1967, 15(6):1382. Appl. Microbiol.

Black and K. H. Lewis

C. B. Donnelly, J. E. Leslie, L. A.

Cheese
Staphylococci from
of Enterotoxigenic
Serological Identification
2
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APPim M I C R O B I O L O G Y , N o v . 1 9 6 7 , p . 1 3 8 2 - 1 3 8 7 V o l . 1 5 , N o . 6
C o p y r ig h t 1 9 6 7 Ame r ic a n S o c ie t y f o r M ic r o b io l o g y Pr in t e d in U . S . A.
S e r o l o g ic a l I d e n t if ic a t io n o f E n t e r o t o x ig e n ic
S t a p h y l o c o c c i f r o m C h e e s e
C . B . DO N N E L L Y , J . E . L E S L I E , L . A. B L AC K, AN D K. H . L E WI S
M il k a n d F o o d R e s e a r c h , N a t io n a l C e n t e r f o r U r b a n a n d I n d u s t r ia l H e a l t h , Pu b l ic H e a l t h S e r v ic e ,
C in c in n a t i, O h io 4 3 2 2 6
R e c e iv e d f o r p u b l ic a t io n 1 5 J u n e 1 9 6 7
S in g l e a n d d o u b l e g e l - d if f u s io n t e c h n iq u e s w e r e e mp l o y e d t o e x a min e s e r o l o g i-
c a l l y c o a g u l a s e - p o s it iv e s t a p h y l o c o c c i f r o m c h e e s e f o r e n t e r o t o x ig e n ic it y . S u p e r -
n a t a n t f l u id f r o m s a c c u l t u r e s w a s e x a min e d f o r e n t e r o t o x in s A a n d B . T h e r e s u l t s
in d ic a t e d t h a t 9 o f 1 5 5 c u l t u r e s f r o m ma r k e t c h e e s e a n d 7 o f 7 7 c u l t u r e s f r o m f o o d -
p o is o n in g c h e e s e p r o d u c e d e n t e r o t o x in A, a n d t h a t n o n e o f t h e c u l t u r e s p r o d u c e d
d e t e c t a b l e l e v e l s o f e n t e r o t o x in B . R e s u l t s o f s e r o l o g ic a l t e s t s w e r e c o n f ir me d b y
in t r a v e n o u s in j e c t io n o f c a t s .
C h e e s e h a s b e e n imp l ic a t e d in s u s p e c t e d s t a p h y -
l o c o c c a l f o o d - p o is o n in g o u t b r e a k s f o r ma n y
y e a r s . S e v e r a l in v e s t ig a t o r s h a v e is o l a t e d c o a g u -
l a s e - p o s it iv e s t a p h y l o c o c c i f r o m c h e e s e ( 1 , 1 2 , 1 4 ) ;
h o w e v e r , d a t a id e n t if y in g a n y o f t h e s e c o a g u l a s e -
p o s it iv e s t a p h y l o c o c c i a s e n t e r o t o x ig e n ic a r e
l imit e d ( 1 , 1 2 , 1 4 , 2 1 ) . Pr o d u c t io n o f c o a g u l a s e b y
S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s is a c c e p t e d a s a n in d ic a t o r
o f p a t h o g e n ic it y , a n d mo s t e n t e r o t o x ig e n ic
s t a p h y l o c o c c i p r o d u c e c o a g u l a s e , b u t t h e l it e r a -
t u r e c o n t a in s f e w d a t a t o s u p p o r t t h e v ie w o f
M c Div it t a n d T o p p ( 1 7 ) t h a t " t h e r e is mu c h e v i-
d e n c e t o in d ic a t e t h a t c o a g u l a s e p r o d u c t io n in d i-
c a t e s e n t e r o t o x in p r o d u c t io n , a l t h o u g h a b s o l u t e
c e r t a in t y h a s n o t b e e n e s t a b l is h e d . " T h e t w o
mo s t p o p u l a r b io a s s a y s f o r e n t e r o t o x in , t h e
mo n k e y f e e d in g t e s t ( 1 1 ) a n d t h e c a t in j e c t io n t e s t
( 1 2 ) , h a v e h a d r e s t r ic t e d a p p l ic a t io n b e c a u s e o f
t h e e x p e n s e . T h e p u r if ic a t io n o f e n t e r o t o x in ( 4 )
a n d t h e d e mo n s t r a t io n o f it s a n t ig e n ic it y ( 5 , 6 )
h a v e l e d t o t h e a p p l ic a t io n o f g e l - d if f u s io n t e s t s
f o r t h e s e r o l o g ic a l d e t e c t io n o f e n t e r o t o x in in c u l -
t u r e p r e p a r a t io n s ( 5 , 6 ) a n d in f o o d s ( 8 , 1 3 , 1 8 ) .
T h is r e p o r t d e s c r ib e s t h e a p p l ic a t io n o f t h e
s in g l e a n d d o u b l e g e l - d if f u s io n t u b e t e c h n iq u e s in
e x a min g c u l t u r e s o f c o a g u l a s e - p o s it iv e s t a p h y l o -
c o c c i f r o m c h e e s e f o r e n t e r o t o x in s A a n d B , a s
w e l l a s t h e a p p l ic a t io n o f t h e mic r o d o u b l e d if f u -
s io n s l id e t e c h n iq u e f o r id e n t if y in g e n t e r o t o x in A.
M AT E R I AL S AN D M E T H O DS
Pr o d u c t io n o f immu n e s e r u m. Ap p r o x ima t e l y 2 0%
p u r e e n t e r o t o x in A f r o m f e r me n t a t io n s o f S . a u r e u s
1 9 6 E - 2 w a s u s e d t o immu n iz e r a b b it s b y t h e s u b -
c u t a n e o u s r o u t e . Pa r t ia l l y p u r if ie d e n t e r o t o x in A ( 3 7
t o 4 0 mg ) w it h F r e u n d s c o mp l e t e a d j u v a n t w a s in -
j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y o v e r a p e r io d o f 3 mo n t h s
( M . S . B e r g d o l l , p e r s o n a l c o mmu n ic a t io n ) . T h e s c h e d -
u l e o f in j e c t io n s , w h ic h v a r ie d s l ig h t l y f o r e a c h r a b b it ,
c o n s is t e d o f a n in it ia l d o s e o f 5 0 o r 1 00 , u g f o l l o w e d b y
d o s e s o f 5 00 u g a f t e r 1 w e e k , 2 , 5 00 Ag a f t e r 2 w e e k s ,
8 mg a f t e r 6 w e e k s , a n d 1 1 mg a f t e r 1 0 w e e k s . A t e r -
min a l d o s e o f 1 5 mg w a s g iv e n a p p r o x ima t e l y 1 3 w e e k s
a f t e r t h e in it ia l in j e c t io n . T h r e e w e e k s a f t e r t h e 1 1 - mg
d o s e a n d 3 w e e k s a f t e r t h e 1 5 - mg d o s e , t h e r a b b it s
w e r e b l e d , a n d t h e s e r a f r o m t h e b l e e d in g s w e r e t it e r e d
a n d p o o l e d .
