03 Manual Tecnica para Coloracao de Gram

Ministrio da Sade
Secretaria de Vigilncia em Sade

Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
Tcnica de Colorao de Gram
Braslia
2011
MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Vigilncia em Sade
Coordenadora do TELELAB:
Nbia Gonalves Dias
Autores:
Claudia Renata Fernandes Martins
Jos Antnio Pinto de S Ferreira
Luiz Alberto Peregrino Ferreira
Luiz Fernando de Ges Siqueira
Maria Luiza Bazzo
Miriam Franchini
Oscar Jorge Berro
Slvio Valle
Assessoria Pedaggica:
Maria Lcia Ricciotti Ribinik
Maristela Arantes Marteleto
Tcnica de Colorao de Gram Braslia: Ministrio da Sade, Departamento de
DST, Aids e Hepatites Virais, 2011.
64 p.il. (Srie TELELAB)
I. Gram I. Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais (Brasil). II. Srie
TELELAB
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais/Ministrio da Sade Tcnica de Colorao de Gram
Os responsveis pela implantao do TELELAB empenharam toda
sua capacidade profssional para tornar este projeto digno da qualidade
tcnica e cientfca e da efcincia que nossa coordenadora geral sempre
imprimiu s realizaes do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
do Ministrio da Sade.
Dra. Lair Guerra de Macedo Rodrigues, exemplo de coragem e
liderana, dedicamos este trabalho.
Sumrio
Apresentao....................................................................................... 7
Introduo e Modicaes ao Mtodo de Gram................................9
Quais as modifcaes feitas pelo metdo de gram?................................ 12
Quais as diferenas bioqumicas entre a safranina e a fucsina?.............. 13
Preparao dos Corantes e Tcnica de Colorao de Gram............ 15
O que preciso para preparar os corantes de Gram?.............................. 17
Como preparar a violeta-de-metila?......................................................... 18
Como preparar o lugol?............................................................................. 19
Como preparar o lugol diludo para uso?................................................ 19
Como preparar a safranina?...................................................................... 19
Como armazenar os corantes?.................................................................. 19
Como fazer a colorao de Gram?............................................................ 19
Princpio de Funcionamento............................................................ 21
Como funciona a colorao de Gram?..................................................... 23
Controle de Qualidade...................................................................... 25
Como fazer o controle de qualidade do mtodo de
colorao de Gram?................................................................................... 27
Como fazer a manuteno das cepas-padro?......................................... 27
Como preparar as lminas de controle de qualidade
para uso dirio........................................................................................... 27
Resultados......................................................................................... 29
Frmulas........................................................................................... 35
Biossegurana................................................................................... 39
Consideraes Finais........................................................................ 54
Referncias Bibliogrcas................................................................. 63
Agradecimentos................................................................................ 64
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais/Ministrio da Sade
7
Agora voc faz parte do Sistema de Educao a Distncia para pro-
fssionais da sade, envolvidos com o diagnstico laboratorial das Doenas
Sexualmente Transmissveis e Aids - DST/AIDS - TELELAB.
O TELELAB foi criado para levar at voc cursos com informaes
indispensveis para que seu trabalho seja realizado dentro dos padres de
qualidade estabelecidos pelo Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais.
Assistindo ao programa de vdeo e estudando este manual, voc ter
a oportunidade de verifcar o que pode ser mudado no seu dia-a-dia e o que
pode ser mantido.
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comunique-se diretamente:
TELELAB - Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
Telefone gratuito: 0800 - 61 2436
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8
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Vdeo e Manual
Assista ao vdeo quantas vezes voc precisar.
No manual esto todos os contedos para o seu estudo.
Ps-teste
Questionrio
de Avaliao
Faa o ps-teste e responda ao questionrio de avalia-
o. Suas informaes so fundamentais para a melho-
ria do TELELAB.
Certificado
Para obter o certificado, voc dever acertar no minmo
80% do ps-teste.
Depois da correo do seu teste via internet pelo
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais, voc
receber o certificado.
Ao fnal deste curso voc ser capaz de:
identifcar os fundamentos dos
testes e os procedimentos para
execuo recomendados pelo
Departamento de DST, Aids e
Hepatites Virais para a realizao
da colorao de Gram; e
executar a colorao de Gram,
obedecendo aos critrios tcni-
cos, critrios de controle de qua-
lidade e cuidados de biossegu-
rana recomendados.
11
Introduo
O mtodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia o
mtodo de Gram. A bacterioscopia, aps colorao pelo mtodo de Gram
com diagnstico presuntivo de triagem, ou at mesmo confrmatrio em
alguns casos, constitui pea importante e fundamental na erradicao e
no controle das Doenas Sexualmente Transmissveis (DST). Essa tcni-
ca simples, rpida e tem capacidade de resoluo, permitindo o correto
diagnstico em cerca de 80% dos pacientes em carter de pronto atendi-
mento em nvel local.
Os custos com investimento e manuteno so consideravelmente
baixos diante da efccia alcanada com os resultados imediatos dos testes.
Essa tcnica requer instalao simples, necessitando apenas de uma sala
pequena com disponibilidade de gua e gs, onde dever ser instalado um
balco com pia e um bico de Busen, eventualmente substitudo por uma
lamparina ou espiriteira.
