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DISCREPNCIAS NA FENOTIPAGEM ABO

TUTORA: SILVIA LEO BONIFCIO


TUTORA- MOR: ANA LCIA GIRELLO
Fenotipagem ABO
o que diz a portaria....
PORTARIA N 2.712, DE 12 DE NOVEMBRO DE 2013

Art. 175. Os testes pr-transfusionais incluiro:
I - para sangue total e concentrado de hemcias:
a) a tipagem ABO (direta e reversa) e RhD e pesquisa de anticorpos
antieritrocitrios irregulares no sangue do receptor;
b) a retipagem ABO (direta) e RhD do componente sanguneo;
!"#" % &'%#() *+, -./(0% (
/(1(/2% 23" "4/.#%05/.%2 6"
/(7('0"/
PORTARIA N 2.712, DE 12 DE NOVEMBRO DE 2013

No Art. 176.
3 A tipagem ABO ser realizada testando-se as hemcias com
reagentes anti-A, anti-B e anti-AB.
4 Na hiptese do 3, caso sejam usados antissoros monoclonais, a
utilizao do soro anti-AB no obrigatria.
5 A tipagem reversa sempre ser realizada, testando-se o soro
ou plasma com suspenso de hemcias conhecidas A1 e B e,
opcionalmente, A2 e O.
6 Nenhum resultado de tipagem ABO ser concludo at a
resoluo das discrepncias entre a tipagem direta e reversa.
Fenotipagem ABO
o que diz a portaria....
4
O que pesquisamos na fenotipagem ABO?
! Prova direta
! Pesquisa a presena ou ausncia dos antgenos ABO na
membrana das hemcias.
! Prova reversa
! Pesquisa anticorpos naturalmente formados contra os
antgenos que no possuimos, e que esto presentes no
soro/ plasma.
5
Realizao de prova reversa

Segundo a Portaria 2.712/ 2013:
" No realizar prova reversa em em recm-natos at os 4 meses de
idade.
! Pois desenvolvem anticorpos naturais a partir do nascimento, e
somente em torno de 03-06 meses de idade teremos pequenas
quantidades anticorpos formados.
! Esta produo mxima entre 05- 10 anos de idade.
6
Tcnica em tubo
Fenotipagem ABO
REAGENTES NECESSRIOS PARA A
FENOTIPAGEM ABO (TUBO)
" Soro anti-A
" Soro anti-B
" Soro anti-AB *
! *segundo a portaria, sua utilizao opcional



" Reagente de hemcias A
1
" Reagente de hemcias B
! *concentrao de 3 a 5%
Para a tipagem direta
Para a tipagem reversa
Cad meus EPIs?
Pergunta que no quer calar!
Quais so os equipamentos de proteo individual obrigatrios para
quem atua em Laboratrios de imuno-hematologia?

" Jaleco manga longa
" Luvas de procedimentos
" culos ou viseira de proteo
" Calados fechados
" Roupas adequadas (mangas e calas
compridas)
" Mscaras
" Usar sempre cabelos presos (com ou
sem touca)
" NO USAR adereos/adornos,
maquiagem, salto alto
PROIBIDOS!
http://www.faciltst.com.br/cgi-sys/suspendedpage.cgi
Observar o correto
modo de
procedimento, as
limitaes da tcnica,
a interpretao de
resultados, entre
outras informaes
importantes, nas
bulas dos reagentes!
11
Uma bancada
limpa e
organizada
ajuda a garantir
a qualidade
do trabalho!
SEMPRE
identifique e
numere os tubos de
ensaio para os
testes!

12
Importante!
A centrifugao
inadequada das
amostras pode trazer
problemas tcnicos.
O tempo, velocidade
e rotao adequados
pode variar de uma
centrifuga para
outra. Por isso,
temos que validar
os equipamentos
antes do uso!


