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reaccin
= d(cant. CO
2
)/dt
Materiales:
Tubos de ensayo
Beaker
Bao mara
Regla
Tapones
Agujas de jeringa
Manguera con 0.35 cm de dimetro y
3m de largo
Solucin coloreada (azul de metileno o
violeta de genciana)
Sustancias:
Levadura fresca al 5%
3
Glucosa 1% y 10%
Fructosa al 10%
Sacarosa al 10%
Almidn 1 %
NaF 0.1M
Agua destilada
Seccin Experimental
f. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura y 2mL de solucin de glucosa al 10%.
g. Tape el tubo de ensayo con un tapn de caucho, agite y atraviese el tapn con una aguja de jeringa
desechable.
h. Tome una manguera para fermentacin, adicinele 1mL de solucin coloreada, colquela a presin en
la boca de la aguja y fjela a la mesa de trabajo con cinta. Tanto el tapn como la manguera deben
quedar bien hermticos de tal forma que no hayan fugas. Procure que la manguera quede lo mas lineal
posible.
i. Ponga el sistema en un beaker que contenga agua entre 37-40C. Tenga cuidado que la manguera no
quede en contacto con alguna superficie caliente y la solucin coloreada no est a ms de 50 cm del
tubo.
j. Marque la manguera donde se encuentra la solucin coloreada.
3
Esta solucin se prepara en un buffer de acetato pH = 5.5
k. A penas comience a moverse la solucin coloreada cuente dos minutos y vuelva a marcar la posicin
donde se encuentra esta solucin.
l. Siga marcando cada dos minutos durante doce minutos.
m. Desconecte la manguera y mida con una regla la distancia recorrida por la solucin coloreada cada dos
minutos.
n. Repita los pasos (a) hasta (h) con: glucosa al 1%, fructosa al 10%, sacarosa al 10% y almidn al 1%.
o. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura, 2mL de solucin de glucosa al 10% y
1mL de agua destilada.
p. Repita los pasos (b) hasta (h)
q. Por ltimo, coloque en un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura, 2mL de solucin de glucosa
al 10% y 1mL de la solucin de NaF y repita los pasos (b) hasta (h).
r. Anote los datos en la siguiente tabla:
Carbohidrato Glucosa
1%
Glucosa 10%
Glucosa 10%
con NaF
Fructosa
10%
Sacarosa
10%
Almidn
1%
Tiempo (min) Longitud (cm)
2
4
6
8
10
Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos
Dispngalos por el desague
Resultados
e. Con los datos obtenidos en el numeral anterior calcule la velocidad de la reaccin para cada
carbohidrato y complete la tabla.
Carbohidrato
reaccin
Glucosa 1%
Glucosa 10%
Glucosa 10% con NaF
Fructosa 10%
Sacarosa 10%
Almidn 1%
Nota: el volumen de CO
2
producido se calcula con la frmula del volumen de un cilindro: V = r
2
h,
donde: r , es el radio de la manguera (0.17cm) y h es el promedio de las longitudes medidas (haga esta
operacin con los valores que sean ms homogneos)
a. Escriba la reaccin neta balanceada de la fermentacin de cada uno de los carbohidratos.
b. Segn las ecuaciones del numeral anterior, Dnde ocurrira la mayor produccin de CO
2
? Est ello
de acuerdo con los datos obtenidos experimentalmente?
c. Segn la experiencia cual es el orden de los carbohidratos segn la rapidez en la fermentacin? Cmo
se podra justificar?
d. Cmo interpretara el efecto del fluoruro de sodio (NaF) sobre la fermentacin?.
Preguntas
e. En que consiste la fermentacin lctica y glicrica? En que diferencian de la fermentacin etanlica?
f. El arsenato (AsO
4
2-
) es qumicamente similar al fosfato inorgnico (PO
4
2-
) y algunas enzimas que
utilizan fosfato inorgnico pueden utilizar tambin el arsenato. La produccin de ATP en la glucolisis es
inhibida por el arsenato. Identifique las enzimas que pueden ser afectadas.
g. Adems de ATP, se forman otros dos productos importantes en la glicolisis. Cules son?
h. Enumere algunos inhibidores de la gliclisis
PRACTICA 9
DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SUERO SANGUNEO
Objetivos
1. Cuantificar el contenido de glucosa en suero sanguneo
2. Comparar el resultado obtenido con los datos reportados y determinar el estado de salud del paciente
Aspectos Tericos
Metabolismo de los glcidos.
La digestin de los polisacridos se inicia en la boca, en donde la amilasa de la saliva hidroliza el almidn para
dar dextrinas y maltosa. En el estmago, la amilasa de la saliva se inactiva por el pH. En el intestino, a pH ms
alcalino, actan las enzimas procedentes del pncreas como la amilasa pancretica. Finalmente, enzimas de la
mucosa intestinal concluyen la degradacin (disacaridasas). Posteriormente los monosacridos, principalmente
la glucosa, son absorbidos a travs de la pared intestinal hacia el torrente sanguneo y llevados al hgado por
medio de la circulacin portal.
La glucosa es la principal fuente de energa en los seres vivos. Por tal razn es un metabolito fundamental en
los procesos biolgicos. La glucosa tras su degradacin por la va glucoltica se obtiene una gran cantidad de
energa en forma de ATP. Alteraciones en el metabolismo de la glucosa conducen a estados de hipoglucemia o
hiperglucemia (diabetes) que producen unos trastornos clnicos que en algunos casos pueden resultar fatales.
La determinacin del contenido de glucosa en el suero fisiolgico es una prueba indicativa del estado de salud
del individuo y resulta necesaria en los casos de alteraciones metablicas u hormonales (deficiencia en insulina,
glucagn, etc).
Alteraciones del metabolismo glucdico, la diabetes
Aunque las patologas relacionadas con alteraciones del metabolismo glucdico son muy diversas, vamos a
centrarnos en los trastornos en la regulacin del nivel de la glucosa en sangre. Cuando la homeostasis de la
glucosa se rompe por disfuncin de cualquier elemento que la mantiene, sobrevienen los sndromes hiper o
hipoglucmicos que, como su nombre indican, conllevan el aumento (>120 mg/dL en ayunas) o la disminucin
(<45-50mg/dL) de la glucemia, respectivamente.
Diabetes mellitus
La diabetes mellitus es la causa ms frecuente y grave de hiperglucemia. Es una metabolopata crnica que
aparece como consecuencia de la deficiencia absoluta o relativa de insulina. En estas condiciones, la entrada
de glucosa en las clulas est disminuida y en consecuencia los niveles en sangre se mantienen elevados
(hiperglucemia). Esta deficiencia da lugar a una serie de complicaciones a largo plazo, lo que origina una gran
morbilidad y mortalidad.
Causas de la diabetes mellitus
La glucosa es un azcar que proviene de los alimentos que comemos, circula por la sangre y es utilizada por el
organismo para obtener la energa necesaria para desarrollar cualquier tipo de trabajo. La causa de la diabetes
es una anomala en la produccin o el funcionamiento de la insulina por el pncreas.
La insulina es una hormona que fabrica el pncreas, cuya misin es facilitar el paso de los azcares de la
sangre a las clulas. Cuando no hay insulina como en los diabticos jvenes (Tipo 1), o no funciona
correctamente, como ocurre en los adultos (Tipo 2), el azcar no pasa de la sangre a los rganos y el
funcionamiento es deficiente. Al tiempo, el azcar se acumula en la sangre en cantidades superiores a las
normales, apareciendo hiperglucemia. Cuando la glucosa en sangre es superior a 180 mg, el organismo no
puede retenerla, por lo que la elimina por la orina: Glucosuria. En un paciente mal controlado o no tratado
aparecer hiperglucemia y glucosuria.
Clasificacin: Actualmente la diabetes se clasifica en:
a. Diabetes tipo I (dficit total de insulina).
b. Diabetes tipo II (resistencia a la insulina o defecto secretor con resistencia a la insulina, los enfermos al
principio no requieren la administracin de insulina).
c. Diabetes secundaria (enfermedades pancreticas, tumores endocrinos, entre otros).
d. Diabetes gestacional (se detecta durante el embarazo).
Cmo se detecta la Diabetes?
El estudio de diabetes se realiza mediante la medicin de la glucosa en sangre y en ayunas (glucemia basal) y
se recomienda en las siguientes circunstancias:
En todos los individuos mayores de 45 aos, y repetir cada 3 aos mientras sea normal.
En poblacin ms joven cuando existan factores de riesgo.
Cuando aparezcan sntomas o signos que sugieran diabetes:
- Poliuria (orinar mucho).
- Polifagia (aumento del apetito).
- Polidipsia (beber mucho por sed).
- Prdida de peso.
- Retinopata.
- Proteinuria.
- Infecciones urinarias de repeticin.
- Infecciones cutneas de repeticin,...
Cuando el nivel de glucosa plasmtica en ayunas est entre 110 y 125, hay que repetir la glucemia y si
persiste, realizar un test de Tolerancia Oral (75g de glucosa disuelta en 300ml de agua que se ha de tomar en
3-5 minutos).
Pacientes con antecedentes de Hipertensin arterial o trastornos del colesterol.
