Izolacija rekombinantnih učinkovin

Osamitev biofarmacevtika iz celične kulture je ena od najbolj kritičnih

faz bioprodukcije.Običajno je produkta zelo malo: 
10 mg - 200 mg /l supernatanta

Stopnje izolacije:
 
A. Odstranitev trdnih delcev
B. Obogatitev produkta
B. prvo čiščenje (pridobitev surovega produkta)
C. vmesno čiščenje (čiščenje/izolacija učinkovine)
C. končno čiščenje (odstranitev kontaminantov)

Osnove farmacevtske biotehnologije

 Čiščenju sledi formulacija in sterilizacija.

 Stopenj čiščenja mora biti čim manj, biti morajo čimbolj enostavne,
učinkovite in varne.
 Pri izolaciji ločimo dve fazi:
 
A. načrtovanje izolacije
B. prenos iz laboratorija v industrijski obseg (scale-up)
 
Pred načrtovanjem izolacije je pomembno poznati sledeče informacije:
 
1. določitev glavnih kontaminantov (ali imamo prokariontski ali
evkariontski sistem)
2. Fizikalno-kemijske in strukturne značilnosti produkta (termična
stabilnost, IP, MW., hidrofobnost, gostota, strukturna stabilnost)
3. Nevarnost navzkrižne kontaminacije (zaprti-odprti sistem izolacije)

Osnove farmacevtske biotehnologije

Primer postopka čiščenja rekombinantnega glikoziliranega interferona :
UF
celična kultura

TFF/centrifugiranje Hidrofobno-interakcijska
kromatografija

UF/DF UF/DF

Anionsko-izmenjevalna
kromatografija Gelska filtracija

F
F

UF/DF

Polnjenje
Kationsko-izmenjevalna Označevanje
kromatografija

Končna
A farmaecevtska
oblika

Osnove farmacevtske biotehnologije

Strukturne značilnosti rekombinantnih proteinov
Ker so zdravilne učinkovine rekombinantnega izvora največkrat
enostavni ali sestavljeni proteini in peptidi, ki so aktivni v njihovi nativni
konformaciji, moramo poznati sledeče njihove značilnosti:
 
1. primarna struktura (aminokislinsko zaporedje)
2. sekundarna struktura (α-helix, β-zavoj)
3. terciarna struktura (S-S mostički, hidrofobne interakcije, hodikove vezi,
elektrostatske interakcije, Van der Waalsove interakcije)

Učinek vseh parametrov vodi v pravilno zvitje proteina (folding), ki ga

lahko dokažemo z CD spektri (določitev alfa-helixa v UV področju 180-
260 nm, ali določitev aromatskih AK in disulfidov v UV območju 250-340
nm), ali FTIR spektri, upoštevajoč standardno substanco.

Osnove farmacevtske biotehnologije

Osnove farmacevtske biotehnologije
Optimalno sliko pravilne konformacije pa dobimo z X-žarkovno analizo (rentgenska
difrakcija) in/ali visoko zmogljivostno NMR strukturo.

Osnove farmacevtske biotehnologije

 Stabilnost rekombinantnih proteinov

Proteinske molekule so predvsem v vodni ali puferni raztopini

velikokrat nestabilne. Struktura proteina ima reaktivne skupine, ki v
stiku z okoljem lahko reagirajo in zmanjšajo proteinsko stabilnost ter
delovanje.
 
Običajne reakcije, ki vplivajo na stabilnost:

 
Osnove farmacevtske biotehnologije
reakcija vpliv na strukturno analizna metoda
značilnost detekcije
oksidacija:Cys - hidrofobnost RP-HPLC
(disulfidi) - velikost MS
-znotraj verige gelska filtracija
- med verigami
- Trp, Met

hidroliza peptidne - velikost SDS-PAGE. gelska

vezi filtracija

hidroliza stranske - hidrofobnost, naboj IEF, I.I. kromatografija

verige
(deamidacija)
acilacija - hidrofobnost, naboj MS; I.I. kromatografija.
IEF
esterifikacija (Asp) - naboj MS, I.I. kromatografija.
IEF
sprememba v sek. - agregacija, hidrofobnost RP-HPLC, gelska
strukturi filtracija

amidacija - naboj MS, I.I. kromatografija,

IEF

Osnove farmacevtske biotehnologije

Tehnike identifikacije rekombinantnih učinkovin:

      SDS-PAGE (poliakrilamidna elektroforeza)

      Izoelektrični fokusing (IEF)
      Kapilarna elektroforeza (CE)
      Določitev proteinov z metodo pivnanja "Western blot"
      Aminokislinska analiza
      Aminokislinsko sekveniranje
      Določitev glikozilacijskega vzorca
      Peptidno mapiranje
      Masna spektroskopija
      NMR spektrometrija in modeliranje

Osnove farmacevtske biotehnologije

Identification techniques
1. SDS-PAGE

Osnove farmacevtske biotehnologije

2. Isoelectric focusing (IEF)

Osnove farmacevtske biotehnologije

 3. Capillary electrophoresis (CE)

1. Capillary
2. Buffer reservoir
3. Buffer reservoir
4. Proton beam
5. Interaction zone with ion window
6. Detector
7. Manometer
8. Vacuum pump
9. High voltage power supply
10. Platinum electrodes
Osnove farmacevtske biotehnologije
4. Peptidno mapiranje

Osnove farmacevtske biotehnologije

4. Peptide mapping

Osnove farmacevtske biotehnologije

5. RP-HPLC

Osnove farmacevtske biotehnologije

6. Mass spectrometry (MALDI-TOF)

Osnove farmacevtske biotehnologije

Obdelava fermentacijske brozge
Filtracija
Supernatant, ki vsebuje biotehnološki produkt, je potrebno ločiti od celičnih ostankov,
netopnih delcev in ostankov celičnih membran in sten. To naredimo največkrat s
filtracijo:

- običajna filtracija grobih delcev (do 100 μm)

- ultrafiltracija
- filtracija do sterilnosti (0,22 μm). (pazi virusi! Nanofiltracija 30-50 nm)
 

Za farmacevtsko industrijo in uporabo je izjemno pomembna kvaliteta filtrov. Potrebno

je upoštevati smernice in pravilnike.

