Sintezni peptidi – biološke učinkovine?

Sintezni peptidi kot

biološke učinkovine
Tomaž Bratkovič

Peptidne učinkovine: pro et contra Razmah peptidnih učinkovin

visokospecifič
visokospecifične interakcije z endogenimi receptorji • razvoj sinteznih in bioloških peptidnih knjiž
knjižnic
praviloma visoka jakost • napredek tehnologij presejanja visokih zmogljivosti
nizka toksič
toksičnost • učinkovitejši sintezni pristopi
malo interakcij z drugimi uč
učinkovinami
• stanje danes:
- na tržišču več kot 40 peptidnih učinkovin
- ~180 učinkovin v kliničnih raziskavah
- več kot 400 učinkovin v predkliniki

neprimeren farmakokinetič
farmakokinetični profil
praviloma potrebna parenteralna aplikacija
zapletena in draga sinteza
potencialna imunogenost
 Biološke knjižnice peptidov
Tehnologija predstavitve na bakteriofagu
Peptidi kot učinkovine
Praviloma endogenim peptidnim hormonom
enake učinkovine ali njihovi analogi.
analogi
...inzulin, vazopresin, oksitocin, somatostatin, kalcitonin,
agonisti/antagonisti gonadoliberina, pramlintid...

Neposredna povezava
genotipa in fenotipa! Nekatere novejše peptidne učinkovine imajo
povsem nove strukture.
strukture
...enfuvirtid, bivalirudin, glatiramer, bortezomib...
afinitetna selekcija
posameznih bakteriofagnih
klonov

Priprava peptidnih učinkovin Zapletenost peptidov

• izolacija iz tkiv (obsoletno) peptid = linearen oligomer α-aminokislin
• tehnologija rekombinantne DNA Xaan, n < 100
• kemijska sinteza
osrednji predmet današnjega predavanja:
SINTEZNE PEPTIDNE UČINKOVINE
Zakaj sintezni peptidi?
Število potencialnih stereoizomerov oktapeptida:
• patentna zaščita postopka rekombinantnega pridobivanja,
• ekonomsko upravičeno pri krajših peptidih, 28 = 256 (brez upoštevanja morebitnih kiralnih
centrov v stranski verigi!!!)
• posebne strukturne zahteve (npr. C-amidacija),
• varnost...
Osnovni principi kemijske sinteze
Zaščitne skupine
peptidov
R2
OH druga (v reakcijo vstopajoč
vstopajoča) AK • Uporabljamo ortagonalne zaščitne skupine,
H2 N
skupine tj.
O
zaščita aminske skupine takšne, ki jih je mogoče odstraniti pod različnimi
R2 R1
pogoji.
Z2 OH OH prva AK
NH H2N
O O
• Ščitimo:
aktivacija karboksilne skupine zaščita karboksilne skupine
Me-/Et-
- α-karboksilno skupino prve AK [estri: Me- Et-, Bz-
Bz-, t-Bu-
Bu-estri]
estri
R2 R1 (↑ topnost peptida v organskih topilih, preprečena tvorba kislinskih
Z2 X O
NH H2N anhidridov v prisotnosti aktiviranih AK, selektivna aktivacija α-
Z1
O O
karboksilne skupine v reakcijo vstopajoče AK)
tvorba peptidne vezi
- α-aminsko skupino v reakcijo vstopajoče AK [karbamati: Z, BOC, BOC
O R1
NH
Fmoc]
Fmoc
O
Z2 NH Z1 (preprečeno vključevanje te bazične in nukleofilne skupine v reakcije)
R2 O

se lektivn a odstranitev zaščitne - potencialne reaktivne funkcionalne skupine v stranskih verigah

skupine z aminske skupine
(-COOH, -NH2, -SH, -OH, gvanidinska skupina)
R1
O (preprečena tvorba razvejanih ali cikličnih peptidov)
H2N O
NH Z1
R2 O

Dva načina kemijske sinteze Kondenzacija fragmentov

• Sinteza v raztopini Način priprave daljših sinteznih peptidov:
- klasičen pristop
- izolacija vmesnih produktov vsake sintezne stopnje ločena sinteza krajših peptidnih segmentov (v
- neomejena kapaciteta raztopini ali na trdnem nosilcu), nato združevanje
• Sinteza na trdnem nosilcu fragmentov v reakciji kondenzacije in odstranitev
- enostavno odstranjevanje nezreagiranih reagentov, zaščitnih skupin.
recikliranje
- izolacija vmesnih produktov sinteze ni potrebna
R2 O
- omejena kapaciteta polimerni nosilec O
NH
HN O