So ainda necessrios: microscpio com objetiva de imerso e bate-
ria para a colorao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo pr-
prio laboratrio ou por um laboratrio habilitado que assegure a qualidade
do produto.
Finalmente, e mais importante, so necessrios tcnicos de laborat-
rio treinados, responsveis e conscientes do valor do seu trabalho.
As interpretaes dos esfregaos corados pelo Gram envolvem
consideraes relacionadas com as caractersticas da colorao, tama-
nho, forma e agrupamento das clulas. Estas caractersticas podem ser
infuenciadas por vrios fatores, incluindo idade da cultura (esfregao de
cultura), meio de cultivo utilizado, atmosfera e incubao e presena de
substncias inibidoras.
A colorao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu des-
cobridor, o mdico dinamarqus Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884,
Gram observou que as bactrias adquiriram cores diferentes, quando tra-
12
tadas com diferentes corantes. Isso permitiu classifc-las em dois grupos
distintos: as que fcavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e
as que fcavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.
Aps descrio do mtodo, inmeras propostas de modifcao
foram feitas. Neste manual, voc vai conhecer a tcnica, os corantes e os
procedimentos para a correta realizao da colorao de Gram, recomen-
dados pelo Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministrio
da Sade.
Quais as modificaes feitas ao mtodo de Gram?
O mtodo original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza
um outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. importante res-
saltar que a soluo de violeta-de-metila, em sua preparao, j contm
fxador qumico. Devido a isso, a fxao do esfregao em chama caiu em
desuso e atualmente contra-indicada.
O diferenciador h 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se
usa apenas o lcool etlico (99,5 Gay-Lussac). Esse mais seguro do que
o lcool - acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do
operador para que no ocorresse a hiperdescolorao. Alm do que, no
permitia uma boa reprodutibilidade da tcnica.
Entretanto, a modifcao mais importante foi a do corante secun-
drio, tambm chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram
foi substituda pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substi-
tuiu a fucsina pela safranina.
A safranina mantm-se mais distante da violeta no espectro de cor,
diferenciado com maior nitidez as bactrias Gram-negativas que se desta-
cam das Gram-positivas e da colorao de fundo, que assume a cor verme-
lho-claro. Veja a fgura 1:
13
Violeta
Violeta
Safranina Fucsina
Figura1: representao, no espectro de cores, da distncia entre a safranina e a
fucsina, em relao violeta.
Quais as diferenas bioqumicas entre a safranina e a fucsina?
Safranina Fucsina
Corante cido Corante Bsico
Pertencente ao Grupo das
Triarilpirazinas
Pertencente ao Grupo das
Triarilmetanos
Solvel em gua Insolvel em gua
17
O que preciso para preparar os corantes de Gram?
Para preparar os corantes, voc vai precisar de:
1 bquer de 500 ml;
1 bquer de 1 litro;
1 balana gramatria ou eletrnica;
2 bastes de vidro;
1 proveta de 200 ml;
1 proveta de 500 ml;
1 esptula ou uma colher de caf;
violeta-de-metila;
lcool etlico (99,5 Gay-Lussac)
lcool metlico (99,5 Gay-Lussac)
axalato de amnia;
iodeto de potssio;
iodo metlico;
safranina ou fucsina; e
gua destilada.
Outros materiais de uso rotineiro para realizao da tcnica:
lminas limpas e desengorduradas
cronmetro ou relgio
leo de imerso
microscpio
18
Como preparar a violeta-de-metila? (vide Frmulas)
A) Primeira soluo:
Se voc utilizar uma balana gramatria ou eletrnica, colo-
que o papel de pasagem no prato e pese o papel. Adicione a
este valor 2 gramas de violeta-de-metila. Siga atentamente as
instrues contidas no manual do equipamento. Assegure-se
de que sua balana foi certifcada pelo INMETRO.
Transfra a violeta-de-metila para o bquer de 500 ml, junte 100
ml de lcool etlico e, em seguida, 100 ml de lcool metlico. Mis-
ture lentamente com o auxlio do basto de vidro. Deixe des-
cansar por alguns minutos e repita o procedimento de mistura
vrias vezes, at conseguir a completa dissoluo do corante.
B) Segunda soluo:
Pese 4 gramas de oxalato de amnia. No bquer de 1 litro, jun-
te o oxalato de amnia metade da gua destilada (200 ml).
Misture lenta e constantemente como na 1 soluo, at conse-
guir a completa dissoluo, observando se no restaram res-
duos no fundo do bquer. Voc observar que o preparo dessa
soluo vai desencadear uma reao endotrmica, isto , a so-
luo fcar ligeiramente gelada. Para acelerar o processo de
dissoluo do sal, voc pode aquecer em banho-maria a 37 C.
C) Preparo final:
Junte as duas solues (A e B) e utilize o restante da gua des-
tilada (200 ml) para recuperar os resduos da violeta-de-meti-
la no bquer. Deixe descansar por 24 horas e fltre em papel de
fltro comum, acondicionando o corante em frasco de vidro
escuro, previamente lavado, seco e rotulado.
19
Como preparar o lugol? (vide- frmulas)
Para preparar essa soluo, pese 4,5 gramas de iodeto de potssio.
Transfra o iodeto de potssio para um bquer contendo 450 ml de gua
destilada. Com o auxlio de um basto de vidro, misture at a completa
dissoluo. Em seguida, pese 3 gramas de iodo metlico e junte soluo
de iodeto de potssio. Continue misturando at a completa dissoluo. Ar-
mazene em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.
