BAB III

PROSEDUR KERJA
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Identifikasi Senyawa Golongan Alkaloid
Alat :
Penangas air
Timbangan
Batang pengaduk
Tabung reaksi
Gelas ukur
Corong kaca
Kertas saring
Cawan porselen
Erlenmeyer
Piper
Lempeng KLT
Penotol (mikropipet)
Chamber
Vial
Vortex
Bahan :
Ekstrak Nimba
HCl 2N
NaCl
Pereaksi Mayer
Pereaksi Wagner
NH
4
OH 28%
Klorofom bebas air
Metanol
Eluen (Etil asetat methanol air)
Pereaksi dragendorf
Kiesel gel GF 254

3.1.2 Identifikasi Glikosida Saponin, Triterpenoid, Dan Steroid
Alat :
Tabung reaksi
Corong
Kapas basah
Penangas air
Vortex
Gelas ukur
Pipet
Gelas ukur
Beaker glass
Vial
Chamber
Lempeng KLT
Penotol (mikro pipet)
Timbangan
Bahan :
Ekstrak daun Nimba
Air suling
Etanol
H
2
SO
4

HCl 2N
Ammonia
n-heksana
Eluen (n-hekasana etil asetat)
Kiesel gel GF 254

3.1.3 Identifikasi Senyawa Golongan Flavonoid
Alat:
Tabung reaksi
Penangas air
Gelas ukur
Vortex
Erlenmeyer
Chamber
Penotol (mikro pipet)
Lempeng KLT
Bahan :
Ekstrak daun Nimba
n-heksana
etanol
HCl pekat
Potongan magnesium
Air suling
Kiesel gel GF 254
Eluen (butanol - asam asetat glacial air)
Uap ammonia
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Identifikasi Senyawa Golongan Alkaloid
Penyiapan Sampel
















Reaksi Pengendapan






Menimbang ekstrak sebanyak 0,3 g , masukkan ke dalam tabung reaksi
Menambahkan 5 ml HCl 2 N ke dalam tabung reaksi
Panaskan dengan penangas air selama 2-3 menit, sembari diaduk
Setelah dingin, tambah dengan 0,3 g NaCl, diaduk rata kemudian disaring
Menambahkan 5 ml HCl 2N pada filtrat yang diperoleh
Larutan tersebut kemudian dibagi menjadi 3 bagian yang disebut sebagai
larutan IA, IB, IC

Menambahkan pereaksi Mayer pada larutan IA
Menambahkan pereaksi Wagner pada larutan IB
Larutan IC dipakai sebagai blanko (pembanding)
Adanya kekeruhan atau endapan pada larutan menunjukkan adanya alkaloid

Kromatografi Lapis Tipis











3.2.2 Identifikasi Glikosida Saponin, Triterpenoid, Dan Steroid
Uji Buih






Memasukkan ekstrak sebanyak 0,3 g dalam tabung reaksi
Menambahkan air suling ke dalam tabung reaksi
Mengocok tabung dengan kuat selama 30 detik
Tes buih positif mengandung saponin bila terjadi buih yang stabil selama lebih
dari 30 menit dengan tinggi 3 cm di atas permukaan cairan

Menambahkan NH
4
OH 28% hingga larutan bersifat basa
Menambahkan 5 ml kloroform bebes untuk ekstraksi, kemudian disaring
Menguapkan filtrate hingga kering
Melarutkan fitrat yang telah diuapkan dengan methanol dan siap untuk
pemerikasaan dengan KLT
Semprot dengan penampak noda (pereaksi dragendorf) pada lempeng, Jika
timbul warna jingga, menunnjukkan adanya alkaloid dalam ekstrak

Setelah tereluasi, lihat jarak migrasi dengan menggunakan sinar UV 254, dan
hitung Rf

Reaksi Warna (Uji Salkowski)










Identifikasi Sapogenin Steroid Atau Triterpenoid Secara KLT











Melarutkan 0,2 g ekstrak dalam 10 ml etanol
Membagi larutan menjadi 2, masing-masing ltabung 5 ml, disebut sebagai
larutan IIA dan IIA
Larutan IIA sebagai blanko dan larutan IIB ditambah 1-2 ml H
2
SO
4
p melaui
dinding tabung reaksi
Adanya steroid tak jenuh ditandai dengan timbulnya cincin berwarna merah
diantara kedua larutan
Menambahkan 5 ml HCl 2N pada 0,5 g ekstrak
Didihkan dan menutup dengan corong berisi kapas basah selama 2 jam untuk
menghidrolisis saponin
Setelah tereluasi, lihat jarak migrasi dengan menggunakan sinar UV 254, dan
hitung Rf
Uapkan hingga tersisa 0,5 ml larutan, kemudian totolkan pada pelat KLT
Setelah dingin, netralkan dengan ammonia, kemudian ekstraksi dengan 3 ml n-
heksana sebangak 3 kali
Semprot dengan penampak noda (anisaldehida asam sulfat) pada lempeng,
mengandung sapogenin jika noda berwarna merah ungu (ungu)
Identifikasi Terpenoid Atau Steroid Bebas Secara KLT








3.2.3 Identifikasi Senyawa Golongan Flavonoid
Reaksi Warna





Uji Bate-Smith Dan Metcalf






Sedikit ekstrak ditambah beberapa tetes etanol, diaduk hingga larut
Totolkan pada fasee diam, dan lalukan uji kromatografi lapis tipis
Setelah tereluasi, lihat jarak migrasi dengan menggunakan sinar UV 254, dan
hitung Rf

Semprot dengan penampak noda (anisaldehida asam sulfat) pada lempeng,
mengandung sapogenin jika noda berwarna merah ungu (ungu)
Melarutkan residu dalam etanol dan membagi menjadi 4 bagian, massing-
masing disebut sebagai larutan IIIA,IIIB,IIIC, dan IIID.
Mengocok 0,3 g ekstrak dengan 3 ml n-heksana berkali-kali hingga n-heksana
tidak berwarna.

Larutan IIIA sebagai blanko, menambahkan 0,5 ml HCl p kedalam larutan IIIB
dan mengamati perubahan yang terjadi

Memanaskan larutan IIIB diatas penganas air dan mengamati lagi perubahan
warna yang terjadi

Bila secara perlahan menjadi warna merah terang atau ungu menunjukkan
adanya senyawa leukoantosianin (membandingkan dengan blanko)
Uji Wilstater







Kromatografi Lapis Tipis

Larutan IIIA sebagai blanko, menambahkan 0,5 ml HCl p kedalam larutan IIIC
dan 4 potong magnesium. Mengamati perubahan yang terjadi

Mengencerkan dengan air suling dan 1 ml butanol, mengamati warna yang
terjadi pada setiap lapisan.

Bila perubahan warna merah jingga menunjukkan adanya flavon, merah pucat
menunjukkan adanya flavonol, dan merah tua menunjukkan adanya flavonon
Menotolkan Larutan IIID pada fase diam dan lakukan uji kromatografi lapis
tipis

Setelah tereluasi, lihat jarak migrasi dengan menggunakan sinar UV 254, dan
hitung Rf

Semprot dengan penampak noda (uap ammonia) pada lempeng, mengandung
senyawa gol.falvonoid jika noda berwarna kuning (tidak permanen)