C u l t u r e s . S e v e n t y - s e v e n c o a g u l a s e - p o s it iv e c u l t u r e s
o f S . a u r e u s is o l a t e d f r o m f o o d - p o is o n in g c h e e s e a n d
1 5 5 f r o m ma r k e t c h e e s e ( 1 2 ) w e r e e x a min e d f o r e n t e r o -
t o x in s A a n d B . I n a d d it io n , s t r a in s o f S . a u r e u s k n o w n
t o p r o d u c e e n t e r o t o x in A ( 1 9 6 E , 2 3 0, a n d s e v e n
o t h e r s ) , e n t e r o t o x in B ( 2 4 3 ) , o r A a n d B ( S - 6 ) , a s w e l l
a s f o u r t h a t w e r e n e g a t iv e f o r e n t e r o t o x in s A a n d B ,
w e r e u s e d t o d e t e r min e t h e a n t is e r u m s p e c if ic it y . T h e
c u l t u r e s w e r e c a r r ie d in c o o k e d me a t me d iu m h e l d a t
r o o m t e mp e r a t u r e a n d o n n u t r ie n t a g a r s l a n t s h e l d a t
4 C .
Pr o d u c t io n o f e n t e r o t o x in . I n t h e s e l e c t io n o f a
me t h o d f o r g r o w in g s t a p h y l o c o c c i t h a t w o u l d y ie l d
c o n c e n t r a t e d e n t e r o t o x in , b o t h t h e c e l l u l o s e - t u b e t e c h -
n iq u e ( E . P. C a s ma n a n d R . W. B e n n e t , B a c t e r io l .
Pr o c . , p . 1 08 , 1 9 6 1 ) a n d t h e s a c - c u l t u r e me t h o d w e r e
c o n s id e r e d . T h e c e l l u l o s e t u b e w a s in o c u l a t e d w it h 0. 5
ml o f a h e a v y s u s p e n s io n o f e n t e r o t o x ig e n ic s t a p h y l o -
c o c c i a n d w a s s u s p e n d e d o n 1 00 ml o f me d iu m c o n -
t a in e d in a R o u x b o t t l e . I n t h e s a c c u l t u r e , t h is t e c h -
n iq u e w a s r e v e r s e d , a n d t h e 1 00 ml o f me d iu m in a
c e l l u l o s e s a c w a s s u r r o u n d e d b y a l a r g e v o l u me o f
in o c u l u m. B e c a u s e s t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x in w il l n o t
p a s s t h r o u g h a d ia l y s is me mb r a n e , t h e c e l l u l o s e t u b in g
w a s u s e d in b o t h me t h o d s t o e f f e c t a c o n c e n t r a t io n o f
e n t e r o t o x in , b y c o n f in in g t h e s t a p h y l o c o c c a l c e l l s a n d
t h e e n t e r o t o x in t o a r e l a t iv e l y s ma l l v o l u me , y e t a l l o w -
in g t h e c e l l s t o b e n u r t u r e d b y a l a r g e v o l u me ( 1 00 ml )
o f me d iu m.
As a r e s u l t o f p r e l imin a r y s t u d ie s , w h ic h in c l u d e d
mo d if ic a t io n s o f t h e s a c c u l t u r e ( in w h ic h t h e v o l u me
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E N T E R O T O XI G E N I C S T APH Y L O C O C C I F R O M C H E E S E
F I G . 1 . G r o w t h o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s in s a c c u l t u r e s , in c u b a t e d o n r o t a r y s h a k e r a t 3 5 C f o r 4 8 h r . ( a ) U n -
in o c u t l a t e d s a c c u l t u r e ; ( b ) in o c u l a t e d . s a c c u l t u r e . N o t e h e a v y g r o w t h in ( b ) f l a s k .
a n d c o n c e n t r a t io n s o f t h e me d ia w e r e v a r ie d ) a n d
mo d if ic a t io n s o f t h e c e l l u l o s e - t u b e t e c h n iq u e , t h e s a c -
c u l t u r e me t h o d o f g r o w in g s t a p h y l o c o c c i w a s s e l e c t e d
f o r t h e p r o d u c t io n o f e n t e r o t o x in . T h e s a c - c u l t u r e
me t h o d o f f e r e d c e r t a in a d v a n t a g e s o v e r t h e c e l l u l o s e -
t u b e t e c h n iq u e in t h a t t h e s a c - c u l t u r e a s s e mb l ie s w e r e
e a s ie r t o p r e p a r e a n d in o c u l a t e , a n d y ie l d e d a l a r g e r
v o l u me o f g r o w t h a n d c r u d e e n t e r o t o x in t h a t w a s
mu c h e a s ie r t o r e c o v e r t h a n t h e s ma l l q u a n t it y ( a p -
p r o x ima t e l y 1 ml ) p r o d u c e d in t h e c e l l u l o s e t u b e s .
S u p e r n a t a n t f l u id f r o m t h e s a c c u l t u r e s c o n t a in e d
f iv e t o t e n t ime s a s mu c h e n t e r o t o x in a s s u p e r n a t a n t
f l u id f r o m c o n v e n t io n a l f l a s k c u l t u r e s . T h e s a c - c u l t u r e
a s s e mb l y w a s ma d e f r o m 4 8 A c e l l u l o s e d ia l y z in g t u b -
in g , a p p r o x ima t e l y 7 . 5 c m w id e . A 4 0- t o 4 5 - c m p ie c e
o f t h is t u b in g w a s w a s h e d in d is t il l e d w a t e r , k n o t t e d
a t o n e e n d , a n d in f l a t e d t o ma k e a s a c . T h e k n o t t e d
e n d w a s p l a c e d in a 3 00- ml E r l e n me y e r f l a s k s o t h a t it
r e s t e d o n t h e b o t t o m o f t h e f l a s k . Do u b l e s t r e n g t h
B r a in H e a r t I n f u s io n ( 1 00 ml ; B B L ) w a s p l a c e d in t h e
s a c a n d t h e o p e n e n d w a s t h e n k n o t t e d . T h e s a c w a s
p o s it io n e d in t h e f l a s k in a U s h a p e a n d t h e t w o
k n o t t e d e n d s , l o c a t e d in t h e n e c k o f t h e f l a s k , w e r e
s e c u r e d t o e a c h o t h e r w it h a r u b b e r b a n d . T h e f l a s k
w a s s t e r il iz e d in t h e a u t o c l a v e a t 1 2 1 C f o r 1 5
min ,
a n d
1 8 ml o f p h o p h a t e - b u f f e r e d
d il u t io n w a t e r w e r e a d d e d
t o t h e f l a s k , o u t s id e t h e s a c o f me d iu m ( F ig . 1 ) .
T h e c u l t u r e s w e r e t r a n s f e r r e d t o B r a in H e a r t I n f u -
s io n Ag a r ( B B L )
s l a n t s a n d w e r e in c u b a t e d a t 3 5 C f o r
1 8 t o 2 4 h r b e f o r e t h e y
w e r e u s e d t o in o c u l a t e s a c -
c u l t u r e a s s e mb l ie s . T h e g r o w t h
f r o m a s l a n t w a s h a r -
v e s t e d in 2 ml o f p h o s p h a t e - b u f f e r e d
d il u t io n w a t e r
a n d w a s a d d e d t o t h e d il u t io n w a t e r s u r r o u n d in g t h e
s a c t o p r o v id e a n in o c u l u m v o l u me o f 2 0 ml .
Ap p r o x ima t e l y 4 0 s a c - c u l t u r e s w e r e p r e p a r e d a n d
in o c u l a t e d a t o n e t ime . T h e y w e r e in c u b a t e d o n a r o -
t a r y s h a k e r a t 3 5 t o 3 7 C f o r 4 8 h r . T h e g r o w t h ( F ig . 1 )
s u r r o u n d in g t h e s a c w a s r e mo v e d f r o m t h e f l a s k s , a n d
t h e c u l t u r e f l u id w a s s e p a r a t e d f r o m t h e c e l l s b y c e n -
t r if u g a t io n a t 2 3 , 5 00 X g f o r 2 0 min . T h e s u p e r n a t a n t
f l u id w a s p r e s e r v e d w it h 1 : 1 0, 000 M e r t h io l a t e a n d
s t o r e d a t 4 C .