Determinacin de glucosa: para el diagnstico de la diabetes es necesario determinar la glucemia, pero
cmo se cuantifica el nivel de glucosa en una muestra?, Los mtodos para determinar la concentracin de
glucosa se clasifican en dos grandes grupos:
a) Mtodos basados en el poder reductor de los hidratos de carbono (reaccin de Benedict, mtodo de la o-
toluidina)
b) Mtodos enzimticos: son los ms utilizados, utilizan enzimas como reactivos (ej. glucosa oxidasa,
hexoquinasa) a fin de aumentar la especificidad. Los dos mtodos que vamos a citar se pueden utilizar para
determinar la glucosa en muestras de suero, orina y lquido cefalorraqudeo.
b.1.) Mtodo de la hexoquinasa: Es el mtodo de referencia y consiste en dos reacciones acopladas:
Glucosa + ATP
Hexoquinasa, Mg++
G-6-PO
4
+ ADP
G-6-PO
4
G-6-PD
6-fosfogluconato NADPH H
+
NADP
+
+
+
+
En la primera reaccin (especfica), catalizada por la enzima hexoquinasa, se fosforila la glucosa formndose
glucosa 6-fosfato. La glucosa 6-fosfato, en una reaccin posterior (reaccin indicadora), se transforma en 6-
fosfogluconato producindose NADPH (1 mol por cada molcula de glucosa). La produccin de NADPH origina
un aumento de absorbancia a 340nm. El incremento de absorbancia a esta longitud de onda ser directamente
proporcional a la concentracin de glucosa.
b.2.) Mtodo de la glucosa oxidasa: Al igual que el anterior consiste en dos reacciones acopladas:
Glucosa + O
2
glucosa oxidasa
cido glucnico H
2
O
2
H
2
O
2
+
cromgeno reducido
peroxidasa
cromgeno oxidado H
2
O
+
+
+ H
2
O
En la primera reaccin (reaccin especfica), catalizada por la enzima glucosa oxidasa (GOD), se oxida la
glucosa y se genera H
2
O
2
. En la segunda reaccin (reaccin indicadora), la enzima peroxidasa (POD) cataliza
la descomposicin del H
2
O
2
lo que provoca oxidacin de un cromgeno que pasa de su forma reducida
(incolora) a su forma oxidada (coloreada). La aparicin del cromgeno oxidado se evala mediante un
espectrofotmetro y ser directamente proporcional a la concentracin de glucosa en la muestra. La 4-
aminoantipirina / fenol es uno de los cromgenos ms utilizados, es oxidado por el agua oxigenada en un compuesto
de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm, con un pico de mxima absorbancia a 500 nm.
Glucosa + 1/
2
O
2
glucosa oxidasa
cido glucnico H
2
O
2
2 H
2
O
2
+
peroxidasa
4 H
2
O
+
+
+ H
2
O
4-Aminoantipirina Fenol
Quinonaimina
+
Este mtodo (GOD/POD) presenta como desventaja que muchos compuestos presentes en el suero u orina
(bilirrubina, cido ascrbico y cido rico) pueden ser oxidados por el H
2
O
2
producido en la reaccin catalizada
por la enzima GOD y por tanto interfieren en el resultado (se da un resultado superior al real).
Tambin se puede cuantificar la concentracin de glucosa de la muestra utilizando slo la primera reaccin y
evaluando la cantidad de oxgeno consumido mediante un electrodo de oxgeno. La cantidad de glucosa en la
muestra es directamente proporcional a la cantidad de oxgeno consumido.
Aspectos prcticos a considerar cuando se analiza la glucemia:
1. Centrifugar la sangre lo antes posible: los eritrocitos y leucocitos consumen glucosa, por tanto, si el contacto
con las clulas es prolongado se pueden dar resultados falsamente bajos (a temperatura ambiente puede
incluso desaparecer al cabo de 6h). Actualmente, existen tubos con separador de suero que funciona como una
interfase entre las clulas y el suero despus de la centrifugacin, haciendo que no sea necesario separar el
suero en otro tubo.
2. Si no se van a analizar inmediatamente, se puede refrigerar la muestra o aadir un conservante ej. Fluoruro
sdico.
3. La concentracin de glucosa en suero refrigerado es estable durante 3 das.
Materiales, Equipos y Sustancias
Sustancias Materiales y Equipos
Suero sanguneo Tubos de ensayo
Reactivos para determinar glucosa:
A. Reactivo: Fosfatos 100 mmol/L, fenol 5 mmol/L, glucosa oxidasa > 10 U/mL,
peroxidasa > 1U/mL, 4-aminoantipirina 0,4 mmol/L, pH 7,5
S. Patrn de Glucosa/Urea/Creatinina: Glucosa 100 mg/dL (5,55 mmol/L), urea
50 mg/dL, creatinina 2 mg/dL. Patrn primario acuoso.
Micropipetas
Espectrofotmetro
Conservacin de los reactivos:
Conservar a 2-8C.
El Reactivo y el Patrn son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se
conserven bien cerrados y se evite la contaminacin durante su uso.
Indicaciones de deterioro:
Reactivo: Presencia de partculas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,150 a 500 nm (cubeta de 1
cm).
Patrn: Presencia de partculas o turbidez.
Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. El suero o plasma deben separarse de los
elementos celulares lo antes posible para evitar la glucolisis. La adicin de fluoruro sdico a la muestra de
sangre previene la glucolisis. La glucosa en suero o plasma es estable 5 das a 2-8C. Los anticoagulantes
como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.
Caractersticas metrolgicas
Lmite de deteccin: 0,23 mg/dL = 0,0126 mmol/L
Lmite de linealidad: 500 mg/dL = 27,5 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra
1/4 con agua destilada y repetir la medicin.
Sensibilidad: 4 mAdL/mg = 0,22 mAL/mmol
Interferencias: la hemoglobina (> 3 g/L), la lipemia (trigliceridos >1,25 g/L) y la bilirrubina (10 mg/dL)
interfieren.. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.
Seccin Experimental
1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.
2. Pipetear en tubos de ensayo:
Tubo 1 (blanco) Tubo 2 Tubo 3
Patrn - 10 L -
Muestra - - 10 L
Reactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Nota: para la conservacin y economa del reactivo se recomienda preparar solo un tubo blanco por grupo.
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos a
37C.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al
menos 2 horas.
Clculos: La concentracin de glucosa en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:
A
Muestra
A
Patrn
x C
Patrn
C
Muestra
=
Valores de referencia:
Neonato, prematuro
Neonato, a trmino
Nios, adultos
25-80 mg/dL = 1,39-4,44 mmol/L
30-90 mg/dL = 1,67-5,00 mmol/L
70-105 mg/dL = 3,89-5,83 mmol/L
Residuos
Todos se depositan en residuos orgnicos no halogenados
Pregunta
En qu consiste el mtodo de valoracin reflectomtrica y el mtodo de sensores por capilaridad para la
determinacin de glucosa en sangre?
Referencias
1. http://www.biosystems.es/Methods/11503c.pdf
2. http://www.bganalizadores.com.ar/resultado.html?linea=4
3. http://www.insp.mx/Portal/Cuidados_salud/diabetes-INSP.pdf
PRACTICA 10
PERFIL LIPDICO
Objetivos
1. Determinacin de la concentracin de colesterol total, HDL-colesterol y triglicridos.
2. Clculo de LDL-colesterol, mediante la frmula de Friedewald.
3. Dar interpretacin diagnstica del resultado.
Aspectos Tericos
Dentro de los lpidos, los triglicridos y el colesterol y sus steres, constituyen dos grupos muy importantes. Los
primeros por su alto contenido energtico y el segundo por su papel estructural en la formacin de membranas
celulares animales en donde constituyen hasta el 25%. Existen varias tcnicas experimentales para extraer y
cuantificar lpidos. Uno de los mtodos, utilizado actualmente a nivel clnico y de investigacin, para valorar el
colesterol y los triglecridos en el plasma y/o suero sanguneos es el enzimtico calorimtrico.
Colesterol Total
El colesterol es un esteroide de alto peso molecular que contiene una estructura ciclopentanofenantreno. El
colesterol de la dieta se absorbe parcialmente y tambin se sintetiza en el hgado y otros tejidos. El colesterol se
encuentra en las membranas celulares en forma libre, en algunas clulas capaces de almacenarlo, eterificado
reversiblemente en cidos grasos y en las lipoprotenas circulantes en el plasma sanguneo, las cuales lo
transportan eterificado en el centro de la clula y libre en su capa externa. El colesterol es necesario para que
las clulas eucariticas formen nuevas membranas y es el precursor biosintetico de sales biliares, hormonas
esteroidales y vitamina D. Las concentraciones elevadas de colesterol se asocian con un riesgo
progresivamente creciente de ateroesclerosis y enfermedad de las arterias coronarias.
La cuantificacin de colesterol en el plasma y/o suero sanguneos por el mtodo enzimtico calorimtrico, se
fundamenta en una hidrlisis de los steres del colesterol catalizada por la colesterol ster hidrolasa, este
colesterol junto con el colesterol libre presente en el plasma o suero sanguneo es oxidado por la colesterol
oxidasa a
4
-colestenona (cetona) y perxido de hidrgeno, el cual en presencia de la peroxidasa, oxida al
sistema cromgeno 4-aminoantipirina/fenol a un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm con
un pico de mxima absorbancia a 500 nm.
Colesterol-HDL
Las HDL participan en la captacin del colesterol de los tejidos y en su transporte hacia el hgado donde se
elimina en forma de cidos biliares. Existe una correlacin positiva entre concentraciones bajas de HDL-
colesterol en plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes
cerebrovasculares. Existen diversos estados patolgicos o influencias ambientales asociados con niveles
reducidos de HDL: enfermedades hepatocelulares agudas o crnicas, hiperalimentacin intravenosa,
malnutricin severa, diabetes, anemia crnica, alteraciones mieloproliferativas, enfermedad de Tangier,
analfalipoproteinemia, estrs agudo, algunos medicamentos y el tabaco. El diagnstico clnico no debe
realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de
laboratorio.
El colesterol de las protenas de baja densidad (LDL), las de muy baja densidad (VLDL) y los quilomicrones es
hidrolizado por la colesterol oxidasa mediante una reaccin enzimtica acelerada no formadora de color. El
detergente presente en el reactivo B solubiliza el colesterol de las lipoprotenas de alta densidad (HDL) de la
muestra. El colesterol de HDL se cuantifica espectrofotomtricamente mediante las reacciones acopladas
descritas a continuacin.
