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ISSN 1679-6535
Dezembro, 2006
Fortaleza, CE
Maria do Socorro Moura Rufino
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Ricardo Elesbo Alves
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Edy Sousa de Brito
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Jorge Mancini Filho
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Ana Vldia Bandeira Moreira
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Engenheira Agrnoma, M. Sc., Bolsista da CAPES, Doutoranda, UFERSA, BR 110, Km 47, 59625-900, Mossor, RN, marisrufino@yahoo.com.br
2
Engenheiro Agrnomo, D. Sc. em Ps-Colheita, Pesquisador da Embrapa Agroindstria Tropical, R. Dra. Sara Mesquita, 2270, Pici, 60511-110, Fortaleza, CE,
elesbao@pesquisador.cnpq.br
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Qumico Industrial, D. Sc. em Tecnologia de Alimentos, Pesquisador da Embrapa Agroindstria Tropical, edy@cnpat.embrapa.br
4
Farmacutico Bioqumico, Ph. D., Professor Titular, USP, Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 14, Butant, 05508-900, So Paulo, SP, jmancini@usp.br
5
Nutricionista, D. Sc., Professora Adjunta I, UFRN, Av. Cordeiro de Farias, s/n, Petrpolis, 59100-180 Natal, RN, ana.vladia@terra.com.br
Metodologia Cientfica:
Determinao da Atividade
Antioxidante Total em Frutas
no Sistema -caroteno/cido
Linolico
Introduo
Uma das maiores alteraes que ocorrem durante o
processamento, distribuio, armazenamento e
preparo dos alimentos a oxidao. E a oxidao
lipdica se destaca, pois pode afetar a qualidade
nutricional, segurana, cor, sabor, aroma e textura
dos alimentos. As reaes oxidativas, alm de produ-
zirem diminuio no valor nutricional dos alimentos,
so tambm responsveis pela formao de compos-
tos potencialmente txicos e antinutricionais para o
organismo humano e animal (Kanazawa et al., 1985;
Shahidi & Wanansundara, 1992).
Existem substncias com propriedades antioxidantes
utilizadas no processamento de leos e gorduras e nos
alimentos que, em geral, so capazes de retardar a
oxidao lipdica (Moreira & Mancini Filho, 2003). Os
antioxidantes podem ser naturais, como cido
ascrbico, -tocoferol e compostos fenlicos presen-
tes nos alimentos, ou sintticos, como 6-hidroxi-
2,5,7,8-tetrametilchroman-2-cido carboxlico (Trolox),
hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado
(BHT). Dentre estes, Trolox o composto sinttico
mais utilizado, por ser um anlogo da vitamina E e ser
de natureza hidrossolvel.
Os antioxidantes sintticos esto restritos a um
mximo de 200 mg/kg pelos cdigos bromatolgicos
de diversos pases, e tm sido freqentemente
monitorados devido a possveis danos que eles podem
vir a provocar no organismo (Babich, 1992).
Componentes como o -caroteno agem inibindo o
oxignio singleto e interagem sinergicamente com a
vitamina E, para inibir a peroxidao lipdica. Outros
constituintes fenlicos em alimentos, tais como os
flavonides, podem tambm reduzir os danos causa-
dos pelo estresse oxidativo (Schwenke, 1998).
O sistema -caroteno/cido linolico foi desenvolvido
por Marco (1968), modificado por Miller (1971) e
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Metodologia Cientfica: Determinao da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema -caroteno/cido Linolico
utiliza o cido linolico, monopalmitato de polioxietileno
sorbitan (Tween 40) e o -caroteno. Trata-se de um
ensaio espectrofotomtrico baseado na oxidao
(descolorao) do -caroteno induzida pelos produtos
da degradao oxidativa do cido linolico (Silva et al.,
1999), ou seja, o mtodo avalia a atividade de inibio
de radicais livres gerados durante a peroxidao do
cido linolico (Duarte-Almeida et al., 2006).
Neste comunicado, so relatadas todas as informa-
es necessrias para a determinao da atividade
antioxidante total em frutas no sistema -caroteno/
cido linolico, baseadas em adaptaes/modificaes
feitas nos laboratrios da Embrapa Agroindstria
Tropical.
2. Materiais Necessrios
Reagentes
-Caroteno - Merck, cdigo 01111324, ou equivalente.
