . 2 . Ti m e c o u r s e o f S 1 4 C N - u p t a k e i n t o c h r o m a f f i n v e s i c l e s
i n t h e p r e s e n c e ( - ) a n d a b s e n c e ( 0 ) o f A TP a n d M g 2 + . C h r o m a f f i n
v e s i c l e s ( 1 . 7 m g o f p r o t e i n ) w e r e i n c u b a t e d a t 3 1 0 f o r v a r i o u s t i m e s
a t p H 7 . 0 . Th e s o l u t i o n s c o n t a i n e d 3 H 2 0 , S 1 4 C N - , a n d , w h e n p r e s e n t ,
5 m M A TP a n d 5 m M M g S O 4 . I n p a r a l l e l e x p e r i m e n t s , t h e f r a c t i o n a l
i n t r a v e s i c u l a r w a t e r v o l u m e s o f t h e p e l l e t s f o r e a c h p o i n t w e r e m e a -
s u r e d . P o i n t s w i t h S E M b a r s r e p r e s e n t t h e m e a n o f t r i p l i c a t e s a m p l e s ;
o t h e r p o i n t s r e p r e s e n t t h e m e a n o f d u p l i c a t e s a m p l e s .
N e u r o b i o l o g y :
H o l z -
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 5 ( 1 9 7 8 )
A O A TP
0 M g S O 4
1 m M E DTA
1 . 2
x
C
1 . 0
0
x
0 . 8
0
c
E
0 . 6
a
0
c o 0 . 4
0
0
' r .
0 . 2
I n
0 1
I n f l u x
_
_ -
_ -
_
E f f l u x
C o n t r o l F C C P C o n t r o l F C C P C o n t r o l F C C P
F I G . 3 . E f f e c t o f 1 M M F C C P o n c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t i n t h e
a b s e n c e ( A ) a n d i n t h e p r e s e n c e ( B ) o f A TP a n d M g 2 + . C h r o -
m a f f i n v e s i c l e s ( 0 . 6 m g o f p r o t e i n ) w e r e i n c u b a t e d a t 3 1 0 a t p H 7 . 0
w i t h 1 - [ 7 - 3 H ] n o r e p i n e p h r i n e w i t h e i t h e r ( A ) 1 m M s o d i u m E DTA ,
o r ( B ) 5 m M A TP a n d 5 m M M g S O 4 . Th e E DTA w a s i n c l u d e d t o
c o m p l e x t r a c e d i v a l e n t i o n s t h a t , t o g e t h e r w i t h a s m a l l a m o u n t o f A TP
t h a t w o u l d h a v e l e a k e d o u t o f t h e v e s i c l e s , m i g h t s t i m u l a t e c a t e -
c h o l a m i n e i n f l u x . Th e d a t a a r e p l o t t e d r e l a t i v e t o t h e c o n t r o l i n f l u x e s
a n d e f f l u x e s i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + . Th e
c o n t r o l v a l u e s f o r t h e i n f l u x a n d e f f l u x i n t h e a b s e n c e o f A TP a n d
M g 2 + w e r e 0 . 2 0 4 a n d 2 . 6 1 n m o l / m i n , r e s p e c t i v e l y . Th e c o n t r o l v a l u e s
f o r t h e i n f l u x a n d e f f l u x i n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + w e r e 1 . 1 2
a n d 1 . 8 0 n m o l / m i n , r e s p e c t i v e l y . n = 4 f o r a l l t h e c o n t r o l s ; n = 3 f o r
m e a s u r e m e n t s w i t h F C C P .
* P < 0 . 0 5 .
t
P <0 . 0 0 1 .
a r e d u c e d v e s i c u l a r u p t a k e o f S 1 4 C N - . I n d e e d , F C C P ( 1 , u M )
i n h i b i t s t h e A TP , M g 2 - i n d u c e d a c c u m u l a t i o n o f S 1 4 C N - ( F i g .
4 ) . Th e e f f e c t i s n o t c a u s e d b y a r e d u c e d S C N - p e r m e a b i l i t y ,
b e c a u s e F C C P a d d e d d u r i n g t h e i n c u b a t i o n c a u s e s t h e S C N -
d i s t r i b u t i o n t o c o l l a p s e . Th e e f f e c t s o f F C C P o n c a t e c h o l a m i n e
i n f l u x a n d o n t h e S C N - d i s t r i b u t i o n a r e w e l l c o r r e l a t e d ( F i g .
5 ) . Th e c o n c e n t r a t i o n n e c e s s a r y f o r h a l f - m a x i m a l e f f e c t s o n
b o t h p r o c e s s e s i s 0 . 6 - 0 . 7 , M .
E f f e c t s o f N - E t h y l m a l e i m i d e ( N E M ) o n C a t e c h o l a m i n e
Tr a n s p o r t , M e t h y l a m i n e C o n c e n t r a t i o n Ra t i o , a n d S C N -
C o n c e n t r a t i o n Ra t i o . N E M , a s u l f h y d r y l r e a g e n t , i n h i b i t s b o t h
8 3 _
o
F C C P
Z
6 C o n t r o l
4T e s
2
1 ~
- > - ~~ F C C P
1 0 2 0
M i n u t e s .