Como preparar o lugol diludo para uso?
Em um frasco conta-gotas escuro, junte 2 ml de lugol concentrado
com 38 ml de gua destilada.
Como preparar a safranina? (vide Frmulas)
Pese 2,5 gramas de safranina. Dissolva bem o p em 250 ml de lcool
etlico 95%, prossiga retirando 10 mL desta soluo e diluindo em 90 mL
de gua destilada, misturando bem at conseguir a completa dissoluo.
Guarde em frasco escuro previamente lavado, seco e rotulado.
Se quiser utilizar em vez de safranina, a fuccina observe o tem de
frmulas.
Lembre-se:
A boA prticA LAborAtoriAL recomendA A identificAo de todos os seus reA-
gentes. Voc deVe incLuir o nome do corAnte,
A concentrAo e A dAtA de prepArAo.
Como armazenar os corantes?
Os recipientes utilizados para os corantes devem ser de cor mbar-escuro,
pois, de forma geral, as substncias corantes sofrem ao da luz, produzindo al-
teraes variadas. Os corantes devem ser colocados em frascos de 1 litro e distri-
budos em frascos conta-gotas com cerca de 100 ml de capacidade, para uso di-
rio. Sempre que os frascos conta-gotas forem reabastecidos, fltre o corante. Esse
procedimento evitar os inconvenientes advindos da precipitao do corante.
Como fazer a colorao de Gram?
Antes de iniciar a colorao, assegure-se de que o esfregao esteja
seco. No fxe o esfregao em chama, pois esse processo promove a desi-
20
dratao brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violeta-de-
metila j contm fxador qumico.
No se pode deixar de destacar que a colorao de Gram somente ser
um recurso rpido e til quando for corretamente realizada (tecnicamente)
e interpretada por profssionais experientes.
Para fazer a colorao, siga os seguintes passos:
1. cubra o esfregao com
violeta-de-metila e deixe
por aproximadamente 15
segundos;
2. adicione igual quantida-
de de gua sobre a lmina
coberta com violeta-de-
metila e deixe agir por
mais 45 segundos;
3. Escorra o corante e lave em um filete de gua corrente. Cubra
a lmina com lugol diludo (1/20) e deixe agir por aproximada-
mente 1 minuto;
4. escorra o lugol e lave em um filete de gua corrente;
5. adicione lcool etlico (99,5 GL) sobre a lmina, descorando-a,
at que no desprenda mais corante;
6. lave em um filete de gua corrente;
7. cubra a lmina com safranina ou (fucsina bsica 0,1 a 0,2%) e
deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
8. lave em um filete de gua corrente;
9. deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxlio de um
papel de filtro limpo;
10. coloque uma gota de leo de imerso sobre o esfregao; e
11. leia em objetiva de imerso (100 X).
Figura 1: material para colorao de Gram.
23
1. Como funciona a colorao de Gram?
Desde o trabalho original de Hans Gram, vrios pesquisadores ten-
taram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no mtodo
de colorao. Conceitos diversos tm sido apresentados, tais como:
1. a existncia de um substrato Gram-positivo e especfico;
2. as bactrias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam dife-
rentes afinidades com o corante primrio cristal de violeta; e
3. a existncia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos
microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos.
Este ltimo o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da parede ce-
lular, quanto as dimenses dos espaos intersticiais, por exemplo, dimetro do
poro, parecem ser determinantes do resultado fnal da colorao de Gram.
Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares so cobertas
pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adio do lugol,
tambm chamado de mordente, ocorre a formao do completo iodo-pa-
rarosanilina. Essa reao tem a propriedade de fxar o corante primrio nas
estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente,
quando se aplica um agente descorante, como lcool etlico, enquanto ou-
tras perdem sua cor mais lentamente ou no perdem a cor. A safranina
cora as estruturas que foram descoradas.
As bactrias que tm a parede celular composta por murena (pep-
tdeoglicano - peptdeo de cido n-acetil murmico), durante o processo
de descolorao com lcool etlico, retm o corante. J as bactrias com
parede celular composta predominantemente por cidos graxos (lipopolis-
sacardeos e lipoprotenas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assu-
mindo a cor do corante de fundo. Veja as fguras 1 e 2.
24
Figura 1. Esquema da parede das bactrias Gram-positivas
Figura 2. Esquema da parede das bacterias Gram-negativas.
27
Como fazer o controle de qualidade do mtodo de colorao de Gram?
O controle de qualidade uma atividade obrigatria da rotina di-
ria. Para realizar o controle de qualidade dos corantes e da colorao de
Gram, voc precisa de duas cepas bacterianas: a Gram-positiva dever ser
a streptococcus pyogenes ATCC - American Type Culture collection - n
19.615 e a Gram-negativa dever ser a Escherichia Coli ATCC n 25.922.
Cocos Gram-positivo apresentam colorao roxa e Cocos Gram-negativo
apresentam colorao rosa.
Para se evitar a evaporao dos reagentes que pode afetar sua efccia
recomenda-se que as solues de trabalho sejam trocadas regularmente,
dependendo da demanda. Deve-se tambm fazer manuteno preventiva e
limpeza nos microscpios e sistema de reviso dos resultados do Gram. A
reviso de lminas por um supervisor poder determinar a necessidade de
treinamentos e adicionar informaes de relevncia clnica. Pode-se tam-
bm comparar os resultados da cultura com leitura do Gram.