Triglicridos
Los triglicridos son steres de glicerol y cidos grasos que provienen de la dieta o son sintetizados
principalmente en el hgado. Los triglicridos se transportan en el plasma en las lipoprotenas y son utilizados
por el tejido adiposo, msculo y otros. Su principal funcin es suministrar energa a la clula. Las
concentraciones elevadas de triglicridos en suero pueden ser debidas a alteraciones hepatobiliares, diabetes
mellitus, nefrosis, hipotiroidismo, alcoholismo, hiperlipoproteinemia familiar IV y V entre otras.
Los triglicridos presentes en la muestra son hidrolizados por la lipasa para liberar cidos grasos y glicerol, este
ltimo es fosforilado por ATP en presencia de glicerol quinasa. El glicerol resultante es oxidado por GPO a
dihidroxiacetona fosfato y perxido de hidrogeno, el cual en presencia de la peroxidasa, oxida al sistema
cromgeno 4-aminoantipirina/4-clorofenol a un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm con un
pico de mxima absorbancia a 500 nm.
Colesterol-LDL
Las LDL son las principales lipoproteinas que transportan colesterol heptico hacia los tejidos. Existe una
correlacin positiva entre concentraciones elevadas de LDL-colesterol en plasma y la incidencia de
aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Existen diversos estados
patolgicos o influencias ambientales asociados con niveles elevados de LDL: nefrosis, diabetes, obesidad,
algunos medicamentos y el tabaco. El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de
un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio.
Si los triglicridos son menor de 400 mg/dl, la concentracin de colesterol LDL (LDL-C) se calcula de la
concentracin de colesterol total (COL-T), la concentracin de HDL colesterol (HDL-C) y la concentracin de los
triglicridos (TG) de acuerdo a la formula de Friedewald:
LDL-C = COL-T HDL-C (TG/5) (mg/dl)
LDL-C = COL-T HDL-C (TG/2,2) (mmol/l)
La ecuacin anterior se obtiene despus hacer el siguiente anlisis:
Colesterol total = Colesterol de VLDL + Colesterol LDL + Colesterol HDL
Por lo tanto:
Colesterol LDL = Colesterol total - Colesterol de VLDL- Colesterol HDL
De aqu, el colesterol total y el HDL-colesterol fueron medidos anteriormente, y el Colesterol de VLDL se estima
que es igual a la cantidad de Triglicridos dividido por 5.
Valores de Referencia:
Hasta 100 mg/dL (2,59 mmol/L)
100-129 mg/dL (2,59-3,34 mmol/L)
130-159 mg/dL (3,37-4,12 mmol/L)
160-189 mg/dL (4,14-4,90 mmol/L)
>190 mg/dL (>4,92 mmol/L)
Optimo
Casi optimo
Moderado
Elevado
Muy elevado
Materiales, Equipos y Sustancias
Sustancias Materiales y Equipos
Suero sanguneo Tubos de ensayo
Reacti vo para determinar colesterol: 10 x 50 mL. Pipes 35 mmol/L, colato sdico
0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa >
0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0.
Patrn de Colesterol. Colesterol 200 mg/dL (5,18 mmol/L)
Pipetas y micropipetas
Reacti vo para determinar triglicridos: Pipes 45 mmol/L, 4 - clorofenol 6 mmol/L,
cloruro magnsico 5 mmol/L,lipasa > 100 U/mL, glicerol quinasa > 1,5 U/mL,
glicerol-3-fosfato oxidasa > 4 U/mL,peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,75
mmol/L, ATP 0,9 mmol/L, pH 7,0.
Patrn de Triglicridos: Glicerol equivalente a trioleina 200 mg/dL (2,26 mmol/L).
Espectrofotmetro
Reacti vos para determinar colesterol-HDL:
A. Reactivo: 2 x 50 mL. Fosfotungstato 0,4 mmol/L, cloruro de magnesio 20
mmol/L.
B. Reactivo: 2 x 50 mL. Fosfatos 35 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL,
colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 1 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L,
colato sdico 0,5 mmol/L, diclorofenol-sulfonato 4 mmol/L, pH 7,0.
S. Patrn de Colesterol HDL: 1 x 5 mL. Colesterol 15 mg/dL. Patrn primario
acuoso.
Bao de agua a 37
o
C
Aguas desionizada
Conservacin de los reactivos: Conservar a 2-8C. El Reactivo es estable hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta, siempre que se conserve bien cerrado y se evite la contaminacin durante su uso.
Indicaciones de deterioro: Presencia de partculas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,200 a 500
nm (colesterol total y trigliceridos).
Caractersticas Generales de la Prueba
1. Colesterol Total
a. Metrologa
Lmite de deteccin: 0,9 mg/dL = 0,023 mmol/L
Lmite de linealidad: 1000 mg/dL = 26 mmol/L
Interferencias: La hemoglobina (>5 g/L) y la bilirrubina (>10 mg/dL) interfieren. La lipemia (triglicridos 10
g/L) no interfiere.
b. Limitaciones
Una muestra con una concentracin de colesterol que excede el lmite de linealidad debe diluirse con solucin
salina a 0.9% y volverse a analizar incorporando el factor de dilucin en el clculo del resultado. Muestras muy
ictricas, hemolticas o lipmicas requieren del uso de un blanco de muestra que puede prepararse agregando
25 L de la muestra a 2.5 mL de agua desionizada.
c. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. El colesterol en suero o plasma es estable 7 das
a 2-8C. Pueden utilizarse como anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.
2. Triglicridos
a. Metrologa
Lmite de deteccin: 1,6 mg/dL = 0,018 mmol/L
Lmite de linealidad: 600 mg/dL = 6,78 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra
1/4 con agua destilada y repetir la medicin.
Sensibilidad analtica: 1,2 mAdL/mg = 112 mAL/mmol
Interferencias: La hemoglobina (10 g/L) no interfiere. La bilirrubina (2,5 mg/dL) interfiere.
b. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. Los triglicridos en suero o plasma son estables
5 das a 2-8C. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.
3. Colesterol-HDL
a. Metrologa
Lmite de deteccin: 3,0 mg/dL = 0,078 mmol/L
Lmite de linealidad: 150 mg/dL = 3,9 mmol/L.
Interferencias: La lipemia (triglicridos 10 g/L) no interfieren. La hemolisis (hemoglobina > 5g/L) y la bilirrubina
(> 10 mg/dL) pueden interferir.
b. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. El Colesterol HDL en suero o plasma es estable
7 das a 2-8C. Como anticoagulante puede utilizarse EDTA, litio o heparina sdica.
Seccin Experimental
A. Determinacin de Colesterol Total
1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.
2. Pipetear en tubos de ensayo:
Tubo 1 (blanco) Tubo 2 (patrn) Tubo 3 (Muestra)
Patrn de
Colesterol
- 10 L -
Muestra - - 10 L
Reactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos
a 37C.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante
al menos 2 horas.
Clculo: La concentracin de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:
A
Muestra
A
Patrn
x C
Patrn
C
Muestra
=
Valores de referencia:
Hasta 200 mg/dL (5,2 mmol/L)
200-239 mg/dL (5,2-6,21 mmol/L)
>240 mg/dL (>6,24 mmol/L)
ptimo
Moderado
Elevado
B. Determinacin de Colesterol-HDL
Precipitacin
1. Pipetear en un tubo de centrfuga
Muestra 0.2 mL
Reactivo A 0.5 mL
2. Agitar bien y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar durante 10 minutos a 5.000 r.p.m.
4. Recoger con cuidado el sobrenadante. El sobrenadante debe ser completamente claro. En caso de persistir
la turbidez o de no obtener una buena sedimentacin del precipitado, adicionar otros 0,5 mL de Reactivo A,
mezclar bien y centrifugar de nuevo. Multiplicar el resultado obtenido por 1,7 para corregir la
dilucin efectuada.
Colorimetra
5. Atemperar el Reactivo B a temperatura ambiente.
6. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrn Muestra
Patrn Colesterol HDL - 50 L -
Sobrenadante muestra - - 50 L
Reactivo (B) 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
7. Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 10 minutos a
37C.
8. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al
menos 30 minutos.
Clculo: La concentracin de colesterol HDL se calcula a partir de la siguiente frmula general:
A
Muestra
A
Patrn
x C
Muestra
=
C
Patrn x 3.5 (Factor de dilucin)
Valores de Referencia
Las concentraciones de colesterol de HDL varan considerablemente con la edad y el sexo. El siguiente valor
discriminante ha sido recomendado para identificar individuos con elevado riesgo de enfermedad coronaria.
Hasta 35 mg/dL (0.91 mmol/L) Riesgo elevado
> 60 mg/dL (1,56 mmol/L) Riesgo bajo
C. Determinacin de Triglicridos
1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.
2. Pipetear en tubos de ensayo:
Tubo 1 (blanco) Tubo 2 (patrn) Tubo 3 (Muestra)
Patrn de
Triglicridos
- 10 L -
Muestra - - 10 L
Reactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos
a 37C.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante
al menos 2 horas.
Clculo: La concentracin de triglicridos en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:
A
Muestra
A
Patrn
x C
Patrn
C
Muestra
=
Valores de referencia:
Hasta 150 mg/dL (1,7 mmol/L)
150-199 mg/dL (1,70-2,25 mmol/L)
200-499 mg/dL (2,26-5,64 mmol/L)
>500 mg/dL (>5,65 mmol/L)
Bajo
Dudoso
Alto
Muy alto
Residuos
Todos se depositan en residuos orgnicos no halogenados
Consulta
Consultar sobre las familias de enzimas a las que pertenecen las enzimas empleadas en esta sesin.
