Informe - Uso Del Microscopio Compuesto y Coloracion de Bacterias - 2014

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 1
FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

2014

Ao de la promocin de la industria responsable y del desarrollo sostenible
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA
Facultad de Ingeniera Ambiental
INFORME DE LABORATORIO N 2 DE MICROBIOLOGA SANITARIA I
USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO - COLORACIN DE
BACTERIAS

PROFESOR: JORGE TELLO
ALUMNO:
CANDIOTTI PORTILLO GIUSSEPPI

LIMA 2014


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1. OBJETIVOS

Para el microscopio:
Aprender a utilizar el microscopio compuesto
Conocer las partes mecnicas y pticas del microscopio
Saber de los cuidados que se debe tener al manejar el microscopio
Para la coloracin de bacterias:
Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica.
Identificar el tipo de bacterias mediante el mtodo de tincin de Gram
Describir las caractersticas de las diferentes formas observadas

2. FUNDAMENTO TEORICO
MICROSCOPIO:
El microscopio, el instrumento ms peculiar del laboratorio de microbiologa, proporciona la
amplificacin gracias a la cual el hombre es capaz de ver organismos y estructuras que a simple
vista seria invisible. Se dispone de microscopios que permiten amplias escalas de aumento, desde
centenares hasta centenares de miles de dimetro. Se cuenta tambin con varios tipos de
microscopios y se han ideado muchas tcnicas por las cuales las muestras de microorganismos se
preparan para el examen con el mximo detalle. Cada tipo de microscopio y cada mtodo de
preparar las muestras ofrecen alguna ventaja precisa para demostrar algunos aspectos.
Los microscopios pertenecen a dos clases, el de luz (ptico) y el electrnico, segn el principio en
que se base la amplificacin. El microscopio mediante el cual la amplificacin se obtiene por un
sistema de lentes pticos (microscopios de luz) abarca los siguientes tipos:

El microscopio electrnico, como su nombre lo indica, se basa en un haz de electrones en lugar de
ondas luminosas para obtener la imagen en lugar de ondas luminosas para obtener la imagen
amplificada.


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Los estudiantes hacen casi la totalidad de sus exmenes, acaso todos, con el microscopio de
campo luminoso, el instrumento de uso ms comn para el trabajo diario. Los otros tipos de
microscopia se usan para propsitos especiales o trabajos de investigacin. Sin embargo, los
estudiantes conocen sus aplicaciones porque cada uno tiene propiedades convenientes para
demostrar estructuras morfolgicas especficas.
MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO
Un microscopio ptico es un instrumento que consiste bsicamente en un tubo con lentes de
aumento en ambos extremos.
El objeto a observar es atravesado con luz visible, que es refractada por las lentes del microscopio
y as se amplifica la imagen.
Permite visualizar estructuras pequeas, cuyas dimensiones son inferiores al lmite del poder de
resolucin del ojo humano.
Un microscopio ptico tiene dos caractersticas fundamentales:
1. la amplificacin (aumento)
2. el poder de resolucin, que a su vez depende de:
a. la calidad de las lentes
b. la longitud de onda de la luz que ilumina
Poder de resolucin es la capacidad de separar dos puntos muy prximos y dar de ellos imgenes
claras y definidas. El del ojo humano es de 100m y el de un microscopio ptico es de 0.24m.
En los microscopios pticos el material biolgico a examinar se observa por transparencia,
significa que la luz debe atravesar los tejidos para formar imgenes. La consecuencia de esto es
que se hace necesario estudiar:
- clulas aplanadas sobre la superficie de un vidrio o, - finos cortes de tejidos suficientemente
delgados como para ser atravesados por radiacin luminosa.
La gran mayora de los componentes celulares no tienen color debido al gran contenido de agua.
Esto plantea la necesidad del uso de colorantes selectivos, los cuales presentan a la vez la
dificultad de matar a las clulas, ya que previamente los tejidos deben ser fijados, deshidratados,
incluidos en un material endurecible y cortados.
Un microscopio ptico consta de una parte mecnica, una parte ptica y un sistema de
iluminacin:


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1) Parte mecnica:
Consta del pie, la columna o brazo, la platina, el tubo y los tornillos macromtrico y micromtrico.
El pie se encuentra en la base, suele tener forma
de herradura y en l descansa el resto del
microscopio.
La columna o brazo, ubicada sobre el pie, sirve
de soporte a los dems accesorios y debe tomarse
de la misma cuando se desea trasladar el
microscopio.
La platina, ubicada en la parte media, de forma
cuadrada o rectangular, soporta la preparacin y
presenta un orificio en el centro que permite el
paso de la luz; una pinza de sujecin para el
preparado y sobrepuesta a ella una platina
mecnica que permite mover la preparacin a
voluntad en dos direcciones (llamadas Norte-Sur y
Este-Oeste), mediante el movimiento de tornillos
ortogonales ubicados sobre la platina o
pendientes de ella. Estos tornillos pueden
funcionar independientemente o ser de comando
coaxial (estar sobre el mismo eje). La mayor parte
de las platinas presentan una escala y un nonio que facilitan la sealizacin de posiciones
determinadas en la preparacin. La escala presenta lneas marcadas a un milmetro de distancia. El
nonio es una escala corta que presenta 10 lneas divisorias que se corresponden con 9 divisiones
de la escala principal.
El tubo sostiene al sistema ptico. En su parte superior se ubican las lentes oculares que pueden
ser una (en los microscopios monoculares) o dos (en los microscopios binoculares). En su extremo
inferior se ubica el revlver, que es una placa giratoria que sostiene las lentes objetivos de
distintos aumentos que pueden cambiarse al girar el revlver.
Los tornillos macromtrico y micromtrico se utilizan para efectuar el enfoque movilizando el
tubo o la platina segn el tipo de microscopio. El primero efecta un ajuste rpido y grosero, y el
segundo realiza un ajuste lento y preciso. Ambos tornillos pueden estar separados o bien ser
coaxiales (dispuestos sobre un mismo eje).
2) Parte ptica:
Consta de las lentes oculares, los objetivos y el condensador.
- Objetivos:
Cada objetivo consiste en un conjunto de lentes que en realidad cumplen la funcin de una sola.
Este sistema sirve para corregir errores de observacin que derivaran del uso de una sola lente.