13
Voce sabe o
que
VALIDAR?
A lavagem das hemcias
coletadas de sangue venoso
para fenotipagem ABO e
Rh(D) no obrigatria.
Contudo, se a amostra for
coletada de sangue de
cordo umbilical, esta
lavagem obrigatria!
(Proceder de 6 a 9 lavagens
para remover toda a gelia
de Wharton!)


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Caso seja necessria a lavagem das
hemcias, separe uma alquota em
um tubo identificado.
Voc sabe COMO lavar hemcias corretamente?
15
16
Voc sabe COMO lavar hemcias corretamente?
Este tempo e rotao podem
variar de acordo com a validao
da centrfuga!
Aps a cetrifugao, remover o
sobrenadante. Proceder as demais
lavagens, repetindo as etapas anteriores.
Preparo da suspenso
de hemcias de 3 a 5%:
Em um tubo
devidamente
identificado,
adicionar 50
microlitros (1 gota)
do concentrado de
hemcias;
adicionar 950
microlitros (19 gotas)
de soluo fisiolgica
0,9%;
Homogeneizar
delicadamente.
17
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PROVA REVERSA
No plasma vamos buscar os anticorpos
naturais do Sistema ABO que esto
regularmente presentes, usando para
isto hemcias comerciais fenotipadas
dos tipos A
1
e B.

Pipetar 100 microlitros de plasma/
soro + 50 microlitros (1 gota) de cada
hemcia nos respectivos tubos.


Prova reversa ABO
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20
21
PROVA DIRETA
Usamos anticorpos comerciais
conhecidos para procurar os
antgenos correspondentes na
membrana das hemcias.
Seguir a indicao da bula dos
reagentes!
Geralmente consiste em
adicionar-se 50 microlitros (1
gota) de cada antissoro nos tubos
identificados.
A seguir
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+ 50 microlitros (uma gota)
da suspenso
de hemcias.

Importante!

A *qualidade da pipeta
e a posio em que ela
e/ou o conta gotas so
usados, so aspectos importantes
para garantir
esta medida!

*preferencialmente, pipetas semi-automticas calibradas periodicamente.
Etapa de leitura

Existem centrfugas
prprias para
Imuno-hematologia!

Ateno velocidade, rotao
e ao
tempo de
centrifugao.
25
26
Etapa de leitura
Voc sabia
que..

Existe uma maneira
correta
para se soltar o
boto de hemcias do
fundo do tubo?

E e que, para se fazer a
leitura,
tambm existem
algumas
regras bsicas?

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P (w) Escore=3

4+ (Escore=12)
3+ (Escore=10)

2+ (Escore=8)
1+ (Escore=5)
boto slido/nenhuma clula livre
alguns aglutinados grandes
aglutinados mdios/sobrenadante claro
aglutinados pequenos/sobren.avermelhado
vrios aglut. pequenos/sobren.avermelhado
Negativo: nenhum aglutinado
INTENSIDADE DAS REAES: PROMOVER A
PADRONIZAO NOS RESULTADOS
Slide:Regina Aparecida Cardoso
Interpretao dos resultados
Ler atentamente o preconizado nas bulas dos reagentes!










A B AB RA
1
RB
B RB RA
1
AB A
TIPO B
TIPO A
TIPO AB
A B AB RA
1
RB
A B AB RA
1
RB
TIPO O
Interpretao dos resultados
Ler atentamente o preconizado nas bulas dos reagentes!
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Tcnica em Gel teste
Fenotipagem ABO
Linha Bio-Rad de microplacas
Lyra Centrfuga/Agitador/Leitor
Produtos da linha Microplaca
Microplaca
DiaCell MP
Diluent 1
Ver mais em : http://www.diamed.com.br/Cmi/Pagina.aspx?206
Fenotipagem ABO - Teste em microplaca
Lyra centrfuga/Agitador/Leitor
Prova reversa
P
r
o
v
a