Acetona P.A.
cido linolico - Acros organics, cdigo 01111322,
ou equivalente.
gua destilada
lcool etlico P.A.
lcool metlico P.A.
Clorofrmio
Trolox (PM = 250,29) Sigma, cdigo 218940050,
ou equivalente.
Tween 40
Equipamentos e Vidrarias
Agitador de tubos de ensaio
Balana analtica
Balo volumtrico 100 mL e 1.000 mL
Banho-maria
Becker 25 mL e 100 mL
Cronmetro digital
Cubetas de vidro (4 x 1 cm)
Erlenmeyer 250 mL
Espectrofotmetro
Oxigenador
Pipeta automtica (10 1.000 L)
Proveta de 50 mL
Tubos de 2 mL
Tubos de ensaio com tampa rosqueada (18 mL)
Preparo de Solues
Soluo de lcool Metlico a 50%
Em balo volumtrico de 1 L, adicionar 500 mL de
lcool metlico; completar o volume para 1.000 mL
com gua destilada, homogeneizar e transferir para um
frasco de vidro devidamente etiquetado. Armazenar
em temperatura ambiente por tempo indeterminado.
Soluo de Acetona a 70%
Em balo volumtrico de 1 L, adicionar 700 mL de
acetona; completar o volume para 1.000 mL com gua
destilada, homogeneizar e transferir para um frasco de
vidro devidamente etiquetado. Armazenar em tempe-
ratura ambiente por tempo indeterminado.
Soluo Controle de Trolox 200 mg/L
Dissolver 2 mg de Trolox em aproximadamente 5 mL
de lcool etlico e completar o volume para 10 mL em
um balo volumtrico com lcool etlico, homogeneizar
e transferir para um frasco de vidro mbar devidamen-
te etiquetado. Preparar e usar apenas no dia da
anlise. Nos testes realizados em laboratrio, foi
constatado que a concentrao de 200 mg/L de Trolox
a que proporciona a maior proteo ao sistema,
quando comparada a outras (Fig. 1), sugerindo-se,
portanto, o seu uso.
Tratamento da gua Destilada
Submeter aproximadamente 500 mL de gua destilada
a borbulhamento com oxignio (oxigenador) por 30
minutos.
Soluo -Caroteno 20 mg/mL
Pesar 20 mg de -caroteno em um tubo de 2 mL,
protegido da luz com papel alumnio, adicionar 1 mL
de clorofrmio, agitar e utilizar imediatamente.
Soluo Sistema -caroteno/cido
Linolico
Em um erlenmeyer, adicionar 40 L de cido linolico,
530 L de Tween 40, 50 L da soluo -caroteno e,
para solubilizar, adicionar 1 mL de clorofrmio,
homogeneizar e, posteriormente, evaporar o clorofr-
mio com o auxlio do oxigenador. Em seguida, adicionar
a gua tratada com oxignio at obter uma
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Metodologia Cientfica: Determinao da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema -caroteno/cido Linolico
absorbncia entre 0,6 nm e 0,7 nm a 470 nm. A
soluo sistema apresenta uma colorao amarelo-
alaranjada (Fig. 2); deve ser sempre protegida da luz e
prontamente utilizada.
Fig. 1. Atividade antioxidante de diferentes concentraes de trolox no sistema -caroteno/cido linolico.
Fig. 2. Soluo -caroteno/cido linolico.
Protocolo do Mtodo
-caroteno/cido Linolico
Obteno dos Extratos da Fruta
Este procedimento foi adaptado de Larrauri et al.
(1997). Como a concentrao de compostos
antioxidantes varia de fruta para fruta, fazem-se
necessrios testes prvios. Em anlises realizadas no
Laboratrio de Fisiologia e Tecnologia Ps-Colheita, da
Embrapa Agroindstria Tropical, com diferentes
frutas, tm-se utilizado de 1 g a 25 g de amostra, de
acordo com a fruta. Pesar a amostra em um bquer de
100 mL, adicionar 40 mL de metanol 50%,
homogeneizar e deixar em repouso por 60 minutos
temperatura ambiente. Centrifugar a 25.406,55 g
(15.000 rpm) durante 15 minutos, transferir o
sobrenadante para um balo volumtrico de 100 mL. A
partir do resduo da primeira extrao, adicionar 40 mL
de acetona 70%, homogeneizar e deixar em repouso
por 60 minutos temperatura ambiente. Centrifugar
novamente a 25.406,55 g (15.000 rpm) durante 15
minutos, transferir o sobrenadante para o balo
volumtrico contendo o primeiro sobrenadante e
completar o volume para 100 mL com gua destilada.