Preguntas
1. A qu clase de compuestos pertenecen triglicridos y el colesterol?
2. Cul es el rol funcional de las diversas lipoprotenas?
3. Cul es el rol de las lipoprotenas en el proceso aterognico?
4. Qu es el colesterol HDL, LDL y VLDL?
5. Mencione algunas fuentes endgenas de colesterol
Referencias
1. http://www.biosystems.es/Methods/
2. http://www.labomed.com.ve
3. http://www.mediben.com/Nutsem2.htm
PRACTICA 11
DETERMINACION DE BILIRRUBINAS EN SUERO SANGUNEO
Objetivos
1. Cuantificar el contenido de bilirrubinas en suero sanguneo
2. Dar interpretacin diagnstica del resultado.
Aspectos Tericos
La bilirrubina es un pigmento amarillo rojizo biliar que se encuentra normalmente en el suero como resultado de
la destruccin de los eritrocitos. Es un producto de la degradacin de la hemoglobina por el sistema
reticuloendotelial y existe en dos formas. La bilirrubina no conjugada (indirecta) es transportada hacia el hgado
donde es fijada a la albmina donde luego es conjugada (directa) con cido glucurnico, se excreta en la bilis
pasando por el duodeno para ser eliminada. Las concentraciones de bilirrubina en la sangre pueden aumentar
debido a varios motivos como son: sobreproduccin de la misma, disminucin de la absorcin por parte del
hgado, disminucin de la conjugacin, disminucin de la secrecin del hgado o bloqueo de las vas biliares.
En caso de aumento de produccin, disminucin de absorcin del hgado o disminucin de la conjugacin, la
bilirrubina no conjugada, denominada bilirrubina indirecta, estar bsicamente elevada. En casos de
disminucin de secrecin del hgado u obstruccin de las vas biliares, la bilirrubina conjugada o bilirrubina
directa, estar bsicamente elevada. Existen una serie de enfermedades heredadas o adquiridas que afectan a
la produccin, captacin, metabolismo y excrecin de bilirrubina, resultando en una hiperbilirrubinemia.
Se observa hiperbilirrubinemia no conjugada en recin nacidos (ictercia fisiolgica), en un aumento de la
destruccin de eritrocitos (anemia hemoltica, hematoma extenso), en eritropoyesis defectuosa as como en
algunas enfermedades genticas poco frecuentes (sndrome de Gilbert, sndrome de Crigler-Najjar).
La hiperbilirrubinemia conjudada se asocia a una disminucin en la excrecin de bilis debida a enfermedades
hepticas (hepatitis o cirrosis) o bien a una colestasis intra o extraheptica. La ictericia es una manifestacin
clnica de la hiperbilirrubinemia, que consiste en una deposicin de los pigmentos biliares en la piel, originando
coloracin amarillenta de la piel y mucosas.
Los mtodos tradicionales para la determinacin de la bilirrubina se basan en la reaccin de sta con el reactivo
diazo para formar el compuesto colorido azo-bilirrubina. La bilirrubina directa presente en la muestra reacciona
con el cido sulfanlico diazoado formando azobilirrubina, un complejo coloreado que puede determinarse
espectrofotomtricamente. La reaccin diazo puede acelerarse mediante la adicin de varios compuestos
qumicos, tales como etanol, cafena o DMSO. Para la determinacin de la bilirrubina total se adiciona un
tensoactivo como agentes solubilizantes, como es el caso de la cetrimida, la cual solubiliza la bilirrubina
indirecta permitiendo su reaccin junto con la fraccin directa. Los trminos directa y total se refieren a las
caractersticas de reaccin en presencia o ausencia de solubilizantes (aceleradores). La bilirrubina directa e
indirecta equivale slo de forma aproximada a las fracciones conjugada y no conjugada.
Bilirrubina Total + Sal de 2,4-diclorofenil diazonio
Tensoactivo
Azobilirrubina
Materiales, Equipos y Sustancias
Sustancias Materiales y Equipos
Suero sanguneo Tubos de ensayo
BILIRRUBINA (TOTAL)
AT. Reactivo. Acido sulfanlico 29 mmol/L, cido clorhdrico 0,2 mol/L, cetrimida 50
mmol/L.
BT. Reactivo. Nitrito sdico 11,6 mmol/L.
Pipetas y micropipetas
BILIRRUBINA (DIRECTA):
AD. Reactivo. Acido sulfanlico 35 mmol/L, cido clorhdrico 0,24 mol/L.
BD. Reactivo. Nitrito sdico 3,5 mmol/L.
Espectrofotmetro
Bao de agua a 37
o
C
Conservacin
Conservar a 15-30C.
Los Reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien
cerrados y se evite la contaminacin durante su uso.
Indicaciones de deterioro: Presencia de partculas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,05 a 540 nm
(cubeta de 1 cm).
Caractersticas Metrolgicas
Lmite de deteccin (bilirrubina total): 0,03 mg/dL = 0,51 mol/L
Lmite de deteccin (bilirrubina directa): 0,02 mg/dL = 0,34 mol/L
Lmite de linealidad: 15 mg/dL = 257 mol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra 1/3
con agua destilada y repetir la medicin.
Interferencias: La hemlisis no interfiere (hemoglobina 10 g/L). La lipemia (trigliceridos > 15 g/L)
Muestras
Suero recogido mediante procedimientos estndar. La bilirrubina en suero es estable 2 das a 2-8C si se
protege de la luz.
Seccin Experimental
A. BILIRRUBINA TOTAL
1. Pipetear en tubos de ensayo:
Tubo 1 (blanco muestra) Tubo 2 (Muestra)
Muestra 100 L 100 L
Reactivo (AT) 1.0 mL 1.0 mL
Reactivo (BT) - 250 L
2. Agitar bien y dejar reaccionar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
3. Leer la absorbancia (A
1
) de la Muestra frente al blanco de la muestra a 540 nm.
B. BILIRRUBINA DIRECTA
1. Pipetear en tubos de ensayo:
Tubo 3 (blanco muestra) Tubo 4 (Muestra)
Muestra 100 L 100 L
Reactivo (AD) 1.0 mL 1.0 mL
Reactivo (BD) - 250 L
2. Agitar bien y dejar reaccionar durante 5 minutos a 37C.
3. Leer la absorbancia (A
2
) de la Muestra frente al blanco de la muestra a 540 nm.
Clculos
La concentracin de bilirrubina en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:
Bilirrubina total = A1 x 12,5 mg/dL, este valor es el producto de la divisin 2,5/0,2 donde 2,5 es la concentracin
y 0,2 es la observancia del patrn.
Bilirrubina directa: A2 x 7,74 mg/dL, este valor es el producto de la divisin 2,5/0,2 donde 2,5 es la
concentracin y 0,2 es la observancia del patrn.
Si se desea expresar la concentracin de bilirrubina total o directa en mol/L se puede utilizar la siguiente
ecuacin:
Concentracin masa (mg/dL) x 17,1 = concentracin sustancia (mol/L)
Valores de referencia en adultos
Total Hasta 1,1 mg/dL (18,8 mol/L)
Directa Hasta 0.25 mg/dL (4,3 mol/L)
Significado Clnico
La bilirrubina se origina por la degradacin de la hemoglobina. Es transportada del bazo al hgado y se excreta
en la bilis. La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas ms
probables de la hiperbilirrubinemia: Bilirrubina Total (T): Aumento de la hemlisis, alteraciones genticas,
anemia neonatal, alteraciones eritropoyticas, presencia de drogas. Bilirrubina Directa (D): Colestasis heptica,
alteraciones genticas y alteraciones hepticas.
Residuos
Todos se depositan en residuos orgnicos no halogenados
Referencias
1. http://www.biosystems-sa.com/Methods/11515c.pdf
2. http://www.spinreact.com.mx/pdf/1001044.pdf
3. http://www.pkids.org/Spa_phrliv.pdf
4. http://www.thermo.com/eThermo/CMA/PDFs/Various/File_28459.pdf
PRACTICA 12
ANALISIS CUALITATIVO DE ORINA
Objetivos
1. Realizar un anlisis cualitativo, mediante pruebas qumicas, de algunos componentes de la orina, como
son: la urea, la creatinina, los cuerpos cetnicos, los sulfatos, la glucosa y los cloruros.
2. Comprobar en la orina algunos de los componentes mencionados mediante el uso de tiras reactivas
Aspectos Tericos
Tiras reactivas para urianlisis: Las tiras reactivas para urianlisis son tirillas de plstico firme en la cual se
encuentran sujetos algunos diferentes reactivos. Dependiendo del producto que se est usando, las tirillas
reactivas proveen pruebas para la glucosa, bilirrubina, cuerpos cetnicos (cido acetoacetico), gravedad
especfica, sangre, pH, protenas, urobilingenos, nitrito y leucocitos en orina. El resultado de la prueba podr
suministrar informacin de acuerdo con el estado del metabolismo del carbohidrato, del hgado, de la funcin
heptica, del balance cido-base y bacteriurea. Cada tirilla es estable y lista para usarse despus de removida
del bote. La tirilla reactiva en su totalidad es desechable. Los resultados son obtenidos por comparacin directa
entre la tirilla de prueba con los bloques de color impresos en la etiqueta del bote. No se requieren clculos o
instrumentos de laboratorio.
Orina: La orina es un lquido acuoso transparente y amarillento, de olor caracterstico, excretado por los riones
y eliminado al exterior por el aparato urinario. Despus de la produccin de orina por los riones, sta recorre
los urteres hasta la vejiga urinaria donde se almacena y despus es expulsada al exterior del cuerpo a travs
de la uretra, mediante la miccin.
Anlisis Fsico de Orina
Olor: La orina normal recin emitida no huele, salvo si se han ingerido determinados alimentos (esprragos). En
las infecciones por microorganismos que degradan la urea la orina huele amonaco. En los enfermos con
cetoacidosis huele a acetona. Un olor dulzn desagradable sugiere inflamacin o focos supurativos urinarios.
