UEZO - CENTRO UNIVERSITRIO ESTADUAL DA ZONA OESTE

CENTRO SETORIAL DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE

CARACTERIZAO DA INTERAO DE Trichomonas
vaginalis COM Bacteroides fragilis

Pedro Souto Rodrigues


Rio de Janeiro
2013





PEDRO SOUTO RODRIGUES
Aluno do Curso de Tecnologia em Biotecnologia
Matrcula 1021327669


CARACTERIZAO DA INTERAO DE Trichomonas
vaginalis COM Bacteroides fragilis


Trabalho de Concluso de Curso, TCC,
apresentado ao Curso de Graduao em
Tecnologia em Biotecnologia, da UEZO
como parte dos requisitos para a obteno
do Grau de Tecnologia em Biotecnologia,
sob a orientao da Prof. Dr. Jessica
Manya Bittencourt Dias Vieira



Rio de Janeiro
2013


ii


CARACTERIZAO DA INTERAO DE Trichomonas
vaginalis COM Bacteroides fragilis

Elaborado por Pedro Souto Rodrigues
Aluno do Curso Tecnologia em Biotecnologia da UEZO

Este trabalho de Graduao foi analisado e aprovado com
Grau: Dez (10)

Rio de Janeiro, 20 de dezembro de 2013.



Prof. Dr. Fabio da Silva de Azevedo Fortes

MSc. Thiago Alves Teixeira dos Santos

Prof. Dr. Jessica Manya Bittencourt Dias Vieira
Presidente


RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL
2013



iii

























Aos meus pais, a quem espero orgulhar ao chegar ao final
de mais uma etapa da vida, dedico minha maior vitria.




iv


AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, que escrevendo certo por linhas tortas me guiou at
aqui.
A meus pais, Pedro e Aristia, pela confiana que sempre depositaram em
mim, e por sempre acreditarem no meu potencial e me impulsionarem nas
conquistas de todas as minhas vitrias.
Ao meu irmo, Daniel, pelas dicas no ingls e pela amizade.
A John (in memorian), meu grande amigo que se foi muito cedo. Com voc
aqui tenho certeza que toda essa jornada teria sido muito mais divertida.
Saudades eternas.
A minha namorada, Amanda, por todo amor, carinho, dedicao e
compreenso.
A Loyze, por sempre me ajudar com os experimentos e me apoiar nos
momentos difceis em que as coisas davam errado.
A todos os colegas do LTBM, que sempre faziam os dias serem divertidos
e prazerosos.
A professora Jessica, quem me orientou e me ajudou na construo deste
trabalho.
Ao professor Sergio Seabra, que sem o qual a realizao desse trabalho
no teria sido possvel e que sempre me ajudou em todos os aspectos.




v

























Que os vossos esforos desafiem as
impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes
coisas do homem foram conquistadas do que
parecia impossvel.
Charles Chaplin


vi

RESUMO

O gnero Bacteroides formado por bastonetes gram-negativos, anaerbios
estritos, resistentes a bile, mveis ou no e no formadores de esporos. Suas
espcies so frequentemente encontradas nas membranas mucosas, inclusive do
trato genital feminino, agindo como agentes em vrios stios de infeces. As
infeces anaerbias so frequentemente polimicrobianas e endgenas.
Trichomonas vaginalis, por sua vez, um parasita flagelado anaerbio facultativo
com distribuio cosmopolita e o agente etiolgico da tricomonase, a doena
sexualmente transmitida no-viral mais comum em humanos. Para persistncia
da infecco, esse parasito possui um mecanimo de fagocitar outros
microrganismos, mas esse processo no totalmente elucidado. Nesse estudo,
fizemos uso de trofozotos de T. vaginalis e a espcie Bacteroides fragilis, por B.
fragilis ser considerada, clinicamente, a mais importante no gnero, uma vez que
a bactria mais comumente isolada de processos de infeco endogenas,
sendo frequentemente associada a infeces gastrointestinais, respiratrias e
infeces no trato genital feminino. Ns realizamos a interao parasito-bacteria
nas propores de 1:10, 1:50 e 1:100 em perodos entre 1 e 12 horas e testes de
viabilidade foram aplicados. Esses dados foram analizados para comparar o
crescimento do patgeno in vitro, na presena e na ausncia de B. fragilis. Os
resultados indicaram que na proporo de 1:100, alteraes na ultraestrutura
foram notadas a partir de 6 horas. Alm disso, foi observado que depois de 8
horas de interao, a viabilidade de T. vaginalis decai, e aps 12 horas de
interao, no se encontra mais trofozotos viveis. Esses dados sugerem que o
parasito suporta B. fragilis em curtos perodos de interao e que nesse tempo,
no h qualquer variao na proliferao do parasito. No decorrer da interao,
os trofozotos colapsam, indicando que B. fragilis talvez produza metablitos
txicos contra a atividade de T. vaginalis.
Palavras-chave: Trichomonas vaginalis, Bacteroides fragilis, Interao