F I G . 4 . Ti m e c o u r s e o f t h e e f f e c t s o f 1 j u M F C C P o n t h e S 1 4 C N -
d i s t r i b u t i o n i n c h r o m a f f i n v e s i c l e s . C h r o m a f f i n v e s i c l e s ( 2 . 1 2 m g o f
p r o t e i n ) w e r e i n c u b a t e d f o r v a r i o u s t i m e s a t 3 1 0 i n m e d i u m c o n t a i n i n g
3 H 2 0 , S 1 4 C N - , 5 m M A TP , a n d 5 m M M g S O 4 , a t p H 7 . 0 2 . I n c u b a -
t i o n s w e r e d o n e i n t r i p l i c a t e . I n p a r a l l e l e x p e r i m e n t s ,
t h e f r a c t i o n a l
i n t r a v e s i c u l a r w a t e r v o l u m e s o f t h e p e l l e t s f o r e a c h p o i n t w e r e m e a -
s u r e d . F C C P w a s a d d e d t o t h e m e d i u m e i t h e r b e f o r e t h e i n c u b a t i o n
b e g a n ( l o w e r h o r i z o n t a l l i n e ) o r a t t h e 1 0 - m i n p o i n t ( a r r o w ) . N o t e t h a t ,
a t 2 0 m i n , t h e S C N - d i s t r i b u t i o n w a s t h e s a m e w h e t h e r t h e F C C P w a s
a d d e d b e f o r e t h e b e g i n n i n g o f t h e i n c u b a t i o n o r a f t e r 1 0 m i n
o f i n c u b a t i o n .
*
P < 0 . 0 0 1 c o m p a r e d t o 1 0 - m i n c o n t r o l .
t
P < 0 . 0 0 1 c o m p a r e d t o b o t h 1 0 - a n d 2 0 - m i n c o n t r o l s .
x
0 [ S C N
] i / [ S C N
l o
0
0 . 5
-
* C a t e c h o l a m i n e
. > ~~~i n f l u x \
C r
o, ~~I
0 . 5 1 . 0
[ F C C P ] ,
M M
F I G . 5 . Do s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f F C C P o n c a t e -
c h o l a m i n e i n f l u x ( 0 ) a n d t h e S 1 4 C N - d i s t r i b u t i o n ( 0 ) . C h r o m a f f i n
v e s i c l e s c o r r e s p o n d i n g t o 0 . 5 m g o f p r o t e i n p e r m l o f i n c u b a t i o n m e -
d i u m w e r e u s e d i n t h e c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t d e t e r m i n a t i o n a n d
1 . 3 m g o f p r o t e i n p e r m l o f i n c u b a t i o n m e d i u m f o r t h e S C N - r a t i o
d e t e r m i n a t i o n . A TP a n d M g S O 4 w e r e p r e s e n t a t 5 m M i n b o t h e x -
p e r i m e n t s .
c a t e c h o l a m i n e i n f l u x i n t o c h r o m a f f i n v e s i c l e s a n d t h e v e s i c u l a r
m e m b r a n e A TP a s e . N E M w a s u s e d b y H a s s e l b a c h a n d Ta u g n e r
( 3 ) t o o b t a i n a p a r t i a l c o r r e l a t i o n b e t w e e n c a t e c h o l a m i n e i n f l u x
a n d A TP a s e a c t i v i t y . Th e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f N E M a r e r e -
d u c e d i f N E M a c t s i n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + . I n l i g h t
o f t h e a b o v e d a t a c o r r e l a t i n g c a t e c h o l a m i n e i n f l u x w i t h
m e m b r a n e p o t e n t i a l , t h e e f f e c t s o f N E M o n c a t e c h o l a m i n e
i n f l u x , m e m b r a n e p o t e n t i a l , a n d t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t
w e r e i n v e s t i g a t e d .
I f c h r o m a f f i n v e s i c l e s a r e i n c u b a t e d w i t h N E M i n t h e p r e s -
e n c e o f A TP a n d M g 2 + , t h e r e i s o n l y a s m a l l ( 1 0 % ) i n h i b i t i o n
o f c a t e c h o l a m i n e i n f l u x , a n d n o e f f e c t o n t h e S C N - a n d m e -
t h y l a m i n e d i s t r i b u t i o n s ( F i g . 6 A ) . H o w e v e r , i f v e s i c l e s a r e i n -
c u b a t e d w i t h N E M b e f o r e t h e a d d i t i o n o f A TP a n d M g 2 + , t h e n
A TP , M g 2 + - s t i m u l a t e d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x i s i n h i b i t e d 5 0 %
( F i g . 6 B ) . N E M d i d n o t h a v e s i g n i f i c a n t e f f e c t o n c a t e c h o l -
a m i n e e f f l u x . Th e s e r e s u l t s a r e c o m p a r a b l e t o t h o s e o f H a s s e l -
b a c h a n d Ta u g n e r ( 3 ) . Th e r e d u c t i o n i n t h e S C N - c o n c e n t r a -
t i o n r a t i o b y N E M c o r r e s p o n d s t o a 1 0 - m V d e c r e a s e i n e l e c t r i c a l
p o t e n t i a l . Th e r e i s n o c h a n g e i n t h e m e t h y l a m i n e r a t i o . H e n c e ,
t h e r e i s o n c e a g a i n a c o r r e l a t i o n b e t w e e n m e m b r a n e p o t e n t i a l
a n d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x . Un d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h N E M
r e d u c e s m e m b r a n e p o t e n t i a l ( w i t h o u t e f f e c t o n t h e H + c o n -
c e n t r a t i o n r a t i o ) , t h e r e i s a l a r g e i n h i b i t i o n o f c a t e c h o l a m i n e
i n f l u x . Un d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h N E M h a s n o e f f e c t o n
m e m b r a n e p o t e n t i a l ( a n d n o e f f e c t o n t h e H + c o n c e n t r a t i o n
r a t i o ) , N E M h a s o n l y a s m a l l e f f e c t o n c a t e c h o l a m i n e i n f l u x .