Hay errores congnitos del metabolismo en los que adquiere un olor peculiar (fenilcetonuria, enfermedad del
jarabe de arce, malabsorcin de metionina) con el ejemplo caracterstico del olor a pies sudados de la acidemia
isovalrica.
Aspecto (color y turbidez): La orina normal tiene color amarillo. La intensidad es inversamente proporcional a
la concentracin de solutos. La orina muy diluida es muy plida y si est concentrada adquiere un color amarillo
intenso, debido a la mayor concentracin de pigmentos excretados por el rin, como la riboflavina.
El color de la orina vara en numerosas situaciones fisiolgicas y patolgicas:
CAUSAS ENDGENAS COLOR DE LA ORINA FACTORES EXGENOS
Bilirrubina (conjugada) Amarillo intenso Antocianinas (remolacha) Roja
Hemoglobina y mioglobina Rojo-parduzco Antraquinonas (laxantes) Anaranjada (pH alcalino)
Hematuria Rojo turbio Rifampicina Anaranjada
Porfirinas y sus
precursores
Rojo Azul de metileno Verde
Melangenos Pardo negruzca L-dopa Pardusca
cido homogentsico Pardo negruzca
Quiluria Blanquecina (lctea)
Piuria Blanquecina (turbia)
Densidad: La densidad urinaria indica la capacidad de concentracin/dilucin del rin. En los adultos sanos
vara entre 1,002 y 1,035 g/ml. En situaciones de deshidratacin extrema puede alcanzar 1,040 g/ml. La
densidad urinaria es un parmetro muy variable en condiciones fisiolgicas, y por lo tanto de poco valor
diagnstico, por lo que slo hay que tenerla en cuenta si es discordante con la situacin clnica que se
sospeche:
Debe ser mayor de 1,025 en situaciones de baja perfusin renal con funcin tubular conservada:
deshidratacin, diabetes mellitus mal controlada, insuficiencia cardiaca.
Debe ser menor de 1,010 en enfermos con diabetes inspida, polidipsia o bajo tratamiento diurtico.
Es constante (alrededor de 1,010) en enfermos en la fase isostenrica de la insuficiencia renal crnica.
Hay diversos mtodos para medir la densidad urinaria, como el clsico densitmetro de vidrio. Actualmente las
tiras reactivas proporcionan una lectura aproximada. Esta prueba se basa en un intercambio inico entre los
polielectrolitos del rea de prueba y los iones en la muestra, lo que resulta en un cambio de color de un
indicador acido-base. Este color va de azul-verde en muestras con baja fuerza inica hasta marrn-amarillo en
orinas concentradas. Altas concentraciones de acido ascrbico (>700 mg/l) pueden simular una densidad
especifica alta. Un medio acido (pH<6.5) da una densidad especfica baja falsa.
La densidad medida utilizando tiras reactivas puede variar ligeramente del valor determinado por otros mtodos,
visto que no sern registrados aumentos de densidad causados por concentraciones de glucosa >1.000 mg/dL
(> 56 mmmol/L). Excrecin elevada de protena puede llevar a resultados ms altos. Orinas muy alcalinas
pueden causar lecturas bajas.
Anlisis Qumico de Orina
pH urinario: el pH es el inverso del logaritmo de la concentracin de iones hidrgeno. Valores bajos indican
acidez y valores altos alcalinidad. La orina cida se asocia con clculos de xantina, cistina, cido rico y oxalato
de calcio; en tanto que la orina alcalina se asocia con clculos de carbonato de calcio, fosfato de calcio y fosfato
de magnesio.
En adultos sanos oscila entre 4,5 y 8,0 aunque normalmente es ligeramente cido. Esta acidez se atribuye a la
presencia de fosfato cido y cidos orgnicos libres. Disminuye en situaciones de acidosis fisiolgica (ayuno) y
patolgica (salvo en las acidosis tubulares), as como si se sigue una dieta rica en protenas o si hay
deshidratacin o proliferacin en la orina de bacterias productoras de cido. Aumenta despus de las comidas,
en situaciones de alcalosis y si hay colonizacin por grmenes que degradan la urea, como Proteus (olor
amoniacal), dieta vegetariana o vmitos pertinaces.
La prueba con la tira reactiva se basa en el mtodo de doble indicacin de pH. En donde el azul de bromotimol
y el rojo de metilo dan colores distintivos sobre los rangos del pH de 5-9 el rango de los colores desde el rojo-
anaranjado hasta el amarillo y el amarillo-verde hasta el azul-verde.
El valor del pH en orina reciente de un paciente sano vara entre 5 y 6. La escala cromtica distingue
claramente valores entre pH 5 y pH 9. El valor pH siempre se debe determinar en orina recin recolectada,
evitando, de esa manera, el aumento indeseado a valores pH > 9, causado por la descomposicin bacteriana.
Protenas: la albumina urinaria es una mezcla de seroalbumina y seroglobulinas. La albuminuria se atribuye a
una lesin renal (nefrosis) o la inflamacin del rgano (nefritis). En condiciones normales el contenido en
protenas de la orina no rebasa los 150 mg/24 horas en el adulto.
La tira reactiva es altamente sensible para albmina, pero no para globulinas o hemoglobina. La sensibilidad
mnima de la tira reactiva es de 10 mg de protena/dL de orina. Los campos de referencia corresponden a las
siguientes concentraciones de albmina: negativo, 30, 100 y 500 mg/dL o 0,3, 1,0 y 5,0 g/L. Resultados falso-
positivos son posibles en orinas alcalinas (pH>9), tras la infusin con polivinilpirrolidina (sustituto sanguneo),
tras la ingestin de medicamentos conteniendo quinina y tambin por residuos de desinfectantes en el
recipiente de colecta. La coloracin de la protena se puede enmascarar por la presencia de colorantes mdicos
(azul de metileno) o pigmentos de remolacha
El significado patolgico de la proteinuria depende de su cuanta, de las caractersticas de las protenas
excretadas y de las circunstancias en que se produce. Por lo tanto, ante una proteinuria positiva, es necesario
cuantificarla y expresarla en cantidad eliminada en 24 horas y adems realizar un estudio electrofortico que
permita conocer la proporcin de las distintas protenas. En trminos cuantitativos, la proteinuria se clasifica en
4 categoras: microalbuminuria, proteinuria leve (de 150 mg a 1 g/24 horas), moderada (de 1 a 3,5 g/24 horas) y
grave o nefrtica (ms de 3,5 g/24 horas).
Glucosa: La presencia glucosa en orina es anormal y se denomina Glucosuria. Esta se da por estado de
hiperglucemia, en donde los niveles plasmticos de glucosa sobrepasan los 170 mg/dl. La hiperglucemia indica
un mal control de la diabetes mellitus o un estado transitorio de resistencia a la insulina.
Las tiras reactivas son muy especficas, basadas en el mtodo de la glucosa-oxidasa, que ha desplazado a
mtodos clsicos, como el de Benedict, que no es especfico para glucosa (otros azucares reductores como la
fructosa y la galactosa tambin dan prueba positiva).
Esta prueba est basada en un principio de una reaccin secuencial doble de una enzima. Una enzima; la
glucosa oxidasa, cataliza la formacin de cido glucnico y el perxido de hidrgeno de la oxidacin de la
glucosa. Una segunda enzima, peroxidasa, cataliza la reaccin de perxido de hidrgeno de potasio iodado a
cromgeno oxidado.
Concentraciones patolgicas de glucosa se indican por un cambio de coloracin de verde a verde azulada.
reas reactivas amarillas o verdosas se deben considerar como resultado negativo o normal. Todas las reas
que presentan un verde ms intenso que el campo de referencia negativo indican un resultado positivo. Los
campos de referencia corresponden a los siguientes rangos de concentracin de glucosa: neg. (amarillo), neg. o
normal (verdoso), 50, 150, 500 y 1000 mg/dL o neg. (amarillo), neg. o normal (verdoso), 2,8, 8,3, 27,8 y 55,5
mmol/L.
Gran cantidad de cido ascrbico presente en la orina tras la ingestin de vitamina C (p. ej., tabletas de
vitamina, antibiticos o jugos de fruta) puede llevar a resultados bajos o falsamente negativos. Adicionalmente,
un efecto inhibidor se produce por cido gentsico. Reacciones falso-positivas tambin pueden ser causados por
residuos de perxido presente en detergentes domsticos.
Cuerpos cetnicos: Derivan del metabolismo lipdico y son tres: cido acetoactico, acetona y cido 3-
hidroxibutrico.
La cetonuria (presencia de cuerpos cetnicos en orina) se da en situaciones de ayuno prolongado y se ve
facilitada por la existencia de vmitos, especialmente en nios pequeos. En la deficiencia insulnica se produce
un incremento del metabolismo de los cidos grasos, con formacin final de cuerpos cetnicos que se eliminan
por la orina. La cetonuria en un diabtico indica un control metablico muy deficiente y es anuncio de una grave
complicacin, el coma cetoacidtico.
Los cuerpos cetnicos, acetona y acetoacetato, se detectan mediante tiras reactivas impregnadas con
nitroprusiato sdico en medio alcalino dando un rango de colores que van desde el beige o rosa tenue para un
resultado negativo hasta uno rosa y rosa-prpura para una lectura positiva. La toma de aspirina o de L-
DOPA a dosis altas puede inducir falsos positivos.
Un resultado negativo del examen es normal. Los resultados de la presencia de acetona en la orina
generalmente aparecen como pequea, moderada o grande con sus valores correspondientes: Pequea: < 20
mg/dL, Moderada: 30-40 mg/dL, Grande: > 80 mg/dL
Creatinina: La creatinina (Cr) procede del metabolismo de la creatina del msculo esqueltico. La eliminacin
urinaria de creatinina es bastante constante, de 0,8 a 1,8 g/24 horas, y disminuye en la insuficiencia renal,
mientras que aumenta en situaciones de rabdomiolisis o ingesta proteica excesiva.