Como fazer a manuteno das cepas-padro?
Para manter as cepas bacterianas do controle de qualidade em seu
laboratrio, voc dever repic-las, a cada 15 dias, em gar nutriente (tubo
com gar inclinado). O controle da pureza das cepas bacterianas dever ser
realizado a cada 2 meses. As cepas devero ser repicadas em placas (m-
todo do esgotamento por estrias) e identifcadas segundo procedimentos
microbiolgicos tradicionais. Aps confrmao da pureza das cepas, estas
devero voltar a ser estocadas em tubos com gar nutriente.
Como preparar as lminas de controle de qualidade para uso dirio?
obedeA Ao seguinte procedimento.
Prepare uma suspenso de Streptococcus Pyogenes e Escherichia Coli.
Para isso, pipete 2 ml de soluo salina estril em um tubo de ensaio limpo
e estril. Junte uma alada do Streptococcus Pyogenes e outra de Escherichia
Coli. Muita ateno com os procedimentos tcnicos e cuidados de biosse-
28
gurana durante a execuo. Flambe a ala bacteriolgica antes e aps a
utilizao com cada uma das cepas bacterianas. No se esquea de esfriar a
ala aps a fambagem.
Prepare 30 lminas para utilizar durante 1 ms, pipetando uma
gota da suspenso bacteriana sobre cada uma das lminas de vidro, lim-
pas, secas e desengurduradas. Deixe as lminas secarem naturalmente.
Estoque-as em um porta-lminas em temperatura ambiente. Lembre-se
de identifcar o porta-lminas.
o controLe de quALidAde deVer sempre ser reALizAdo Ao trmino
dA prepArAo dos corAntes, mesmo que sejA umA simpLes diLuio,
como no cAso do LugoL e todAs As Vezes que o procedimento
de coLorAo for reALizAdo.
cAusAs comuns de erros:
Precipitao do corante pode simular Cocos Gram-positivo.
Uso de lminas que no tenham sido limpas e desengorduradas.
Fixao por calor deve ser evitada, pois esta pode destruir a mor-
fologia e caracteres da amostra.
Esfregaos obtidos de culturas velhas.
Resultado positivo do Gram e cultura negativa, podem sugerir:
Contaminao do corante, presena de agente antimicrobia-
no na amostra ou falha no crescimento do microrganismo por
condies inadequadas de atmosfera, ao seletiva dos meios de
cultura etc.
A discordncia entre o Gram e a cultura pode estar relacionada
com, a coleta, meios de transporte e conservantes inadequados.
31
Veja, nas fguras de 1 a 6, alguns resultados que podem ser obtidos:
Figura1: Cocos Gram-positivos e bacilos Gram-negativos.
Figura 2: Presena de elementos leveduriformes.
32
Figura 3: Leveduras apresentando lamentos micelianos e elementos leveduri-
formes e bacilos Gram-negativos.
Figura 4: Trichomonas vaginalis corado pelo Gram.
33
Figura 5: Diplococos Gram-negativos intracelulares sugestivos de Neisseria
gonorrhoeae.
Figura 6: Cocos Gram-positivos isolados e aos pares sugestivos do gnero
Streptococcus.
34
Figura 7: Bacilos Gram-negativos.
37
Violeta-de-metila:
1 Soluo:
Violeta-de-metila............................................................................ 2,0g
lcool etlico (99,5 Gay-Lussac)........................................... 100,0 ml
lcool metlico (99,57 Gay-Lussac)...................................... 100,0 ml
2 Soluo:
Oxalato de amnia......................................................................... 4,0 g
gua destilada......................................................................... 400,0 ml
Misturar as duas solues, deixar em repouso por um perodo de 24
horas, ao abrigo da luz, aps o perodo de repouso, fltrar em papel de fltro
comum e estocar em frasco escuro previamente lavado e seco.
Lugol (soluo mordente):
Iodeto de potssio...........................................................................4,5g
Iodo metlico..................................................................................3,0g
gua destilada...........................................................................450,0ml
Misturar o Iodeto de potssio na gua, at a completa dissoluo. Acres-
centar o iodo metlico e continuar misturando at dissolver completamente.
Diluir antes de usar, a uma concentrao de 1/20, com gua destilada.
Safranina: soluo reserva
Safranina..........................................................................................2,5g
lcool etlico a 95%.................................................................250,0mL
38
misturAr bem o p em LcooL At A compLetA dissoLuo.
Soluo de trabalho:
Soluo reserva.........................................................................10,0 mL
gua destilada..........................................................................90,0 mL
Fucsina bsica a 2%
Fucsina bsica................................................................................2,0 g
gua destilada......................................................................1000,0 mL
Ateno:
identifique cAdA frAsco com o nome do corAnte e A dAtA do prepAro.
