Bioqumica Experimental II LOT2006 Prof.

Eleonora
1

Teoria da Prtica: Propriedades Qumicas de Glicdios

Diferentemente dos aminocidos que apresentam reaes especficas baseadas principalmente na
natureza qumica de sua cadeia lateral (radical R), os glicdios apresentam estruturas muito
parecidas entre si o que torna quase impossvel identifica-los isoladamente. Neste caso, o que se faz
caracterizar grupos de glicdios utilizando suas propriedades qumicas comuns.
As reaes utilizadas nesta prtica esto baseadas principalmente em duas dessas
propriedades:
Desidratao de glicdios em presena de cidos minerais fortes
Poder redutor


Desidratao de Glicdios em Presena de cidos Minerais Fortes

Hexoses e pentoses colocadas nestas condies so desidratadas, respectivamente a
hidroximetilfurfural e furfural; esses compostos so capazes de se condensar com substncias
fenlicas, com aminas aromticas, tiocompostos, uria, etc. Os complexos formados so algumas
vezes coloridos e utilizados para a caracterizao de certos grupos glicdicos.
Neste caso situam-se: reao de Antrona, reao de Seliwanoff; reao de Bial

1. Reao de Antrona

Teste geral para glicdios

O reagente da Antrona contm antranol em meio de H
2
SO
4
concentrado. O calor liberado pela
diluio do H
2
SO
4
suficiente para que ocorra a reao. No caso de oligo e polissacardeos, o
H
2
SO
4
atua como catalisador de hidrlise convertendo-os a monossacardeos (hexoses e pentoses) e
tambm como agente desidratante levando formao de hidroximetilfurfural e furfural que, em
presena de Antranol, do produtos de condensao coloridos.

OH
+
antranol
O
_
C
H
O
_
H C
OH
_
H
hidroxi metil furfural
OH
OH
H
_
OH
C H
_
C
_
O
H
R
H
2
O
R
O
_
C
_
H
_
_
_
_
O +
composto verde azulado


O hidroximetilfurfural proveniente da desidratao de hexoses produz uma substncia de
colorao verde azulada relativamente estvel enquanto que o furfural proveniente de pentoses
fornece produto de cor anloga, mas que em alguns minutos se torna vermelho amarelado ou rubi.
A exposio do hidroximetilfurfural por um intervalo de tempo longo a essas condies
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2
promove sua decomposio a cido levulnico e cido frmico, o que redunda na formao de
produtos de condensao escuros conhecidos como humina.
Outras substncias orgnicas produzem descolorao do reagente e aparecimento de uma cor
marrom, fruto de sua decomposio.
O teste de Antrona muito sensvel e pode ser usado, quando modificado, para
quantificao de glicdios.


2. Reao de Seliwanoff

Teste de diferenciao entre cetoses e aldoses

A reao feita com resorcinol em meio de HCl, quente. As cetohexoses do uma cor vermelha
que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses correspondentes reagem mais lentamente. Durante o
tempo em que as cetohexoses so desidratadas e reagem com o resorcinol, fornecendo o produto de
condensao vermelha, as aldohexoses do apenas uma colorao rosa plida.

H
OH H
OH
O
HOH
2
C
H
OH
CH
2
OH COH
HO
2
HC
O
3 H
2
O
cetohexose
hidroximetilfurfural
+
OH
OH
resorcinol
produto de colorao vermelha
estrutura desconhecida


O teste de Seliwanoff pode ser modificado para ser utilizado quantitativamente.


3. Reao de Bial

Teste para identificao de pentoses e certos cidos urnicos (galacturnico, glicurnico,
etc.) que se decompem durante o aquecimento, em presena de H
+
, formando pentoses.

O reagente consiste de orcinol em meio de HCl concentrado em presena de ons Fe
3+
. O furfural
proveniente da desidratao de pentoses, quando aquecido em presena do reagente de Bial, d uma
cor verde. O hidroximetilfurfural (hexoses) reage dando uma cor diferente (que vai de amarelo a
marrom).