E f f e c t s o f N E M a n d F C C P o n V e s i c u l a r M e m b r a n e
A TP a s e A c t i v i t y . N E M a n d F C C P b o t h r e d u c e t h e
A TP , M g 2 + - i n d u c e d p o t e n t i a l a n d i n h i b i t A TP , M g 2 + - s t i m u l a t e d
c a t e c h o l a m i n e i n f l u x . N E M h a s b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i t ( 3 ) ,
w h e r e a s F C C P h a s b e e n r e p o r t e d t o s t i m u l a t e ( 1 4 ) , t h e v e s i c u l a r
m e m b r a n e A TP a s e . B e c a u s e t h e c h r o m a f f i n v e s i c l e s i n t h e
p r e s e n t s t u d y w e r e m o r e e x t e n s i v e l y p u r i f i e d t h a n i n t h e p r e -
v i o u s s t u d i e s ( b o t h u t i l i z e d p a r t i a l l y p u r i f i e d c h r o m a f f i n v e s -
i c l e s ) , t h e e f f e c t s o f t h e s e a g e n t s o n v e s i c u l a r m e m b r a n e A TP a s e
a c t i v i t y w e r e r e i n v e s t i g a t e d ( Ta b l e 2 ) . N E M h a s n o e f f e c t o n
t h e A TP a s e a c t i v i t y i f A TP a n d M g 2 + a r e p r e s e n t b e f o r e t h e
a d d i t i o n o f N E M ( e x p e r i m e n t 1 A ) . H o w e v e r , i f c h r o m a f f i n
v e s i c l e s a r e i n c u b a t e d w i t h N E M b e f o r e A TP a n d M g 2 + a r e
a d d e d , t h e n t h e A TP a s e i s i n h i b i t e d 2 3 % ( e x p e r i m e n t 1 B ) .
Th e s e r e s u l t s a r e c o m p a r a b l e t o t h o s e o f H a s s e l b a c h a n d
Ta u g n e r ( 3 ) , e x c e p t t h a t t h e y h a d o b s e r v e d i n c o m p l e t e p r o -
t e c t i o n b y p r i o r a d d i t i o n o f A TP a n d M g 2 + , a r e s u l t p o s s i b l y
c a u s e d b y c o n t a m i n a t i n g A TP a s e . F C C P c a u s e d a 6 0 % s t i m u -
5 1 9 2
N e u r o b i o l o g y :
H o l z
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 5 ( 1 9 7 8 ) 5 1 9 3
A
x 1 .
- c
0 .
9

. 0
.
S r
C o n t r o l N E M
0
- T
I
z
x
I
. :
+ q q
z
I
5 9 . 4
m v
F I G . 6 . E f f e c t s o f N E M o n c a t e c h o l a m i n e i n f l u x , S C N - c o n c e n t r a t i o n r a t i o , a n d m e t h y l a m i n e ( C H 3 N H ) c o n c e n t r a t i o n . r a t i o a c r o s s t h e
c h r o m a f f i n v e s i c l e m e m b r a n e . ( A ) A TP , M g 2 + b e f o r e N E M . C h r o m a f f i n v e s i c l e s w e r e i n c u b a t e d i n m e d i u m c o n t a i n i n g 5 m M A TP a n d 5 m M
M g S O 4 a t 3 1 0 . A f t e r 5
m i n ,
0 . 1 m M N E M w a s a d d e d . A f t e r a n a d d i t i o n a l 1 0
m i n ,
d l - [ 3 H ] e p i n e p h r i n e , S 1 4 C N - a n d 3 H 2 0 , o r [ 1 4 C ] m e t h y l a m i n e
a n d 3 H 2 0 w e r e a d d e d t o m e a s u r e c a t e c h o l a m i n e i n f l u x , S C N - d i s t r i b u t i o n , o r m e t h y l a m i n e d i s t r i b u t i o n , r e s p e c t i v e l y . C a t e c h o l a m i n e i n f l u x
w a s d e t e r m i n e d o v e r a 1 0 - m i n p e r i o d . S C N - a n d m e t h y l a m i n e d i s t r i b u t i o n s w e r e d e t e r m i n e d a f t e r a 1 5 - m i n i n c u b a t i o n . I n p a r a l l e l e x p e r i m e n t s ,
t h e f r a c t i o n a l i n t r a v e s i c u l a r w a t e r v o l u m e s o f t h e p e l l e t s w e r e d e t e r m i n e d . ( B ) N E M b e f o r e A TP , M g 2 + . C h r o m a f f i n v e s i c l e s w e r e i n c u b a t e d
i n m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 1 m M N E M i n t h e a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + a t 3 1 0 . A f t e r 1 0 m i n , i s o t o p e s w e r e a d d e d a n d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x , S C N -
d i s t r i b u t i o n , a n d m e t h y l a m i n e d i s t r i b u t i o n w e r e d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d f o r A . n = 4 - 6 p e r g r o u p .