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En los microscopios modernos es comn que los objetivos sean parafocales, es decir, que si se
encuentra enfocado uno de ellos, al girar el revlver y cambiar por otro objetivo, ste resulta
prcticamente enfocado, siendo suficiente slo una ligera correccin con el micromtrico para
lograr el enfoque perfecto.
En cada objetivo se pueden observar una serie de numeraciones grabadas que indican:

a. Aumento
b. Abertura numrica
c. Espesor del cubreobjetos a utilizar,
en mm.

a. Aumento: puede ser variable (4X, 16X, 20X, 25X, 40X, 45X, 60X, 95X, 100X, estos dos ltimos se
utilizan como objetivos de inmersin). Respecto del aumento hay que diferenciar:
1) Aumento primario: es el dado por el objetivo en s.
2) Aumento total: es el que se obtiene multiplicando el aumento del ocular por el del objetivo.
Nos dice cuntas veces est amplificada la imagen que obtenemos del material examinado.
3) Aumento til: es el aumento total del microscopio cuando no excede de cierta cantidad
condicionada por la abertura numrica del objetivo. Significa que si el aumento total supera el
aumento til la imagen obtenida es muy grande, pero borrosa, sin definicin. En los objetivos
de tipo acromtico el mayor aumento til posible es de mil veces la abertura numrica (A.N. *
1.000), mientras que en los objetivos ms perfeccionados, como los apocromticos o los de
fluorita, el lmite de aumento til es de 1. 500 veces la abertura numrica (A.N. * 1.500).
b. Abertura Numrica (AN): cada objetivo tiene un determinado poder de resolucin que se mide
en trminos de abertura numrica del objetivo. Cuando un objeto es iluminado, la luz emerge de
l formando un cono que penetra en la lente frontal de un objetivo. Se lo denomina ngulo de
abertura; y a la mitad de este ngulo de abertura se lo llama ngulo x. El medio en el que el
objetivo trabaja (aire, aceite o agua) tiene un ndice de refraccin determinado al que designamos
como N. La abertura numrica se determina entonces del siguiente modo:


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La abertura numrica determina las siguientes caractersticas pticas:
1. Resolucin: es la capacidad que posee un objetivo para separar dos puntos muy prximos
entre s.

2. Lmite de resolucin: es la mnima distancia en que dos puntos prximos se ven como
separados.
Por lo tanto: a menor lmite de resolucin, mayor poder resolutivo
El lmite de resolucin se calcula del siguiente modo:

0.61 = constante
= longitud de onda de la luz incidente
A.N. = abertura numrica
Si se pretende poder observar estructuras muy pequeas se requiere el menor lmite de
resolucin posible. Deduciendo de la frmula esto se consigue a mayor abertura numrica y a
menor longitud de onda de la luz incidente.
- Oculares:
Es un sistema de lentes que aumenta la imagen producida en el objetivo, aumento que est
grabado en la parte superior (4X, 5X, 6X, 8X, 10X, 15X y 20X, siendo los ms comnmente usados
los de 6X y 10X).
- Condensador:
Es el tercer elemento de la parte ptica, constituido por una lente que concentra los rayos de luz
iluminando la preparacin en la parte enfocada por el objetivo, de modo que el campo visual
presente una iluminacin uniforme. Adems proporciona al objetivo un cono de luz adecuado en
tamao y naturaleza, para obtener ptimos resultados en la observacin.
El condensador presenta hacia uno o ambos lados un tornillo para subirlo o bajarlo segn las
necesidades. Adems presenta un diafragma semejante al de una cmara fotogrfica que deja
penetrar slo los rayos tiles y elimina los laterales que generalmente molestan.
Antes de enfocar, el diafragma debe estar completamente abierto, gradundose a continuacin
su abertura segn los aumentos del objetivo. Con altos aumentos el diafragma debe estar ms
abierto que con los bajos aumentos.