41
pArA cuidAr de suA segurAnA, dA segurAnA de seus coLegAs de
trAbALho e do meio Ambiente, obedeA Aos procedimentos bsicos
de biossegurAnA em LAborAtrios:
Figura 1: Smbolo do risco biolgico
42
todo cuidAdo pouco nA mAnipuLAo de mAteriAis bioLgicos, tAis como so-
ro, sAngue ou secrees, fLuidos orgnicos, tecidos etc.
redobre suAs precAues, pois esses mAteriAis so potenciALmente infectAn-
tes e muitAs Vezes esto contAminAdos com Agentes etioLgicos diferentes do
que se est pesquisAndo, ou AindA desconhecidos. nuncA pipete com A bocA e
jAmAis cheire pLAcAs de cuLturA.
A inAtiVAo do soro em bAnho-mAriA A 56c por 30 minutos no
eLiminA o potenciAL infectAnte dA AmostrA.
Lembre-se de que, com a automao, aumentou muito o nmero de
amostras processadas em laboratrio e, conseqentemente, aumentou
tambm o risco de contaminao. Como voc sabe, difcil afrmar que
um profssional se contaminou, de fato, em servio. Isso faz com que as
doenas infecto-contagiosas causadas por acidentes de trabalho no sejam
devidamente notifcadas; em conseqncia, as medidas de segurana
envolvendo o biorrisco acabam no sendo implementadas.
43
Figura 2: Ilustrao dos principais equipamentos de proteo individual (EPI)
use sempre equipAmento de proteo indiViduAL (epi): AVentAL ou jALeco Lon-
go de mAngAs compridAs e punho retrtiL, LuVAs descArtVeis, cuLos de pro-
teo, pipetAdores mAnuAis ou Automticos e, quAndo for o cAso, protetor
fAciAL e mscArA de proteo contrA Agentes
infecciosos ou Agentes qumicos.
Os EPI so regulamentados pelo Ministrio do Trabalho e seu uso visa a
minimizar a exposio do tcnico aos riscos e evitar possveis acidentes
nos laboratrios. Note que, s vezes, os profssionais de laboratrio preci-
sam de um tempo para se adaptar ao uso dos equipamentos na sua rotina.
O importante que voc se adapte e incorpore a utilizao dos EPI sua
prtica profssional. O uso indevido dos EPI, ao invs de proteger, poder
ocasionar acidentes.
obs.:
o ideAL no conter boLsos, pArA no
coLocAr objetos contAminAdos, cAne-
tAs, etc. peLA proximidAde com As muco-
sAs dA bocA e nAriz.
44
eVite A formAo e disperso de Aerossis.
Aerossis so micropArtcuLAs sLidAs e LquidAs com dimenses AproximAdAs
entre 0,1 e 50 micrA que podem, cAso contenhAm microorgAnismos, permAnecer
em suspenso e pLenAmente ViVeis por VriAs horA.
A pipetAgem, fLAmbAgem de ALAs, AberturA de frAscos e AmpoLAs, mAnipuLA-
o de seringAs, AguLhAs, LAncetAs, LminAs e outros AssemeLhAdos podem
gerAr e propAgAr Aerossis.
A abertura de frascos, ampolas, tubos e garrafas de cultura requer
cuidados especiais. Envolva a parte a ser aberta com um pedao de gaze.
utilize um pedao de gaze para cada material, prevenindo assim a contami-
nao cruzada. Descarte-a imediatamente em hipoclorito de sdio a 2 %.
Centrfugas, agitadores e maceradores, quando manipulados sem as
precaues e abertos antes da total parada ou trmino da operao, igual-
mente podem contaminar o ambiente laboratorial.
45
Figura 3: Ilustrao do descarte de agulha em recipiente apropriado
jAmAis recoLoque cApAs em AguLhAs. esse procedimento umA dAs principAis
cAusAs dA contAminAo de profissionAis de sAde por microorgAnismos, exis-
tentes no sAngue e em outros fLuidos orgnicos, como por exempLo, o Vrus
dA hepAtite b, hepAtite c e o hiV.
Aps A coLetA, Voc deVe descArtAr esse mAteriAL diretAmente em
recipiente de pAredes rgidAs com tAmpA.
Lembre-se:
cAdA miLiLitro de sAngue contAminAdo com o Vrus dA
hepAtite b contm 1000.000.000 de pArtcuLAs VirAis, que podem permAne-
cer ViVeis por At umA semAnA. bAstA umA dessAs pArtcuLAs pArA contAminAr
A pessoA, no entAnto todo profissionAL de sAde deVe ser VAcinAdo contrA o
Vrus dA hepAtite b.
46
reduzA Ao mximo o mAnuseio de resduos, em especiAL os prfuro cortAntes.
descArte o rejeito prfuro cortAnte diretAmente em
recipiente de pAredes rgidAs, prprios pArA descArte deste mAteriAL. trAtA-se
de cAixAs rgidAs reVestidAs internAmente com pLstico e deVidAmente identi-
ficAdA com instrues de descArte (cAixA pAdronizAdA em cor AmAreLA), que
no deVem ser preenchidos AcimA do Limite de 2/3 de suA cApAcidAde e deVem
ser coLocAdos prximos do LocAL que sero utiLizAdos.