En solucin bsica la creatinina reacciona con acido pcrico dando un complejo de color rojo, el cual se utiliza
para su determinacin colorimtrica.
Urea: La urea es el principal metabolito de las protenas, se filtra con facilidad por el glomrulo y se reabsorbe
en un 40-50 % en el tbulo, aunque este porcentaje vara en funcin del grado de hidratacin y de la diuresis.
La excrecin urinaria de urea oscila entre lmites muy amplios: 6-20 g/da en adultos, 13-15 g/da en nios y 2-3
g/da en lactantes. Aumenta en estados de hipercatabolismo proteico y en dietas ricas en protenas y disminuye
en la insuficiencia heptica (por reduccin de la sntesis) y en la insuficiencia renal.
Cloruros: Aparte de la urea, son los cloruros las sustancias ms abundantes en la orina. El ms importante es
el de sodio y todos ellos derivan principalmente de los alimentos; por lo tanto, su expulsin fluctua segn lo
ingerido. Durante el ayuno puede desaparecer su expulsin, permitiendo asi que se mantenga durante algn
tiempo su concentracin normal en la sangre.
Su determinacin puede realizarse mediante el precipitado blanco de cloruro de plata que se forma cuando se
trata la mezcla que contiene cloruros con una solucin de nitrato de plata.
La excrecin diaria oscila normalmente entre 80 y 180 mEq/24 horas. Sus oscilaciones en condiciones
patolgicas suelen ir paralelas a las del sodio. El cual, en la insuficiencia renal prerrenal, por disminucin del
flujo sanguneo renal, as como en el sndrome hepatorrenal, el rin reabsorbe vidamente el sodio y su
concentracin en orina suele ser inferior a 10 mEq/l. En la insuficiencia renal intrnseca el tbulo pierde su
capacidad de reabsorcin de sodio y la concentracin supera los 20 mEq/l.
Bilirrubina y urobilingeno: Son los principales pigmentos biliares que pueden aparecer en la orina. La
bilirrubina es el producto final del metabolismo del hemo y el urobilingeno es su principal producto de
degradacin por las bacterias de la flora intestinal. Por lo tanto, si no hay paso de bilirrubina al intestino, no se
producir urobilingeno. Una pequea parte del urobilingeno se reabsorbe y es eliminado por la orina en forma
de urobilina. La excrecin mxima de urobilina por orina es de 5 mg/24 horas en el adulto sano.
La determinacin de bilirrubina y urobilina en orina se realiza mediante tiras reactivas, que integran el
acoplamiento de la bilirrubina con sales diazotadas estabilizadas en medio fuertemente acido. Normalmente la
bilirrubina no se detecta en la orina. Cantidades muy escasas son indicador suficiente de una enfermedad del
hgado. La reaccin no se afecta por el pH urinario. Resultados falsos bajos o negativos se observan con altas
concentraciones de acido ascrbico. La luz solar directa promueve la oxidacin de la bilirrubina y produce por
eso falsos bajos o negativos. Concentraciones de urobilinogeno superiores a 100 mol/l producen un cambio en
el color de la zona reactiva de la bilirrubina el cual vira a color naranja (realizar la lectura al cabo de los 2
minutos de haber escurrido la orina). Falsos positivos se observan con la presencia de metabolitos de drogas
que desarrollan color en pH acido, como por ejemplo las fenazopiridinas.
La sensibilidad mnima de la tira reactiva es de 0,5 a 1mg de bilirrubina/dL de orina. Los campos de referencia
corresponden a los siguientes valores: 0 (negativo), 1 (+), 2 (++), 4 (+++) mg/dL o 0 (negativo), 17 (+), 35 (++),
70 (+++) mmol/L.
NITRITO: La presencia de nitritos en orina es signo de colonizacin o infeccin bacteriana. La mayora de los
grmenes Gram negativos que suelen colonizar la orina reducen los nitratos a nitritos, y en esta propiedad se
basa la deteccin por tiras reactivas.
El Test es especfico para nitritos y no reacciona con los dems componentes de la orina. Un resultado negativo
no indica la ausencia de bacterionuria, ya que los organismos que no contienen reductasa para convertir el
nitrato en nitrito no son detectados. El test presenta una sensibilidad de 13-22 umol/L y tiene como
interferencias la elevada densidad especfica de la orina y el cido ascrbico (1,40 mmol/L), los cuales pueden
reducir la sensibilidad del mtodo.
Cualquier coloracin rosa indica una infeccin bacteriana del tracto urinario. La intensidad del color representar
la concentracin del nitrito, pero no proporciona informacin con respecto a la extensin de la infeccin. Un
resultado negativo no excluye la hiptesis de una infeccin del tracto urinario, si sta es causada por una
bacteria que no reducen los nitratos (Enterococcus spp., S. saprophyticus, Acinetobacter y Candida spp.).
Resultados falso- negativos se pueden provocar por altas dosis de cido ascrbico, por terapia con antibiticos,
o por una concentracin muy baja de nitrito como resultado de una dieta pobre en nitrato o fuerte dilucin
(diuresis). En muestras de pacientes femeninas, el flujo vaginal puede causar resultados falso-positivos. A fin de
evitar reacciones falso-positivas, antes de la colecta, se deben debidamente lavar los rganos genitales.
Esta prueba depende en la conversin de nitrato en nitrito mediante la accin de bacteria gram negativaen la
orina. En un medio cido el nitrito en la orina reacciona con cido p-arsanlico para formar un compuesto
diaznico. El compuesto diazonio forma un par con 1N-(1-naptil)-etilenediamine para producir un color rosado.
En el cuadro siguiente se resumen las enfermedades asociadas a la presencia de algunas sustancias en la orina:
Consideraciones sobre las tiras reactivas
a. Reactivos (Basados en pesos secos al momento de la impregnacin)
Reacti vo Tiempo de
Lectura
Composicin Descripcin
Acido
Ascrbico
30 Segundos
0,3% w/w 2,6-diclorofenolindofenol
99,7% w/w buffer e ingredientes no
reactivos
Detecta Acido Ascrbico tan bajo
como 5-10 mg/dl (0,28-0,56 mmol/l)
Glucosa
30 Segundos
1,5% w/w glucosa oxidasa; 0,5% w/w
peroxidasa; 10% w/w yoduro de potasio
75% w/w buffer; 13% w/w ingredientes
no reactivos.
Detecta glucosa tan bajo como 50-
100 mg/dl (2,5-5 mmol/l), Los
resultados Pueden ser ledos a los 10
segundos cualitativamente y en
treinta segundos para resultados
semi-cuantitativos.
Bilirrubina
30 Segundos
0,5% w/w 2,4-dicloroanilina sal
diaznica; 99,5% w/w buffer e
ingredientes no reactivos.
Detecta bilirrubina desde 0,4-0,8
mg/dl (6,8-13,6 mol/l).
Cuerpos
Cetnicos
40 Segundos
5% w/w Nitroprusiato de sodio, 95% w/w
buffer
Detecta cido acetoactico desde
2,5-5 mg/dl (0,25-0,5 mmol/l).
Gravedad
Especfica
45 Segundos
2,5% w/w indicador Azul de bromotimol
17,5% w/w buffer e ingredientes no
reactivos; 55% (Eter metil Vinlico
/Anhdrido maleico); 25% Hidrxido de
sodio.
Determina la gravedad Especfica
entre 1,000-1,030. Los resultados
correlativos con los valores obtenidos
por el mtodo del Index refractario
entre 0,005.
Sangre
60 Segundos
4% w/w 3,3 ,5,5Tetrametilbenzidina
(TMB); 6% w/w Hidroperxido de
Cumena; 90% w/w buffer e ingredientes
no reactivos.
Detecta Hemoglobina libre desde
0,015-0,062 mg/dl o 5-10 Ery/l en
especimenes de orina con, contenido
de Acido Ascrbico de <50 mg/dl.
0,5% w/w Rojo de metilo sal sdica, 5% Permite la diferenciacin cuantitativa
pH
60 Segundos
w/w Azul de bromotimol; 94,5% w/w de
Ingredientes no reactivos.
de valores de pH entre el Rango de
5-9.
Protenas
60 Segundos
0,3% w/w Azul de tetrabromofenol;
99,7% w/w buffer e ingredientes no
reactivos
Detecta albmina desde 7,5-20 mg/dl
(0,075-0,2 g/l).
Urobilingeno
60 Segundos
2,5% w/w p-dietilaminobenzaldehido;
97,5% w/w buffer e ingredientes no
reactivos.
Detecta el Urobilingeno desde
0,2-1,0 mg/dl (3,5-17 mol/l).
Nitritos
60 Segundos
4,5% w/w p-Acido Arsanlico; 95,5% w/w
ingredientes no reactivos.
Detecta el nitrito de sodio desde
0,05-0,1 mg/dl, en orina con una
gravedad Especfica baja y con
menos de 30 mg/dl de Acido
Ascrbico.
Leucocitos
.
120 Segundos
0,5% del derivado del ester del Acido
amino pirrol; 0,4% w/w sal diaznica;
32% w/w buffer; 67,1% w/w Ingredientes
no reactivos.
Detecta leucocitos tan bajo como 10-
25 glbulos blancos Leu/l en orinas
clnicas
b. Advertencias y precauciones: Las tiras reactivas para orina son para uso in vitro. No toque las reas
de prueba de las tirillas de orina.
c. Almacenaje: Almacene a temperatura ambiente entre 15-30c (59-59F) y fuerza de la luz directa del
sol. No las utilize despus de la fecha de expiracin.
d. Procedimiento recomendado para su menejo: Todas las tirillas no usadas debern permanecer en el
bote. l transferirlas a otro contenedor podr causar el deterioro de las tirillas y volverse no reactivas.