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3) Sistema de iluminacin:
Los microscopios ms antiguos presentan como sistema de iluminacin un espejo con una cara
plana y la otra cncava. Este espejo recibe los rayos luminosos de una fuente natural o artificial y
los enva hacia la parte ptica.
Siempre que se use el condensador, el espejo debe enfocarse en su cara plana ya que la cara
cncava acenta demasiado la convergencia de los rayos, cosa que ya cumple el condensador.
Actualmente los microscopios presentan un sistema de iluminacin incorporada con una bombilla
de bajo voltaje y de intensidad regulable con un transformador.
Tipos de observacin:
Segn la forma de iluminacin una observacin con un sistema ptico de aumento puede ser:
a. Por reflexin: se realiza cuando la iluminacin se hace desde arriba del objeto.
Se utilizan pocos aumentos y el microscopio con el que se efecta se denomina estereoscpico o
lupa.
b. Por refraccin o transparencia: se realizan con luz transmitida desde abajo. Para ello los objetos
a ver deben ser lo suficientemente transparentes. Este es el caso del microscopio ptico.
Por otro lado, una observacin tambin puede ser seca o por inmersin:
Observacin seca: se realiza sin colocar lquido alguno entre el cubreobjetos del preparado y el
objetivo.
Observacin por inmersin: en ella se coloca entre el cubreobjetos y el objetivo una gota de aceite
de inmersin (con ndice de refraccin de 1.5, que es el del vidrio) que mejora la imagen por
aumento de la abertura numrica. De este modo, todos los medios atravesados por la luz tienen
un mismo ndice de refraccin. La imagen obtenida es ms luminosa y ms clara. Para hacer
inmersin se utiliza el objetivo de mayor aumento (95X o 100X).
Tcnica de la inmersin:
Consiste en colocar una gota de aceite de inmersin entre el cubreobjetos y la lente frontal del
objetivo de mximo aumento. Para ello, teniendo ya enfocado el objeto en un aumento menor, se
gira levemente el revlver, se coloca una pequea gota de aceite sobre el cubreobjetos, luego se
sigue girando hasta enfocar el objetivo de mayor aumento y se procede al ajuste con tornillo
micromtrico.
Terminada la observacin se eleva el tubo o se baja la platina y se limpia el objetivo con papel de
seda o gnero suave que puede estar humedecido en un detergente especial para lentes.


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Nunca debe utilizarse para limpiar la lente alcohol ni xilol, ya que stos deterioran el cemento que
aglutina las lentes.
Dada la reducida distancia de trabajo que existe cuando se utilizan objetivos de 40X a 100X (que
llega a ser tan slo 0.12 mm) puede suceder que la lente frontal tome contacto con el
cubreobjetos con lo cual dicha lente puede rayarse o desplazarse hacia atrs. Por ello es necesario
evitar todo contacto entre el objetivo y el cubreobjetos. Para evitar estos peligros en la actualidad
estos objetivos cuentan con un muelle protector situado en el interior del tubo del objetivo. Sin
embargo se debe tener precaucin pues los microscopios antiguos no presentan este mecanismo
de seguridad.
MANEJO DEL MICROSCOPIO
Procedimiento
1. Levantar el tubo o bajar la platina.
2. Colocar la preparacin microscpica en la platina.
3. Colocar el objetivo de rastreo (menor aumento).
4. Bajar el tubo (o subir la platina), observando por el costado, (no por el ocular), hasta hacer tope
o bien hasta que la lente frontal del objetivo se encuentre ms o menos a 1 mm del cubreobjeto.
5. Regular la iluminacin:
a. Colocar la lmpara a unos 25 cm.
b. Usar el espejo plano y centrarlo mirando por el tubo hasta que el campo quede
uniformemente iluminado.
c. Abrir completamente el diafragma.
d. Subir del todo el condensador.
6. Centrar el objeto debajo del objetivo mirando por el costado.
7. Levantar el tubo con el tornillo macromtrico hasta lograr una observacin lo ms ntida
posible, posteriormente ajustar la misma con el tornillo micromtrico.
8. Ajustar la iluminacin:
a. bajando levemente el condensador.
b. cerrando el diafragma lo necesario.
9. Buscar el mejor lugar para observar (bordes).
10. Cambiar de objetivo, sin levantar el tubo, hasta obtener el aumento deseado.


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Tincin o coloracin de bacterias
Los microorganismos excepto las algas, son por lo general incoloros y muy ligeramente
refractantes por lo tanto son difciles de estudiar tal como se les encuentra en la naturaleza. Para
poder hacerlos visibles es necesario colorarlos o teirlas previamente antes de observarlos al
microscopio. La coloracin hace resaltar tambin algunas caractersticas morfolgicas que de otra
manera no son visibles por que las distintas partes de una clula tienen afinidad por diferentes
colorantes. Los colorantes ms comunes son aquellos derivados de la anilina como la fucsina,
violeta de gencia, azul de metileno y otros.
La coloracin se usa tambin para diferenciar a los organismos y parte de ellos que de otra manera
no son muy semejantes; el proceso se conoce entonces con el nombre de diferenciacin por
coloracin. La diferenciacin por coloracin se puede hacer empleando un tinte policromado en
cuyo caso algunos organismos o partes de un mismo organismo retienen un color mientras que
otro retiene otro color. Sin embargo la diferenciacin de bacterias por coloracin generalmente
depende de la habilidad de un organismo o parte de el de retener un colorante especifico despus
de que ha sido tratado con un agente decolorante. Los pasos fundamentales para hacer una
diferenciacin de bacterias por coloracin son:
a. Coloracin.
b. Decoloracin.
c. Contracoloracin.
Tipos de Tincin
Tincin Simple: Utiliza un solo colorante.
Tincin acidorresistente: Las bacterias acidorresistentes son las que retiene la carbolficsina, aun
cuando intente descolorarlas con una mezcla de alcohol y cido clorhdrico. Las bacterias
acidorresistentes se tien de color rojo; el resto adquiere el color del colorante de contraste en
este caso el verde o azul.
Tincin negativa: Este procedimiento consiste en la tincin de fondo con un colorante cido para
dejar las clulas incoloras en contraste. Comnmente se utiliza el colorante negro llamado
nigrusna. El mtodo sirve para observar bacterias o estructuras que difcilmente se tien con las
tcnicas directas.
Tincin de los flagelos: Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser visibles en el
microscopio de luz. Sin embargo si se tratan con una suspensin coloidal inestable de sales de
cidos tnico para formar un precipitado denso en la pared celular y en los flagelos, se pueden
poner de manifiesto su presencia y disposicin en las clulas. De esta manera el dimetro
aparenta que la estructura aumento de tamao con fuscina bsica los hace visibles en el
microscopio ptico.