*P <0 . 0 5 .
t p S 0 . 0 0 1 .
l a t i o n o f A TP a s e a c t i v i t y ( e x p e r i m e n t 2 ) , w h i c h i s s i m i l a r t o t h a t
o b t a i n e d b y B a s h f o r d e t a l . ( 1 4 ) .
I t w a s a l s o f o u n d t h a t t h e a b s o l u t e i n c r e a s e i n A TP a s e a c t i v i t y
o f 1 4 . 7 n m o l / m i n p e r m g o f p r o t e i n c a u s e d b y F C C P w a s r e -
d u c e d b y N E M ( 0 . 3 m M ) t o 2 . 0 n m o l / m i n p e r m g o f p r o t e i n .
Th u s , t h e s a m e e n z y m e t h a t i s s t i m u l a t e d b y F C C P i s i n h i b i t e d
b y N E M .
A g e n t s t h a t A l t e r n e i t h e r M e t h y l a m i n e n o r S C N - Di s t r i -
b u t i o n . Th e r e a r e a g e n t s t h a t i n h i b i t c a t e c h o l a m i n e u p t a k e t h a t
a l t e r n e i t h e r t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l n o r t h e H + c o n c e n t r a t i o n
g r a d i e n t ( Ta b l e 3 ) . Re s e r p i n e , t h e c l a s s i c a l i n h i b i t o r o f c a t e -
c h o l a m i n e t r a n s p o r t i n t o c h r o m a f f i n v e s i c l e s , i s a n i m p o r t a n t
e x a m p l e . S i m i l a r r e s u l t s h a v e r e c e n t l y b e e n o b t a i n e d i n c h r o -
m a f f i n v e s i c l e " g h o s t s " ( 1 5 ) . Re s e r p i n e m a y d i r e c t l y i n t e r f e r e
w i t h t h e c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t m e c h a n i s m a n d n o t w i t h t h e
e n e r g y s o u r c e . Ro t e n o n e , a n i n h i b i t o r o f s i t e 1 o f t h e e l e c t r o n
Ta b l e 2 . E f f e c t s o f N E M a n d F C C P o n c h r o m a f f i n v e s i c l e
A TP a s e a c t i v i t y
A TP a s e , n m o l
p h o s p h a t e / m i n
E x p . C o n d i t i o n s p e r m g p r o t e i n
1 A . A TP , M g 2 + C o n t r o l 2 4 . 1 0 . 9
b e f o r e N E M N E M ( 0 . 1 m M ) 2 3 . 0 + 0 . 9
1 B . N E M b e f o r e C o n t r o l 3 4 . 1 + 0 . 8
A TP , M g 2 + N E M ( 0 . 1 m M ) 2 6 . 4 t 0 . 7 *
2 . C o n t r o l 2 6 . 0 + 1 . 0
F C C P ( 1 A M )
4 0 . 7 i 0 . 9 *
N E M ( 0 . 3 m M ) 1 4 . 7 + 0 . 5 *
N E M ( 0 . 3 m M ) 1 7 . 7 0 . 5 t
+ F C C P ( 1 I M )
E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h c h r o m a f f i n v e s i c l e s a t 0 . 8 - 1 . 1
m g o f p r o t e i n p e r m l . I n e x p . 1 A c h r o m a f f i n v e s i c l e s w e r e p r e i n c u b a t e d
f o r 5 m i n i n 5 m M A TP a n d 5 m M M g S O 4 b e f o r e N E M w a s a d d e d .
I n e x p . 1 B , N E M w a s a d d e d 1 0 m i n b e f o r e 5 m M A TP a n d 5 m M
M g S O 4 . I n b o t h 1 A a n d 1 B , A TP h y d r o l y s i s w a s m e a s u r e d d u r i n g a
1 5 - m i n p e r i o d b e g i n n i n g 1 0 m i n a f t e r N E M w a s a d d e d . I n e x p . 2 ,
c h r o m a f f i n v e s i c l e s w e r e i n c u b a t e d f o r 5 m i n i n t h e a b s e n c e o f A TP
a n d M g 2 + w i t h o r w i t h o u t N E M . A t 5 m i n , 5 m M A TP a n d 5 m M
M g S O 4 w e r e a d d e d w i t h o r w i t h o u t F C C P . A TP h y d r o l y s i s w a s
m e a s u r e d o v e r t h e f o l l o w i n g 1 5 - m i n p e r i o d .