No tire el secante del bote. No abra el contenedor hasta que est listo para usarse. Los botes abiertos
debern ser usados dentro de los 3 siguientes meses despus de abiertos.
e. Recoleccin de la muestra y preparacin: Recolecte la muestra de orina en un contenedor limpio y
realice la prueba lo ms pronto posible. No centrifugue. No se recomienda el uso de conservadores
para orina. Si la prueba no se puede llevarse a cabo dentro de una hora despus de la recoleccin,
refrigere la muestra inmediatamente. Permita que la muestra refrigerada tome la temperatura ambiente
antes de realizar la prueba.
Sustancias y Materiales
Sustancias Materiales
Orina Tubos de ensayo
Solucion fenol-nitroprusiato de sodio: 4,7g fenol y 6mg de
nitroprusiato de sodio en 100ml de agua desionizada ( 250ml)
Un bao de agua a 40C y otro de agua
hirviendo
Nitroprusiato de sodio 0.1M Tiras reactivas para el anlisis de orina
Hipoclorito de sodio alcalino: disolver 2g de NaOH en 100ml
de agua desionizada y agregar 7,5ml de hipoclorito de sodio
comercial al 5%. Guardar en frasco ambar.
Nitrato de plata 1%
Acido pcrico 1%
Hidrxido de sodio 1M
Reactivo de Benedict
Acido actico 10%
Reactivo de Biuret
Seccin Experimental
A. Pruebas Qumicas
1. pH: Tome una tira de papel indicador, sumrjala en la orina y determine el valor del pH
2. Urea: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de la solucin fenol-nitroprusiato y 10
gotas de hipoclorito alcalino. Coloque el tubo en un bao de agua a 40 C durante 5 minutos y anote los
resultados. La aparicin de una coloracin azul-violeta es positivo para urea.
3. Creatinina: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 4 gotas de la solucin de cido pcrico y 4
gotas de hidrxido de sodio 1M. La aparicin de una coloracin naranja que se torna rojiza es prueba positiva
para creatinina.
3. Cuerpos cetnicos: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de la solucin de
nitroprusiato y 10 gotas de hidrxido de sodio 1M. Anote la aparicin de algn color. Coloque el tubo en un bao
de agua hirviendo y observe si hay algn cambio. En caliente adicione 5 gotas de cido actico al 10%.
Observe y anote los resultados. La formacin de un complejo verde-azul es prueba positiva para acetona.
4. Cloruros: Adicione 1.0 mL de orina en un tubo de ensayo y aadale 1 gota de nitrato de plata. La formacin
de un precipitado blanco es prueba positiva para cloruros.
6. Glucosa y otros azucares reductores: aada 1.0 mL de orina a un tubo de ensayo, adicinele 2 mL de
solucin de Benedict y caliente la solucin en un bao de agua hirviendo durante 5 minutos. Enfre el tubo a
temperatura ambiente. Si la solucin permanece transparente y azul, significa que no hay glucosa (o cualquier
otro azcar reductor). Si la solucin es verde, la muestra de orina contiene aproximadamente 0.25% de glucosa;
si es amarilla, 1% de glucosa; si es naranja, ms del 1% de glucosa; y si es rojo ladrillo, ms del 2% de glucosa.
7. Albmina: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de hidrxido de sodio al 25 % y 10
gotas del reactivo biuret. Observe y anote los resultados. La aparicin de una coloracin violeta es prueba
positiva para protenas.
B. Prueba con Tiras Reactivas
Notas de la prueba
1. Se recomienda usar solo orina fresca, bien homogenizada y sin centrifugar. Se recomienda usar la primera
orina de la maana por que se concentra durante la noche.
3. La recoleccin de la muestra debe realizarse en frascos limpios y libre de desinfectactes o detergentes.
4. No tocar las zonas reactivas de las tiras.
5. Inmediatamente despus de retirar el nmero de tiras necesarias, tapar correctamente el envase.
6. Retire el bote solamente de las tirillas necesarias para usarse inmediatamente y tape nuevamente el bote
bien cerrado.
Procedimiento
1. Sumerja completamente la tira reactiva en la muestra de orina por dos segundos.
2. Mientras es retirada, toque la tirilla por un lado con el borde del bote para retirar el exceso de orina.
3. Coloque la tira sobre una toalla de papel absorbente para eliminar el exceso de orina y evitar que se corra
(contaminacin de los cuadros reactivos adyacentes).
4. Compare cada rea de reaccin a su bloque de color correspondiente en la tabla y lea a los tiempos
especficos. La lectura apropiada a tiempo es crtica para obtener resultados ptimos
5. Obtenga los resultados directos por medio de la comparacin directa de colores
NOTA: Todas las reas de los reactivos a excepcin de los leucocitos debern ser ledas entre 1-2 minutos
para visin de orina positiva de orina negativa. Los cambios en el color despus de 2 min no son para valores
de diagnstico.
Bibliografa
1. http://www.mn-net.com
2. http://es.wikipedia.org/wiki/Orina
3. http://www.hsa.es/org/dmedica/centrales/bioquimica/docs/boletin/Sistematico_de_Orina.pdf
4. http://protgtstore.com/pdf/PruebaUrianalisisACON.pdf
5. http://www.spinreact.com.mx/pdf/52010.pdf
6. ftp://ftp.mn-net.com/espanol/Flyer_Catalogs/Medi-Test/Br_Medi-TestES.pdf
7. Holum, John r, Practicas de qumica general, qumica orgnica y bioqumica, Mxico, Limusa Wiley, 1972, p:
143.
PRACTICA 13
TITULACIN DE AMINOCIDOS
Objetivos
1. Realizar la titulacin de un aminocido y hacer su correspondiente curva de titulacin
2. Determinar a partir de la curva de titulacin los valores de pKa y el punto isoelctrico
3. Determinar las posiciones de las formas inicas de los aminocidos al variar el pH.
Aspectos Tericos
Generalidades
Las protenas son biomolculas grandes que se encuentran en todo organismo viviente. Existen muchos tipos y
tienen funciones biolgicas diferentes. La queratina de la piel y las uas, la fibroina de la seda, las telas de la
araa y la mayor parte de las enzimas que catalizan las reacciones biolgicas dentro de las clulas son
protenas. Las protenas estn constituidas de muchas unidades de aminocidos enlazados en una cadena
larga (figura 1).
H
2
N C
H
R
1
C N
O H
C C
H
R
2
N
O H
C C
R
3
OH
O
H
n
Aminocido
N-terminal
Aminocido
C-terminal
Enlaces amdicos
Estructura general de una protena
Figura 1. Estructura de una protena
Los aminocidos, como su nombre lo indica, son compuestos orgnicos bifuncionales. Contienen un grupo
amino bsico y un grupo carboxilo cido (figura 2):
H
2
N
C
C
O
OH
H
R
Figura 2. Estructura general de un aminocido
La hidrlisis cida, bsica o enzimtica de las protenas de todos los seres vivos produce veinte -L-
aminocidos, los cuales se muestran en la siguiente tabla:
Tabla nica. Aminocidos presentes en las protenas
Nombre Smbolo pK
1
(-COOH) pK
2
(-NH
3
+
) pK
3
Glicina Gly 2.4 9.8 -
Alanina Ala 2.4 9.9 -
Valina Val 2.2 9.7 -
Leucina Leu 2.3 9.7 -
Isoleucina Ile 2.3 9.8 -
Serina Ser 2.2 9.2 ~ 13
Treonina Thr 2.1 9.1 ~ 13
Cisteina Cys 1.9 10.8 8.3
Metionina Met 2.1 9.3 -
Acido aspartico Asp 2.0 9.9 3.9
Asparagina Asn 2.1 8.8 -
Acido glutmico Glu 2.1 9.5 4.1
Glutamina Gln 2.2 9.1 -
Arginina Arg 1.8 9.0 12.5
Lisina Lys 2.2 9.2 10.8
Histidina His 1.8 9.3 6.0
Fenilalanina Phe 2.2 9.2 -
Tirosina Tyr 2.2 9.1 10.1
Triptfano Trp 2.4 9.4 -
Prolina Pro 2.0 10.6 -
Definicin de cidos y bases
Un cido y una base se pueden definir segn los modelos de Lewis y Brnsted, los cuales se explican a
continuacin:
En el modelo de Lewis, un cido es una molcula que es capaz de aceptar pares de electrones y una base
es aquella molcula que tiene la capacidad de donar pares de electrones. En la siguiente ecuacin se
puede observar que el enlace, entre el nitrgeno y el aluminio, es formado por el par libre de electrones
provenientes del amoniaco.
H
3
N
+
AlCl
3
H
3
N-AlHCl
3
Base Lewis cido Lewis Complejo cido-base Lewis
En la definicin de Brnsted, las sustancias que tienen la capacidad de donar protones son clasificados
como cidos Brnsted y las sustancias que sirven como aceptores de protones se clasifican como bases
Brnsted. En la siguiente ecuacin se ejemplifica un caso general de la reaccin cido-base cuyo equilibrio
est determinado por la fuerza cida y bsica relativa de los reactivos y donde las concentraciones de
equilibrio pueden ser calculadas a travs de la constante de equilibrio, K. En esta ecuacin, igualmente, se
define lo que se conoce como cido y base conjugados.
HA + B
BH + A
K
cido Base
cido
conjugado
de B
Base
conjugada
de HA
Fuerza cida
cidos Carboxlicos: La fuerza cida es la capacidad que tiene una sustancia de donar protones. Esta se
determina por medio de la constante de acidez o constante de ionizacin cida, la cual est definida de la
siguiente manera:
RCOOH + H
2
O RCOO
-
+ H
3
O
+
[RCOOH]
[H
3
O
+
][RCOO
--
]
Ka =
Como los valores de K
a
son pequeos, es ms conveniente manejar la acidez en trminos del pK
a
, el cual est
definido igual que el pH como:
pK
a
= - Log K
a
Mientras ms bajo sea el valor del pK
a
para una sustancia ms cida ser esta.