H
H
H
O
H
C
HO
C
HO
H C
OH
H
C
C
OH
pentose
O
C
O
H
furfural
+
HO OH
CH
3
orcinol
(5 metil 1, 3 dihidroxi benzeno)
produto de colorao verde
estrutura desconhecida


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3
O teste de Bial foi modificado para permitir quantificar pentoses. Respondem tambm ao
teste de Bial trioses e o cido 5-cetoaldnico.
As cetoheptoses do uma cor prpura enquanto que as cetohexoses e metilpentoses
fornecem uma soluo de cor laranja onde, posteriormente, em repouso, forma-se um precipitado de
cor verde escura.

cidos urnicos: produtos de oxidao do grupo lcool primrio dos glicdios.
cidos aldnicos: produtos de oxidao da carbonila aldedica dos glicdios.



Poder Redutor

Os acares contm grupos aldedos e cetonas capazes de reduzir sais de metais pesados; desses os
mais usados so, geralmente, os sais de Cu
2+
.
O princpio fundamental de todos os procedimentos analticos que utilizam Cu
2+
sua
dissoluo em meio alcalino, em presena de cidos orgnicos - como cido ctrico e o cido
tartrico - capazes de formar complexo.
Tambm podem ser empregados outros cidos orgnicos como EDTA, cido lctico e cido
trihidroxiglutrico, ou um cido sacrico. cidos sacricos so o produto da oxidao da carbonila
aldedica e do grupamento lcool primrio dos glicdios sendo, portanto, cidos dicarboxlicos.
A reao de formao do complexo ocorre, em geral, em meio fortemente alcalino e isto
promove profundas modificaes na estrutura do acar.
Os acares, individualmente, apresentam poder redutor diferente sobre o Cu
2+
; isto
significa que dois tipos de hexoses, numa mesma concentrao fornecem quantidades diferentes de
xido cuproso (produto final da reduo). De qualquer forma, os mtodos podem ser adaptados de
modo a se tornarem reprodutveis e a haver proporcionalidade entre a quantidade de Cu
2
O
produzido e a concentrao de glicdios presente dentro de certo limite (certa faixa).
A quantidade de ons cobre reduzida pelos diferentes glicdios funo do pH, da
temperatura, da concentrao e tipo de glicdios e do tipo de on orgnico complexante.
H diversos mtodos para determinao do teor de Cu
2
O, como, por exemplo, gravimetria e
colorimetria. No ltimo caso, o Cu
2
O formado dissolvido num excesso de reagente como
fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsnio-molibdato, formando-se um complexo de cor azul. Este
procedimento muito adequado para verificao de glicdios em materiais biolgicos.
Dentre os testes baseados no poder redutor dos glicdios, podemos destacar os testes de
Benedict e de Barfoed modificado.


1. Teste de Benedict

Teste geral para glicdios redutores

O reagente consiste de uma nica soluo onde esto presentes ons de Cu
2+
, citrato e carbonato de
sdio. A reao complexa e influenciada por uma srie de fatores; podendo ser esquematizada
por:

Cu
2+
+ glicdio composto oxidado + Cu
2
O
(precipitado vermelho)

As transformaes intermedirias sofridas pelo glicdio no so completamente conhecidas,
mas foram identificados produtos como cido metassacarneos e osonas, resultantes de reaes de
oxirreduo intramoleculares e rearranjos.
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4




2. Teste de Barfoed modificado

Teste de diferenciao entre monossacardeos e dissacardeos redutores

A reao feita usando-se acetato de cobre em meio de cido lctico ou de cido actico (Reagente
de Barfoed), a quente e por 30 segundos e o produto formado nesta primeira etapa posteriormente
revelado com soluo de fosfomolibdato.
S os monossacardeos daro um produto de colorao azul.
Esta diferenciao pode ser explicada pelo fato de que, em meio cido, a mutarrotao
ocorre em velocidade cerca de 4000 vezes menor do que em meio alcalino.
Dentro de um curto intervalo de tempo os monossacardeos, devido sua estrutura, tm
maior reatividade e talvez formem o enediol (um dos possveis responsveis pelo poder redutor dos
glicdios) mais fcil e rapidamente que os dissacardeos.
A adio posterior do cido fosfomolbdico leva formao de um complexo corado de cor
azul intensa.

Cu
2+
+ glicdio Cu
2
O + composto oxidado
(ppt.)

H
3
PO
4
.12MoO
3


Complexo de cor azul de estrutura desconhecida

Deve-se atentar para o fato de que o teste tambm dar positivo se a concentrao dos
dissacardeos redutores for muito maior do que a dos monossacardeos.