I mmu n o d if f u s io n t e s t s . T h e s in g l e a n d d o u b l e g e l -
d if f u s io n t u b e t e c h n iq u e s a n d t h e mic r o - s l id e t e s t ( 1 0)
w e r e u s e d in t h is s t u d y . T h e s in g l e d if f u s io n t e c h n iq u e
w a s u s e d t o s c r e e n t h e c h e e s e c u l t u r e s f o r e n t e r o t o x in s
A a n d B . E n t e r o t o x in - a n t is e r u m a g a r , 0. 4 ml ( 1 3 ) , in
c l e a n a g a r - c o a t e d t e s t t u b e s ( 5 mm in s id e d ia me t e r b y
5 0 mm l o n g ) , w a s o v e r l a id w it h 0. 4 ml o f t h e s u p e r -
n a t a n t f l u id ( a n t ig e n ) f r o m t h e s a c c u l t u r e s o f t h e
c h e e s e is o l a t e s . T h e t u b e s w e r e s e a l e d w it h Pa r a f il m
a n d w e r e in c u b a t e d a t 3 0 C . Af t e r 2 4 h r , t h e y w e r e
e x a min e d b y o b l iq u e l y t r a n s mit t e d l ig h t , a n d t h r e e
t y p e s o f r e a c t io n s w e r e o b s e r v e d ( F ig . 2 ) . T h e f ir s t o f
t h e s e w a s a p o s it iv e t e s t t h a t a p p e a r e d a s a z o n e o f
p r e c ip it a t e d a n t ig e n - a n t ib o d y o r ig in a t in g a t t h e a n t i-
g e n - a n t is e r u m a g a r in t e r f a c e , w h ic h e it h e r r e ma in e d
t h e r e a s a n a r r o w b a n d ( e q u iv a l e n c e r e a c t io n ) o r
e x t e n d e d d o w n in t o t h e s e r u m a g a r a n d e n d e d in a
s h a r p l y d e f in e d f l a t f r o n t e d g e . T h e l e n g t h o f t h e s e
z o n e s w a s me a s u r e d in mil l ime t e r s w it h a h a n d c a l ip e r .
T h e s e c o n d a n d t h ir d t y p e s o f r e a c t io n s w e r e a t y p ic a l ,
a n d w e r e e it h e r s h o r t , h a z y z o n e s w it h r o u n d e d f r o n t
e d g e s a t t h e a n t ig e n - a n t is e r u m a g a r in t e r f a c e , o r r in g s
1 3 8 3
V O L . 1 5 ,
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DO N N E L L Y E T AL .
N T E R F A C E - >
f T Y PI C AL AT Y PI C AL I 4
ZO N E _ ZO N E S - = - T Y PI C AL ZO N E
( a ) ( b I )
F iG . 2 . S in g l e a n d d o u b l e d if f u s io n t u b e t e s t s f o r
e n t e r o t o x in A. ( a ) S in g l e d if f u s io n t e s t s h o w in g t y p ic a l
p o s it iv e z o n e ; ( b ) a n d ( c ) s in g l e d if f u s io n t e s t s s h o w in g
a t y p ic a l n e g a t iv e z o n e s ; a n d ( d ) d o u b l e d if f u s io n t u b e
t e s t s h o w in g t y p ic a l p o s it iv e z o n e .
o c c u r r in g a t a b o u t t h e mid p o in t o f t h e s e r u m a g a r
l a y e r . C u l t u r e s w h ic h p r o d u c e d a t y p ic a l r e a c t io n s
o n l y , a s w e l l a s t h o s e t h a t p r o d u c e d n o r e a c t io n , w e r e
r e g a r d e d a s n e g a t iv e f o r e n t e r o t o x in .
T h e d o u b l e g e l - d if f u s io n t u b e t e s t w a s u s e d t o c o n -
f ir m t h e r e s u l t s o f t h e s in g l e d if f u s io n t e s t . I n t h is t e s t
( 1 3 ) , o n l y 0. 3 ml o f s e r u m a g a r w a s u s e d , a n d w a s
o v e r l a id w it h a n e q u a l v o l u me o f b u f f e r e d a g a r b e f o r e
t h e a n t ig e n ( 0. 3 ml ) w a s a d d e d . T h e d o u b l e d if f u s io n
t e s t s , a l s o in c u b a t e d a t 3 0 C , w e r e e x a min e d a f t e r 3 ,
7 , a n d 1 4 d a y s , a n d o n l y t w o t y p e s o f r e a c t io n s w e r e
o b s e r v e d ( F ig . 2 ) . T h e f ir s t w a s a p o s it iv e t e s t a n d
r a n g e d in s iz e f r o m a n a r r o w b a n d o f p r e c ip it a t e d
a n t ig e n - a n t ib o d y in t h e b u f f e r e d a g a r l a y e r t o a w id e r
z o n e t h a t o r ig in a t e d in t h e b u f f e r e d a g a r , b u t e x t e n d e d
d o w n in t o t h e s e r u m a g a r . T h e s e c o n d r e a c t io n w a s t h e
a t y p ic a l , s h o r t , h a z y z o n e t h a t h a s b e e n d e s c r ib e d . T h e
mic r o d o u b l e d if f u s io n s l id e t e s t w a s u s e d t o v e r if y
c h e e s e c u l t u r e s t h a t w e r e p o s it iv e f o r e n t e r o t o x in A b y
t h e s in g l e a n d d o u b l e d if f u s io n t u b e t e c h n iq u e s .
T h e mic r o - s l id e t e s t , d e s c r ib e d in d e t a il b y C r o w l e
( 1 0) , w a s ma d e o n c l e a n , a g a r - c o a t e d , 7 . 5 b y 2 . 5 c m
s l id e s . A d e l imit e d a r e a , 2 c m l o n g , w a s f l o o d e d w it h
b u f f e r e d a g a r a n d w a s imme d ia t e l y c o v e r e d w it h a
p l a s t ic t e mp l a t e w it h f o u r f u n n e l - s h a p e d h o l e s s u r -
r o u n d in g a f if t h c e n t e r h o l e . Wh e n t h e a g a r h a d s o l id i-
f ie d , t h r e e a d a c e n t c o r n e r h o l e s w e r e f il l e d w it h t h e
r e f e r e n c e a n t ig e n , t h e f o u r t h c o r n e r h o l e w a s f il l e d
w it h s u p e r n a t a n t f l u id f r o m t h e S . a u r e u s c u l t u r e
b e in g e x a min e d , a n d t h e c e n t e r h o l e w a s f il l e d w it h
a n t is e r u m. T h e s l id e s w e r e in c u b a t e d in a mo is t c h a m-
b e r a t 3 0 C f o r 7 2 h r a n d w e r e t h e n e x a min e d . T h e
t e s t s in w h ic h t h e l in e s o f p r e c ip it a t io n f r o m t h e u n -
k n o w n c o a l e s c e d , o r j o in e d w it h t h e r e f e r e n c e l in e o f
p r e c ip it a t io n f o r me d b y t h e r e a c t io n o f t h e a n t is e r u m
w it h t h e r e f e r e n c e a n t ig e n , w e r e c o n s id e r e d p o s it iv e f o r
e n t e r o t o x in A ( 8 ) . T e s t s in w h ic h t h e l in e s f r o m t h e
c u l t u r e s c u r v e d a w a y f r o m t h e r e f e r e n c e l in e , o r in
w h ic h n o l in e s w e r e p r o d u c e d , w e r e c o n s id e r e d n e g a -
t iv e ( F ig . 3 ) .