*
P < 0 . 0 1 v s . c o n t r o l .
t
P < 0 . 0 0 1 v s . c o n t r o l a n d F C C P g r o u p s a n d P < 0 . 0 1 v s . N E M g r o u p .
t r a n s p o r t c h a i n i n m i t o c h o n d r i a , i s a l s o a p o t e n t i n h i b i t o r o f
c a t e c h o l a m i n e i n f l u x . I t d o e s n o t a l t e r c a t e c h o l a m i n e e f f l u x a n d
h a s e f f e c t s o n n e i t h e r t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t n o r t h e
m e m b r a n e p o t e n t i a l . I t m a y a c t i n t h e s a m e m a n n e r a s r e s e r -
p i n e . A t r a c t y l o s i d e , a n i n h i b i t o r o f n u c l e o t i d e t r a n s p o r t a c r o s s
t h e c h r o m a f f i n v e s i c l e m e m b r a n e ( 1 6 ) , h a s n o e f f e c t o n c a t e -
c h o l a m i n e t r a n s p o r t , t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t , o r t h e
m e m b r a n e p o t e n t i a l . Th i s s u g g e s t s t h a t A TP t r a n s p o r t i n t o
v e s i c l e s i s n o t a p r e r e q u i s i t e f o r t h e e f f e c t o f A TP a n d M g 2 + o n
e l e c t r i c a l p o t e n t i a l a n d c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t .
DI S C US S I O N
A TP a n d M g 2 + s t i m u l a t e , i n u i t r o , t h e i n f l u x o f c a t e c h o l a m i n e s
i n t o c h r o m a f f i n v e s i c l e s , t h e a d r e n e r g i c s t o r a g e v e s i c l e s i n
a d r e n a l m e d u l l a r y c e l l s . I n t h i s s t u d y w i t h i n t a c t c h r o m a f f i n
v e s i c l e s , a n i n s i d e - p o s i t i v e v e s i c l e m e m b r a n e p o t e n t i a l c o r r e -
l a t e d w i t h t h e A TP , M g 2 + - i n d u c e d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x i n
t h r e e w a y s : ( i ) Th e c o m b i n a t i o n o f A TP a n d M g 2 + i n c r e a s e d
t h e r a t e o f c a t e c h o l a m i n e i n f l u x s e v e r a l f o l d a n d i n d u c e d a
c h a n g e i n t h e i n t r a v e s i c u l a r m e m b r a n e p o t e n t i a l f r o m a n e g -
a t i v e v a l u e t o a p p r o x i m a t e l y + 5 0 m V w i t h o u t a l t e r i n g t h e H +
c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t . ( i i ) I n t h e p r e s e n c e o f A TP a n d M g 2 + ,
F C C P , a H + c a r r i e r , i n h i b i t e d c a t e c h o l a m i n e u p t a k e i n t o t h e
v e s i c l e s a n d r e d u c e d m e m b r a n e p o t e n t i a l o v e r a l m o s t i d e n t i c a l
Ta b l e 3 . E f f e c t o f v a r i o u s d r u g s o n c a t e c h o l a m i n e i n f l u x a n d o n
m e t h y l a m i n e a n d S C N - d i s t r i b u t i o n s
Re l a t i v e
c a t e c h o l a m i n e [ C H 3 N H ' ] i / [ S C N ] i /
i n f l u x [ C H 3 N H 3 i O [ S C N J O
C o n t r o l 1 . 0 0 0 . 0 5 1 4 . 8 + 0 . 6 8 . 8 1 0 . 4 2
Re s e r p i n e ( 5 , M ) 0 . 2 2 0 . 0 1 * 1 6 . 3

0 . 3 8 . 7 3 0 . 1 1
Ro t e n o n e ( 2 5 M M ) 0 . 4 1 0 . 0 7 * 1 6 . 2 + 0 . 2 8 . 4 4 + 0 . 1 9
A t r a c t y l o s i d e
( 0 . 2 m M ) 0 . 9 6 0 . 0 1 1 6 . 0

0 . 5 8 . 9 5
0 . 1 0
C a t e c h o l a m i n e i n f l u x , m e t h y l a m i n e ( C H 3 N H + ) d i s t r i b u t i o n , a n d
S C N - d i s t r i b u t i o n w e r e d e t e r m i n e d i n s e p a r a t e i n c u b a t i o n s a t 3 1 0
i n t h e p r e s e n c e o f 5 m M A TP a n d 5 m M M g 2 + . C a t e c h o l a m i n e i n f l u x
w a s d e t e r m i n e d o v e r a 1 0 - m i n i n c u b a t i o n . M e t h y l a m i n e a n d S C N -
d i s t r i b u t i o n s w e r e d e t e r m i n e d a f t e r 1 0 - a n d 1 5 - m i n i n c u b a t i o n s , r e -
s p e c t i v e l y . Th e r e w a s 1 - 2 m g o f p r o t e i n p e r s a m p l e . Dr u g s w e r e
p r e s e n t a t t h e b e g i n n i n g o f t h e i n c u b a t i o n . M e d i u m p H w a s 6 . 9 0 .