Teste com Iodo

Teste de identificao do amido

O amido composto de dois tipos de cadeia: a amilose e a amilopectina. Foi verificado que a
amilose capaz de formar um complexo de incluso de colorao azul com o I
2
. O grau de adsoro
do I
2
, a partir de uma soluo diluda de I
2
-KI, pela amilose nativa 19-20%, enquanto que a
amilopectina adsorve 0,5%. Para que a cor azul aparea necessrio que a amilose tenha no mnimo
40 resduos (unidades) de glicose.
Cadeias pequenas de amilose ou amilopectina tambm adsorvem o I
2
, s que necessrio
usar solues mais concentradas de I
2
-I
-
.
Essas cadeias do cores que variam entre o vermelho-marrom e o amarelo.
osona
cido metassacarneo
CH
2
OH
C
C
H
O
O
COOH
CH
2
OH
OH
H H
cido dicarboxlico
COOH
COOH
(cido sacrico ou sacarneo)
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5
O mecanismo da reao envolve a incluso de um arranjo linear de poli I
2
-I
-
, na hlice da
amilose. O I
2
parece interagir atravs de valncias secundrias e sabe-se que os ons I
-
so
necessrios mas se desconhece a exata natureza do arranjo do poli I
2
-I
-
.
A estimativa do teor de amilose presente no amido pode ser feita atravs da determinao do
I
2
livre por titulao ou pela medida da intensidade de absoro do complexo azul num dado
comprimento de onda, relacionando-se ento com uma curva padro. Infelizmente a cor azul
depende no s do peso molecular da amilose, como tambm da sua forma de extrao (impurezas
presentes) e, portanto este mtodo tem aplicabilidade restrita.
A amilopectina d uma cor violeta ou avermelhada com I
2
. As dextrinas (formadas a partir
da ao da -amilase sobre a amilopectina) so muito ramificadas e produzem uma cor vermelha,
assim como o glicognio (composto apenas de amilopectina, ainda mais ramificada do que a
existente no amido). As dextrinas de pequeno peso molecular no do cor com I
2
. A cor produzida
pela reao com I
2
e amilopectina usada para indicar o seu grau de ramificao.



Reao Propriedade Reagentes Aplicao
Antrona Antrona + H
2
SO
4
Identificao de
glicdios
Seliwanoff Resorcinol + HCl
conc.
Diferenciao entre
cetose e aldose
Bial


Desidratao com cido
forte seguido de
condensao com derivado
fenlico
Orcinol + HCL +
FeCl
3

Identificao de
pentoses e certos
cidos urnicos
Benedict CuSO
4
+ citrato de
sdio + carbonato de
sdio
Identificao de
glicdios redutores
Barfoed
(modificado)


Oxidao do glicdio com
ons CU
2+
em meio
alcalino ou cido
1) Acetato cprico +
cido lctico
2) cido
fosfomolbdico
Diferenciao entre
monossacardeo e
dissacardeos
redutores

Iodo Formao de complexo de
incluso com a amilose
I
2
+ KI (Lugol) Identificao de amido


Referncias:

Manual de Cursos Prticos em Bioqumica.
Departamento de Bioqumica, Instituto de Qumica, UFRJ.

Fundamentos de Bioqumica Experimental.
Jos Raul Cisternas, Jos Varga, Osmar Monte. 2 ed., Editora Atheneu, So Paulo, 2001.

LEHNINGER - Principles of Biochemistry
David L. Nelson, Michael M. Cox. Fifth Edition. W. H. Freeman and Company, New York, 2008.
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Anexo 1

D-arabinose
D-talose D-galactose D-idose D-gulose D-glicose D-altrose D-alose
D-lixose
D-ribose
D- treose
D-eritrose
D-manose
D-xilose
D - Aldoses com 3 a 6 tomos de carbono
D-gliceraldedo
H
OH
_
C
_
|
|
CH
2
OH
CHO
Legenda:
OH
CHO
Observaes:
1) As setas indicam as relaes estereoqumicas, no as vias biossintticas.
2) A configurao em torno do C
2
distingue os membros de cada par de monossacardeos.
3) As formas L correspondentes a esses 15 acares so suas imagens especulares.