C a t - in j e c t io n t e s t s . S e l e c t e d c u l t u r e s w e r e e x a min e d
f o r e n t e r o t o x in b y a mo d if ic a t io n o f t h e in t r a v e n o u s
c a t - in j e c t io n t e s t ( 1 2 ) . T h e s e c u l t u r e s w e r e g r o w n b y
t h e s a c - c u l t u r e me t h o d , w e r e c e n t r if u g e d , a n d t h e
s u p e r n a t a n t f l u id w a s p a s s e d t h r o u g h a n u l t r a - f in e
f r it t e d g l a s s f il t e r . T h e f il t r a t e s w e r e d ig e s t e d w it h
0. 2 % t r y p s in ( Dif c o 1 : 2 5 0) a t 3 7 C f o r 2 h r t o in -
a c t iv a t e a - a n d
# 3 - h e mo l y s in s ,
a n d w e r e t h e n e x a min e d
f o r t h e s e h e mo l y s in s b y a c o n v e n t io n a l t w o f o l d s e r ia l
d il u t io n t e s t b e f o r e t h e y w e r e in j e c t e d in t o c a t s .
T h e f il t r a t e s w e r e d il u t e d 1 : 5 in 0. 8 5 % N a C l s o l u -
t io n , a n d 5 ml o f e a c h f il t r a t e w a s in j e c t e d in t r a v e -
n o u s l y in t o t h e l e f t r e a r l e g o f e a c h o f f o u r c a t s . T h e
c a t s w e r e o b s e r v e d f o r 3 h r f o r e me t ic r e s p o n s e s . Wh e n
t h r e e o r mo r e o f t h e f o u r c a t s v o mit e d b e t w e e n 1 0 min
a n d 3 h r a f t e r in j e c t io n , t h e t e s t w a s c o n s id e r e d p o s i-
t iv e . V o mit in g b y t w o c a t s w it h in t h is p e r io d w a s
c o n s id e r e d a q u e s t io n a b l e r e a c t io n . A r e s p o n s e b y
o n l y o n e o r n o n e o f f o u r c a t s w a s c o n s id e r e d n e g a t iv e .
R E S U L T S
T it e r a n d s p e c if ic it y o f immu n e s e r a . S e v e r a l
r a b b it s w e r e immu n iz e d w it h p a r t ia l l y p u r if ie d
e n t e r o t o x in A, b u t o n l y t h r e e s u r v iv e d t h e s c h e d -
u l e o f in j e c t io n s . O f t h e s e t h r e e , o n l y o n e
p r o d u c e d a n a n t is e r u m t h a t w a s s p e c if ic f o r e n -
t e r o t o x in A.
T h e t it e r o f t h is a n t is e r u m f o r id e n t if y in g e n -
F I G . 3 . M ic r o - s l id e t e s t w it h e n t e r o t o x in A a s
r e f e r e n c e a n t ig e n .
U n k n o w n in
u p p e r r ig h t - h a n d c o r n e r . ( a ) U n -
k n o w n , id e n t it y w it h e n t e r o t o x in A; ( b ) u n k n o w n , n o n s p e c if ic r e a c t io n , n e g a t iv e f o r
e n t e r o t o x in A; ( c ) u n k n o w w n
n e g a t iv e , o r e n t e r o t o x in A l e v e l t o o s ma l l t o d e t e c t .
1 3 8 4 APPL . M I C R O B I O L .

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1
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E N T E R O T O XI G E N I C S T APH Y L O C O C C I F R O M C H E E S E
t e r o t o x in A w a s d e t e r min e d in s in g l e d if f u s io n
t e s t s . Zo n e s o f p r e c ip it a t e d a n t ig e n - a n t ib o d y w e r e
o b s e r v e d a t a n t is e r u m d il u t io n s g r e a t e r t h a n
1 : 1 00, b u t t h e y w e r e b e t t e r d e f in e d a t ' h ig h e r
a n t is e r u m c o n c e n t r a t io n s . A 1 : 6 0 d il u t io n w a s
u s e d in e x a min in g t h e c h e e s e c u l t u r e s f o r e n t e r o -
t o x in A. I n t h e s in g l e d if f u s io n t e s t , t h is d il u t io n
p r o d u c e d w e l l - d e f in e d , t y p ic a l l y p o s it iv e z o n e s
w it h k n o w n e n t e r o t o x in A- p r o d u c in g s t a p h y l o -
c o c c i. Wit h t h e 1 : 6 0 d il u t io n , s t r a in s o f s t a p h y l o -
c o c c i t h a t w e r e n e g a t iv e f o r e n t e r o t o x in A, a n d
a n e n t e r o t o x in B - p o s it iv e s t r a in p r o d u c e d e it h e r
n o r e a c t io n o r a t y p ic a l r e a c t io n s . T h e e n t e r o t o x in
B a n t is e r u m w a s a l s o u s e d a t a 1 : 6 0 d il u t io n a n d
w a s s p e c if ic a t t h is d il u t io n ( 1 3 ) .
S e n s it iv it y o f g e l - d if f u s io n t e s t s . B e c a u s e mig r a -
t io n d is t a n c e o f p r e c ip it a t e d a n t ig e n - a n t ib o d y
c o mp l e x ma y b e a f f e c t e d b y a n t ig e n d il u e n t ( 1 3 ) ,
s e n s it iv it ie s o f t h e s in g l e a n d d o u b l e g e l - d if f u s io n
t e s t s f o r d e t e c t in g e n t e r o t o x in in s a c - c u l t u r e s w e r e
d e t e r min e d b y a s s a y in g v a r y in g c o n c e n t r a t io n s o f
e n t e r o t o x in s A a n d B in s u p e r n a t a n t f l u id f r o m
s a c - c u l t u r e s o f n o n e n t e r o t o x ig e n ic s t a p h y l o c o c c i.
Wit h a 1 : 6 0 d il u t io n o f e n t e r o t o x in A a n t is e r u m,
c o n c e n t r a t io n s a s l o w a s a p p r o x ima t e l y 0. 4 a n d
0. 2 , u g o f e n t e r o t o x in A p e r ml o f s a c - c u l t u r e
f l u id c o u l d b e d e t e c t e d b y t h e s in g l e a n d d o u b l e
d if f u s io n t e c h n iq u e s , r e s p e c t iv e l y ; w it h e n t e r o -
t o x in B a n t is e r u m a t t h e s a me d il u t io n , 0. 6 , u g o f
e n t e r o t o x in B c o u l d b e d e t e c t e d b y s in g l e d if f u s io n
p r o c e d u r e , a n d 0. 2 , u g c o u l d b e d e t e c t e d b y d o u b l e
d if f u s io n . T h e mic r o - s l id e t e s t h a d a s e n s it iv it y o f
a p p r o x ima t e l y 1 . 0 M g p e r ml ( 8 ) .
