REPLICAZIOAE DEL DAA

Sintesi di molecole Iiglie di DNA uguale a quelle parentali

Esperimento di Meselson-Stahl
a) Cellule coltivate per varie generazioni
in un terreno contenente solo N pesante
(
15
N), per cui, dopo centriIugazione per
gradiente di densita, si ottiene una sola
banda (blu) di DNA
b) Cellule coltivate in
15
N sono trasIerite
in un terreno contenente solo N leggero
(
14
N). Dopo centriIugazione, la banda di
DNA (viola) sedimenta in una zona piu
alta della precedente essendo un ibrido
(
15
N/
14
N)
c) Continuando la replicazione per un`altra
generazione, si producono due DNA ibridi
bande di DNA (banda viola) e due DNA
leggeri (banda rossa)
Questo esperimento conIerma l`ipotesi
della replicazione semiconservativa, in
base alla quale durante la replicazione le
nuove molecole di DNA sono Iormate da
un Iilamento parentale ed uno
neosintetizzato
La replicazione inizia in un sito d'origine e procede
simultaneamente in entrambe le direzioni
L`aggiunta di
3
H per un breve
periodo, immediatamente
precedente la reazione, consente
di distinguere la replicazione
unidirezionale da quella
bidirezionale, determinando se il
composto marcato (in rosso) si
trovi in corrispondenza di una o di
entrambe le Iorcelle di
replicazione visualizzate negli
autoradiogrammi.
Le catene di DAA a livello della forcella di replicazione
Una nuova catena di DNA (rosso) viene sempre sintetizzata in direzione 5` 3`.
Lo stampo viene copiato nella direzione opposta (3` 5`).
La catena sintetizzata in modo continuo (nella direzione della Iorcella di replicazione) e la
catena veloce. L`altra catena, la catena lenta, viene sintetizzata in piccoli segmenti
(Irammenti di Okazaki) nella direzione opposta a quella della Iorcella di replicazione.
I Irammenti di Okazaki vengono poi riuniti dalla DNA ligasi.
Allungamento di una catena di DAA
Per l`allungamento della catena di DNA sono necessarie una catena singola spaiata che
Iunzioni da stampo ed una catena primer che Iornisca un`estremita 3`-ossidrilica libera
alla quale vengono aggiunte nuove unita nucleotidiche.
Ciascun nuleotide viene selezionato in base alla complementarieta con le basi della
catena stampo. Il prodotto della reazione ha un nuovo gruppo ossidrilico libero in 3` e
puo permettere l`aggiunta di un altro nucleotide.
Contributo della geometria delle coppie di
basi alla replicazione fedele del DAA
Le coppie standard AT e GC hanno una
geometria molto simile.
Contributo della geometria delle coppie di
basi alla replicazione fedele del DAA
Le geometria di coppie di basi sbagliate puo
escluderle dal sito attivo.
La DNA polimerasi I ha un sito attivo in cui
non possono entrare coppie di basi sbagliate.
Corre:ione delle bo::e (proofreading activitv)
L`analisi strutturale della DNA polimerasi I ha
permesso di localizzare la sua attivit
esonucleasica in posizione distale rispetto
all`attivita polimerasica.
Una base erroneamente appaiata (ad es. C-A)
ostacola la traslocazione dell`enzima verso il
nuovo sito.
Scivolando indietro, l`enzima corregge l`errore
con la sua attivita 3`-5` esonucleasica.
Frammento di Klenow:
Ottenuto dopo la rimozione della porzione corrispondente all`attivita 5`-~3`
esonucleasica, mantiene la Iunzione polimerasica e 3`-~5` esonucleasica.
DNA
Aick translation
L`attivita` 5`-~3` esonucleasica della DNA
polimerasi I e in grado di degradare una
catena di RNA o DNA (verde) legata allo
stampo e di sostituire simultaneamente la
catena degradata mediante l`attivita
polimerasica.
Queste attivita sono importanti per il ruolo
della DNA polimerasi I nella riparazione
del DNA e nella rimozione dei primers di
RNA durante la replicazione
Nel punto in cui inizia la sintesi del DNA si
trova un`interruzione (nick) che lascia un
OH libero in 3` e un IosIato in 5`.
La DNA polimerasi I estende la catena di
DNA complementare allo stampo spostando
l`interruzione distalmente nel DNA (nick
translation).
Dopo la sintesi, l`interruzione viene sigillata
da un altro enzima.
La replicazione del DAA dei procarioti
Avviene in tre Iasi: Ini:io, Allungamento, Termine
IAIZIO
In E.Coli l`origine della replicazione, chiamata oriC, e Iormata da 245 bp.
Gli elementi critici sono 3 sequenze di 13 bp e 4 sequenze di 9 bp che
Iungono da sito di legame per la proteina DnaA.
Modello dell'inizio della replicazione all'origine
di E.Coli, oriC
(a) Circa 20 molecole di DnaA, ciascuna legata
ad un ATP, si legano alle 4 sequenze di 9 bp.
Il DNA si avvolge attorno a questo
complesso.
(b) Le 3 sequenze ripetute (ricche di AT)
vengono di seguito denaturate.
(c) Esameri della proteina DnaB si legano al
complesso con l`aiuto della proteina DnaC.
L`attivita elicasica di DnaB disavvolge
ulteriormente il DNA per prepararlo al
legame con i primers ed alla replicazione.
Immediatamente dopo la replicazione, il DNA
viene emimetilato: l`elica parentale con oriC
viene metilata, mentre l`elica neosintetizzata
non lo e. L`emimetilazione serve per
interagire con la membrana plasmatica.
Proteine di E. Coli alla forcella di replicazione
SSBP (single strand binding proteins): si legano al DNA a singola elica tenendole separate
Elicasi: svolgimento del DNA
Primasi (DnaG): sintesi dei primer di RNA
DNA polimerasi III: allungamento della catena di nuova sintesi
DNA polimerasi I: riempimento delle lacune; rimozione dei primer
DNA ligasi: sutura del DNA
DNA topoisomerasi (girasi). superavvolgimento
ALLUACAMEA1O
E` composto da due eventi, apparentemente simili, ma ben distinti per quanto riguarda il
meccanismo: la sintesi della catena veloce e la sintesi della catena lenta.
Sintesi dei frammenti di Okazaki
a) Ad intervalli, la DNA primasi
sintetizza un primer di RNA
per un nuovo Irammento di
Okazaki.
La sintesi della catena lenta
procede nel senso opposto a
quello della Iorcella.
b) Ciascun primer viene esteso
dalla DNA polimerasi III
c) La sintesi del DNA continua
Iinche il Irammento si estende
Iino ad incontrare il primer del
Irammento di O. sintetizzato
in precedenza.
A questo punto un nuovo
primer viene sintetizzato
vicino alla Iorcella di
replicazione per iniziare
nuovamente il processo
Sintesi della catena veloce e della catena lenta del DAA
La complessita della sintesi dei Irammenti di
Okazaki sta nel coordinamento della
sintesi della catena veloce e della catena
lenta: entrambe le catene sono prodotte
da un singolo dimero asimmetrico di
DNA polimerasi III (core ).
Il coordinamento si realizza Iacendo piegare
ad anello il DNA della catena lenta e
procedendo insieme nei due diversi
percorsi di polimerizzazione.
La sintesi dei Irammenti di Okazaki coinvolge
un complesso apparato enzimatico. La
DnaB elicasi e la DnaG primasi
costituiscono un`unita Iunzionale
all`interno del complesso replicativo
denominata primosoma.
(a) Non appena la doppia elica del DNA
viene separata dalla elicasi, la primasi le
si associa temporaneamente
(b) Sintetizzando un corto primer di RNA
(c) Il complesso della DNA polimerasi
III catalizza l`aggiunta di una nuova
subunita (blu scuro) che Iunziona
come una pinza scorrevole) al
nuovo primer di RNA.
(d) Le subunita del core della DNA
polimerasi III sintetizzano il
Irammento di Okazaki. Quando la
sintesi del Irammento viene
completata, la replicazione si
arresta, le subunita della DNA
polimerasi III si dissociano dalla
subunita e dal Irammento di
Okazaki e si associano ad una
nuova subunita .
Cio da inizio alla sintesi di un nuovo
Irammento di Okazaki.
I primer di RNA sono rimossi
dall`attivita 5`-~3` esonucleasica
della DNA polimerasi I e
sostituiti con DNA dallo stesso
enzima.
La restante interruzione viene
riparata dalla DNA ligasi in
presenza di ATP e NAD