vii


ABSTRACT

The Bacteroides genus is composed by gram-negative, bacillus, obligate
anaerobes, bile-resistant and non-spore forming bacterium. The genus species
are commonly found on the mucous membranes, including the female genital
tract, acting as agents of several site infections. The anaerobic infections are
usually polymicrobial and endogenous. Trichomonas vaginalis, for its part, is an
anaerobic facultative flagellate parasite with worldwide distribution which is
trichomoniasis etiologic agent, the most common non-viral sexually transmitted
disease in humans. As for the infection persistence, this parasite possesses as a
mechanism phagocyting other microorganisms, but this process is not completely
elucidated. In this study we make use of T. vaginalis trophozoites and the species
Bacteroides fragilis, for B. fragilis is considered, clinically, the most important in its
genus, once it is the most commonly bacteria isolated from endogenous infectious
processes, being usually associated to gastrointestinal, respiratory and female
genital tracts infections. We performed the parasite-bacteria interaction in 1:10,
1:50 and 1:100 proportions in periods between 1 and 12 hours and viability tests
have been applied. These data have been analyzed to rival the pathogen growth
in vitro in the presence and absence of B. fragilis. The results indicate that in the
1:100 proportion post-interaction analysis, ultrastructural alterations were
noticeable after 6 hours. Furthermore, it was observed that after 8 hours the T.
vaginalis viability decays, and that after 12 hours of interaction no viable
trophozoites are found. These data suggest that the parasite covers B. fragilis in
short interaction periods and that in this time there are no variations of the parasite
proliferation, but as time goes by the trophozoites collapse, indicating that B.
fragilis may produce toxic metabolites against the T. vaginalis activity.
Key words: Trichomonas vaginalis, Bacteroides fragilis, Interaction



viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Composio da microbiota humana ...................................................... 2
Figura 2 - Ciclo de vida de Trichomonas vaginalis ................................................ 3
Figura 3 - Ilustrao de T.vaginalis feita por Donn em 1836 ............................... 6
Figura 4 - MEV mostrando ensaio de interao entre B. fragilis e T. vaginalis.... 13
Figura 5 - MEV mostrando ensaio de interao entre B. fragilis e T. vaginalis.....14
Figura 6 - MEV mostrando ensaio de interao entre B. fragilis e T. vaginalis.... 15
Figura 7 - MET mostrando ensaio de interao entre B. fragilis e T. vaginalis .... 16


LISTA DE GRFICOS

Grfico 1 - Interao parasito-bactria na proporo de 1:10 ............................. 17
Grfico 2 - Interao parasito-bactria na proporo de 1:50 ............................. 18
Grfico 3 - Interao parasito-bactria na proporo de 1:100 ........................... 19





ix

SUMRIO

Resumo .................................................................................................................. vi
Abstract ................................................................................................................. vii
Lista de Figuras .................................................................................................... viii
Lista de Grficos ..................................................... Error! Bookmark not defined.
1. Introduo .........................................................................................................1
2. Reviso de Literatura ........................................................................................5
2.1. Bacteroides fragilis .................................................................................... 5
2.1.1. Aspectos taxonmicos de Bacteroides fragilis ................................. 5
2.1.2. Patogenicidade e virulncia de Bacteroides fragilis ......................... 5
2.2. Trichomonas vaginalis ............................................................................... 6
2.2.1. Aspectos taxonmicos de Trichomonas vaginalis ........................... 6
2.2.2. Patogenicidade e virulncia de Trichomonas vaginalis ................... 7
2.3. Fagocitose ................................................................................................. 8
3. Objetivos ...........................................................................................................9
3.1. Objetivos geral .......................................................................................... 9
3.2. Objetivos especficos ................................................................................ 9
4. Justificativa ..................................................................................................... 10
5. Metodologia .................................................................................................... 11
5.1. Cultivo de Bacteroides fragilis ................................................................. 11
5.2. Cultivo de Trichomonas vaginalis ............................................................ 11
5.3. Interao parasito-bactria ...................................................................... 11
5.4. Microscopia Eletrnica de Varredura ...................................................... 11