Th e r e w e r e f o u r s a m p l e s p e r g r o u p .
*
P < 0 . 0 0 1 v s . c o n t r o l .
N e u r o b i o l o g y :
H o l z
P r o c . N a t i . A c a d . S c i . US A 7 5 ( 1 9 7 8 )
c o n c e n t r a t i o n r a n g e s o f F C C P . Th e c h a n g e i n p o t e n t i a l c a u s e d
b y F C C P ( i n t r a v e s i c u l a r s i d e m o r e n e g a t i v e ) i n t h e p r e s e n c e
o f a l a r g e r i n t r a v e s i c u l a r t h a n e x t r a v e s i c u l a r H + c o n c e n t r a t i o n
i s t h e c h a n g e e x p e c t e d i f F C C P a c t s a s a H + c a r r i e r i n t h e v e s -
i c l e m e m b r a n e . F C C P h a d n o e f f e c t o n t h e H + c o n c e n t r a t i o n
g r a d i e n t . Th e i n h i b i t i o n o f c a t e c h o l a m i n e u p t a k e i n t o s t o r a g e
v e s i c l e s b y H + c a r r i e r s h a s b e e n p r e v i o u s l y o b s e r v e d i n s p l e n i c
n e r v e v e s i c l e s ( 1 7 ) a n d i n c h r o m a f f i n v e s i c l e s ( 1 8 ) . ( i i i ) N E M ,
w h e n p r e i n c u b a t e d w i t h v e s i c l e s i n t h e a b s e n c e o f A TP a n d
M g 2 + , r e d u c e d t h e A TP M g 2 + - i n d u c e d p o t e n t i a l a c r o s s t h e
v e s i c l e m e m b r a n e a n d i n h i b i t e d A TP , M g 2 + - s t i m u l a t e d c a t e -
c h o l a m i n e i n f l u x . Wh e n t h e e f f e c t o f N E M o n m e m b r a n e p o -
t e n t i a l w a s p r e v e n t e d b y c o i n c u b a t i o n o f N E M w i t h A TP a n d
M g 2 + , t h e i n h i b i t i o n o f A TP M g 2 + - s t i m u l a t e d c a t e c h o l a m i n e
i n f l u x w a s a l m o s t c o m p l e t e l y p r e v e n t e d .
Re s e r p i n e , w h i c h b l o c k s c a t e c h o l a m i n e i n f l u x , h a d n o e f f e c t
o n t h e p o t e n t i a l . I t i s , t h e r e f o r e , u n l i k e l y t h a t t h e p o t e n t i a l
d e v e l o p s f r o m t h e p r o c e s s o f c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t . F u r -
t h e r m o r e , a s d i s c u s s e d b e l o w , c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t i s n o t
c o r r e l a t e d w i t h v e s i c u l a r m e m b r a n e A TP a s e a c t i v i t y . Th e r e -
s u l t s s u g g e s t t h a t t h e t r a n s v e s c u l a r m e m r r a n e p o t e n t i a l d r i v e s
A TP , M g 2 + - s t i m u l a t e d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x . Th e c h a n g e i n
m e m b r a n e p o t e n t i a l i n d u c e d b y A TP a n d M g 2 + i s i n t h e d i -
r e c t i o n t o i n c r e a s e t h e e l e c t r i c a l c o m p o n e n t o f t h e H + e l e c -
t r o c h e m i c a l g r a d i e n t ( F i g . 1 ) ; t h e r e s u l t s a r e , t h e r e f o r e , c o m -
p a t i b l e w i t h t h e A TP , M g 2 + s t i m u l a t i o n o f c a t e c h o l a m i n e i n f l u x
b e i n g c a u s e d b y a n i n c r e a s e d H + e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t .
Un d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h t h e i n t r a v e s i c u l a r s p a c e i s a c i d i f i e d
b y A TP a n d M g 2 + ( 6 ) ( n o t i n v e s t i g a t e d i n t h e p r e s e n t s t u d y ) ,
t h e i n c r e a s e d H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t m a y a l s o c o n t r i b u t e
t o t h e s t i m u l a t i o n o f c a t e c h o l a m i n e u p t a k e .
Th e r e i s c o m p e l l i n g e v i d e n c e t h a t t h e A TP a s e o f t h e c h r o -
m a f f i n v e s i c l e m e m b r a n e i s a H + p u m p t h a t c a n i n c r e a s e t h e
i n t r a v e s i c u l a r H + c o n c e n t r a t i o n ( 6 , 7 , 1 4 ) . O n e i m p o r t a n t a s p e c t
o f t h e p r e s e n t s t u d y w a s t h e a l t e r a t i o n o f m e m b r a n e p o t e n t i a l
b y A TP , M g 2 + , a n d F C C P w i t h o u t t h e a l t e r a t i o n o f i n t r a v e s i -
c u l a r H + c o n c e n t r a t i o n . C a s e y e t a l . ( 6 ) d e m o n s t r a t e d t h a t o n l y
i f a p e r m e a n t a n i o n w e r e p r e s e n t c o u l d A TP a n d M g 2 + i n d u c e
a n e t i n f l u x o f H + . Th e a n i o n s p r e s e n t i n t h e e x p e r i m e n t s r e -
p o r t e d a b o v e w e r e e i t h e r i m p e r m e a n t ( s u l f a t e ) o r p o o r l y p e r -
m e a n t a n d u s e d a t l o w c o n c e n t r a t i o n s ( p h o s p h a t e ) .