1ERMIAE
Le sequenze 1er (ciascuna delle quali e costruita in modo da costituire una sorta di
trappola dove la Iorcella di replicazione puo entrare ma non uscire) sono
posizionate in due gruppi con orientamento opposto.
Esse Iormano un complesso con una proteina chiamata Tus (Terminus Utilization
Substance).
Il complesso Tus-1er e in grado di arrestare la replicazione, ma solo da una
direzione; inIatti, quando la Iorcella di replicazione che per prima incontra il
complesso si Ierma.
L`altra Iorcella, invece, si Ierma quando incontra la prima gia Ierma.
Le poche centinaia di coppie di basi
rimaste Ira i due complessi proteici
vengono replicate (con un meccanismo
ignoto) completando due cromosomi
circolari Ira loro intersecati
(catenanes).
La loro separazione richiede in E.Coli
la presenza dell`enzima DNA
Topoisomerasi IV (un tipo di
topoisomerasi II), che agisce rompendo
temporaneamente entrambe le catene
di uno dei due cromosomi e
permettendo all`altro di passare
attraverso l`interruzione.
La replicazione del DAA degli eucarioti
E` piu complessa rispetto a quella dei procarioti.
Le origini della replicazione, chiamate 'sequenze che si replicano
autonomamente (autonomously replicating sequences, ARS) o replicatori,
sono lunghe circa 150 basi e sono molto ripetute.
L`inizio della replicazione richiede una proteina multimerica, ORC (origin
recognition complex) che si lega a numerose sequenze contenute nel
replicatore.
La replicazione e eIIettuata da un enzima chiamato DAA polimerasi , in
associazione con la DAA polimerasi .
La DAA polimerasi possiede attivita primasica e polimerasica ma non
l`attivita 3`-~5` esonucleasica. Si ritiene che provveda alla sintesi dei
primers per i Irammenti di Okazaki.
La DAA polimerasi , che estende i primers costruiti dalla polimerasi , si
associa ad una proteina denominata PCNA (proliferating cell nuclear
antigen). La PCNA possiede un`attivita simile alla subunita della DNA
polimerasi III dei procarioti. La DNA polimerasi , che presenta
proofreading activitv, e probabilmente responsabile sia della sintesi della
catena veloce che della catena lenta.
Un`altra polimerasi, la DAA polimerasi , puo prendere il posto della
polimerasi in alcune situazione, come ad esempio la riparazione del DNA.