Q u a n t it a t io n o f e n t e r o t o x in . E n t e r o t o x in A w a s
q u a n t it a t e d b y s in g l e d if f u s io n a s s a y p r o c e d u r e
t h r o u g h t h e u s e o f a s t a n d a r d c u r v e . I t w a s a s -
s u me d ( M . S . B e r g d o l l , p e r s o n a l c o mmu n ic a t io n )
t h a t t h e e n t e r o t o x in A p r e p a r a t io n
w a s 2 0% p u r e ,
a n d t h a t u n d e r s t a n d a r d c o n d it io n s , e n t e r o t o x in
c o n c e n t r a t io n w a s a n e x p o n e n t ia l
f u n c t io n o f
mig r a t io n d is t a n c e . T h e s t a n d a r d c u r v e w a s p r e -
p a r e d b y r e l a t in g v a r y in g c o n c e n t r a t io n s o f e n -
t e r o t o x in A in mic r o g r a ms ,
d is s o l v e d in s a c -
c u l t u r e s u p e r n a t a n t f l u id ,
t o mil l ime t e r s o f mi-
g r a t io n o f t h e a n t ig e n - a n t ib o d y c o mp l e x , a n d
t h e n c a l c u l a t in g r e g r e s s io n
l in e s . Wit h t h e r e -
s u l t in g s t r a ig h t - l in e c u r v e , q u a n t it ie s
o f e n t e r o -
t o x in A p r o d u c e d
in s a c - c u l t u r e f e r me n t a t io n s
w e r e e s t ima t e d .
E x a min a t io n o f c h e e s e c u l t u r e s b y a g a r g e l -
d if f u s io n t e s t s . T h e s u p e r n a t a n t
f l u id s f r o m s a c -
c u l t u r e s o f 2 3 2 c u l t u r e s is o l a t e d f r o m c h e e s e w e r e
s c r e e n e d f o r e n t e r o t o x in s A a n d B
b y
t h e
s in g l e
d if f u s io n t e s t . Wh e n e x a min e d w it h e n t e r o t o x in
A a n t is e r u m, 1 6 o f t h e 2 3 2 c u l t u r e s w e r e c o n -
f ir me d a s p o s it iv e f o r e n t e r o t o x in A
b y s in g l e
a n d
d o u b l e g e l - d if f u s io n
t e s t s . O n r e e x a min a t io n w it h
e n t e r o t o x in A a n t is e r u m,
2 5 c u l t u r e s w h ic h
in it ia l l y p r o d u c e d a t y p ic a l
z o n e s o r
r in g s
o r
q u e s t io n a b l e r e a c t io n s w e r e f o u n d t o b e n e g a -
t iv e . O n r e e x a min a t io n w it h e n t e r o t o x in A a n t i-
s e r u m, 1 3 c u l t u r e s p r o d u c e d w e a k o r a t y p ic a l
r e a c t io n s b y s in g l e d if f u s io n a n d w e a k o r d e l a y e d
p o s it iv e r e a c t io n s b y d o u b l e d if f u s io n t e s t s . T h e
d e l a y e d r e a c t io n s w e r e n o t o b s e r v e d u n t il t h e
7 t h o r 1 4 t h d a y , w h e r e a s t y p ic a l e n t e r o t o x in
A- p o s it iv e s t r a in s p r o d u c e d p o s it iv e z o n e s w it h in
7 2 h r . Wh e r e v e r p o s s ib l e , t h e o r ig in a l s a c - c u l t u r e
s u p e r n a t a n t f l u id w a s u s e d f o r t h e r e - e x a min a t io n .
B e c a u s e o f t h e u n c e r t a in s t a t u s o f t h e s e 1 3 c u l -
t u r e s , t h e y , t o g e t h e r w it h t h e 1 6 e n t e r o t o x in A-
p o s it iv e c u l t u r e s a n d 1 0 n e g a t iv e c o n t r o l s ( s e l e c t e d
a s b e in g n e g a t iv e f o r e n t e r o t o x in A a n d B o n t h e
b a s is o f g e l - d if f u s io n t u b e a n d c a t t e s t s ) w e r e
e x a min e d f o r e n t e r o t o x in A p r o d u c t io n b y t h e
mic r o - s l id e t e s t . F o r t h is t e s t , o n e o f t h e 1 6 e n -
t e r o t o x in A- p o s it iv e c u l t u r e s is o l a t e d f r o m c h e e s e
w a s s e l e c t e d a s t h e e n t e r o t o x in A r e f e r e n c e a n t i-
g e n . T h e e n t e r o t o x ig e n ic it y o f t h is c u l t u r e ( S .
a u r e u s M F 7 1 ) h a d b e e n d e mo n s t r a t e d r e p e a t e d l y
b y c a t t e s t s . I t p r o d u c e d n o r e a c t io n w it h e n t e r o -
t o x in B a n t is e r u m a n d g a v e t y p ic a l l y p o s it iv e
r e a c t io n s in s in g l e a n d d o u b l e d if f u s io n t u b e t e s t s
w it h e n t e r o t o x in A a n t is e r u m. T h e c h a r a c t e r iz a -
t io n o f S . a u r e u s M F 7 1 a s a n e n t e r o t o x in A-
p o s it iv e c u l t u r e w a s f u r t h e r e s t a b l is h e d b y t h e f a c t
t h a t it p r o d u c e d l in e s o f id e n t it y ( F ig . 3 ) in mic r o -
s l id e t e s t s w it h k n o w n e n t e r o t o x in A- p o s it iv e
s t a p h y l o c o c c i 1 9 6 E a n d 2 3 0, ( 6 ) , a n d 2 0% p u r i-
f ie d e n t e r o t o x in A. F o r e x a min a t io n o f t h e c h e e s e
c u l t u r e s , t h e r e f e r e n c e a n t ig e n w a s d il u t e d t o
c o n t a in a p p r o x ima t e l y 4 o r 2 , Ag o f e n t e r o t o x in A
p e r ml ; t h e s e c o n c e n t r a t io n s w e r e u s e d w it h 1 : 2 0
a n d 1 : 3 0 d il u t io n s o f e n t e r o t o x in A a n t is e r u m,
r e s p e c t iv e l y .
Al l 1 6 c h e e s e c u l t u r e s t h a t ' w e r e p o s it iv e f o r
e n t e r o t o x in A b y s in g l e a n d d o u b l e d if f u s io n t u b e
t e s t s p r o d u c e d l in e s o f id e n t it y w it h S . a u r e u s M F
7 1 , t h e r e f e r e n c e a n t ig e n . N o n e o f t h e o t h e r c u l -
t u r e s ( t h e 1 3 q u e s t io n a b l e o n e s o r t h e 1 0 n e g a t iv e
c o n t r o l s ) p r o d u c e d l in e s o f id e n t it y w it h t h e
r e f e r e n c e a n t ig e n ( T a b l e 1 ) .
N o n e o f t h e 2 3 2 c o a g u l a s e - p o s it iv e c u l t u r e s
f r o m c h e e s e p r o d u c e d d e t e c t a b l e l e v e l s o f e n t e r o -
t o x in B w h e n t e s t e d b y t h e s in g l e d if f u s io n t u b e
t e s t .
T AB L E 1 . V e r if ic a t io n b y mic r o - s l id e t e s t o f e n t e r o -
t o x in A- p o s it iv e g e l - d if f u s io n t u b e t e s t s
T u b e d if f u s io n t e s t s
M ic r o - s l id e t e s t s
N o . o f c u l t u r e s
( e n t e r o t o x in A) ( e n t e r o t o x in A r e f e r -
e n c e a n t ig e n )
1 6 + +
1 3 4
l O a
-
a
N e g a t iv e c o n t r o l s
1 3 8 5 V O L . 1 5 , 1 9 6 7

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m

DO N N E L L Y E T AL .