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Anexo 2

Observao:
A configurao em torno do C
3
distingue os membros de cada par.
D-eritrulose
D-tagatose
D-sorbose
D-psicose
D-frutose
D-xilulose
D - Cetoses com 3 a 6 tomos de carbono
C
|
|
CH
2
OH
CH
2
OH
O
Diidroxiacetona
C = O
OH
Legenda:
D-ribulose


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Anexo 3

Estrutura cclica de oses
forma aldedo livre
D-glicose
H
2
O
H
2
O
hidrato de aldedo
aps ciclizao: hemiacetal
forma glucopiranose
(ponte osdica 1-5)
Estrutura cclica
de Tollens
Configurao
de Haworth
H
2
O
hidrato de cetona
aps ciclizao: hemicetal
forma frutofuranose
(ponte osdica 2-5)
Estrutura cclica
de Tollens
-D-frutofuranose
Configurao
de Haworth
C = O
CH
2
OH
H-C-OH
H-C-OH
HO-C-H
CH
2
OH
forma cetona livre
D-frutose
H
2
O
OH
C
O H
CH
2
OH
H-C-OH
H-C- OH
HO-C-H
CH
2
OH
5
2
CH
2
OH
CH
2
OH
H-C-OH
H-C
HO-C-H
OH C
O 5
2
6
4
3
1
HOH
2
C
O
CH
2
OH
H
HO H
H
OH
OH
-D-glucopiranose
2
3
4
6
1
5
O
H
CH
2
OH
OH
OH
H
H
H OH
HO
H
H-C-OH
H-C-OH
H-C
HO-C-H
CH
2
OH
OH H
C
O
1
5
C
H O
CH
2
OH
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C- OH
HO-C-H
CH
2
OH
O H
C
H OH
Observao:
Quando um monossacardeo se cicliza, o carbono da carbonila, denominado carbono anomrico, torna-se um
centro quiral com duas configuraes possveis.

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Anexo 4


O H
O
C H
2
H
H
H O
O H H
H
H
O H
5
1
6
4
3
2
O
2
3
1
H O H
2
C
O
H O H
O H
C H
2
O H
D - g l i c o s e ( )
p o n t e o s d i c a
- 1 , 2
H
- D - f r u t o s e
H
4
6
5
e x t r e m i d a d e r e d u t o r a
( c a r b o n o a n o m r i c o l i v r e )
p o n t e o s d i c a
- 1 , 4
D - g l i c o s e ( )
O
2
3
4
6
1
5
O H
O H
H
H
H O H
H
H
C H
2
2
3
4
6
1
5
O H
H
H
H O H
H O
H
H
C H
2
D - g l i c o s e ( )
O
O H
O
O H
C H
2
O H
O
H
H
H O
O H H
H
H
O H
5
1
6
4
3
2
C H
2
O H
O
H
H
O H H
H
H
O H
O H
5
1
6
4
3
2
O
D - g a l a c t o s e ( )
D - g l i c o s e ( )
p o n t e o s d i c a
- 1 , 4
e x t r e m i d a d e r e d u t o r a
( c a r b o n o a n o m r i c o l i v r e )
o u
S a c a r o s e
M a l t o s e
L a c t o s e
D i s s a c a r d e o s
O
2
3
4
6
1
5
O H
H
H
H O H
H O
H
H
C H
2
O
O H
O H H
H H O
H
C H
2
O H
O
H O H
2
C
1
3
4
6
2
5

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Roteiro de Prtica: Reaes Qumicas de Glicdios


1. MATERIAL
Solues de glicdios na concentrao de 0,1M
Suspenses:
Dextrina 0,5%
Carboximetil celulose (CMC) 0,5%
Agar
(*)
0,5%
Amido 0,5%
cido poligalacturnico 0,5%
Soluo de furfural 2,3 g/mL
Soluo de cido glutmico 0,1M
Reagente de Antrona: Antrona em H
2
SO
4
concentrado
Reagente de Bial: orcinol em HCl concentrado
Reagente de Seliwanoff: resorcinol em HCl
Reagente de Benedict: CuSO
4
em meio alcalino
Reagente de Barfoed modificado: CuSO
4
em meio levemente cido
Soluo de Lugol: I
2
e I
-

Banho termostatado a 100C


2. OBJETIVO
Caracterizar grupos de glicdios a partir de suas propriedades qumicas


3. PROCEDIMENTO

a) Teste de Antrona

Em tubo de ensaio colocar 0,2 mL das solues a serem testadas.
Adicionar cuidadosamente 1 mL do reagente de antrona.
Fazer o teste com solues de glicose 0,1M, sacarose 0,1M, cido glutmico 0,1M, amido
0,5% e CMC 0,5 %.
Fazer um branco de reao com 0,2 mL de gua destilada.