x

5.5. Microscopia Eletrnica de Transmisso .................................................. 12
5.6. Avaliao da proliferao de T. vaginalis ................................................ 12
6. Resultados e Discusso ................................................................................. 13
6.1. Resultados .............................................................................................. 13
6.1.1. Avaliao da ultraestrutura de T. vaginalis em interao com B.
fragilis atravs de microscopia eletrnica de varredura ........................... 13
6.1.2. Anlise de T. vaginalis aps ensaios de interao atravs de
microscopia eletrnica de transmisso .................................................... 16
6.1.3. Avaliao da proliferao do protozorio in vitro, na ausncia e na
presena de B. fragilis ............................................................................. 17
6.2. Discusso ............................................................................................... 19
7. Consideraes Finais ..................................................................................... 22
8. Perspectivas Futuras ...................................................................................... 23
9. Referncias Bibliogrficas .............................................................................. 24


1

1. INTRODUO
A famlia Bacteroidaceae composta por bactrias anaerbias que
colonizam a orofaringe e os tratos gastrointestinal e genital feminino de humanos.
composta por bacilos gram-negativos no formadores de esporos (CATO &
JOHNSON, 1976), incluindo o gnero Bacteroides. As espcies de Bacteroides
so anaerbias estritas e bile resistentes (SONG et al., 2004).
Bacteroides fragilis considerada, clinicamente, a mais importante dentro
do gnero, j que a mais comumente isolada de processos infecciosos
endgenos, estando geralmente associada a infeces nos tratos gastrintestinal,
respiratrio e genital feminino, e dos tecidos moles (GIAMARELLOU, 2000).
A mucosa intacta representa importante barreira que impede a proliferao
de microrganismos anaerbios de se espalharem para outros stios. Portanto, as
infeces anaerbias ocorrem normalmente na presena de fatores que so
predisponentes (BROOK, 1987). As bactrias anaerbias tm assumido grande
importncia clnica nos ltimos anos, em decorrncia de avanos nas tcnicas de
deteco e identificao deste grupo microbiano, sendo ratificado o envolvimento
desses microrganismos em diversos processos infecciosos dos tratos respiratrio,
gastrointestinal e genital feminino. No processo infeccioso as bactrias atuam
tanto como patgenos nicos quanto em associaes com microrganismos
facultativos (FERREIRA et al., 2003), o que caracteriza as infeces anaerbias
como polimicrobianas (ONDERDONK et al., 1977). Nesse contexto, as espcies
do gnero Bacteroides tm merecido ateno especial pela alta incidncia de
isolamento em casos clnicos (KOETH et al., 2004).
O interesse na microbiota bacteriana do trato genital feminino aumentou
em funo da relao existente com as infeces ginecolgicas, uma vez que
cerca de 50% das bactrias encontradas nas secrees vaginais e cervicais so
anaerbias (ENGELKIRK et al., 1992). Gorbach et al. (1973), demostraram a
predominncia de Lactobacillus e Bacteroides spp. na flora cervical, sendo o
gnero Bacteroides composto por espcies frequentemente associadas com
infeces no trato genital feminino, mostrando, deste modo, a relevncia dos


2

estudos envolvendo estes microrganismos (FINEGOLD, 1977; FINEGOLD &
LANCE, 1989; SZKE et al., 1996).

Figura 1: Principais filos de bactrias que compe a microbiota humana.
Fonte: Adaptado de http://scienceblogs.com.br
Trichomonas vaginalis parasito causador da tricomonase, doena
sexualmente transmissvel no viral mais comum em humanos. Alm disso,
cosmopolita e infecta de 250 a 350 milhes de pessoas no mundo (COSTA et al.,
2005). O parasito se divide por fisso binria, tem um ciclo de vida simples e
habita o lmen e a mucosa do trato urogenital humano (HUPPERT, 2009).


3


Figura 2. Ciclo de vida de T. vaginalis.
Fonte: http://fcfrp.usp.br
Trichomonas vaginalis possui a capacidade de realizar a fagocitose,
mecanismo de internalizao de partculas por vesculas fagocticas ou
fagossomos, processo realizado mais frequentemente por clulas fagocticas
como macrfagos (MELLMAN, 1996; CONNER & SCHMID, 2003). Este
fenmeno foi demonstrado por Pereira-Neves & Benchimol (2007) em ensaios em
que foi evidenciado a capacidade de T. vaginalis de ingerir partculas inertes e
clulas de maneira eficiente por mecanismo similar ao observado em outras
clulas fagocticas, porm tal mecanismo ainda no est completamente
elucidado. Alm disso, j foi descrito que T. vaginalis consegue fagocitar diversos
outros tipos de bactrias, assim como microrganismos eucariticos, tais como
Saccharomyces cerevisiae.