T AB L E 2 . C o mp a r is o n o f s in g l e d if f u s io n a s s a v a n d
c a t t e s t f o r e n t e r o t o x in A p r o d u c e d in s a c -
c u l t u r e f e r me n t a t io n s o f s t a p h y l o c o c c i
is o l a t e d f r o m c h e e s e
E n t e r o t o x in A
C a t b io a s s a y
C u l t u r e n o . a n d s o u r c e ( e me s is p e r n o .
F il t r a t e
f il t a t e
in j e c t e d )
j ig / ml j ig / mi
F o o d - p o is o n in g C h e e s e
3 1 1 3 . 5 8 . 0 4 / 4
3 6 8 . 4 6 . 2 4 / 4
6 5 8 . 9 6 . 2 4 / 4
7 0 1 9 . 5 1 9 . 5 4 / 4
7 1 1 2 . 0 8 . 9 4 / 4
7 3 1 9 . 5 1 3 . 6 4 / 4
M a r k e t c h e e s e
2 2 4 1 2 . 0 4 . 1 3 / 4
2 2 4 - 2 8 . 4 4 . 4 4 / 4
2 4 0 8 . 4 2 . 4 4 / 4
2 4 0- 2 1 1 . 2 8 . 4 4 / 4
2 4 4 - 2 2 . 2 1 . 4 4 / 4
2 4 5 3 . 4 2 . 5 4 / 4
2 9 6 2 . 9 1 . 8 4 / 4
a
T r y p s in d ig e s t e d f il t r a t e .
E x a min a t io n o f c h e e s e c u l t u r e s b y c a t t e s t . T o
c o mp a r e t h e r e s u l t s b y t h e s in g l e d if f u s io n t u b e
t e s t w it h b io a s s a y s f o r e n t e r o t o x in , 1 3 o f t h e
s t r a in s t h a t w e r e p o s it iv e f o r e n t e r o t o x in A a n d 1 4
t h a t w e r e n e g a t iv e f o r e n t e r o t o x in s A a n d B w e r e
e x a min e d b y t h e c a t in j e c t io n t e s t . T a b l e 2 s h o w s
t h a t t r y p s in iz e d f il t r a t e s o f t h e 1 3 s t r a in s o f
s t a p h y l o c o c c i w e r e p o s it iv e f o r e n t e r o t o x in A b y
b o t h s in g l e d if f u s io n t e s t s a n d c a t b io a s s a y s . T h e
r e d u c e d q u a n t it ie s o f e n t e r o t o x in A in t r y p s in iz e d
f il t r a t e s o f t h e 1 3 s t r a in s , c o mp a r e d w it h t h a t in
t h e ir r e s p e c t iv e u n t r e a t e d f il t r a t e s , ma y in d ic a t e
d e s t r u c t io n o f e n t e r o t o x in A b y t r y p s in , o r t h e
e f f e c t o f t h e in c l u s io n o f t r y p s in in t h e immu n o -
d if f u s io n s y s t e m.
O f 1 4 c u l t u r e s t h a t w e r e n e g a t iv e f o r e n t e r o -
t o x in s A a n d B b y g e l - d if f u s io n t u b e t e s t s , t e n
w e r e n e g a t iv e f o r e n t e r o t o x in b y t h e c a t t e s t . T w o
c u l t u r e s p r o d u c e d v o mit in g in t w o o u t o f f o u r
c a t s , w h ic h is c o n s id e r e d a q u e s t io n a b l e r e a c t io n .
T w o c u l t u r e s p r o d u c e d p o s it iv e c a t t e s t s , b u t t h is
ma y h a v e b e e n d u e t o t y p e s o f e n t e r o t o x in o t h e r
t h a n A o r B .
T h e t r y p s in iz e d f il t r a t e s o f e n t e r o t o x in A- p o s i-
t iv e c u l t u r e s in j e c t e d in t o c a t s w e r e n e g a t iv e f o r
j - h e mo l y s in , b u t s e v e r a l o f t h e m h a d l o w t it e r s
f o r a - h e mo l y s in ( e . g . , 1 : 4 , 1 : 8 , 1 : 3 2 4 ) . At t h e s e
l o w t it e r s , h o w e v e r , a - h e mo l y s in w a s n o t c o n -
s id e r e d t o b e a c a u s e o f e me s is in t h e c a t s , b e c a u s e
a t r y p s in iz e d f il t r a t e f r o m a n
e n t e r o t o x in - n e g a t iv e
s t r a in o f s t a p h y l o c o c c i, w h ic h h a d a t it e r o f
1 : 3 2 f o r a - h e mo l y s in , p r o d u c e d n o e me t ic r e -
a c t io n .
DI S C U S S I O N
I t is b e y o n d t h e s c o p e o f t h is p a p e r t o e x p l a in
t h e a t y p ic a l z o n e s o b s e r v e d in s o me o f t h e s in g l e
a n d d o u b l e d if f u s io n t e s t s o r t h e r in g s o b s e r v e d
in s in g l e d if f u s io n t e s t s . T h e a t y p ic a l z o n e s w e r e
a p p a r e n t l y n o t s e r o l o g ic a l r e a t io n s , b e c a u s e t h e y
w e r e o b s e r v e d in p l a in b u f f e r e d a g a r c o n t r o l s o f
c e r t a in c u l t u r e s . T h e a t y p ic a l r in g s , o b s e r v e d in
s in g l e d if f u s io n t e s t s w it h e n t e r o t o x in A a n t i-
s e r u m, a s w e l l a s w it h e n t e r o t o x in B a n t is e r u m
a n d n o r ma l r a b b it s e r u m, p r o b a b l y r e p r e s e n t e d
a n a n t ig e n - a n t ib o d y r e a c t io n t h a t d id n o t in v o l v e
e n t e r o t o x in s A o r B . T h e p o s it iv e - a p p e a r in g r e -
a c t io n s t h a t o c c u r r e d in s in g l e a n d d o u b l e d if f u -
s io n t u b e t e s t s o f c e r t a in c u l t u r e s , w h ic h w e r e
t y p ic a l e x c e p t t h a t t h e r e a c t io n s in d o u b l e d if -
f u s io n t e s t s w e r e n o t o b s e r v e d u n t il a f t e r 7 2 h r ,
ma y h a v e b e e n d u e t o a n t ig e n s t h a t w e r e c l o s e l y
r e l a t e d b u t n o t id e n t ic a l t o e n t e r o t o x in A.