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Tincin de la cpsula: La cpsula se pone de manifiesto mediante una coloracin negativa o una
modificacin de esta. Uno de los mtodos de tincin de la cpsula incluye el tratamiento de las
bacterias con un solucin caliente de cristal violeta seguido por un lavado con una solucin de
sulfato de cobre. El sulfato de cobre tambin imparte color al fondo y esto resulta en que la clula
y el fondo aparezcan teido en color azul oscuro mientras la cpsula aparece de color azul plido.
Tincin del ncleo: Los ncleos se pueden teir por la tincin de Feulgen la cual es especfica para
el ADN.
Tincin de las esporas: Las esporas se observan de la manera ms simple como cuerpos
refringentes intracelulares en suspensiones de bacterias sin teir, la parte de las esporas
relativamente impermeable, las esporas comnmente se tien con verde de malaquita y
carbolfucsina o carbolfucsina
Tincin de Giensa: El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de
protozoos en la sangre para observar materias ncleos de las clulas.

Tincin Gram
Tipo de coloracin de las bacterias que constituyen un carcter sistemtico; segn tomen o no
color, aplicando este mtodo, se distinguen los grupos Gram positivos y Gram negativos.
La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa
para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo
dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la
diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan
de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.
La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta tcnica
diferencial es una de las de uso ms comn en microbiologa. El frote bacteriano teido se somete
a las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal violeta, alcohol y safranina o alguna
otra solucin de contraste conveniente.


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DIFERENCIAS MOLECULARES ENTRE UNA BACTERIA GRAN POSITIVA Y OTRA GRAN NEGATIVA.
BACTERIAS GRAM POSITIVAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Poseen una pared celular interna y una pared de
peptidoglucano.
*Peptidoglucano: es un exoesqueleto que da
consistencia y forma esencial para replicacin y
supervivencia de la bacteria.
Poseen una pared celular ms compleja:
-pared celular interna
-pared de peptidoglucano
- bicapa lipdica externa
No tiene membrana externa Membrana externa: forma un saco rgido alrededor
de la bacteria, mantiene estructura y es barrera
impermeable a macromolculas, ofrece proteccin
en condiciones adversas

No tiene espacio periplasmtico
Espacio periplasmtico: espacio entre la superficie
externa de la membrana citoplasmtica y la interna
de la membrana externa.
La red de murena est muy desarrollada y llega a
tener hasta 40 capas
La red de murena presenta una sola capa
La penicilina mata a las gram positivas, ya que
bloquea la formacin de enlaces peptdicos entre las
diferentes cadenas del peptidoglucano
La penicilina no mata a las Gram negativas, a causa
de la capa de lipopolisacridos situada en la parte
externa de la pared celular.

No contiene LPS
Contiene LPS: estimulador de respuestas inmunes:
activa clulas B, liberacin de IL, FNT, IL 6 por
macrfagos.
En la tincin de Gram, retienen la tincin azul Quedan decoloradas.

Conservan el complejo yodocolorante

Pierden el complejo yodocolorante

Son esporulantes y no esporulantes, como
Streptococcus, Cisteria, Frankia.

Pueden ser anaerobios o aerobios
Poseen otros componentes: cidos teicoicos y
lipoteicoicos, y polisacridos complejos.
Poseen protenas con concentraciones elevadas.


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Causas que alteran la tincin de Gram
Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibiticos.
Bacterias resistentes a la tincin Gram
Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva, tien como gram negativas:
Mycobacterias (estn encapsuladas).
Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (prdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).

Caractersticas de la clula bacteriana
COCO
Proviene del griego kkkos, lo que se traduce
como grano, es de forma esfrica. Estas se
clasifican en:
-Diplococo: Cocos en grupos de dos.
-Tetracoco: Cocos en grupos de cuatro.
-Estreptococo: Cocos en cadenas.
-Estafilococo: Cocos en agrupaciones irregulares o
en racimo.

BACILO
Proviene del latn baculus, lo que significa varilla,
tienen forma de bastoncillo.


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FORMAS HELICOIDALES
-Vibrio: ligeramente curvados y en forma de
coma, juda o cacahuete.
-Espirilo: en forma helicoidal rgida o en forma
de tirabuzn.
-Espiroqueta: en forma de tirabuzn (helicoidal
flexible)

3. METODOLOGA

3.1 . Procedimientos utilizados en el microscopio

Debes colocar tus microscopios en una mesa fija, de modo tal que puedas sentarte con
comodidad para ver el ocular sin estirarte o apoyarte. trata que la mesa sea lo
suficientemente grande como para colocar sobre ella todo el material que necesites para
trabajar. El objeto que se desea examinar debe colocarse en un portaobjetos, que se una
lamina de vidrio de 1mm d espesor y a continuacin se cubre con un cubreobjetos, un
cuadrado de 2cm de lado o un circulo con esa medida de dimetro.

La distancia del microscopio al filo de la mesa no debe ser menor a 15 cm. Adems de
limpiar los oculares, objetivos, condensador y espejo para una mejor visualizacin en el
microscopio.

Practica hasta que tengas la certeza de saber para qu lado debes mover el macrmetro,
para hacer subir o bajar las lentes. Para comenzar, seleccione siempre la lente de menor
aumento que te permite ver mejor el objeto y encontrar fcilmente la parte que ms te
interesa observar.