4

Street et al. (1984) relataram a interao de Trichomonas com outros
microrganismos patognicos do trato genital e observaram que as espcies
bacterianas de Neisseria gonorrhoeae e Mycoplasma hominis so rapidamente
inativadas e fagocitadas, sugerindo um mecanismo de persistncia da infeco do
parasito. Tal descoberta mostra a relevncia do estudo deste mecanismo
fagoctico de T. vaginalis com outros agentes causadores de infeces, como B.
fragilis.



















5

2. REVISO DE LITERATURA
2.1. Bacteroides fragilis
2.1.1. Aspectos taxonmicos de Bacteroides fragilis
A famlia Bacteriodaceae compreende 13 gneros, sendo Bacteroides,
Fusobacterium, Prevotella e Porphyromonasos os mais importantes devido
frequncia com a qual causam infeces no organismo hospedeiro. As espcies
do gnero Bacteroides so bacilos ou cocobacilos gram-negativos (SONG et al.,
2004).
Bacteroides fragilis foi descrita pela primeira vez por Veillon e Zubber em
1898 como Bacillus fragilis, sendo includa no gnero Bacteroides por Castellani e
Chalmers em 1919. Em 1923, o gnero Bacteroides foi descrito como sendo este
composto por bacilos anaerbios obrigatrios, gram-positivos e negativos e no
formadores de esporos, e posteriormente, em 1937, Weiss e Rettger excluram os
organismos gram-positivos do gnero Bacteroides.
At o final do sculo XX, devido aos avanos em tcnicas de biologia
molecular, houveram diversas mudanas no gnero Bacteroides, e em 2007,
Wexler relatou que as espcies que fazem parte deste gnero so B. acidifaciens,
B. caccae, B. coprocola, B. coprosuis, B. eggerthi, B. finegoldi, B. fragilis, B.
helcogenes, B. intestinalis, B. massiliensis, B. nordii, B. ovatus, B.
thetaiotaomicron, B. vulgatus, B. plebeius, B. uniformis, B. salyersai, B. pyogenes,
B. finegoldii, B. goldsteinii, B. doreie e B. johnsonii.
2.1.2. Patogenicidade e virulncia de Bacteroides fragilis
O potencial patognico determinado pelos mecanismos que as bactrias
utilizam para o estabelecimento da enfermidade, como a capacidade de adeso
s clulas epiteliais do organismo hospedeiro, invaso tecidual, resistncia s
defesas do hospedeiro, produo de metablitos e danos teciduais (DUERDEN,
1994; SHARP, 1999).


6

A colonizao bacteriana inicia-se com o processo de adeso que contribui
para a sua permanncia no organismo hospedeiro. Bacteroides fragilis se liga s
clulas epiteliais por estruturas como as fmbrias. Desta forma, aps a aderncia
bacteriana s clulas epiteliais do hospedeiro, observam-se mudanas estruturais
e bioqumicas nas mesmas (SHARP, 1999).
Bacteroides fragilis pode ainda produzir enzimas extracelulares que so
capazes de promover a hidrlise nos tecidos do hospedeiros, alterando a sua
estrutura celular (DUERDEN, 1994; SHARP, 1999).
2.2. Trichomonas vaginalis
2.2.1. Aspectos taxonmicos de Trichomonas vaginalis
De acordo com Maciel et al. (2004) em 1836, Donn descreveu pela
primeira vez o parasito Trichomonas vaginalis. No entanto, a pesquisa sobre esse
microrganismo s se iniciou no sculo XX.

Figura 3. Ilustrao de T. vaginalis feita por Donn em 1836.
Fonte: http://jmb.sagepub.com
A classificao taxonmica indica que o gnero Trichomonas pertence ao
filo Zoomastigina, a classe Parabasalia, ordem Trichomonadida e famlia


7

Trichomonadidae (SCHWEBKE & BURGESS, 2004). Tricomonaddeos so
protistas anaerbios facultativos e as trs espcies encontradas no homem so:
T. tenax, T. hominis e T. vaginalis, no entanto, T. tenax e T. hominis so
considerados no patognicos (SCHWEBKE & BURGESS, 2004; TASCA & DE
CARLI, 2007).
2.2.2. Patogenicidade e virulncia de Trichomonas vaginalis
Trichomonas vaginalis tem se destacado como um dos principais
patgenos do homem e da mulher e est associado a srias complicaes de
sade