O R1

Robert Bruce Merrifield

Nobelova nagrada za kemijo 1984
 Kakovostne zahteve Okrnjen pregled
Vsaka odstopanja od želene strukturiranosti peptidnih učinkovin
peptidnih učinkovin
imajo za posledico zniž
znižanje ali izgubo biološ
biološke aktivnosti oz.
pridobitev toksič
toksičnih ali imunogenih karakteristik na račun • Vazopresini
spremenjene konformacije. • Oksitocini
↓ • Somatostatini
Kemijsko sintezo je potrebno voditi tako, da omejimo verjetnost • Kalcitonini
nastajanja než
neželenih analogov1, končni produkt pa izolirati • Analogi gonadoliberina
in temeljito preč
prečistiti2 ter dokazati ustreznost kemijske • Enfuvirtid
strukture3. • Pramlintid
1 kemijsko in optično čisti reagenti (analize: polarimetrija, Tm, HPLC, TLC, NMR, IR,
• Eptifibatid
MS), topila, katalizatorji in polimerni nosilci • Bivalirudin
2 odstranitev vseh nečistot (RP-HPLC)
3 AK-analiza, MS, določitev AK-zaporedja; peptidno kartiranje, NMR, disulfidne • Glatiramer
• Bortezomib Peptidne učinkovine praviloma apliciramo parenteralno!
povezave

Vazopresin Vazopresin
indikacije
• hipofizni nevrohormon; imenovan tudi AVP, antidiuretični hormon kranialni diabetes insipidus (poliurija in polidipsija zaradi pomanjkanja
(ADH) endogenega hormona)
• vazopresinski receptorji (GPCR) so dveh podtipov: alternativa kateholaminskim vazokonstriktorjem pri hipotenziji (npr. septični šok)
vazokonstriktorno
- V1 (tudi V1a) na GMC v žilnih stenah arteriol in kapilar (vazokonstriktorno Danes zaradi neprimernega PK-profila in multipotentnosti (neželeni učinki:
delovanje), angiozna bolečina, nevarnost miokardnega infarkta, hiponatremija,
zastrupitev z vodo, krčenje endometrija) uporaba pretežno opuščena.
antidiuretič
- V2 na endotelijskih celicah zbiralc/distalnega nefrona (antidiuretično
delovanje) in na žilnih endotelijskih celicah (prokoagulativno
prokoagulativno
delovanje – le v suprafizioloških odmerkih!) selektivni agonist receptorjev
antidiuretično,
V2, zato deluje antidiuretič no
dezmopresin nima pa vazokonstriktornega
delovanja; spodbuja tudi
sproščanje vWF in fVIII in tako
indikacije učinkuje prokoagulativno

kranialni diabetes insipidus

preprečavanje nočne enureze pri otrocih
von Willebrandova bolezen tipa I ter lažja oblika hemofilije A
Oksitocin Somatostatin
• hipofizni nevrohormon • peptidni mediator, udeležen v uravnavanje
• spodbuja krčenje GMC v steni maternice in alveolah mlečnih žlez sproščanja:
- rastnega hormona (⇒ GHIF),
GHIF tirotropina in
prolaktina iz adenohipofize,

- inzulina in glukagona iz endokrinih celic

trebušne slinavke,
- amilaze iz eksokrinega dela trebušne
slinavke,
- gastrina iz celic G v želodčni sluznici,
- kateholaminov in indolaminov v CŽS...
indikacije
sprožitev poroda (odsotnost
naravnih popadkov) spodbujanje dojenja

omejevanje poporodnih krvavitev preprečevanje mastitisa • povišano izražanje somatostatinskih receptorjev je značilno za številne
zaradi atonije maternice tumorske celice

Somatostatin Somatostatin
indikacija

• zapletena fiziologija: preprečevanje/omejevanje krvavitev iz ezofagealnih varic cirotičnih bolnikov

(nepoznan vazokonstriktrni mehanizem delovanja)
- ni klasičen hormon temveč parakrino delujoča signalna molekula,
- biosinteza poteka v večini tkiv, v največji meri pa v endokrinem delu
pankreasa, sluznici prebavil in centralnem ter perifernem
živčevju,
- poznamo dve obliki biološko aktivnega somatostatina
- znanih je pet podtipov somatostatinskih receptorjev (GPCR): sst1- somatostatin-
somatostatin-14
sst5, katerih pojavnost ni tkivno specifična; celo na isti celici so oktreotid
lahko različni receptorji sst

⇓ indikacije
Sistemska terapevtska uporaba GHIF in analogov je akromegalija
problematič
problematična. nekateri drugi tumorji lanreotid
(antiproliferativno
antiproliferativno delovanje)
delovanje
 Kalcitonin Kalcitonin
• ščitnični hormon • sintezni : rekombinantni *
• vzdržuje homeostazo kalcijevih ionov • humani, lososov in sintezni analog kalcitonina **

humani kalcitonin
indikacije

K lososov kalcitonin
osteoporoza

Pagetova bolezen
kosti (deformirajoči
karbokalcitonin
osteitis) (izključno sintezen)

hiperkalciemija
povezana z rakavimi
obolenji *..........razlike v profilu nečistot
metastazne bolečine **........razlike v imunogenosti, jakosti in t1/2