A reao praticamente imediata e o teste considerado positivo se apresentar cor verde intensa.

Observar: a) com que glicdio aparece o anel verde
b) em que tubo a colorao verde mais intensa
c) o aquecimento provocado pela diluio de H
2
SO
4
na gua, tocando a base dos
tubos com cuidado.

Anotar os resultados na tabela anexa.


b) Teste de Seliwanoff

Em tubo de ensaio colocar 0,2 mL das solues a serem testadas.

(*)
Polissacardeo de estrutura no completamente estabelecida contm D-L-galactose com radicais sulfato.
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Adicionar 1 mL do reagente de Seliwanoff.
Aquecer em banho termostatado a 100C por 3 minutos.
Fazer o teste com solues de glicose 0,1M, frutose 0,1M, sacarose 0,1M e lactose 0,1M.
Fazer um branco de reao com 0,2 mL de gua destilada.

O teste considerado positivo se apresentar cor vermelha.

Observar: a) em que tubo(s) aparece a cor e o tempo necessrio para que isto ocorra.
b) a colorao obtida nos outros tubos.

Anotar os resultados na tabela anexa.


c) Teste de Bial

Em tubo de ensaio colocar 0,5 mL das solues a serem testadas.
Adicionar 1 mL do reagente de Bial.
Aquecer em banho termostatado a 100C por 2 minutos.
Fazer o teste com solues de glicose 0,1M, arabinose 0,1M, cido poligalacturnico 0,1M e
furfural 2,3 g/ mL.
Fazer um branco de reao com 0,5 mL de gua destilada.

O teste considerado positivo se apresentar cor verde ou verde azulada.
Observar: a) em que tubo(s) h aparecimento imediato da cor verde
b) a colorao obtida nos outros tubos.

Anotar os resultados na tabela anexa.


d) Teste de Benedict

Em tubo de ensaio colocar 0,4 mL das solues a serem testadas.
Adicionar 2 mL do reagente de Benedict.
Aquecer em banho termostatado a 100C por 5 minutos.
Fazer o teste com solues de glicose 0,1M, frutose 0,1M, sacarose 0,1M e lactose 0,1M e
amido 0,5%.
Fazer um branco de reao com 0,4 mL de gua destilada.

O teste considerado positivo se formar um precipitado vermelho.

Observar: a) em que tubo(s) verifica-se a formao do precipitado.
b) em que tubo(s) no h formao de precipitado.

Anotar os resultados na tabela anexa.


e) Teste de Barfoed modificado

Em tubo de ensaio colocar 0,2 mL das solues a serem testadas.
Adicionar 0,5 mL da soluo 1 de Barfoed.
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Aquecer em banho termostatado a 100C por 30 segundos.
Resfriar.
Adicionar 0,5 mL da soluo 2 de Barfoed.
Agitar levemente para misturar os reagentes
Fazer o teste com solues de glicose 0,1M, lactose 0,1M e sacarose 0,1M.
Fazer um branco de reao com 0,2 mL de gua destilada.

O teste considerado positivo quando apresentar cor azul intensa.

Observar: a) em que tubo(s) ocorre o desenvolvimento de cor azul.
b) em que tubo(s) ocorre colorao azul plido.

Anotar os resultados na tabela anexa.


f) Teste com Iodo

Em tubo de ensaio colocar 2 mL das solues a serem testadas.
Adicionar 0,1 mL da soluo de Lugol (I
2
+ KI)
Fazer o teste com suspenses de amido 0,5%, dextrina 0,5%, CMC 0,5%, agar 0,5%
Fazer um branco de reao com 2 mL de gua destilada

O teste considerado positivo quando apresenta cor azul intensa

Observar: a) em que tubo aparece o complexo de cor azul.
b) qual(is) a(s) cor(es) que aparece(m) nos outros tubos.

Anotar os resultados na tabela anexa.




Bioqumica Experimental II - BQ212 Prof. Eleonora
13

Tabela de Resultados


Teste Substncias Testadas Observaes

glicose

sacarose
Antrona
amido


CMC


cido glutmico


glicose


frutose

Seliwanoff
sacarose


lactose


glicose


arabinose

Bial
cido poligalacturnico


furfural


glicose


frutose

Benedict
sacarose


lactose


amido


glicose

Barfoed
lactose

(modificado)
sacarose


amido


dextrina

Iodo
CMC


agar