(LEHKER & ALDERETE, 2000). Estudos recentes demonstraram que T.
vaginalis promove a transmisso do vrus da imunodeficincia humana (HIV)
(FLEMING & WASSERHEIT, 1999); causa de baixo peso em bebs, bem como
de nascimentos prematuros; predispe mulheres a doena inflamatria plvica
atpica, cncer cervical e infertilidade (MACIEL et al., 2004).
A ao citopatognica de T. vaginalis pode ser dividida em 4 fases:
adeso, citlise, fagocitose e digesto intracelular (MIDLEYJ & BENCHIMOL,
2009).
O estabelecimento de T. vaginalis na vagina se inicia com o aumento do
pH, j que o pH normal neste stio cido (3,8 4,5) e o microrganismo cresce
em pH maior que 5. A elevao do pH vaginal na tricomonase evidente, com
reduo concomitante de Lactobacillus acidophilus e aumento na proporo de
bactrias anaerbias (PETRIN et al., 1998).

Os estudos de Lpez et al. (2000) demonstraram que a interao entre T.
vaginalis e o seu hospedeiro um processo complexo, no qual esto envolvidos
componentes associados superfcie celular do parasito, clulas epiteliais do
hospedeiro e tambm componentes solveis encontrados nas secrees vaginal
e uretral. A aderncia e a citotoxicidade exercidas pelos parasitos sobre as
clulas do hospedeiro podem ser ditadas por diversos fatores de virulncia.
Alguns autores indicaram que a atividade fagoctica de T. vaginalis talvez
constitua em um mecanismo patognico (MALDONATO et al., 1998).


8

2.3. Fagocitose
De acordo com Alberts et al. (2002), a endocitose um processo pelo qual
uma clula capta macromolculas, substncias particuladas e, em casos
especializados outras clulas. Nesse processo, o material a ser ingerido
progressivamente circundado por uma pequena poro da membrana plasmtica,
a qual invagina-se e ento projeta-se para formar uma vescula endoctica. Um
destes processos especializados de endocitose a fagocitose, no qual alguns
protozorios realizam a sua alimentao. A fagocitose,portanto, consiste no
englobamento de partculas slidas pela membrana celular atravs da formao
de pseudpodes. Aps a adeso da partcula superfcie ocorre a ingesto da
mesma e a formao do vacolo fagoctico. A fuso deste vacolo aos lisossomos
faz com que as enzimas ali presentes degradem a partcula que se encontra
internalizada (DE SOUZA, 1994).













9

3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Analisar os efeitos da interao entre Bacteroides fragilis e Trichomonas vaginalis,
realizando ensaios em diferentes tempos e propores.
3.2. Objetivos especficos
Observar a ultraestrutura de superfcie de T. vaginalis em interao com B.
fragilis atravs de microscopia eletrnica de varredura;
Analisar T. vaginalis aps ensaios de interao atravs de microscopia
eletrnica de transmisso;
Avaliar a proliferao do protozorio in vitro, na ausncia e na presena de
B. fragilis.














10

4. JUSTIFICATIVA
Bacteroides fragilis apresenta interesse clnico, bem como T. vaginalis.
Desta forma, levando em considerao que geralmente as infeces por
anaerbios so polimicrobianas e que a tricomonase, a doena sexualmente
transmissvel no viral mais comum em humanos, o estudo da interao de B.
fragilis com T. vaginalis se mostra relevante para o entendimento do processo
infeccioso parasitrio bem como bacteriano, mimetizando o stio real do
estabelecimento da infeco.
Street et al. (1984) relataram a interao de Trichomonas com outros
microrganismos patognicos do trato genital e observou que as espcies
bacterianas de Neisseria gonorrhoeae e Mycoplasma hominis so rapidamente
inativadas e fagocitadas pelo parasito, sugerindo um mecanismo de persistncia
da infeco. Assim sendo, tal descoberta mostra ainda a relevncia do estudo
deste mecanismo fagoctico de T. vaginalis com outros agentes causadores de
infeces.