d
i
r
e
t
a

Em microplacas, para uma
interpretao correta dos
resultados, a agitao/
centrifugao uma etapa
crtica
ATENO!
Agitao insuficiente
Agitao excessiva
Agitao correta
Leitura dos aglutinados
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Tcnica em Gel teste
Fenotipagem ABO
Primeiramente, escolha o perfilde cartela
adequada para seu teste
Veja mais em : http://www.diamed.com.br/Cmi/Pagina.aspx?121
Cada um deles tem uma
tcnica, que pode variar!
Consultem as bulas!
Cartes para Prova Reversa ABO
Veja mais em : http://www.diamed.com.br/Cmi/Pagina.aspx?121
Conjunto de equipamentos Tcnica manual
ID-System Bio-Rad
Usando como exemplo da cartela ID-ABO/ reversa:
Prova direta
Prova reversa
Organize sua bancada de trabalho:
Equipamentos, estao de trabalho, reagentes, amostras,
planilhas de trabalho e descarte de materiais.
OBS:Ateno utilizao dos equipamentos de proteo individual .
Reagentes: hemcias para prova reversa, diluentes e cartelas.
Identificar os cartes com dados da amostra-teste
Pipeta de
volumes
adequados ao
mtodo.
Retirar o lacre de alumnio dos cartes. Homogeneizar os reagentes de hemcias. Observar
que todos os reagentes estejam temperatura ambiente a, no mnimo, 10 min)
Adicionar primeiramente as hemcias aos microtubos correspondentes
prova reversa: 1 gota (50 ul) de ID-Diacell A1*...
*observar que a concentrao destas hemcias varia de 0,8 a 1%
... E 1 gota (50 ul) de ID-Diacell B
Aspirar plasma ou soro
Vantagem do gel:
podemos utilizar apenas
uma nica amostra
coletada com EDTA para
todos os testes da
rotina!
Adicionar 50 ul de plasma ou soro aos microtubos de
prova reversa. Incubar 10 minutos a T.A.
Preparar suspenso de hemcias de trabalho: 1 ml de diluente 2 (LISS) ...
Pipetar 12, 5 microlitros
de hemcias (sedimento).
No necessrio lavar
hemcias, nem mesmo de
recm-nascido coletada de
sangue de cordo umbilical!
Homogeneizar. Aspirar a suspenso de hemcias-teste
Pipetar 50 ul em cada microtubo do carto de fenotipagem ABO+reversa
Proceder centrifugao
(Contrabalanar sempre as caapas em forma de cruz)
A velocidade (varivel de acordo com o modelo do equipamento) e tempo de
centrifugao (10 minutos) so fixas para este mtodo.

Ateno: nunca interromper a centrifugao e reiniciar, sob pena de falsos resultados.
Ler, interpretar e anotar resultados (manualmente ou em equipamentos
automatizados prprios para esta tcnica.
Interpretao fenotipagem ABO/Rh e prova reversa.
Os resultados podero ser conferidos, pois so estveis por at 48 horas e passveis de
documentao por scanner, xerox ou leitores automatizados. Uma das vantagens deste
mtodo a biossegurana, j que os cartes e ponteiras so descartveis .
Descarte dos materiais*
*Descartar de acordo com as normas preconizadas pelo servio de GRSS
!"# %"&%" ' (")%*+,
INTERPRETAO DAS AGLUTINAES
W 1+ 0
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Fenotipagem ABO