Aminas: Las aminas son el resultado del reemplazo de uno varios tomos de hidrgeno por grupos alqulicos
o arlicos en la molcula de amoniaco. Son las bases orgnicas ms fuertes encontradas en los organismos
vivientes, aunque su fuerza bsica es moderada comparada con las bases inorgnicas; al igual que en el
amoniaco, es el par libre de electrones sobre el nitrgeno el que tiene la habilidad para enlazarse al protn.
N
R
R
1
R
2
donde R, R
1
y R
2
son
grupos alqulicos arlicos
Amina
RNH
2
+ H
2
O RNH
3
OH
+
K
b
Sal de amonio Amina
La fuerza bsica relativa de una base se determina en trminos del valor del pK
a
de su cido conjugado.
Entre ms grande sea el valor del pK
a
del el cido conjugado, ms bsica es la amina:
RNH
3
+ H
2
O H
3
O RNH
2
+
K
a
[RNH
3
+
]
[H
+
][RNH
2
]
K
a
=
Estructuras de los aminocidos
Como los aminocidos contienen un grupo cido y un grupo bsico, presentan una reaccin cido-base y se
encuentran principalmente en la forma de un ion bipolar o zwitterin (figura 3):
R C
H
NH
2
C
O
OH R C
H
NH
3
+
C
O
O
-
Forma ionizada
(zwitterin)
Figura 3. Formacin del ion dipolar de un aminocido
Los iones dipolo de los aminocidos son sales internas y por ello tienen muchas de las propiedades fsicas
asociadas con las sales. Son solubles en agua e insolubles en solventes poco o no polares y son sustancias
cristalinas de punto de fusin alto. Adems, los aminocidos son anfteros: pueden reaccionar como cidos o
bases, dependiendo del pH. En solucin acuosa cida, un ion dipolo de un aminocido se comporta como una
base que acepta un protn para formar un catin; en solucin acuosa bsica, es un cido que pierde un protn
y da lugar a un anin (figura 4).
+
H
3
N
C
C
O
O_
H
R
+
H
3
N
C
C
O
OH
H
R
H
3
O
+
H
2
O +
+
H
3
N
C
C
O
O_
H
R
H
2
N
C
C
O
O_
H
R
H
2
O +
OH
-
Figura 4. Comportamiento anftero de un aminocido
Note que es el carboxilato, -COO
-
, no el grupo amino, el que acta como sitio bsico y acepta un protn en
solucin cida. De modo similar, es el catin amonio, -NH
3
+
, y no el grupo carboxilo, el que funciona como el
sitio acdico y dona un protn en solucin bsica.
Puntos isoelctricos
En solucin cida, un aminocido se protona y se encuentra principalmente como un catin. En solucin bsica,
se desprotona y se presenta como anin. As, debe haber un pH intermedio al cual el aminocido este
equilibrado entre las formas aninica y catinica y se encuentre como el ion dipolo neutro. Este pH se llama
punto isoelctrico pI del aminocido (figura 5).
+
H
3
N
C
C
O
OH
H
R
H
3
O
+
+
H
3
N
C
C
O
O_
H
R
H
2
N
C
C
O
O_
H
R
OH
-
H
3
O
+
OH
-
pH bajo
(protonado)
pH alto
(desprotonado)
Punto i soelctrico
(ion dipolo neutro)
pH
I
II
III
Figura 5. Punto isoelctrico del aminocido
El punto isoelctrico de un aminocido depende de su estructura. Los 15 aminocidos con cadena lateral
neutras o algo cidas tienen puntos isoelctricos cercanos a la neutralidad, en el intervalo de pH de 5.0 a 6.0,
los dos aminocidos con cadenas laterales ms cidas, presentan puntos isoelctricos a un pH menor y los tres
aminocidos con cadena lateral bsica tienen puntos isoelctricos a un pH ms elevado.
Los puntos isoelctricos de los 13 aminocidos sin cadena lateral acida o bsica son el promedio de las dos
constantes de disociacin, pKa
1
y pKa
2
. La alanina, por ejemplo, tiene pKa
1
= 2.34 y pKa
2
= 9.69, de modo que
el pI de la alanina es (2.34 + 9.69)/2 6.01. Para los cuatro aminocidos con una cadena lateral muy acida, el
pI es el promedio de los dos valores ms bajos de pKa, por ltimo, para los tres aminocidos con una cadena
lateral bsica, el pI es el promedio de los dos valores ms altos de pKa.
Titulacin de un aminocido
La titulacin es un procedimiento analtico que consiste en agregar a una solucin del aminocido cantidades
sucesivas de un agente titulante (acido o base) registrando simultneamente los valores de pH que se generan.
Los datos obtenidos se grafican, ubicando los volmenes del titulante en la abscisa (eje x) y los valores de pH
en la ordenada (eje y), de la unin de estos puntos se obtiene una grfica denominada curva de titulacin, a
partir de la cual se pueden determinar los valores de pKa y el punto isoelctrico de los aminocidos. La
siguiente figura muestra los clculos y el grafico de titulacin para determinar el pI de la alanina.
Figura 6. Curva de titulacin y clculo de pI para la alanina
La forma de la curva de titulacin presenta dos regiones planas amortiguadas y una inflexin con una vertical
muy pronunciada; las regiones planas indican la mnima variacin del pH a medida que se agrega la base, ello
muestra la presencia de dos sistemas amortiguadores, el primero formado por las especies I y II, y el segundo
por las especies II y III. La mxima capacidad de ellos se obtiene a la mitad de cada semititulacin, cuando la
concentracin de las especies I y II, y II y III, son iguales; para el primer sistema el punto medio muestra un pH
= 2.3, y ese ser el pKa del equilibrio entre las especies I y II, en otro sistema el punto medio ocurre a un pH =
9.7, y ser por lo tanto el pKa del equilibrio entre las formas II y III.
La regin vertical de la curva indica una variacin brusca del pH con mnimas adiciones de NaOH, denotando la
finalizacin de la primera semititulacin y la no presencia de sistemas amortiguadores; igual situacin ocurre al
inicio y final de toda la titulacin, donde la presencia mayoritaria de una sola especie provoca esas variaciones
bruscas en el pH. Lo prctico de este hecho es que sirve para mostrar el punto final de la titulacin y para
determinar con cierta aproximacin el punto isoelctrico del aminocido, entendido como el pH correspondiente
al punto medio de la parte ms vertical de la curva de titulacin, que en este caso seria 6.0.
Las curvas de titulacin de los aminocidos con grupos en su cadena lateral que se ionizan, tales como la
histidina, la lisina y el acido glutamico, son ms complejas, puesto que son una combinacin de la curva
correspondiente a la disociacin del grupo de la cadena lateral y las curvas de valoracin de los grupos -amino
y -carboxilo. A continuacin se muestran las curvas de titulacin para la lisina y acido glutmico
respectivamente (figura 7).
H
3
N(CH
2
)
4
CHCO
2
H
NH
3
H
3
N(CH
2
)
4
CHCO
2
-
NH
3
H
3
N(CH
2
)
4
CHCO
2
-
NH
2
H
2
N(CH
2
)
4
CHCO
2
-
NH
2
OH
-
H
3
O
+
OH
-
H
3
O
+
OH
-
H
3
O
+
Forma dicatinica
pKa
1
= 2.2
Forma monocatinica
pKa
2
= 9.0
Ion dipolar
pKa
3
= 10.5
Forma aninica
OH
-
H
3
O
+
OH
-
H
3
O
+
OH
-
H
3
O
+
Forma dianinica
pKa
1
= 9.67
Forma monocatinica
pKa
2
= 2.19
Ion dipolar
pKa
3
= 4.25
Forma aninica
HO
2
CCH
2
CH
2
CHCO
2
H
NH
3
HO
2
CCH
2
CH
2
CHCO
2
-
NH
3
-O
2
CCH
2
CH
2
CHCO
2
-
NH
3
-O
2
CCH
2
CH
2
CHCO
2
-
NH
2
A
B
Figura 7. Curva de titulacin y clculo de pI para A). lisina y B). cido glutmico
Materiales, Equipos y Sustancias
Sustancias Materiales y Equipos
Solucin de aminocidos (glicina, alanina,
tirosina) 0.1M en HCl 0.05M
Beakers
Solucin de NaOH 0.1M Bureta de 25 mL
Agua destilada pH-metro
Seccin Experimental
1. Calibre el pH-metro. Siga las instrucciones del profesor para calibrar y limpiar pH-metro.
2. Adicione 10 mL de la solucin de aminocido suministrada por el profesor, a un erlenmeyer y sumerja el
electrodo indicador de pH; anote el valor.
3. Con un poco de NaOH 0.1M enjuague una bureta, bote el residuo y proceda a llenarla con la misma solucin.
4. Adicione 0.5 mL de NaOH 0.1M a la solucin de aminocido, agite, mida y anote el pH.
5. Contine agregando de a 0.5 mL de NaOH 0.1M hasta que el pH sea cercano a 12. No olvide medir y anotar
el pH despus de cada adicin de titulante.
6. Consulte con el monitor donde depositar el NaOH sobrante; proceda luego a enjuagar la bureta con
abundante agua.
Informe
Haga una grfica de pH vs mL de NaOH
De la curva anterior deduzca y justifique, para el aminocido que est titulando, los valores de pKa
1
,
pKa
2
, y pI. Comprelos con los reportados en la literatura.
Escriba la reaccin que sufre la forma dipolar del aminocido a medida que se adiciona la base.
Residuos
Todos se depositan en residuos para neutralizar
Referencias
1. Hormaza, Angelina, Manual de laboratorio de biorganica, Medellin : Universidad Nacional de Colombia,
2004, pp: 87-90.
2. Litwack, Gerard, Bioqumica experimental : un manual de laboratorio, Ed. Omega, Barcelona, 1967, pp:
157-164