Determinao da Atividade Antioxidante
Total (AAT)
A partir do extrato obtido no item anterior, preparar
em tubos de ensaio, no mnimo trs diluies diferen-
tes, em triplicata. Misturar 0,4 mL de cada diluio do
extrato com 5 mL da soluo sistema (item soluo
sistema -caroteno/cido linolico). Utilizar como
controle 0,4 mL da soluo de trolox (item soluo
controle de trolox 200 mg/L) com 5 mL da soluo
sistema -caroteno/cido linolico, homogeneizar os
tubos de ensaio em agitador e manter em banho-maria
a 40 C. Realizar a primeira leitura (470 nm) aps 2
minutos de efetuada a mistura e depois em intervalos
de quinze minutos at 120 minutos. O
espectrofotmetro deve ser calibrado com gua.
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0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 15 30 45 60 75 90 105 120
Tempo (min)
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sistema
200 mg/L
100 mg/L
50 mg/L
25 mg/L
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Metodologia Cientfica: Determinao da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema -caroteno/cido Linolico
Exemplares desta edio podem ser adquiridos na:
Embrapa Agroindstria Tropical
Endereo: Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici,
CEP 60511-110 Fortaleza, CE
Fone: (0xx85) 3299-1800
Fax: (0xx85) 3299-1803 / 3299-1833
E-mail: negocios@cnpat.embrapa.br
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edio on line: dezembro de 2006
Comit de
Publicaes
Expediente
Comunicado
Tcnico, 126
Presidente: Francisco Marto Pinto Viana
Secretrio-Executivo: Marco Aurlio da Rocha Melo
Membros: Janice Ribeiro Lima, Andra Hansen Oster,
Antonio Teixeira Cavalcanti Jnior, Jos Jaime
Vasconcelos Cavalcanti, Afrnio Arley Teles
Montenegro, Ebenzer de Oliveira Silva.
Supervisor editorial: Marco Aurlio da Rocha Melo
Reviso de texto: Jos Ubiraci Alves
Editorao eletrnica: Arilo Nobre de Oliveira
Normalizao bibliogrfica: Ana Ftima Costa Pinto.
Ministrio da
Agricultura, Pecuria
e Abastecimento
O decrscimo da leitura da absorbncia das amostras
correlacionado com o sistema e estabelece a
percentagem de oxidao (Eq. 2), subtraindo-se a
percentagem de oxidao de cada amostra de 100
(Eq. 3). Verifica-se a ao antioxidante da amostra
(fruta), comparando-a com a atividade do antioxidante
sinttico (trolox).
Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e
Tecnolgico (CNPq) e Unio Europia pelo apoio
financeiro - Projetos Atividade antioxidante de frutas
do Nordeste brasileiro como fator de Proteo da
Sade CNPq Edital CT-Sade/MCT/MS 030/2004
Processo 506.633/2004-7 e Producing added value
from under-utilised tropical fruit crops with high
commercial potential - Sixth Framework Programme
Contrato 0015279, respectivamente.
Referncias
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Environmental Research, v.29, p.1-29, 1992.
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radicais DPPH. Cincia e Tecnologia de Alimentos, v.26, n.2,
p.446-452, 2006.
KANAZAWA, K.; KANAZAWA, A.E.; NATAKE, M. Uptake of
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para avaliao do grau de oxidao lipdica e da capacidade
antioxidante. Qumica Nova, v.22, n.1, p.95-103, 1999.
(Reduo Abs)
sistema
(Eq. 2)
[(Reduo Abs)
amostra
x 100]
% Oxidao =
(Eq. 3) % Proteo = 100 (% Oxidao)
Os resultados so expressos em percentagem de
inibio da oxidao. A reduo da absorbncia do
sistema sem antioxidante (Eq. 1) considerada como
100% de oxidao.
Reduo da absorbncia = Abs
inicial
Abs
final (Eq. 1)