" O fenmeno de dupla populao
bastante fcil de ser visualizado
por esta metodologia!
" Dados devem ser analisados,
c o mo h i s t r i a c l n i c a ,
transfusional e laboratorial:
! Transfuso recente no isogrupo
! Transplante de medula ssea no
isogrupo
! Quimera de sangue (Me/RN)
! Subgrupo ABO
! Descartar efeito fibrina!
Dupla populao
Interpretao: BRhD+
Seguir o padro de intensidade de aglutinao especificado para este mtodo.
INTERPRETAO DOS RESULTADOS
ARhD-
BRhD+
ABRhD+
ORhD+
Resultados dos testes
O que so discrepncias ABO?
# quando ocorre incompatibilidade entre os resultados
observados na fenotipagem ABO direta e reversa.*
# *E tambm com os resultados lanados anteriormente deste mesmo doador/ paciente.
# Segundo a Portaria 2.712/2013:
# Toda discrepncia ABO deve ser resolvida antes da
liberao dos resultados.
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O que diz literalmente a Portaria 2.712/2013?
" Seo VI
Dos Exames de Qualificao no Sangue do Doador
" (....)
" Art. 120. O registro de uma tipagem ABO e RhD prvia de um doador
no serve para a i denti fi cao das uni dades de sangue
subsequentemente doadas pelo mesmo doador.
" 1o Novas determinaes devem ser realizadas a cada doao.
" 2o Em caso de doaes prvias, deve ser comparada a tipagem ABO e
RhD com o ltimo registro disponvel.
" 3o Qualquer discrepncia nos resultados das tipagens sanguneas de
que trata o caput ser resolvida antes de se rotular e liberar para uso
os componentes sanguneos produzidos.

O que diz literalmente a Portaria 2.712/2013?
" Seo VI
Dos Exames de Qualificao no Sangue do Doador
" (....)
Art. 124. recomendada a realizao da investigao de subgrupo de A
em doadores de sangue, quando houver resultados discrepantes entre
as provas ABO direta e reversa ou na busca de concentrado de hemcias
de subgrupo A2 para pacientes que apresentam anticorpo anti-A1
clinicamente significante.

O que diz literalmente a Portaria 2.712/2013?
" Seo X
Da Transfuso Sangunea
" (....)
" 3o A tipagem ABO ser realizada testando-se as hemcias com
reagentes anti-A, anti-B e anti-AB.
" 4o Na hiptese do 3o, caso sejam usados antissoros monoclonais,
a utilizao do soro anti-AB no obrigatria.
" 5o A tipagem reversa sempre ser realizada, testando-se o soro ou
plasma com suspenso de hemcias conhecidas A1 e B e,
opcionalmente, A2 e O.
" 6o Nenhum resultado de tipagem ABO ser concludo at a
resoluo das discrepncias entre a tipagem direta e reversa.
O que diz literalmente a Portaria 2.712/2013?
" Seo X
Da Transfuso Sangunea
" (....)
" Art. 181. Na amostra pr-transfusional inicial para transfuso em
neonatos e crianas de at 4 (meses) de vida ser realizada a tipagem
ABO direta.
" 1o No ser realizada a tipagem reversa.


I- Fatores relacionados tcnica

II- Fatores relacionados s hemcias

III- Fatores relacionados ao soro

Discrepncias nas Classificaes ABO
Discrepncias de resultados
Como resolv-las?
# Rever os detalhes operacionais:
# Rever detalhes da execuo da
tcnica
# Rever registros
# Transcrio de resultados
# Verificar possvel troca de amostras
# Qualidade da amostra:
$ Hemolisada, lipmica, aglutinao espontnea.
$ Data da coleta!
PORQUE ACONTECEM?
Primeiramente, levar em considerao que pode
ter ocorrido uma falha tcnica.
Discrepncias nas Classificaes ABO
FALHAS TCNICAS PODEM OCORRER DEVIDO:
1- AMOSTRA:
- identificao inadequada da amostra
- anotao incorreta de resultados
- interpretao incorreta


Discrepncias nas Classificaes ABO
Resultados Discrepantes
" Podem ser devidos a
erros clericais
! Identificao
! registros, amostras
! Anotao
! Transcrio
! Interpretao

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FALHAS TCNICAS PODEM OCORRER DEVIDO:
2- REAGENTES:
- Manuseio incorreto dos reagentes
- Falha em seguir as orientaes do fabricante
- Reagentes contaminados ou inativados
- Falha em adicionar reagentes

Discrepncias nas Classificaes ABO
3- NA REAO DE AGLUTINAO
- Concentrao inadequada das hemcias a serem
testadas
- Vidrarias sujas
- Temperatura de incubao incorreta
- Razo clula/soro incorreta