Esta uma regra bsica para diminuir os riscos de acidente nos
laboratrios. fundamental que os materiais perfuro cortantes como
agulhas, seringas, lancetas sejam descartados em recipientes rgidos com
tampa e que estejam identifcados com smbolo e expresso de resduo
infectante. As agulhas no devem ser entortadas, quebradas, recapeadas
ou removidas da seringa aps o uso. Deve-se descontaminar em auto-
clave 35 min a 125 C e ento encaminhar ao lixo hospitalar. O acondi-
cionamento dos resduos de laboratrio deve seguir a Norma Brasileira
(NBR) 9190 da Associao Brasileira de Normas Tcnicas - ABNT, que
recomenda sacos brancos leitosos para os resduos potencialmente infec-
tantes e hospitalares e escuros para o lixo comum.
Os profssionais responsveis pela limpeza e conservao devem ser
bem orientados e usar equipamentos de proteo. Todos os recipientes
para descarte devem estar identifcados.
Lembre-se de que, pela legislao brasileira, quem gera o resduo o
responsvel pela sua eliminao e controle.
No caso dos materiais reutilizveis, como vidraria e utenslios,
deposite-os em recipiente contendo o desinfetante prprio, pelo tempo
de contato recomendado e, em seguida, faa a autoclavao. Depois, lave
normalmente esses materiais e guarde-os para uso posterior.
47
identifique e sinALize os principAis riscos presentes em seu LAborAtrio. pro-
dutos e reAs que oferecem risco deVem ser mArcAdos com os deVidos smbo-
Los internAcionAis em etiquetAs Auto-AdesiVAs pAdro.
Veja, a seguir, os principais smbolos associados aos riscos em
laboratrios.
PERIGO BIOLGICO
Entrada permitida somente para pessoas autorizadas
Natureza do risco:
Funcionrio responsvel:
Em caso de emergncia, chame por:
Telefone diurno: Telefone residencial:
Figura 4: Smbolo de risco biolgico para entrada de laboratrio.
48
Figura 5: Principais smbolos internacionais associados aos riscos em laboratrios.
49
Verifique sempre As condies de funcionAmento dos equipAmentos de prote-
o coLetiVA (epc): extintores de incndio, chuVeiros de
segurAnA, LAVA-oLhos, piA pArA LAVAgem de mos, cAixA de AreiA e
cAbine de segurAnA bioLgicA.
Existem trs tipos de cabines de segurana biolgica de fuxo vertical
disponveis no mercado: as de classe I, classe II e classe III. So recomenda-
das para o uso em laboratrios clnicos as de classe II. As cabines de fuxo
horizontal no protegem o trabalhador. Veja a fgura, na pgina seguinte.
Procedimentos que devem ser observados na cabine de segurana
biolgica:
Descontamine a superfcie interior e aguarde 15 minutos antes de
manipular materiais e depois do uso repita a descontaminao com gaze
estril embebida em lcool 70 %;
Ligue a cabine e a luz ultravioleta 20 minutos antes e deixe tudo liga-
do pelo mesmo tempo ao fnal de sua utilizao;
Use avental de mangas longas, luvas descartveis e mscara;
No efetue movimentos rpidos ou bruscos dentro da cabine e evite
operaes que causem turbulncia;
No trabalhe com portas e janelas abertas e no permita a abertura
de portas ou circulao de pessoas atrs do trabalhador quando este se en-
contrar manipulando amostras na cabine de segurana biolgica.
No use bico de Bunsen, pois pode acarretar danos ao fltro HEPA e
causar desequilbrio do fuxo de ar. Se necessrio, use incinerador eltrico
ou microqueimador automtico; e
Mantenha as grelhas anteriores e posteriores da cabine desobstru-
das. A cabine no um depsito. Evite guardar equipamentos ou quais-
quer outros objetos no seu interior.
50
Figura 6: Ilustrao das cabines de segurana biolgica - classes I, II e III.
As cabines de classe I e II so consideradas como barreira de prote-
o parcial e a de classe III uma barreira de proteo total.
pArA descontAminAo pessoAL, de equipAmentos e superfcies fixAs, utiLize
desinfetAntes eficientes e AdequAdos pAdronizAdos peLA ccih (centrAL de
controLe de infeces hospitALAres). use sempre
produtos registrAdos no ministrio dA sAde.
No existe um desinfetante nico que atenda a todas as necessida-
des. fundamental conhecer os diversos agentes qumicos e sua compati-
bilidade de uso para evitar custos excessivos e utilizao inadequada.
Para a descontaminao de amostras biolgicas na rotina dos la-
boratrios clnicos, recomendamos os compostos liberadores de cloro. O
mais comumente utilizado o hipoclorito de sdio a 2 %. Sua forma mais
ativa o cido hipocloroso (HOCI), que formado em solues com pH
51
entre 5 e 8. A efccia do cloro decresce com o aumento do pH e vice-versa.
Cabe lembrar que a atividade desse cido diminuda na presena de ma-
tria orgnica, fato que deve ser considerado quando aplicado em superf-
cies contendo sangue e outros lquidos corpreos. Os hipocloritos tm sua
estabilidade dependente de fatores como concentrao, temperatura, pH,
luz, metais e prazo de validade.
Os hipocloritos so corrosivos para metais. Objetos de prata, alum-
nio e at mesmo de ao inoxidvel so atingidos, quando imersos em so-
lues rotineiramente utilizadas em laboratrio. O hipoclorito de sdio
txico e causa irritao na pele e olhos. Se ingerido, provoca corroso das
membranas e mucosas e sua inalao causa irritao severa no trato respi-
ratrio. Jamais misture os hipocloritos com outras substncias qumicas,
tais como desinfetante, lcool, solues germicidas, solues de amnia, etc.