N E M a n d F C C P b o t h i n h i b i t e d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x a n d
r e d u c e d v e s i c u l a r m e m b r a n e e l e c t r i c a l p o t e n t i a l , b u t t h e y h a d
o p p o s i t e e f f e c t s o n t h e A TP a s e a c t i v i t y . N E M i n h i b i t e d t h e
e n z y m e a n d F C C P s t i m u l a t e d i t . Th u s , i t i s u n l i k e l y t h a t t h e
A TP , M g 2 + - s t i m u l a t e d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x i s d i r e c t l y c o u p l e d
t o t h e A TP a s e . I n s t e a d , t h e A TP a s e a c t s i n d i r e c t l y t o i n c r e a s e
t h e v e s i c u l a r m e m b r a n e e l e c t r i c a l p o t e n t i a l , p r o b a b l y a s p a r t
o f a n e l e c t r o g e n i c m e c h a n i s m o f H + t r a n s p o r t . Di c y c l o h e x y l -
c a r b o d i i m i d e ( DC C D) , l i k e N E M , h a s b e e n s h o w n t o i n h i b i t
v e s i c l e m e m b r a n e A TP a s e , v e s i c l e m e m b r a n e " e n e r g i z a t i o n "
( m e a s u r e d b y a f l u o r e s c e n t p r o b e ) , a n d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x
( 9 ) . Th e s t i m u l a t i o n o f t h e A TP a s e b y F C C P ( r e f . 1 4 ; Ta b l e 2 )
m a y r e s u l t f r o m t h e r e d u c t i o n o f t h e A TP a s e c o u p l e d p o t e n -
t i a l .
I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t c a t e c h o l a m i n e c o n c e n t r a t e s w i t h i n
t h e c h r o m a f f i n v e s i c l e b y t h e s a m e m e c h a n i s m a s m e t h y l a m i n e
( 4 , 8 ) . I n t h i s m e c h a n i s m , t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e u n c h a r g e d
f o r m o f c a t e c h o l a m i n e w o u l d b e e q u a l i n s i d e a n d o u t s i d e t h e
v e s i c l e . A h i g h i n t r a v e s i c u l a r c o n c e n t r a t i o n o f c h a r g e d f o r m
w o u l d r e s u l t f r o m e q u i l i b r a t i o n w i t h t h e h i g h i n t r a v e s i c u l a r H +
c o n c e n t r a t i o n . A l t h o u g h t h i s m e c h a n i s m m a y e x p l a i n c a t e -
c h o l a m i n e i n f l u x i n t h e a b s e n c e o f A TP a n d M g 2 + , i t c a n n o t
e x p l a i n t h e A TP , M g 2 + - i n d u c e d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x . A TP , a n d
M g 2 + s t i m u l a t e d c a t e c h o l a m i n e i n f l u x 4 - t o 6 - f o l d a n d , y e t , h a d
n o e f f e c t o n t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t . I n s t e a d , A TP a n d
M g 2 + c r e a t e d a m e m b r a n e p o t e n t i a l w i t h t h e i n t r a v e s i c u l a r s i d e
p o s i t i v e . I f c a t e c h o l a m i n e t r a n s p o r t i s c o u p l e d t o t h i s p o t e n -
t i a l , t h e n a c h a r g e d s p e c i e s m u s t b e i n v o l v e d i n t h e t r a n s p o r t
c y c l e . F o r e x a m p l e , a n e g a t i v e l y c h a r g e d c o m p l e x m a y b e t h e
t r a n s p o r t e d e n t i t y . O n c e o n t h e i n n e r s i d e o f t h e m e m b r a n e ,
i t c o u l d e q u i l i b r a t e w i t h t h e i n t r a v e s i c u l a r p H . Th e t o t a l H +
e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t i s a p p r o x i m a t e l y 1 2 0 m V . 5 0 m V i s
c o n t r i b u t e d b y m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d 7 0 m V i s c o n t r i b u t e d
b y t h e H + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t ( 1 5 - t o 2 0 - f o l d H + c o n c e n -
t r a t i o n r a t i o a c r o s s t h e v e s i c l e m e m b r a n e ) . Wh a t e v e r t h e
m e c h a n i s m o f t r a n s p o r t , a t s t e a d y s t a t e , i f e n e r g y f o r t r a n s p o r t
c o m e s o n l y f r o m t h e H + e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t , o n e e x p e c t s
a c o n c e n t r a t i o n r a t i o o f c a t e c h o l a m i n e a c r o s s t h e m e m b r a n e
o f a t l e a s t 1 0 0 : 1 . Th i s p r e d i c t i o n i s i n r e a s o n a b l e a g r e e m e n t w i t h
c a t e c h o l a m i n e r a t i o s a s h i g h a s 1 4 0 : 1 , w h i c h w e r e d e t e r m i n e d
i n c h r o m a f f i n v e s i c l e g h o s t s ( 1 9 ) i n w h i c h t h e c o n c e n t r a t i o n o f
s o l u b l e c a t e c h o l a m i n e c o u l d b e m e a s u r e d w i t h o u t i n t e r f e r e n c e
f r o m a s t o r a g e c o m p l e x .