Coloca el portaobjetos sobre la platina de manera tal que la parte que quieres observar se
encuentre bajo la lente. Utiliza los broches para fijar el portaobjetos en su sitio. Observa
desde un costado la platina y mueve la perilla de enfoque para acercar la lente .Luego mira
a travs del microscopio y sube las lentes girando el micrmetro hasta que el objeto entre
en foco y su imagen se vuelva ntida y clara.


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3.2 . Procedimientos utilizados en la coloracin de bacterias.

Usar portaobjetos limpios y pasarla varias veces cortando la llama del mechero.
Dejar enfriar el portaobjetos y colocar una gotita de agua destilada con el inoculador
esterilizado.
Con el inoculador estril, tocar ligeramente el cultivo que ha de ser examinado (cultivos de
18-42 h) y transferir un poco de l sobre la gotita de agua en el portaobjetos.
Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo hasta la parte central del portaobjetos,
cuidado que se forme una pelcula muy delgada.
Fijar el extendido sobre el portaobjeto pasndola sobre la llama del mechero 3 veces.
Dejar enfriar.
Cubrir la pelcula con el colorante cristal violeta (gram #1) y dejar cubierto por espacio de
1-2 minutos
Lavar con agua hasta retirar el exceso.
Se aade solucin Lugol (gram #2) u se deja reposar durante 1 minuto.
Decolorarla con alcohol-acetona (gram #3) durante 5 a 15 segundos.
Lavar la lmina con agua.
Se tie con safranina (gran #4) por un espacio de 20-30 segundos.
Lavar la lmina con agua durante 2 segundos
Dejar secar o secar con papel
Aadir una gota de aceite a la lmina para poder examinar con el microscopio utilizando el
objetivo de 97x de inmersin.

4. RESULTADOS Y/O OBSERVACIONES:

Uso del microscopio compuesto:
ALGAS: Aumento ---- 10x10x Aumento ----10x43x


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HILOS: Aumento -----10X10X Aumento ------- 10X43X

CEBOLLA: Aumento ------ 10X10X Aumento -------- 10X43X

ESPORAS DE HONGOS:

OBSERVACION:
AUMENTO:
10X10X: plomos, circulares y
alargadas
10X43X: plomas, circulares
10X97X: Nada

LETRA E: Aumento -------10x10x


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Coloracin de bacterias:

Grupo N1 AGRUPACION GRAM
CARACTERISTICAS DE
CRECIMIENTO
OBSERVACION
PLACA N 4 ____ ____
Lobulado, plana,
crema y opaco
No se pudieron
visualizar en el
microscopio
HUELLA DIGITAL ____ ____
Entero, plana,
crema y opaco

CARACTERISTICAS DE
CRECIMIENTO
OBSERVACION
FOTOCOPIADORA ____ ____
Entero, plana,
crema y opaco
No se pudo visualizar
en el microscopio
HUELLA DIGITAL Estafilococos
Gram
Negativo
Entero, plana,
crema y opaco
Se realiz con el
microscopio del
grupo N 2

CARACTERISTICAS DE
CRECIMIENTO
OBSERVACION
LAB.
MICROBIOLOGIA
Estreptobacilos
Gram
Negativo
Entero, plana,
crema y opaco
Se visualiz con el
microscopio del
grupo N 2
PLACA N 4 Estafilococos
Gram
Negativo
Lobulado, plana,
crema y opaco
CARACTERISTICAS DE
CRECIMIENTO
OBSERVACION
HUELLA DIGITAL ____ ____
Entero, plana,
crema y opaco
en el microscopio
FOTOCOPIADORA Estafilococos
Gram
Negativo
Entero, plana,
crema y opaco
se realiz la medicin
con aumento
de 97x10x
TUBO N 3 Diplobacilos
Gram
Negativo
Pelcula


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Grupo N 5 AGRUPACION GRAM
CARACTERISTICAS DE
CRECIMIENTO
OBSERVACION
HUELLA DIGITAL Estreptobacilos
Gram
Positiva
Entero, plana,
crema y opaco
Se realiz con el
microscopio del
grupo N 2
TUBO N 3 ____ ____ Pelcula
en el microscopio

5. DISCUSIONES:
La letra e se visualiz invertida a travs del microscopio.
Se pudo observar la pared celular de la cebolla.
En la muestra de las algas de pudieron observar los filamentos.
En el grupo N 1 no se pudo observar las bacterias con la coloracin de gram
debido a una mala manipulacin del microscopio.
En el grupo N 2 si se pudo observar las bacterias y fueron gram negativas en
agrupaciones de Estafilococos y Diplobacilos hallados en las muestras de
fotocopiadora y tubo N3 respectivamente.
En los dems grupos no se pudo observar el los microscopios propios de estos y se
pidi la ayuda del grupo N 2 para la visualizacin.
En el grupo N3 se hall estafilococos gram negativo en la muestra de la huella
digital.
En el grupo N4 se observ Estreptobacilos y estafilococos gram negativos en las
muestras del lab. microbiologa y placa N 4 respectivamente.


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En el grupo N5 se visualiz bacterias gram positivas agrupadas en Estreptobacilos
hallada en la muestra de la huella digital.

6. CONCLUSIONES

Si bien la manipulacin del microscopio es sencilla necesita del debido cuidado y la
prctica necesaria para lograr un verdadero adiestramiento.
La muestra de la letra e se vio invertida debido a una de las caracterstica del
microscopio compuesto.
No siempre ser posible visualizar la muestra con todos los objetivos debido a la
potencia de aumento.