11

5. METODOLOGIA
5.1. Cultivo de Bacteroides fragilis
Espcimes de B. fragilis (ATCC25285) foram reativadas em caldo BHI
(Brain Heart Infusion) PRAS (Pre-Reduced Anaerobically Sterilized) a partir de
estoque em BHI-gar inclinado e incubadas em estufa por 24 h a 37C. Critrios
de viabilidade e pureza foram utilizados aps semeadura em placas de gar
sangue suplementadas com vitamina K e hemina. Aps o perodo de incubao,
em ambiente de anaerobiose, as colnias foram repicadas para novo caldo BHI-
PRAS.
5.2. Cultivo de Trichomonas vaginalis
Trofozotos de T. vaginalis foram cultivados em tubos de vidro de 8ml
contendo 7 mL de meio Trypticase-Yeast Extract-Maltose (TYM) como descrito
por Diamond (1957), acrescido de 10% de soro fetal bovino inativado. As culturas
foram mantidas em estufa a 37C por 24 horas e o meio foi trocado aps este
perodo, que corresponde fase logartmica de crescimento.
5.3. Interao parasito-bactria
Trichomonas vaginalis foi cultivado em tubo de vidro de 8ml com meio TYM
suplementado com soro fetal bovino a 10% e a bactria foi inoculada ao meio. A
interao protozorio-bactria foi feita na proporo de 1:10, 1:50 e 1:100 em
perodos entre 1h e 12h e testes de viabilidade sero aplicados.
5.4. Microscopia Eletrnica de Varredura
A estrutura dos protozorios e das bactrias foi analisadas por microscopia
eletrnica de varredura. Aps diferentes perodos de interao, as amostras foram
fixadas em soluo contendo glutaraldedo 2.5% e 4% de paraformaldedo
nascente em tampo cacodilato de sdio 0.1 M, pH 7.4, desidratadas em
solues de acetona (de 30 a 100%), secas usando ponto crtico de CO2 e
montadas em suportes. As amostras foram cobertas com ouro (2030 nm) para
observao em Microscpio Eletrnico de Varredura Jeol JSM 6490LV.


12

5.5. Microscopia Eletrnica de Transmisso
Experimentos para microscopia eletrnica de transmisso, com diferentes
tempos de interao foram preparados. As amostras foram fixadas em soluo
contendo glutaraldedo 2.5% em tampo cacodilato de sdio 0.1 M, pH 7.4,
lavadas no mesmo tampo e ps-fixadas por 40 minutos no escuro em soluo de
tetrxido de smio 1% em tampo cacodilato de sdio 0.1 M, pH 7.4. As amostras
foram lavadas no mesmo tampo, desidratadas em acetona e embebidas em
resina epxi. Seces ultrafinas foram contrastadas com acetato de uranila e
citrato de chumbo e observadas ao Microscpio Eletrnico de Transmisso FEI
SPIRIT 120 Kvolts.

5.6. Avaliao da proliferao de T. vaginalis
Aps diferentes perodos de interao, as amostras foram coradas com
azul de tripan para anlise da viabilidade celular e as clulas vivas sero contadas
em cmara de Neubauer. B. fragilis foi quantificada pela escala de McFarland.
Com os resultados foi montada uma curva de crescimento do protozorio sozinho
e frente a interao com a bactria. Os resultados so representativos de trs
experimentos diferentes.








6. RESULTADOS E DISCUSSO


13

6.1. Resultados
Os resultados foram descritos de acordo com os objetivos propostos.
6.1.1. Observao da ultraestrutura de superfcie de T. vaginalis em
interao com B. fragilis atravs de microscopia eletrnica de varredura
A interao do protozorio T. vaginalis com B. fragilis na proporo de
1:100, foi analisada aps 2, 6 e 12 horas, atravs de microscopia eletrnica de
varredura. Aps o perodo de 2 horas, no possvel observar modificaes na
ultraestrutura do parasito (B, C e D) em comparao com o controle sem bactria
(A). Alm disso, possvel observar bactrias aderidas na superfcie do parasito
(setas B, C e D ), e tambm, B. fragilis aparentemente sendo internalizada por T.
vaginalis (estrela D).

Figura 4: Microscopia eletrnica de varredura mostrando ensaios de interao de T. vaginalis com
B. fragilis na proporo de 1:100, aps 2 horas de interao.


14

Aps o perodo de incubao de 6 horas na proporo 1:100parasito-
bactria, no possvel observar modificaes na ultraestrutura do parasito (B, C
e D) em comparao com o controle sem bactria (A). Nota-se bactrias aderidas
na superfcie do parasito (setas em B e C) e bactrias sendo internalizadas
(estrelas em B e C). Alm disso observa-se bactrias aderidas superfcie do
protozorio (setas em D).

Figura 5. Microscopia eletrnica de varredura mostrando ensaios de interao de T. vaginalis com
B. fragilis na proporo de 1:100, aps 6 horas de interao.