4- EQUIPAMENTOS
-excesso de centrifugao
-centrifugao insuficiente


Discrepncias nas Classificaes ABO
Resultados Falsos Negativos Resultados Falsos Positivos
Reagente ou soro teste no adicionado ao tubo Centrifugao acima do recomendado
Hemlise no identificada como uma reao
positiva
Uso de reagentes , glbulos vermelhos ou salina
contaminados
Quantidade inadequada de soro (ou reagente)
adicionado aos glbulos vermelhos
Uso de tubos sujos
Centrifugao abaixo do recomendado Interpretao ou anotao dos resultados
incorretamente
Incubao a temperatura acima de 20-24C
Interpretao ou anotao dos resultados
incorretamente
PODEM OCORRER resultados falso-positivo e/ou falso negativo:

Causas comuns de resultados falso-negativos e falso-positivos
Discrepncias nas Classificaes ABO
1- Conferncia dos dados
Amostras (tubo seco X tubo anticoagulante)
Identificar os tubos de ensaio na execuo do teste

2- Conferir dados do paciente
Idade, diagnstico, medicao, tipagem prvia, nveis de hemoglobina

3- Controle de Qualidade
Reagentes, equipamentos, tcnica e funcionrios




Resolvendo Discrepncias ABO
Fatores relacionados tcnica
CATEGORIA CAUSAS
Perda/Diminuio da
reatividade nos GV

- Subgrupo ABO; Leucemia; Transfuso; Transplante
Reatividade extra nos
eritrcitos
- Autoaglutininas / excesso de protenas recobrindo os GV;
- GV no lavados protenas no plasma;
- GV no lavados Anticorpo no soro do paciente que reage com
componente do anti-soro;
- Transplante; Antgeno B adquirido ; Fenmeno B(A)
Campo misto
- Transfuso recente; Transplante, subgrupo ABO, quimera
Perda/Diminuio da
reatividade no Soro
- Idade; Subgrupo ABO; Hipogamaglobulinemia; Transplante.
Reatividade extra no soro
- Autoanticorpo e/ou Aloanticorpo frio;
- Anticorpo no soro/plasma que reage com componente do anti-soro;
Transfuso de componentes plasmticos;
- Transplante; Infuso de Imunoglobulina.
Possveis causas de discrepncia ABO

Discrepncias ABO verdadeiras
I- Fatores relacionados tcnica

II- Fatores relacionados s
hemcias

III- Fatores relacionados ao soro

Discrepncias nas Classificaes ABO
Problemas com as fenotipagens
Variabilidade de nmero de stios antignicos
Limites de deteco dos testes
Tipos de anticorpos utilizados nos reagentes
Transfuses anteriores
TMO
Alteraes temporrias devido patologias

Antgenos ABO fracos ou ausentes

Ex.

Anti-A

Anti-B

AC

Hemcias A
1

Hemcias B


Fentipos
Provveis

1

0

0

0

0

4+

A

2

0

4+

0

0

0

AB (ou B *)
*Anticorpo Anti-A no
detectado

3

1+

0

0

0

4+

A
Causas mais provveis para as discrepncias:
1- Diminuio ou perda de antgenos devido a doenas como Leucemia, linfoma
ou outras afeces malgnas (exs: 1, 2 e 3)

2- Subgrupos de A fracos : A
m
, A
y
(exs: 1 e 2) e A
x
(ex: 3)

1) Incubar a prova direta por 15-30 minutos temperatura ambiente ou
4
o
C para aumentar a associao antgeno anticorpo (acompanhar o
teste de um autocontrole);
2) Adsoro-eluio: Incubar uma alquota de clulas vermelhas
lavadas, a 4
o
C, com anti-A ou anti-B (conforme o caso) para adsorver
anticorpos para o correspondente antgeno de clulas vermelhas e
posterior eluio.
3) Realizar pesquisa de subgrupos de A com Lectinas Anti-A1 e anti-H
4) Pesquisa de substancias solveis ABO na saliva.