La diferencia entre los colores obtenidos de las bacterias Gram. Se basa en las
diferencias que existen entre sus paredes celulares y su resistencia a la decoloracin,
la membrana externa Gram negativa es soluble al alcohol /acetona, la delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el cristal violeta y la clula se decolora. Al
contrario de la Gram positivas que posee una pared celular ms resistente y con
mayor proporcin de peptidoglicano , los cuales no son permeables al alcohol/cetona,
sino que este acta deshidratando los poros cerrndolo, atrapando el cristal violeta y
la clula se decolora. Al contrario de la Gram positivas que posee una pared celular
ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicano, los cuales no son
permeables al alcohol/cetona, sino que este acta deshidratando los poros
cerrndolo, atrapando el cristal violeta y manteniendo la coloracin azul.

La mayor parte de las colonias analizadas resultaron agrupaciones de los cocos, los
cuales pueden causar afecciones respiratorias y algunos procesos severos como la
meningitis.

Comparando los resultados concluimos que la mayora de las bacterias estudiadas
eran Gram negativo.
Luego de conocer la morfologa de las bacterias podemos reconocerlas.

7. RECOMENDACIONES :

Se debe tener cuidado al momento de pasar el portaobjetos en el mechero y evitar
quemaduras o rupturas del material, adems de la conservacin de las colonias.

Se debe tener en cuenta la edad de las bacterias as como la debida esterilizacin de los
instrumentos.


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Hacer un adecuado uso del microscopio al observar los colores de las bacterias.

Tener en cuenta la limpieza para disminuir el crecimiento de las bacterias y as evitar
algunas enfermedades que causan estas.

Siempre debemos trasladar el microscopio, agarrndolo con las dos manos una de ellas en
el brazo, y la otra con la palma hacia arriba sosteniendo la base o pie.

Los tornillos (macromtrico y micromtrico) y el revlver deben moverse siempre con
cuidado y sin apresuramiento, para evitar que los lentes se rompan o rayen.

Al acercar la lente del objetivo a la preparacin, debemos mirar directamente y no a travs del
ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar
alguno de ellos o ambos.

Debemos utilizar una gota de aceite para realizar la observacin con el objetivo de inmersin
97X.

Para limpiar la lente debe usarse solo papel lente. Puesto que otro material puede rayarlo.

Ningn lquido debe mojar pieza alguna del microscopio. Las lminas que se colocan en la
platina debern estar siempre secas.

8. BIBLIOGRAFA

Pelczar Michael J. Microbiologa, editorial McGraw Hill cuarta edicin, Mxico 1982.
(Microscopio Tincin de Gram)
Biologa de los microorganismos Brock- Michael T. Madigan (Estructura y funcin celular-
Microscopio)
http://www.maristasourense.com/extras/materias/bioloxia/Microscopio.PDF
http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-
pdf/biologia2010/Apuntes%20Te%F3ricos%202010/Microscop%EDa%202010.pdf
http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-y-gram.html
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo4_4.htm


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9. CUESTIONARIO:
1. Explique las funciones de las siguientes partes del microscopio:

a) Diagrama: Est formado por un conjunto de laminillas que dejan un orificio en
su centro. El dimetro del orificio puede ser variado mediante una palanca, con lo
que se regula la cantidad de luz que llega a la preparacin.
b) Condensador: Es un sistema de lentes situado debajo de la platina que
concentra la luz sobre la preparacin, consiguindose as una iluminacin ms
intensa.
c) Objetivos: Representan el componente ptico ms importante del microscopio.
Su principal funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y
proyectar una imagen ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del
microscopio (Lente situada cerca de la preparacin). Si se utiliza el aumento 100x
es necesario agregar a la preparacin aceite de inmersin, cuya funcin es evitar
la dispersin de los rayos luminosos.

2. Explique el fundamento de las siguientes clases de microscopio.
a) Microscopio de campo oscuro: El efecto producido por la tcnica del campo
oscuro cosiste en un fondo negro sobre el cual se ven los objetos intensamente
iluminados. La nica luz que es capaz de entrar en el objetivo es la que es
dispersada por la muestra, por lo tanto, los microorganismos se observan
brillantes sobre un fondo oscuro. La resolucin de los microscopios de campo
oscuro es bastante alta y pueden observarse en ellos objetos difcilmente
percibidos por microscopia de campo claro o de contraste de fases. La microscopia
de campo oscuro tambin es un mtodo excelente para observar la movilidad en
los microorganismos, ya que permite resolver los penachos de flagelos mediante
esta tcnica y tambin en el examen de microorganismos sin teir suspensos en
lquido.
b) Microscopio de fluorescencia: Se utiliza para visualizar muestras capaces de
emitir fluorescencia; es decir, capaces de emitir una determinada longitud de onda
cuando previamente ha incidido sobre ellas una luz de menor longitud de onda
(luz ultravioleta). La fluorescencia puede ser debida a que determinadas clulas
posean sustancias fluorescentes naturales como la clorofila u otros componentes
fluorescentes o por hacer sido previamente tratas con un colorante fluorescente.
La microscopia de fluorescencia se usa habitualmente en diagnsticos
microbiolgicos as como en ecologa microbiana y tambin en la tcnica de
anticuerpos fluorescentes o inmunofluorescencia, que se utiliza para identificar las
clulas individuales que reaccionan con el anticuerpo.