15

Aps o perodo de interao de 12 horas na proporo de 1:100, nota-se
algumas modificaes na ultraestrutura do parasito, em comparao com o
controle sem bactria (A), principalmente a perda da forma elipside do
protozorio (B e C). Alm disso, observa-se modificaes na disposio das
bactrias, que sugerem a formao de biofilme (B, C e D), devido ao aparente
elevado grau de organizao de B. fragilis.

Figura 6. Microscopia eletrnica de varredura mostrando ensaios de interao de T. vaginalis com
B. fragilis na proporo de 1:100, aps 12 horas de interao.







16

6.1.2. Anlise de T. vaginalis aps ensaios de interao atravs de
microscopia eletrnica de transmisso
O protozorio T. vaginalis, aps 6 horas de interao com B. fragilis na
proporo de 1:100, foi observado atravs de microscopia eletrnica de
transmisso com o objetivo de confirmar a ocorrncia de fagocitose. A imagem
abaixo mostra B. fragilis internalizada por T. vaginalis (seta).

Figura 7. Microscopia eletrnica de transmisso mostrando ensaios de interao de T. vaginalis
com B. fragilis na proporo de 1:100, aps 6 horas de interao. N Ncleo, H
Hidrogenossomo. Imagem controle cedida por BENCHIMOL, M.

N
H
H
H


17

6.1.3. Avaliao da proliferao do protozorio in vitro, na ausncia e na
presena de B. fragilis
A proliferao do parasito in vitro foi analisada atravs de contagem em
cmara de neubauer, utilizando azul de tripan para analisar a viabilidade do
protozorio. O eixo Y mostra o nmero de clulas viveis de T. vaginalis e o eixo
X o tempo em horas. Depois de cada contagem, as amostras foram semeadas em
placas de gar sangue suplementado com vitamina K e hemina e posteriormente
incubadas em ambiente de anaerobiose durante 24 horas 37C para garantir a
de viabilidade de B. fragilis aps as 12 horas de experimento (dados no
mostrados).
Os resultados mostram que na proporo parasito-bactria de 1:10, a partir
de um perodo de 8 horas, a viabilidade de T. vaginalis comprometida em
relao ao controle.

Grfico 1. Viabilidade celular de T. vaginalis em perodos de 0 a 12 horas, em interao com B.
fragilis na proporo de 1:10 (vermelho), em comparao com o controle (azul).




18

Em ensaios de interao na proporo de 1:50, observado uma queda
mais expressiva no nmero de parasitos viveis em comparao ao ensaio
performado na proporo de 1:10 a partir de 2 horas de interao.

Grfico 2. Viabilidade celular de T. vaginalis em perodos de 0 a 12 horas, em interao com B.
fragilis na proporo de 1:50 (vermelho), em comparao com o controle (azul).












19

Em ensaios de interao na proporo de 1:100, observado uma queda
expressiva no nmero de parasitos viveis aps 6 horas de interao, em
comparao com ensaios de interao em outras propores menores. A partir de
10 horas de interao j no so mais observadas clulas viveis.

Grfico 3. Viabilidade celular de T. vaginalis em perodos de 0 a 12 horas, em interao com B.
fragilis na proporo de 1:100 (vermelho), em comparao com o controle (azul).

Os resultados demonstram que o nmero de clulas vaveis de T. vaginalis
est diretamente relacionado com a proporo de B. fragilis. Tais resultados so
condizentes com as imagens obtidas atravs de microscopia eletrnica de
varredura.

6.2. Discusso
Infeces geniturinrias so dividas em duas categorias principais:
infeces primrias, devido a microorganismos patognicos sexualmente
transmissveis, como parasitos (Trichomonas vaginalis), bactrias (Treponema
pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi) e