Analogi gonadoliberina Analogi gonadoliberina

• gonadoliberin je hipotalamusni peptidni nevrohormon • Agonisti gonadoliberina ob kontinuirani uporabi izzovejo
• izzove sintezo in sproščanje gonadotropinov LH/ICSH in FSH iz neodzivnost adenohipofize na endogeni gonadoliberin in tako so
adenohipofize njihovi končni učinki podobni antagonistom.
antagonistom

indikacije

paliativno zdravljenje tumorjev, odzivnih na

! steroidne spolne hormone (rak prostate, rak
dojke; antiproliferativno delovanje)
delovanje

endometrioza

prezgodnja puberteta

nadzorovana hiperstimulacija jajčnikov z

namenom superovulacije (+ rekombinantni
FSH in hCG) v okviru oploditve z
uravnavanje biomedicinsko pomočjo
menstrualnega cikla spermatogeneza
Analogi gonadoliberina
gonadoliberin
buserelin (agonist)
Enfuvirtid
• največja sintezna peptidna učinkovina (36 AK)
• strukturno posnema fragment ektodomene transmembranskega
glikoproteina gp41 virusa HIV-1
• zavira proces zlitja virusne ovojnice na gostiteljske celice (limfocite
CD4+)

goserelin (agonist)

abareliks (antagonist)

Pramlintid Pramlintid
• sintezni analog humanega amilina, peptidnega nevroendokrinega • endogeni amilin (IAPP, islet amyloid polypeptide) nastaja v β-celicah
hormona. Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in se v kri izloča skupaj z
• ne tvori potencialno toksičnih fibrilarnih agregatov (amilin fibrilizira) inzulinom

• sinergistično uravnavata plazemski nivo glukoze

• amilin deluje na CŽS (prehaja krvno-možgansko pregrado):
upočasnjuje praznjenje želodca ter tako zadržuje absorpcijo ogljikovih
hidratov ter izzove občutek sitosti
indikacija
kot remedium adiuvans pri inzulinskem zdravljenju diabetesa mellitusa
humani amilin pramlintid
 *
Eptifibatid Bivalirudin
* Nε-aminoiminometillizin
• “sintezni hirudin” - v strukturi združuje dva fragmenta hirudina:
• krajši sintezni fragment barburina, toksina iz strupa severnoameriške
a. segment, ki se veže v aktivno mesto trombina, in
klopotače Sistrurus miliarius barbouri
b. segment, ki interagira z oksianionsko luknjo trombina
• mimetik strukture fragmentov endogenih ligandov integrinskega
receptorja (vWF, fibrin ipd.): Arg-Gly-Asp a b
• antitrombotik, antagonist gpIIb/IIIa

indikacija

preprečevanje ishemičnih dogodkov a

pri bolnikih z akutnim koronarnim
sindromom oz. nestabilno angino
pektoris
b
(tudi pri pacientih, ki jim nameravajo
koronarno arterijo rekanalizirati s
postopkom perkutane transluminalne
koronarne angioplastike)

Bivalirudin Glatiramer
• visokospecifičen neposreden reverzibilen inhibitor trombina • zmes acetatnih soli sinteznih oligopeptidov povprečne molekulske
• terapija je vselej kombinirana z acetilsalicilno kislino (tudi antiintegrini) mase 4,7 – 11 kDa, z AK-sestavo
Tyr : Glu : Ala : Lys : = 1,0 : 1,5 : 4,5 : 3,6 (množinsko razmerje)
⇓ • dajemo ga subkutano – “terapevtska vakcinacija”
vakcinacija”
sinergističen učinek
indikacija
indikacija
zmanjševanje frekvence zagonov in
preprečevanje ishemičnih dogodkov upočasnjevanje napredovanja
pri bolnikih z akutnim koronarnim invalidnosti pri bolnikih z RRMS
sindromom oz. nestabilno angino
pektoris
• ob interferonih β edina učinkovina, ki spremeni potek bolezni pri
(tudi pri pacientih, ki jim nameravajo bolnikih z MS
koronarno arterijo rekanalizirati s
postopkom perkutane transluminalne
koronarne angioplastike)
Glatiramer Bortezomib
• posnema strukturo antigenov mielinskega bazičnega proteina (MBP): • sintezen dipeptid z boronskim analogom L-levcina
periferna senzibilizacija limfocitov T z “napačnimi” antigeni vodi v CŽS • učikuje kot visokoselektivni reverzibilni zaviralec kimotripsinu
ob kontaktu z MBP do sproščanja protivnetnih (Th2) citokinov podobne proteazne podenote proteasoma 20S
imunomodulatorno delovanje)
(imunomodulatorno delovanje

Bortezomib Sklepi
indikacija
Indikacijska področ
področja - trendi Mehanizem delovanja
agonisti
multipli mielom
antagonisti ali inhibitorji
PPI
⇑ sintezna cepiva
• mielomske celice imajo močno povišano aktivnost jedrskega dostavni sistemi
dejavnika NF-κB v primerjavi z normalnimi hemopoetskimi celicami
• proteasom je posredno odgovoren za aktivacijo NF-κB (prek
razgradnje njegovega zaviralca IκB)

[ NF-κB izzove transkripcijo številnih zaviralcev apoptoze ter celičnih adhezivnih proteinov ]