O f t h e f o u r t y p e s o f e n t e r o t o x in t h a t h a v e b e e n
s e r o l o g ic a l l y id e n t if ie d a n d d e s ig n a t e d a s A, B ,
C , a n d D ( 3 , 9 ; E . P. C a s ma n , R . W. B e n n e t , a n d
R . E . Ke p h a r t , B a c t e r io l . Pr o c . , p . 1 3 , 1 9 6 6 ) , A
h a s b e e n mo s t f r e q u e n t l y a s s o c ia t e d w it h f o o d
p o is o n in g in t h is c o u n t r y . O u r s t u d y s h o w s t h a t
s e v e n o f 7 7 ( 9 . 1 %) o f t h e c o a g u l a s e - p o s it iv e
s t a p h y l o c o c c i is o l a t e d f r o m f o o d - p o is o n in g c h e e s e
a n d n in e o u t o f 1 5 5 ( 5 . 8 %) is o l a t e d f r o m ma r k e t
c h e e s e , p r o d u c e d e n t e r o t o x in A. N o n e o f t h e c u l -
t u r e s p r o d u c e d e n t e r o t o x in B . C a s ma n ( 7 ) r e -
p o r t e d t h a t a p p r o x ima t e l y 4 . 4 % o f 2 4 5 s t r a in s o f
s t a p h y l o c o c c i is o l a t e d f r o m f r o z e n f o o d s p r o -
d u c e d e n t e r o t o x in A a n d 4 . 0% p r o d u c e d e n t e r o -
t o x in B . Amo n g 1 9 0 s t r a in s is o l a t e d f r o m r a w
mil k , h e f o u n d t h a t 3 . 2 % p r o d u c e d e n t e r o t o x in A
a n d 1 . 0% p r o d u c e d e n t e r o t o x in B . H e a l s o r e -
p o r t e d t h a t o f 2 1 2 s t r a in s is o l a t e d f r o m t h e n o s e s
o f a p p a r e n t l y h e a l t h y in d iv id u a l s , 4 0. 2 % p r o -
d u c e d e n t e r o t o x in A, 4 . 2 % p r o d u c e d e n t e r o t o x in
B , a n d 5 . 5 % p r o d u c e d b o t h A a n d B . H e r e -
p o r t e d t h a t 2 3 . 3 % o f 4 4 9 s t r a in s f r o m c l in ic a l
s p e c ime n s p r o d u c e d e n t e r o t o x in A, 4 . 5 % p r o -
d u c e d e n t e r o t o x in B , a n d 3 . 8 % p r o d u c e d A a n d
B . T h e s e d a t a in d ic a t e t h a t t h e in c id e n c e o f
s t r a in s p r o d u c in g e n t e r o t o x in B is mu c h s ma l l e r
t h a n t h e in c id e n c e o f s t r a in s p r o d u c in g e n t e r o -
t o x in A.
I n a p r e v io u s s t u d y ( 1 2 ) , it w a s r e p o r t e d t h a t 6 8
o u t o f 3 4 3 ma r k e t c h e e s e s a mp l e s c o n t a in e d
c o a g u l a s e - p o s it iv e s t a p h y l o c o c c i. T h e p r e s e n t
s t u d y s h o w s t h a t s e v e n o f t h e s e 3 4 3 s a mp l e s
( 2 . 0 %) c o n t a in e d e n t e r o t o x in A- p r o d u c in g s t a p h -
y l o c o c c i. T h e in c id e n c e o f e n t e r o t o x ig e n ic s t r a in s
w o u l d p r o b a b l y h a v e b e e n h ig h e r if s e r a h a d b e e n
a v a il a b l e f o r e x a min in g t h e c u l t u r e s f o r o t h e r
t y p e s o f e n t e r o t o x in . T h is v ie w is
s u p p o r t e d b y
t h e o b s e r v a t io n t h a t t w o c u l t u r e s t h a t w e r e n e g a -
t iv e f o r e n t e r o t o x in s A o r B
b y
t h e
g e l - d if f u s io n
t e s t s w e r e p o s it iv e f o r e n t e r o t o x in b y
t h e c a t t e s t .
1 3 8 6 APPL . M I C R O B I O L .

o
n

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b
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7
,

2
0
1
2

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a
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d

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o
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E N T E R O T O XI G E N I C S T APH Y L O C O C C I F R O M C H E E S E
E n t e r o t o x ig e n ic s t a h y l o c o c c i in c h e e s e h a v e
b e e n r e p o r t e d b y o t h e r in v e s t ig a t o r s ( 1 , 1 4 , 2 1 ) .
T h e p r e s e n c e o f t h e s e o r g a n is ms in s ma l l n u mb e r s
in t h e f in is h e d p r o d u c t d o e s n o t n e c e s s a r il y me a n
t h a t t h e y w e r e o r ig in a l l y p r e s e n t in n u mb e r s t o o
s ma l l t o p r o d u c e s ig n if ic a n t a mo u n t s o f e n t e r o -
t o x in in imp r o p e r l y h a n d l e d mil k o r d u r in g
c h e e s e ma k in g . A ma r k e d r e d u c t io n o f s t a p h y l o -
c o c c i mr a y o c c u r in c h e d d a r a n d c o l b y c h e e s e s
d u r in g s t o r a g e a n d c u r in g ( 1 6 , 1 9 ) . T h u s t h e
n u mb e r p r e s e n t in ma r k e t c h e e s e p r o b a b l y r e p -
r e s e n t s o n l y a s ma l l f r a c t io n o f t h e n u mb e r p r e s e n t
w h e n t h e c h e e s e w a s ma d e . T h a t s t a p h y l o c o c c i
c a n p r o d u c e s ig n if ic a n t l e v e l s o f e n t e r o t o x in in
c h e e s e o r c h e e s e mil k is il l u s t r a t e d b y t h e c h e e s e -
b o r n e f o o d - p o is o n in g o u t b r e a k in I o w a ( 1 5 ) .
M o s t r a w mil k c o n t a in s c o a g u l a s e - p o s it iv e s t a p h -
y l o c o c c i, s o me o f w h ic h a r e e n t e r o t o x ig e n ic ( 2 , 7 ) ,
a n d t h e r e f o r e e n t e r o t o x in c o u l d b e p r o d u c e d in
imp r o p e r l y h a n d l e d mil k b y t h e mu l t ip l ic a t io n o f
s t a p h y l o c o c c i ( 2 0) b e f o r e t h e a c t u a l c h e e s e ma k in g
b e g in s ( C . B . Do n n e l l y , J . E . L e s l ie , a n d L . A.
B l a c k , B a c t e r io l . Pr o c . , p . 1 3 , 1 9 6 6 . ) . E n t e r o t o x in
p r o d u c t io n is mo r e l ik e l y d u r in g c h e e s e ma k in g ,
w h e n t h e s e q u e n c e o f t e mp e r a t u r e s ma y b e f r o m
a p p r o x ima t e l y 3 1 t o 3 8 t o 2 5 C ( r o o m t e mp e r a -
t u r e ) f o r a s l o n g a s 2 4 h r . J e z e s k i e t a l . ( 1 6 ) h a v e
s h o w n t h a t s t a p h y l o c o c c i w il l in c r e a s e f r o m
t h o u s a n d s p e r mil l il it e r o f mil k t o mil l io n s p e r
g r a m o f c h e e s e d u r in g t h is p e r io d . Ap p a r e n t l y t h e
ma x ima l s t a p h y l o c o c c a l c o u n t o b t a in e d in e it h e r
mil k ( 2 0) o r c h e e s e ( 1 6 ) is p r o p o r t io n a l t o t h e
in o c u l u m l e v e l , s o t h a t s t a p h y l o c o c c i in l o w
n u mb e r s w o u l d h a v e l e s s c h a n c e o f r e a c h in g a c e l l
d e n s it y t h a t c o u l d p r o d u c e s ig n if ic a n t l e v e l s o f
e n t e r o t o x in t h a n w o u l d s t a p h y l o c o c c i
in h ig h
n u mb e r s .
T h r e e s t e p s t h a t w il l r e d u c e t h e p u b l ic h e a l t h
h a z a r d o f e n t e r o t o x ig e n ic s t a p h y l o c o c c i in c h e e s e
o r c h e e s e mil k a r e : ( i) r a p id c o o l in g a n d c o n t in -
u o u s r e f r ig e r a t io n o f mil k f r o m t ime o f mil k in g
u n t il it is u s e d in ma k in g c h e e s e , ( ii) h e a t in g o f
mil k t o d e s t r o y e n t e r o t o x ig e n ic s t a p h y l o c o c c i, a n d
( iii) p r e v e n t io n o f r e c o n t a min a t io n o f h e a t e d mil k
o r c h e e s e w it h s t a p h y l o c o c c i.
