MODUL 8

Deteksi Fragmen DNA menggunakan Elektroforesis Gel

I. Tujuan
Memahami cara mendeteksi dan memisahkan fragmen-fragmen DNA
melalui elektroforesis gel agarosa.

II. Prinsip
Pada tahapan ini, loading buffer ditambahkan kedalam suspensi DNA
dengan tujuan untuk menambahkan densitas dan mewarnai DNA sehingga
memudahkan penandaan migrasi DNA. Suspensi tersebut kemudian dipipet
kedalam sumur gel agarosa. Larutan etidium bromide (1/100mL)
ditambahkan ke dalam gel agarosa sebelum gel membeku. Visualisasi DNA
hasil elektroforesis dilakukan dengan mengamati pita DNA yang terdifusi ke
dalam gel agarosa pada trasluminator UV. Berat molekul dan kuantitas jumlah
DNA diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya terhadap laju
migrasi fragmen-fragmen DNA standar (DNA marker).

III. Teori Dasar
Isolasi atau ekstraksi DNA merupakan pemindahan DNA dari sel dan
langkah awal pada proses analisa DNA dengan menggunakan metode
elektroforesis atau PCR (Rice, 2010). Sedangkan elektroforesis adalah proses
pemindahan makromolekul, terutama protein dan asam nukleat yang berbeda
dalam segi ukuran, muatan, atau massa. Ketika molekul bermuatan ditempatkan
pada medan listrik maka akan bergerak sesuai dengan muatannya, contohnya
protein ada yang bermuatan positif, negatifl atau netral. Berbeda dengan
protein, asam nukleat bemuatan negatif yang konsisten maka akan bergerak
kearah anoda sesuai dengan bobot massanya (Marks, 2000).
Gel yang biasa digunakan pada elektroforesis adalah agarose dan
polikrilamida. Pada praktikum digunakan gel agarose yang terbuat dari
ganggang laut dengan struktur dasar D-galaktose dan 3,6-anhidro L-galaktosa.
Gel agarose dapan memisahkan DNA mulai dari 200 pb sampai 50.000 pb
(Sudjadi 2008).
Elektroforesis merupakan teknik untuk memisahkan molekul-molekul
seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan kecepatan
migrasi melewati gel elektroforesis. Teknik elektroforesis digunakan untuk
memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan
objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan
ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul
tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi
karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang
bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari
gel elektroforesis (Lawrence 1989: 156).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.
(Davis dkk. 1994: 151).
Praktikum elektroforesis gel menggunakan gel agarosa. Gel agarosa
diperoleh dari rumput laut dan biasanya digunakan dalam konsentrasi 0,5--
2%. Alasan memakai agarosa dibandingkan poliakrilamida adalah agarosa
mudah untuk disiapkan karena proses pembuatannya mudah. Gel agarosa
dibuat dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer,
kemudian dipanaskan dan tunggu sampai mengeras. Gel agarosa juga bersifat
non-toxic (Bowen 2000: 1).
Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA, dan
protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju
elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan bergerak ke
elektroda positif melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen DNA yang
terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik
dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan adalah etidium
bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada DNA. Gel yang diberi
etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi DNA
sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan senyawa
karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang menggunakan
etidium bromida harus menggunakan sarung tangan (Schleif 1993: 26--29).
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel
karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul
berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat
sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa
yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil,
konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan
ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak
dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan
densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan
densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan
molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan
molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik
sehingga mempercepat migrasi DNA. (Wolfe 1993: 127)
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen
DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang
berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau
purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam
kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda,
mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing,
mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit
tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu,
mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme
atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari
evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural
di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA,
protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi
melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar
individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam
rekombinan plasmid DNA (Russell 1994: 299--310 & 500501)
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.
Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil apmlifikasi. Marker
DNA yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi
molekul DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-
basanya (Martin 1996: 77).

IV. Alat dan Bahan
IV.1 BAHAN:
1. DNA marker, gene ruler 1Kb (6 )
2. Suspensi DNA berupa DNA kromosom bakteri, DNA plasmid, dan DNA
plasmid hasil restriksi
3. Agarosa
4. Larutan dapar TAE 1x (242 g Tris-base; 57,1 g asam asetat glasial; 100
mL EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam aquadest hingga 1000mL)
5. Aquadest
6. Loading dye 6x ( 0.25% bromofenolbiru; 0.25% xylene cyalol FF,
sukrosa 40%)
7. Etidium bromide
IV.2 ALAT:


Alat Elekroforesis Gel Gelas Ukur 1000mL Kaca Mata UV

Kamera Digital Kertas Parafilm
Labu Erlenmeyer
50mL

Mikropipet Sarung Tangan Tabung Eppendrof

Tip Mikropipet Transluminator UV

V. Prosedur
Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,3 gram agarosa ke dalam
larutan dapar TAE 1x hingga 30 mL di dalam erlemeyer. Larutan agarosa
kemudian di didihkan hingga larut sempura (jernih). Setelah itu, gel agarosa
didiamkan hingga hangat. Baki gel agarosa disiapkan dengan melekatkan
selotip dikedua ujung baki,lalu sisir elektroforesis dipasang pada salah satu
ujung baki. Setelah gel agarosa hangat, Ditambahkan larutan etidium bromida
0,2 L, goyang erlenmeyer hingga larutan gel menjadi homogen. Larutan Gel
dituangkan ke dalam baki gel agarosa, lalu dibiarkan hingga beku. Sisir
elektroforesis dicabut dengan hati-hati, lalu selotip pada ujung-ujung baki
dilepaskan. Gel agarosa dimasukkan kedalam tangki elektroforesis yang telah
diisi larutan dapar TAE 1x dan gel agarosa harus terendam seluruh
permukaannya oleh TAE. Setelah itu, Sampel (DNA Kromosom, DNA plasmid
Restriksi, DNA plasmid non Restriksi) sebanyak 10 L dan loading dye 2 L
dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet secara berulang dengan
pemipetan. Campuran DNA masing-masing dimasukkan ke dalam sumur-
sumur gel agarosa. Sumur nomor 6 diisi dengan DNA Kromosom,7 dan 8 diisi
dengan DNA plasmid Restriksi dan DNA plasmid non-Restriksi. Sedangkan
DNA marker disi pada sumur nomor 5. Kabel dari sumber arus dihubungkan ke
tangki elektroforesis, dimana kabel yang tersambung ke kutub negatif harus
berada didekat sumur. Sumber arus dinyalakan sumber arus, voltase diatur pada
90 volt, kekuatan arus 400mA dan waktu running selama 1 jam 45 menit.
Elektroforesis dirunning dengan menekan tombol run pada sumber arus.
Setelah elektroforesis selesai, maka sumber arus dimatikan dan baki diangkat
dari tangki elektroforesis. Gel dikeluarkan dari baki elektroforesis. Gel
diletakkan di atas transluminator UV. Transluminator dinyalakan, kemudian
pita DNA yang tervisualisasi diamati. Berat molekul dan kuantitas jumlah DNA
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya terhadap laju migrasi
fragmen-fragmen DNA marker.

VI. Data Pengamatan
No. Perlakuan Hasil Pengamatan
1. Gel agarosa 1% dibuat dengan
melarutkan 0,3 g agarosa ke dalam
larutan dapar TAE 1x hingga volume 30
mL dalam erlenmeyer. Kemudian
dididihkan hingga larut sempurna.

Agarosa larut seluruhnya dan
terbentuk larutan agarosa yang
jernih
2. Baki gel agarosa disiapkan dengan
melekatkan selotip di kedua ujung baki
Baki gel agarosa siap untuk
digunakan
3. Diamkan larutan agarosa hingga bersuhu
sekitar 50-60 C kemudian ditambahkan
larutan etidium bromida 0,2 , goyang
erlenmeyer sehingga larutan gel menjadi
homogeny
Larutan gel agarosa homogen
dengan larutan etidium bromida dan
berwarna jernih
4. Tuangkan larutan gel ke dalam baki gel
agarosa, lalu sisir elektroforesis
dipasang pada salah satu ujung kaki ,
lalu dibiarkan sampai beku. Setelah
beku, sisir elektroforesis dicabut dengan
hati-hati, lalu selotip pada ujung baki
dilepaskan
Gel membeku dan terbentuk sumur-
sumur setelah sisir elektroforesis
dicabut
5. Gel agarosa dimasukkan ke dalam
tangki elektroforesis yang telah diisi
larutan dapar TAE 1x. Seluruh
permukaan gel harus terendam dalam
TAE
Seluruh permukaan gel terendam
dalam TAE
6. Disiapkan 10 suspensi DNA (DNA
marker, DNA kromosom, DNA plasmid,
dan DNA plasmid hasil restriksi) dan
2loading dye 6x di tabung eppendorf
1,5 mL. Dihomogenkan campuran
tersebut melalui pemipetan berulang
dengan mikropipet
Suspensi DNA homogen dengan
loading dye, dan siap untuk
dielektroforesis
7. Campuran DNA masing-masing
dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel
agarosa. Nomor sumur dan jenis
suspensi DNA yang dimasukkan dicatat


1 = kosong
2 = kosong
3 = plasmid nonrestriksi kelompok 1
4 = plasmid restriksi kelompok 1
5 = kromosom
6 = DNA marker
7 = kromosom
8 = plasmid restriksi kelompok 2
9 = plasmid nonrestriksi kelompok 2
10 = kosong
8. Kabel dari sumber arus dihubungkan ke
tangki elektroforesis, dimana kabel yang
tersambung ke kutub negatif harus
berada di dekat sumur. Elektroforesis
dirunning sampai tanda batas yang
dibuat.

9. Setelah elektroforesis selesai, baki
diangkat, gel dikeluarkan dari baki,
kemudian direndam di dalam aquadest
selama 15 menit
Gel siap untuk diamati di bawah
transluminator UV
10. Gel diletakkan di atas transluminator
UV, diamati pita-pita DNA
yangtervisualisasi
Terbentuk pita-pita DNA berwarna
jingga
11. Berat molekul dan kuantitas jumlah
DNA diperkirakan dengan
membandingkan laju migrasinya
terhadap DNA marker
Diketahui berat molekul dan
kuantitas jumlah DNA


Hasil elektroforesis DNA






Bowen, R. 2000. Principles of gel electrophoresis. 3 Januari 2000: 4 hlm. Tersedia
online di http://www.vivo.colostate.edu. (Diakses pada 14 Oktober 2013)
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm.
Lawrence, E. 1989. Hendersons dictionary of biological terms. 10th ed. John Will &
Sons, New York: ix + 637 hlm.
Marks D.B, A.D Marks, Collen M.Smith. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah
Pendekatan Klinis. Penerjemah: Brahm U, terjemahan dari: Basic Medical
Biochemistry: Aclicical Approach. Jakarta: EGC.
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher,
Oxford: xvi + 175 hlm.
Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College
Publishers, New York: xvi + 528 hlm.
Schleif, R. 1993. Molecular and cellular biology. Wadsworth Inc., Belmont: xviii +
1145 hlm.
Sujadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing
Company, Belmont: xvii + 820 hlm.