Th i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y a S l o a n Re s e a r c h F e l l o w s h i p , a Un i -
v e r s i t y o f M i c h i g a n Ra c k h a m F a c u l t y De v e l o p m e n t A w a r d , a n d a
P h a r m a c e u t i c a l M a n u f a c t u r e r s A s s o c i a t i o n F o u n d a t i o n Re s e a r c h
S t a r t e r G r a n t .
1 . K i r s h n e r , N . ( 1 9 6 2 ) J . B i o l . C h e m . 2 3 7 , 2 3 1 1 - 2 3 1 7 .
2 . Ta u g n e r , G . & H a s s e l b a c h , W. ( 1 9 6 6 ) N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s
A r c h . P h a r m a k . E x p . P a t h . 2 5 5 , 2 6 6 - 2 8 6 .
3 . H a s s e l b a c h , W. & Ta u g n e r , G . ( 1 9 7 0 ) B i o c h e m . J . 1 1 9 , 2 6 5 -
2 7 1 .
4 . J o h n s o n , R. G . & S c a r p a , A . ( 1 9 7 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 2 1 8 9 -
2 1 9 1 .
5 . P o l l a r d , H . B . , Zi n d e r , O . , H o f f m a n , P . G . & N i k o d e j e v i c , 0 .
( 1 9 7 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 4 5 4 4 - 4 5 5 0 .
6 . C a s e y , R. P . , N j u s , D. , Ra d d a , G . K . & S e h r , P . A . ( 1 9 7 7 ) B i o c h e m .
J . 1 5 8 , 5 8 3 - 5 8 8 .
7 . P h i l l i p s , J . H . & A l l i s o n , Y . P . ( 1 9 7 8 ) B i o c h e m . J . 1 7 0 , 6 6 1 -
6 7 2 .
8 . J o h n s o n , R. G . , C a r l s o n , N . J . & S c a r p a , A . ( 1 9 7 8 ) J . B i o l . C h e m .
2 5 3 , 1 5 1 2 - 1 5 2 1 .
9 . B a s h f o r d , C . L. , C a s e y , R. P . , Ra d d a , G . K . & Ri t c h i e , G . A . ( 1 9 7 6 )
N e u r o s c i e n c e 1 , 3 9 9 - 4 1 2 .
1 0 . Tr i f a r o , J . M . , & Dw o r k i n d , J . ( 1 9 7 0 ) A n a l . B i o c h e m . 3 4 , 4 0 3 -
4 1 2 .
1 1 . J o h n s o n , R. G . & S c a r p a , A . ( 1 9 7 6 ) J . G e n . P h y s i o l . 6 8 , 6 0 1 -
6 3 1 .
1 2 . E u l e r , U. S . v o n & F l o d i n g , I . ( 1 9 5 5 ) A c t a . P h y s . S c a n d . S u p p l .
3 3 , 1 1 8 , 4 5 - 5 6 .
1 3 . Lo w r y , 0 . H . , Ro s e b r o u g h , N . J . , F a r r , A . L. & Ra n d a l l , R. J .
( 1 9 5 1 ) J . B i o l . C h e m . 1 9 3 , 2 6 5 - 2 7 5 .
1 4 . B a s h f o r d , C . L. , Ra d d a , G . K . & Ri t c h i e , G . A . ( 1 9 7 5 ) F E B S Le t t .
5 0 , 2 1 - 2 4 .
1 5 . P h i l l i p s , J . H . ( 1 9 7 8 ) B i o c h e m . J . 1 7 0 , 6 7 3 - 6 7 9 .
1 6 . K o s t r o n , H . , Wi n k l e r , H . , P e e r , L. J . & K o n i g , P . ( 1 9 7 7 ) N e u r o -
s c i e n c e 2 , 1 5 9 - 1 6 6 .
1 7 . E u l e r , U. S . v o n & Li s h a j k o , F . ( 1 9 6 9 ) A c t a . P h y s i o l . S c a n d . 7 7 ,
2 9 8 - 3 0 7 .
1 8 . B a s h f o r d , C . L. , C a s e y R. P . , Ra d d a , G . K . & Ri t c h i e , G . A . ( 1 9 7 5 )
B i o c h e m . J . 1 4 8 , 1 5 3 - 1 5 5 .
1 9 . Ta u g n e r , G . ( 1 9 7 2 ) N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s A r c h . P h a r m a k . E x p .
P a t h . 2 7 4 , 2 9 9 - 3 1 4 .
5 1 9 4
N e u r o b i o l o g y :
H o l z