Resolvendo Discrepncias ABO
Fatores relacionados Hemcias
Antgenos ABO fracos ou ausentes

Antgenos Extras

Exemplos

Anti-A

Anti-B

AC

Hemcias A
1

Hemcias B


Fentipos
Provveis

1

4+

1+

0

0

4+

A

2

2+

4+

2+

4+

0

B

3

2+

2+

2+

4+

4+

O

4

1+

1+

1+

4+

4+

O

Causas mais provveis para as discrepncias:
1- Fenmeno B adquirido (ex: 1)
2- Poliaglutinao por exposio do antgeno T (exs: 2 e 3)
3- Gelia de Wharton (ex: 4)
4- Dupla populao de clulas (Como nos casos de quimera e TMO)



" Fentipo B (A):
- Pode-se suspeitar do Fentipo B (A) quando os glbulos vermelhos do
paciente reage fracamente com anticorpos monoclonais anti-A e
fortemente com anti-B na prova direta e o soro reage com hemcias A
1
,
mas no com hemcias B na prova reversa.

- A maioria dos exemplos reage fracamente com o reagente Anti-A devido
ao clone MHO4 sendo a reao de aglutinao frgil e fcil de dispersar.
Um teste com anti-A de procedncia diferente pode confirmar e resolver
a discrepncia.





Resolvendo Discrepncias ABO
Fatores relacionados Hemcias
Antgenos Extras
" Paciente apresenta sepse bacteriana, e na tipagem
ABO em gel policlonal observamos:
Exemplo: Fenmeno B adquirido

" Repetida a tipagem ABO em tubo com anti-A
monoclonal observamos:
! Resposta: ARh+ (lindo!)
" Perguntas possveis: O que houve de errado?
! O que o gel est pegando?
! O gel est com problema?
! O paciente tem algum problema?
! Tipagem em tubo melhor?
! Oh meu Deus, esta eu no sei mesmo!.....
Exemplo: Fenmeno B adquirido

Hoje isto raro!
Fentipo B adquirido

Apenas detectado com Antisoros monoclonais: clone ES2
ou policlonais
I- Fatores relacionados tcnica

II- Fatores relacionados s hemcias

III- Fatores relacionados ao soro

Resolvendo Discrepncias ABO
Anticorpos ABO fracos ou ausentes:
- imunodeficincia
- neonatos
- idade avanada
- quimioterapia
- plasmafrese teraputica
- pacientes com hipogamaglobulinemia
Discrepncias nas Classificaes ABO
1- Incubar o soro do paciente com os glbulos vermelhos
comerciais (A
1
e B) em temperatura ambiente por 15-30
minutos.

2- Se continuar a no apresentar reao de aglutinao,
incubar a 4C por 15-30 minutos, incluindo um tubo
para auto-controle, e tambm os tubos a pesquisa de
anticorpos irregulares (PAI).
Resolvendo Discrepncias ABO
Fatores relacionados ao Soro
Anticorpos ABO fracos ou ausentes
Anticorpos Irregulares:

-Autoanticorpos
autocrioaglutininas (anti-I, anti-HI, etc...)

- Alo-anticorpos IgM : anti-M, -N, -Le
a
, -Le
b
, -P1Pk


- Anti-A
1
em indivduos A
2
e A
2
B

- Transfuso de componentes plasmticos contendo
anticorpos ABO
Discrepncias nas Classificaes ABO
1- Realizar a identificao do anticorpo em temperatura
ambiente, e 4C se necessrio (caso de PAI positiva).
2- Se confirmada a presena de anticorpos frios, realizar a
PAI+AC pr-aquecida para verificar se o anticorpo em
questo tem significado clnico.
4- Se confirmado presena de anti-A1, realizar prova reversa
pr-aquecida para verificar se o anticorpo em questo tem
significado clnico.


Resolvendo Discrepncias ABO
Fatores relacionados ao Soro
Anticorpos Irregulares
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ABO e indique os testes realizados na sua
resoluo.
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a compreenso do caso.
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