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c) Microscopio de contraste de fase: La microscopia de contraste de fase es de
un valor incalculable para el estudio de las clulas vivas y de amplio uso en
estudios biolgicos aplicados y especulativos. La muestra se ilumina de manera
controlada por medio de objetivos especiales de contraste de fase y un
condensador ensamblado a un microscopio de luz ordinaria.
El sistema ptico especial de que est provisto el microscopio de contraste de fase
hace posible distinguir estructuras que solo difieren ligeramente en cuanto a sus
ndices de refraccin. Por ejemplo, las estructuras o unidades dentro de una
clula, son ndices de refraccin similares y, por lo tanto, no discernibles por el
microscopio de luz, se distinguen con el microscopio de contraste de fase.
La luz que atraviesa un material y pasa a otro de una densidad ligeramente
diferente sufre una desviacin, o es refractada. El microscopio de campo luminoso
no hace visible estas ligeras variaciones en la densidad o ndice de refraccin, si
bien se producen irregularidades mnimas e las ondas frontales que atraviesan el
material. El dispositivo de contraste de fase transforma las irregularidades en las
variaciones correspondientes en la brillantez. Este sistema de iluminacin
controlada hace posible distinguir detalles estructurales que varan muy
ligeramente en su densidad o ndice de refraccin. Pone de manifiesto diferencias
en las clulas y en sus estructuras no discernibles por otros mtodos.

d) Microscopio electrnico: La microscopia electrnica difiere en muchos
aspectos de las tcnicas descritas en relacin con la microscopia ptica. El
microscopio electrnico tiene la ventaja de su extraordinaria amplificacin, con un
poder de resolucin 100 veces mayor que el del microscopio ptico por la gran
cortedad de longitud de onda del haz electrnico usado para ampliar el espcimen
(es posible distinguir objetos tan pequeos como de 10 A). El microscopio
electrnico se vale de ondas de electrones y campos magnticos para producir la
imagen, mientras que el microscopio de luz hace uso de ondas luminosas y lentes
de vidrio. En microscopia electrnica, el espcimen que se va a examinar se
prepara como una pelcula muy fina y seca sobre pantallas pequeas y se
introduce en el instrumento en un punto situado entre el condensador magntico
y el objetivo magntico, comparable a la platina del microscopio de luz. La imagen
ampliada se ve en una pantalla fluorescente por una ventana a prueba de aire o se
registra en una placa fotogrfica por una cmara introducida en el instrumento.
3. Defina las siguientes propiedades de los lentes:
3.1. Apertura Numrica (AN): El ngulo determinado por el eje ptico y los rayos
ms externos que aun capta el objetivo es una medida de la apertura del objetivo;
es la mitad del ngulo de apertura. La magnitud de este ngulo se expresa como un
valor seno. El valor seno de la mitad del ngulo de apertura se multiplica por el
ndice de refraccin n del medio que llena el espacio entre el cubreobjetos y el
objetivo, da la apertura numrica: AN =n*sen. Capacidad de captacin de la luz por
la lente.


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3.2. Poder de resolucin: Es una funcin de la longitud de onda de la luz utilizada y
de una caracterstica propia de las lentes denominada apertura numrica. En
general, hay una correlacin entre la capacidad de aumento de una lente y su
apertura numrica: las lentes de mayor aumento poseen generalmente mayores
aperturas numricas. Es la capacidad que posee un microscopio para separar dos
puntos muy prximos entre s.

3.3. Ejemplo:
Supongamos que se utiliza un filtro verde con una longitud de onda luminosa
=0.55m, un objetivo de inmersin con un AN de 1.25 y el condensador con un AN
de 0.9. Hallando el poder de resolucin:

Un poder de resolucin de 0.255 m significa que si dos puntos estn separados
menos de 0.255 m aparecern como un solo punto. Deben de estar separados
ms de 0.255 m para aparecer como dos objetos distintos.
4. Explique el fundamento de la coloracin de Gram.
Las diferencias estructurales entre las paredes celulares de la bacteria Gram positivas y
Gram negativas son las responsables del diferente comportamiento de las clulas a la
tincin de Gram. En dicha tincin, se forma dentro de las clulas un complejo cristal
insoluble violeta-yodo que en el caso de las Gram negativas puede extraerse con alcohol,
pero no en las Gram positivas, que poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas
de peptidoglicano. Esto provoca el cierre de los poros de las paredes impidiendo la salida
del complejo cristal violeta-yodo. En las bacterias Gram negativas, el alcohol penetra
rpidamente en la capa externa que es rica en lpidos y la fina capa de peptidoglicano no
impide el paso del solvente, por lo que el complejo se extrae fcilmente.

Gram positivas

Gram negativas


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5. Mencione enfermedades producidas por bacilos Gram negativos,
bacilos Gram positivos, cocos Gram negativos y cocos Gram positivos.

Cocos Gram positivos. Enfermedad
Staphylococcus aureus Abscesos, endocarditis, gastroenteritis, dermatitis
exfoliativa estafiloccica.