Aps o tratamento por 24 horas com hipoclorito de sdio a 2%, os
materiais devem ser autoclavados. A autoclavao recomendada tendo
em vista a possibilidade de o hipoclorito no atingir as partes do material
a ser esterilizado. Caso isso no seja possvel, a alternativa o mtodo de
fervura por perodo no inferior a 30 minutos.
obserVe, nA tAbeLA AbAixo, A indicAo de ALguns Agentes qumicos e seu es-
pectro de Ao AntimicrobiAnA.
eficinciA AntimicrobiAnA de ALguns Agentes qumicos desinfetAntes frente A Agen-
tes microbiAnos.
Bactrias
vrus
lipoflicos
vrus
hidroflicos
micobacterias fungos
Esporros
bacterianos
Etanol + + - + V -
Formaldeido + + + + + +
Glutaraldedo + + + + + +
Comp. Cloro + + + + + +
Fenis + + - + + -
Quaternrios
de amnia
+ + + - + -
Lodforos + + + - + -
(+) Atividade
(-) Ausncia de atividade
(V) Varivel de acordo com o microorganismo
52
tenhA muito cuidAdo com A mAnipuLAo e estocAgem de substnciAs qumicAs.
LeiA com Ateno As informAes contidAs nos rtuLos.
A estocagem de matria-prima deve ser feita em armrios apropria-
dos, bem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor. importante observar a
incompatibilidade entre as diferentes substncias.
Sempre que recomendado pelo fabricante, os agentes qumicos de-
vem ser manipulados em capelas de exausto qumica devidamente insta-
ladas. Ateno: No confunda capela de exausto qumica com cabine de
segurana biolgica.
Veja a seguir os riscos relacionados a cada categoria qumica:
Categoria qumica e riscos relacionados
GRUPO QUMICO RISCO
cidos Corroso
Bases Corroso
Cianetos e Sulfetos Envenenamento
Lquidos inflamveis Incndio
Slido Inflamvel Incndio
sejA sempre consciente dA importnciA de suAs Aes nA preserVAo dA bios-
segurAnA em seu LocAL de trAbALho:
Lave as mos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial;
Nunca pipete com a boca;
Jamais cheire placas de cultura ou qualquer material biolgico
ou qumico;
Dentro do laboratrio, no fume, no coma, no beba, no pre-
pare refeies, no aplique cosmticos;
53
Quando estiver usando luvas, no manuseie objetos de uso co-
mum, como telefones, maanetas de portas e janelas, jornais, re-
vistas; Deve ser proibido a presena de jornais no ambiente de
laboratrio;
Deve-se tomar cuidado com a utilizao de canetas, lpis e mar-
cadores de textos e a contaminao destes objetos com material
biolgico;
No guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores
para armazenagem de material biolgico; e
Vacine-se contra a hepatite B e faa o controle de ttulo de Anti-
Hbs rotineiramente.
seguindo essAs recomendAes, Voc VAi estAr contribuindo pArA A diminuio
de Acidentes.
cAso AconteA um Acidente de trAbALho em seu LAborAtrio, notifique ime-
diAtAmente A suA chefiA e certifique-se de que o mesmo tenhA sido formAL-
mente notificAdo.
54
Consideraes Finais
Muitas das atividades aqui descritas j fazem parte do seu cotidia-
no. Faa uma refexo sobre o que acabou de ler e verifque o que pode
ser mantido, modifcado e incorporado a seu trabalho e ao seu laboratrio
para que a sua prtica profssional se desenvolva de acordo com os pro-
cedimentos tcnicos e cuidados de biossegurana recomendados pelo
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais, do Ministrio da
Sade. As questes colocadas a seguir facilitaro essa reflexo.
Condies gerais do laboratrio
As reas de circulao esto desobstrudas?
Qual a situao geral quanto ao aspecto de limpeza?
Qual o estado de conservao e manuteno de pisos, escadas,
paredes e tetos?
O local de trabalho est adequado para as atividades envolvendo o
risco biolgico?
As bancadas e demais mobilirios do laboratrio esto em condies
de uso?
Existem bancadas apropriadas para trabalhos com solventes e
demais substanciais qumicas corrosivas?
Existe pia diferenciada para lavagens das mos no laboratrio?
Existem mecanismos de conteno que previnam a entrada de insetos
e roedores?
Existem programas de manuteno preventiva de equipamentos?
55
Estocagem
Os produtos armazenados e a rea de estocagem esto organizados
com os devidos cuidados de segurana?
Existe o cuidado de se estocar materiais e/ou substncias incom-
patveis separadamente?
Local de higiene pessoal e de alimentao
O local mantido limpo e em condies de higiene?
Existe gua potvel disponvel?
Existem sabo e toalha em condies de uso?
Existe local para troca de roupa e guarda objetos pessoais?
Existe rea para alimentao separada da rea de laboratrio?
Existe adequada organizao para coleta de lixo e demais rejeitos
(no infecciosos)?
Refrigerao e ventilao
A temperatura de trabalho est entre 20 e 26 C?
As janelas esto protegidas contra o excesso sola?
Existe ventilao adequada, especialmente nas salas com cabines de
fluxo laminar?
Iluminao
A iluminao geral adequada?