Osnove farmacevtske biotehnologije

Osnove farmacevtske biotehnologije
 Centrifugiranje in precipitacija

Vzporedno s filtracijo, včasih pa pred filtracijo, uporabljamo tudi centrifugiranje, kjer z

mehansko silo ločimo večje delce od majhnih. V industrijskem merilu je centrifugiranje
vprašljivo, potrebna je dolgotrajna validacija.
 
Topnost proteinov je odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti proteina in okolice. Z
naraščajočo ionsko jakostjo se bo topnost proteinov zmanjševala (izsoljevanje). Za
izsoljevanje običajno uporabljamo (NH4)2SO4, NaCl, podobne učinke pa dosežemo tudi z
organskimi topili, ki se mešajo z vodo (aceton, etanol).
 
Za oboritev proteinov pa poznamo različne anorganske soli:
 
I. negativno nabiti ioni: -SCN-, I-, ClO4-, Br-, Cl-, CH3COO-, PO43-, SO42-

II. pozitivno nabiti ioni: -Ba2+, Ca2+, Mg2+, Li+, Cs+, Na+, K+, Rb+, NH4+

Osnove farmacevtske biotehnologije

3.3.4. Kromatografija

      Adsorbcijska kromatografija

      Hidrofobno-interakcijska kromatografija
      Gelska filtracija

Osnove farmacevtske biotehnologije

      Afinitetna kromatografija

Osnove farmacevtske biotehnologije

      Ionsko-izmenjevalna kromatografija

Osnove farmacevtske biotehnologije

 Odstranitev kontaminantov

Kvaliteta bioprodukta se meri v čistoti, konsistentnosti in aktivnosti. Medtem, ko je pri

sinteznem produktu aktivnost enaka stopnji aktivne učinkovine, pa je pri učinkovini
proteinskega izvora aktivnost, kljub čistoti lahko manjša. Kljub temu pa pazimo, da je
kontaminantov čim manj (izvor kontaminacije, glej poglavje 3.3.2).
Najpogostejši kontaminanti so: virusi, produkti bakterij (pirogeni), DNA, proteinski
"stranski" produkti.

A. Virusi

So kontaminanti pri sesalskih celicah. prisotni so lahko v zelo manjhnih količinah, zato
jih je težko detektirati. Stopnje ravnanja s potencialnimi virusnimi kontaminanti, so:
 
- detekcija (PCR, ELISA)
- inaktivacija
- odstranitev
 

Osnove farmacevtske biotehnologije

Osnove farmacevtske biotehnologije
 Sterilnost

Večina proteinov se vnaša parenteralno in morajo zato biti sterilni. Proteine ne moremo
sterilizirati z avtoklaviranjem, z X-žarčenjem ali etilenskim tretmajem. Ker ne moremo kar
sterilizirati končnega produkta, mora biti celoten porces produkcije, izolacije in polnjenja
voden v aseptičnih pogojih.
Aparature in pribor ločeno steriliziramo s suhim zrakom ali vlažno sterilizacijo,
lahko se poslužimo gama-radiacije ali kemijskega postopka sterilizacije.
Prefiltri služijo za odstranitev večjih delcev in so pred sterilno filtracijo nujni, sicer
pride do zamašitve filtrov za končno, sterilno filtracijo. To izvedemo na koncu izolacijskega
postopka s filtri 0,22 μm.
 
Polnjenje izvajamo v prostorih razreda 100 (največ 100 delcev velikosti 0,5 μm ali večji na 1
kubični čevelj) , v aseptičnih komorah (pretok zraka skozi HEPA filtre), osebje mora biti
zaščiteno po pravilih. Kontrola, čiščenje, zamenjava filtrov in pogosta validacija HEPA
opreme so nujni !

Osnove farmacevtske biotehnologije

Odstranitev pirogenov
Pirogeni lahko izvirajo iz:
- bakterijskih
- mikoplazemskih
- glivnih
- virusnih izvorov. 
Največkrat pa so endotoksini, ki jih proizvajajo G(-) bakterije:

fosfat skupina s fosfatom

različne sladkorne enote

maščobne kisline

Osnove farmacevtske biotehnologije

 Imajo visok negativni naboj, veliko nagnjenost k agregiranju (do velikosti 10 6 Mw) in veliko
adsorptivno sposobnost vezanja na steklene ali polimerne površine. So termostabilni
(120oC), razgradijo pa se s suhim steriliziranjem.
 
Najbolje jih odstranimo z I.I. kromatografijo in filtracijo tik pred polnitvijo.

Preprečevanje TSE
Prenosljiva spongifromna encefalopatija (TSE) oziroma goveja spongiformna encefalopatija
(BSE) se prenašata s prioni - nepravilno zvitimi PrP proteini.
 
V farmaciji poskušamo uporabljati čim manj izhodnih surovin živalskega izvora (albumin,
želatina, stearat), če pa že, mora proizvajalec izhodnih surovin pisno jamčiti o
neoporečnosti surovin (certifikati).

Osnove farmacevtske biotehnologije

Osnove farmacevtske biotehnologije
Osnove farmacevtske biotehnologije
Osnove farmacevtske biotehnologije