20

vrus (Herpes simplex), e infeces devido aos membros da microbiota, como
Bacteroides fragilis e membros da famlia Enterobacteriaceae (RONALD, A.R. &
ALFA, M.J., 1996). Com isso, o estudo dos microrganismos residentes no trato
genital feminino tem aumentado em funo dessa relao existente da microbiota
com as infeces ginecolgicas.
No processo infeccioso, as bactrias atuam tanto como patgenos nicos
quanto em associaes com microrganismos facultativos, e cerca de 50% das
bactrias encontradas nas secrees vaginais e cervicais so anaerbias. Por
estes fatores, tm-se observado a necessidade de estudos de microorganismos
anaerbios com outros microrganismos existente, de maneira facultativa ou no,
no trato genital feminino (GORBACH et al., 1973; ENGELKIRK et al., 1992;
FERREIRA et al., 2003).
No presente estudo, foi analizada a interao de Trichomonas vaginalis e
Bacteroides fragilis em diferentes perodos de tempo e propores, com o objetivo
de analisar essa interao a nvel ultraestrutural, afim de verificar a presena de
modificaes morfolgicas indicativas de fagocitose atravs de microscopia
eletrnica de varredura. Os resultados mostraram bactrias aderidas ao parasito e
sendo aparentemente internalizadas. Benchimol (1995) realizou a interao de T.
vaginalis com bactrias da espcie Escherichia coli e obteve resultados
semelhantes. Em seu estudo, E. coli foi rapidamente fagocitada e inativada por T.
vaginalis.
Anlises realizadas por microscopia eletrnica de transmisso mostraram
que aps o perodo de 6h de interao, so encontradas no interior do parasito,
estruturas alongadas incomuns, semelhante a B. fragilis, indicando a
interiorarizao da bactria pelo parasito. E apesar de no estar totalmente
elucidado, possvel tambm deduzir que esta fagocitose do parasito possa ser
uma tentativa para o balano ecolgico do meio, como mecanismo de
persistncia da infeco pelo parasito, resultados estes que confirmam os obtidos
por Street et al. (1984).


21

Diversos estudos j avaliaram a capacidade de endocitose de T. vaginalis.
Pereira-Neves & Benchimol (2007) demonstraram que T. vaginalis pode realizar
dois tipos diferentes de fagocitose. Uma a fagocitose clssica, com a emisso
de pseudpodes. A segunda, fagocitose por afundamento, onde no h a
emisso de pseudpodes. Nesse estudo no foi observado a ocorrncia de
fagocitose clssica. Isso se deve, provavelmente, ao fato da cepa utilizada de T.
vaginalis ter sido mantida em cultura desde os anos 80. Existem diversos estudos
que indicam que cepas selvagens de T. vaginalis realizam a fagocitose clssica
mais frequentemente do que cepas domesticadas.
Aps estas observaes, foi analisado a viabilidade do parasito na
interao com Bacteroides fragilis, os ensaios foram realizados utilizando
diferentes propores parasito-bactria, e foi constatado que ao decorrer do
tempo, com incio entre 2 e 8h de interao, o nmero de T. Vaginalis diminui em
comparao com o controle, estes dados sugeriram, portanto, que o parasito
fagocita a bactria numa tentativa de persistncia da infeco, porm este
mecanismo no o bastante, e Bacteroides fragilis consegue contornar esta
investida do parasito. Os estudos de Rudek e Haque (1976) demonstraram que B.
fragilis pode produzir e liberar desoxiribonucleases, proteases e lipases no meio
extracelular. A produo destes metablitos uma possvel explicao para a
morte de T. vaginalis quando em interao com B. fragilis durante longos perodos
de tempo. Essa explicao fortemente justificada pela reduo do nmero de
parasitos viveis de acordo com o aumento da proporo parasito-bactria.
Outra possvel explicao para a morte do protozorio o fato da interao
ocorrer em sistema fechado. Este modelo pode causar a competio de nutrientes
entre ambos microrganismos e esta tambm uma possvel explicao para os
resultados obtidos.





22

7. CONSIDERAES FINAIS

Trichomonas vaginalis foi capaz de fagocitar B. fragilis em todos
experimentos realizados, nas propores de 1:10, 1:50 e 1:100;

Durante os ensaios de interao, foi mostrado que a ultraestrutura de T.
vaginalis drasticamente modificada aps um perodo de 12 horas, mas
alteraes j podem ser notadas a partir de 6 horas, e isso provavelmente
ocorre devido a metablitos produzidos por B. fragilis;

A viabilidade celular de T. vaginalis decai de acordo com o tempo de
incubao e proporo de B. fragilis, no entanto, a viabilidade de B. fragilis
mantida mesmo depois de 12 horas de interao (dados no mostrados);

Foram encontradas evidncias que B. fragilis forma biofilme aps longos
perodos de incubao.











23

8. PERSPECTIVAS FUTURAS
Estudos futuros so necessrios para averiguar outros aspectos
importantes do processo de fagocitose do parasito, como o provavel papel
de receptores e outros mecanismos responsveis pela adeso de B. fragilis
no corpo celular de T. vaginalis;

Ser realizado o experimento, utilizando uma cepa selvagem de T.
vaginalis a fim de se obter um resultado comparativo;

Novos ensaios de interao sero performados utilizando uma cepa de
isolado de B. fragilis;

Ainda, afim de se obter mais resultados comparativos, sero realizados
experimentos utilizando outras espcies de Bacteroides.













24

9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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