56
Existe iluminao dirigida nas bancadas de trabalho?
Servios
O laboratrio tem suficiente abastecimento de gua, energia eltrica e gs?
Existe adequada manuteno de fusveis, lmpadas e cabos eltricos?
A limpeza e higienizao das caixas d gua so realizadas com
perodo cidade recomendada?
Segurana geral
O laboratrio devidamente fechado e seguro quando no est ocupado?
As portas e janelas so mantidas devidamente fechadas?
Os materiais txicos e equipamentos de risco so estocados em rea
segura?
Preveno de incndio
Existe sistema de alarme?
As passagens pelas portas de emergncias esto desobstrudas?
O sistema de deteco de incndio est bom em funcionamento e
regularmente testado?
Existe sinalizao de emergncia?
Existem extintores de incndio para os diversos tipos de materiais e
em quantidade suficiente?
Os extintores esto dentro do prazo de validade?
Existe sinal de no fumar na rea de laboratrio?
57
A equipe est treinada e combate a incndio?
Estocagem de lquidos inflamveis
O local est separado do prdio principal?
Existe ventilao suficiente para retirar vapores?
O local est devidamente sinalizado?
Existem lminas seladas para proteo contra ignio nos vapores?
Existe advertncia de no fumar?
Risco com eletricidade
As instalaes esto de acordo com os padres de estabelecimentos
pela ABNT?
Existe fio terra? Os equipamentos esto devidamente aterrados?
Os equipamentos com potencial de risco de desligamento esto devi-
damente ligados a um circuito de emergncia para os casos de queda
ou interrupo de energia?
Os cabos de conexo aos diversos equipamentos esto em perfeito
estado de manuteno?
Cada equipamento est ligado em uma tomada; evita-se o uso de bejamim?
Todas as tomadas tm sua voltagem identificada?
Voc sabe onde fica o quadro-geral de fora da sua unidade?
Gases e comprimidos
Os diversos tipos de gases esto devidamente identificados?
Os cilindros possuem vlvulas de segurana?
58
Existe advertncia de no utilizao de leo nas vlvulas?
Os cilindros esto devidamente seguros contra quedas?
Existe ventilao suficiente para evitar a formao de bolses de
gases e imploses?
Proteo pessoal
Existem em quantitativo suficiente para evitar a formao de bolses
de gases e exploses?
Proteo pessoal
Existem em quantidade sufciente:
Lava-olhos?
Chuveiros de emergncia?
Protees contra radiaes, incluindo os dozmetros?
Mscaras contra partculas?
Luvas descartveis?
Pipetadores manuais e/ou automticos?
culos de proteo e outros?
Segurana e sade ocupacional
Existe servio de sade ocupacional?
Existe caixa com materiais para primeiros socorros?
Existem profissionais treinados em primeiros socorros?
Existem informaes sobre como agir em caso de emergncia, tais como:
Telefone de hospitais, pronto socorros e bombeiros?
59
Existe um programa de vacinao atualizada?
Existe sinalizao educativa para prevenir o risco?
Equipamento de laboratrio
Os equipamentos esto validados e certificados quanto a seu uso?
Existe procedimento de desinfeco de equipamentos antes de
envi-los manuteno?
As cabines de segurana biolgica e qumica so regulamentes testadas?
As autoclaves esto validadas?
As centrfugas, rotores e frascos tm seus tempos de utilizao
devidamente anotados?
Vidrarias quebradas e trincadas so descartadas?
Existem recipientes adequados para descartar frascos quebrados e
material perfurante?
As capelas de exausto para manipulao esto devidamente sinalizadas?
Suas balanas esto certificados pelo INMETRO?
Seus congeladores, geladeiras, fornos, estufas ou equipamentos termo-
regulavis possuem sinais de controle e registro de temperatura?
Material infeccioso, qumico e radiativo
Os materiais biolgicos so recebidos em condies de segurana?
Utilizam-se luvas descartveis, quando se est manipulando material
biolgico:
As bancadas so desinfetadas com a devida freqncia?
60
Existe protocolo de descarte de material contaminado?
Os desinfetantes so apropriados e devidamente validados?
As substncias esto devidamente etiquetadas?
Existe cartaz com riscos e categorias toxicolgicas das diversas
substncias?
O estoque de radioistopos devidamente controlado?
Existe procedimento de descarte de substncias qumicas e radio-
istopos?
Existem procedimentos que viso evitar contato entre substncias
qumicas compatveis?
Utilize o manual, junto com o vdeo, como fonte permanente de
consulta. Mantenha este manual sempre ao seu alcance e faa dele
um instrumento a mais de trabalho.
Voc tem comunicAo diretA e grAtuitA com:
TELELAB - Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
Telefone gratuito: 0800 - 61 2436
e-mail: telelab@aids.gov.br
61
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disciplinar. Editora FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 362p.
VALLE, S. 1996, Regulamentao da Biossegurana em Biotecnologia.
Edio Curso de Biossegurana da FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 80p.
Agradecimentos:
s equipes da:
Faculdade de Higiene e Sade Pblica - Universidade de So Paulo;
Ao Laboratorio ControlBio, So Paulo; e
Hospital Universitrio -
Universidade Federal de Santa Catarina-UFSC
Projeto Grfco, diagramao, arte-fnalizao e capa:
Lcia Helena Saldanha Gomes -

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