L I T E R AT U R E C I T E D
1 . AL L E N , V . D. , AN D W. D. S T O V AL L . 1 9 6 0 L a b o r a -
t o r y a s p e c t s o f s t a p h y l o c o c c a l f o o d p o is o n in g
f r o m c o l b y c h e e s e . J . M il k F o o d T e c h n o l . 2 3 :
2 7 1 - 2 7 4 .
2 . B E L L , W. B . , AN D M . 0. V E L I Z. 1 9 5 2 . Pr o d u c t io n
o f e n t e r o t o x in b y s t a p h y l o c o c c i r e c o v e r e d f r o m
t h e b o v in e ma mma r y g l a n d . V e t . M e d . 4 7 : 3 2 1 -
3 2 2 .
3 . B E R G DO L L , M . S . , C . R . B o R J A, AN D R . M . AV E N A.
1 9 6 5 . I d e n t if ic a t io n o f a n e w e n t e r o t o x in a s
e n t e r o t o x in C . J . B a c t e r io l . 9 0: 1 4 8 1 - 1 4 8 5 .
4 . B E R G DO L L , M . S . . H . S U G I Y AM A, AN D G . M .
DAC K. 1 9 5 9 . S t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x in . I .
Pu r if ic a t io n . Ar c h . B io c h e m. 8 5 : 6 2 - 6 9 .
5 . B E R G DO L L , M . S . , M . J . S U R G AL L A, AN D G . M .
DAC K. 1 9 5 9 . S t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x in . I d e n -
t if ic a t io n o f a s p e c if ic p r e c ip it a t in g a n t ib o d y
w it h e n t e r o t o x in n e u t r a l iz in g p r o p e r t y . J . I m-
mu n o l . 8 3 : 3 3 4 - 3 3 8 .
6 . C AS M AN , E . P. 1 9 6 0. F u r t h e r s e r o l o g ic a l s t u d ie s o f
s t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x in . J . B a c t e r io l . 7 9 :
8 4 9 - 8 5 6 .
7 . C AS M AN , E . P. 1 9 6 5 . S t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x in .
An n . N . Y . Ac a d . S c i. 1 2 8 : 1 2 4 - 1 3 1 .
8 . C AS M AN , E . P. , AN D R . W. B E N N E T . 1 9 6 5 . De t e c -
t io n o f s t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x in in f o o d . Ap p l .
M ic r o b io l . 1 3 : 1 8 1 - 1 8 9 .
9 . C AS M AN , E . P. , M . S . B E R G DO L L , AN D J . R O B I N -
S O N . 1 9 6 3 . De s ig n a t io n o f s t a p h y l o c o c c a l
e n t e r o t o x in s . J . B a c t e r io l . 8 5 : 7 1 5 - 7 1 6 .
1 0. C R O WL E , A. J . 1 9 6 1 . I mmu n o d if f u s io n , p . 3 7 - 8 6 .
Ac a d e mic Pr e s s , I n c . , N e w Y o r k .
1 1 . DAC K, G . M . 1 9 5 6 . F o o d p o is o n in g , 3 r d e d . , p .
1 1 2 - 1 1 3 . T h e U n iv e r s it y o f C h ic a g o Pr e s s ,
C h ic a g o , I l l .
1 2 . DO N N E L L Y , C . B . , L . A. B L AC K, AN D K. H . L E WI S .
1 9 6 4 . O c c u r r e n c e o f c o a g u l a s e - p o s it iv e s t a p h y -
l o c o c c i in c h e d d a r c h e e s e . Ap p l . M ic r o b io l .
1 2 : 3 1 1 - 3 1 5 .
1 3 . H AL L , H . E . , R . AN G E L O r T I , AN D K. H . L E WI S .
1 9 6 3 . Q u a n t it a t iv e d e t e c t io n o f s t a p h y l o c o c c a l
e n t e r o t o x in B in f o o d b y g e l - d if f u s io n me t h o d s .
Pu b l ic H e a l t h R e p t . U . S . 7 8 : 1 08 9 - 1 09 8 .
1 4 . H AU S L E R , W. J . , J R . , E . J . B Y E R S , J R . , L . C . S C AR -
B O R O U G H , J R . , AN D S . L . H E N DR I C KS . 1 9 6 0.
S t a p h y l o c o c c a l f o o d in t o x ic a t io n d u e t o c h e d -
d a r c h e e s e . J . M il k F o o d T e c h n o l . 2 3 : 1 - 6 .
1 5 . H E N DR I C KS , S . L . , R . A. B E L KN AP, AN D W. J .
H AU S L E R , J R . 1 9 5 9 . S t a p h y l o c o c c a l f o o d in t o x i-
c a t io n d u e t o c h e d d a r c h e e s e . J . M il k F o o d
T e c h n o l . 2 2 : 3 1 3 - 3 1 7 .
1 6 . J E ZE S KI , J . J . , H . A. M O R I u S , E . A. ZO T T O L A, E .
G E O R G E , AN ) F . F . B U S T A. 1 9 6 1 . T h e e f f e c t o f
p e n ic il l in in mil k o n t h e g r o w t h a n d s u r v iv a l o f
S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s d u r in g t h e ma n u f a c t u r e
a n d c u r in g o f c h e d d a r a n d c o l b y c h e e s e . J .
Da ir y S c i. 4 4 : 1 1 6 0.
1 7 . M C DI v r r r , M . E . , AN D E L E AN O R B . T O PP. 1 9 6 4 .
C o mp a r is o n o f s e v e r a l s e l e c t iv e me d ia f o r is o l a -
t io n a n d d if f e r e n t ia t io n o f c o a g u l a s e - p o s it iv e
s t r a in s o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . Ap p l . M ic r o -
b io l . 1 2 : 1 6 9 - 1 7 2 .
1 8 . R E AD, R . B . , J R . , W. L . PR I T C H AR D, AN D C . B .
DO N N E L L Y . 1 9 6 3 . As s a y o f s t a p h y l o c o c c a l e n -
t e r o t o x in in mil k b y immu n o d if f u s io n . J . Da ir y
S c i. 4 6 : 5 9 8 - 5 9 9 .
1 9 . T AKAH AS H I , I . , AN D C . K. J O H N S . 1 9 5 9 . S t a p h y -
l o c o c c u s a u r e u s in c h e d d a r c h e e s e . J . Da ir y S c i.
4 2 : 1 03 2 - 1 03 7 .
2 0. T H AT C H E R , F . S . , AN D D. R o s s . 1 9 6 0. M u l t ip l ic a -
t io n o f s t a p h y l o c o c c i d u r in g c h e e s e ma k in g . T h e
in f l u e n c e o f mil k s t o r a g e t e mp e r a t u r e s a n d o f
a n t ib io t ic s . C a n . J . Pu b l ic H e a l t h . 5 1 : 2 2 6 - 2 3 4 .
2 1 . T H AT C H E R , F . S . , AN D W. S I M O N . 1 9 5 6 . A c o m-
p a r a t iv e a p p r a is a l o f t h e p r o p e r t ie s o f s t a p h y -
l o c o c c i is o l a t e d f r o m c l in ic a l s it e s a n d f r o m
d a ir y p r o d u c t s . C a n . J . M ic r o b io l . 2 : 7 03 - 7 1 4 .
V O L . 1 5 , 1 9 6 7 1 3 8 7

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