Streptococcus Pyogenes Faringitis, celulitis, fiebre reumtica, mionecrosis
Streptococcus Agalactiae Meningitis Neonatal, Sepsis, Endometritis,
Neumonia.
Streptococcus Faecalis Infecciones de vias urinarias y biliares,
Bacteriemia, Endocarditis.
Streptococcus Pneumoniae Neumonia, Meningitis, Peritonitis, Otitis media,
Sinusitis

Cocos Gram negativos. Enfermedad
Neisseria meningitides Meningitis y meningococemia
(Diplococo)
Neisseria gonorrhoeae Gonorrea
(Diplococo)
Bacilos Gram positivos. Enfermedad
Bacillus antracis ntrax pulmonar y cutneo.
Clostridium tetani Ttanos
Clostridium botullinum Botulismo clsico-Botulismo infantil
Clostridium perfringens Gangrena gaseosa, Enteritis necrosarte
Corynebacterium Difteria
Bacilos Gram negativos. Enfermedad
Escherichia coli Diarrea
Salmonella Typhi Fiebre tifoidea
Salmonella enteritidis Enterocolitis
Vibrio cholerae Clera
klebsiella pneumoniae Enfermedad pulmonar crnica Neumona
Pseudomonas aeruginosa Infeccin de heridas en especial de quemadura
Haemophilus influenzae Bronconeumona
Bordetella pertussis Tosferina
Brucella. Brucelosis
B. Abortus.
B. Suis
B. Melitensis
Francisella tularensis Tularemia


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6. Defina las siguientes estructuras bacterianas:
A. Pared Celular: Se encuentran dentro de la capsula y fuera de la membrana
que est en contacto con el citoplasma. La pared celular tiene una gran rigidez que
se demuestra fcilmente sometiendo a bacterias de formas diferentes a
condiciones fsicas extremas como presiones osmticas muy altas o muy bajas, o
temperaturas inferiores a la de congelacin seguidas de descongelacin; las
bacterias conservan su forma original. Son necesarias tcnicas muy fuertes para
romper las paredes celulares de muchas bacterias. La pared celular constituye una
porcin apreciable del peso seco total de la clula; dependiendo de la especie. Las
paredes celulares bacterianas parecen ser esenciales para el desarrollo y divisin
de bacterias, porque a las bacterias a las que se le ha despojado selectivamente de
la pared, es decir, los protoplastos son incapaces de un desarrollo y divisin
normales.

B. Membrana citoplasmtica: Inmediatamente por dentro de la pared celular
se encuentra una membrana fina llamada membrana citoplsmica. Este dato fue
obtenido debido a tcnicas especiales como coloraciones selectivas y microscopia
electrnica. La membrana citoplsmica es una estructura de extrema importancia
funcional. Es una membrana semipermeable selectiva que regula el paso de
nutrientes y productos de desecho dentro y fuera de la clula, logro notable si se
considera que la clula microscpica flota en un medio qumico heterogneo y en
extremo complejo, donde es capaz de tomar y retener lo necesario para la vida y
descargar el exceso o los productos de desecho. Tambin se localizan varias
enzimas que sintetizan lquidos complejos, as como componentes de la pared
celular y enzimas que intervienen en el transporte de electrones y en la
fosforilacion oxidativa.

C. Ribosomas: El ribosoma es un orgnulo pequeo formado por ARN y protenas
cuya funcin es colaborar en la traduccin, una etapa de la sntesis de protenas.

7. Cmo afecta la edad de cultivo a la coloracin Gram?
Si bien los organismos gram negativos son constantes en cuanto a su reaccin al gram, en
ciertas circunstancias los organismos gram positivos muestran variacin en la respuesta.
Cultivos viejos de algunas bacterias gram positivas pierden la facultad de retener el cristal
violeta y se tie con la safranina. Un efecto similar es a veces debido a cambios en el
medio o a pequeas modificaciones en la tcnica de tincin. As, es necesario apegarse a
los procedimientos establecidos.


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10. ANEXO:

PARED CELULAR DE LOS PROCARIOTAS:

Las bacterias se dividen en dos grandes grupos: las gram positivas y las gram negativas. La
distincin inicial entre estos dos tipos se llev a cabo mediante una tincin diferencial
denominada Tincin de Gram; pero la diferente reaccin a la tincin de gram se basa en
las diferencias que existen en la estructura de las paredes celulares. La morfologa de las
paredes celulares es muy distinta en las clulas gram positivas y negativas. La pared celular
en las gram negativas est compuesta por varias capas y es bastante compleja, mientras
que en la pared en las gram positivas est formada fundamentalmente por un solo tipo de
molculas y suele ser ms ancha. Un examen detallado mediante microscopa electrnica
de barrido permite detectar diferencias claras en la textura de la superficie de los dos tipos
de paredes celulares.

Peptidoglicano:

En la pared celular de bacteria hay una capa rgida que es la responsable de la resistencia
de la pared celular. En bacteria gram negativas existen capas adicionales que se sitan en
el exterior de esta. Esta capa rgida tiene una composicin qumica muy similar tanto en
bacteria gram positivas como en gram negativas. Se denomina capa de peptidoglicano,
esta constituido por una lmina en la que las cadenas de derivados de azucares se
conectan entre s por puentes peptdicos a travs de los aminocidos.
En batera gram positivas, el peptidoglicano representa hasta el 90% de la pared, aunque
otra clase de componentes, los cidos teicoicos, tambin suelen estar presentes en
pequeas cantidades. Aunque algunas bacterias poseen solo una capa de peptidoglicano
rodeando a la clula, muchas otras, en especial las bacteria gram positivas, presentan
varias capas. En bacteria gram negativas, el peptidoglicano constituye solo alrededor del
10% de pared, estando constituido el resto por una membrana externa. Sin embargo,
tanto en gram positivas como en gram negativas se cree que la forma de las bacterias
viene determinada por la longitud de las cadenas peptidoglicano y por el nmero y tipo de
puentes establecidos entre las cadenas.
Diagrama esquemtico de paredes celulares Gram positivas y Gram negativas.

Informe - Uso Del Microscopio Compuesto y Coloracion de Bacterias - 2014

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