Teknik Kimia Politeknik Negeri Malang

HPLC
(High Performance Liquid
Chromatography)
Della Fajar P
Dinni Hayyu
Farid Jatmika
Putri Fenny
M. Rizky Alfiz
Retno Sari
Tujuan Praktikum
Menganalisa sampel
secara kualitatif dan
kuantitatif dengan
HPLC
Mempelajari cara
kerja alat HPLC
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang
didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen
campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam
(stationary) dan fase bergerak (mobile).
Kromatografi
Fase diam
Padat
Cair
Fase gerak
Cair
Gas
Kromatografi cair berperforma tinggi (high
performance liquid chromatography, HPLC)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk
zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan
tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya,
HPLC berupaya untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat
padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan
merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan
fase diam (stasioner).
HPLC
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode
kromatografi adalah memisahkan setiap komponen
dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi
(kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari
masing-masing komponen tersebut (kuantitatif).
Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui
informasi tentang identitas kimia dari analat dalam
suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk
mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut
dalam sample
Pompa
Katup
Kolom
Gerbang
suntik
Detektor
Data
Prosesor
Botol
penampung
Komponen HPLC
Komponen-komponen HPLC
Botol penampung berjumlah 4 buah
Berisi fase gerak (Aquabidest dan Methanol)
Berfungsi sebagai wadah pencampuran jika memang
di perlukan.
Botol Penampung
Tekanan dapat mencapai
400 bar
Laju air yang dihasilkan
konstan dan tidak
berfluktuasi
Dapat menghasilkan laju
hingga 10 ml/menit
Dapat memproduksi laju alir
secara tepat
Tidak bersifat korosif
Pompa
dengan kriteria :
Tangki dan piston bergerak maju
mundur dilengkapi beberapa katup
Reciprocating pump
Batang berulir dan piston
Displacement pump
Tangki bertekanan yang didalamnya
memiliki gelembung fleksibel terbuat
dari karet
Pneumatic pump
Jenis Pompa
Berfungsi mengatur komposisi pelarut yang
diperlukan dan mengatur laju alir pelarut.
Katup
Terbuat dari baja tahan karat dengan permukaan
yang sangat halus dan berdinding tebal.
Ukurannya biasanya 4.6 mm dan panjang 25 cm.
Kolom yang digunakan saat praktikum bersifat
nonpolar dari jenis C-18/RP-18
Kolom
Gerbang suntik didesain sedemikian rupa sehingga
mampu membatasi jumlah analit yang masuk
kolom pada volum tertentu misalnya 20 mikroliter.
Jika analit yang disuntikkan melebihi dari jumlah
maka sisanya akan dibuang .
Gerbang suntik
Kriteria:
Mimiliki sensitivitas 0, 1 pikogram hingga 10 nanogram/detik
Mampu memberikan respon linier sesuai jumlah yang terdeteksi
Respon harus lebih cepat dan tidak tergantung pada laju alir
Mudah dioperasikan
Dapat mendeteksi beragam senyawa
Tidak berifat destruksif

Jenis-jenisnya
Spektofotometer UV, Fluorometri, Spekrofotometer Infra Merah,
Refraktometer, Konduktometer dan Spektogram massa.

Yang digunakan pada saat praktikum: Spektofotometer UV yang
merupakan detektor selektif.

Detektor


Detektor
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari
beberapa panjang gelombang. Jika menyinarkan sinar UV pada
larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi
yang berlawanan, maka akan mendapatkan pembacaan langsung
berapa besar sinar yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap
akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut
yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut
menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap
dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum
UV.
Untuk mengubah sinyal dari detektor menjadi data
berupa angka-angka yang diperlukan misalnya
waktu retensi (Rt), luas kurva, presentase luas
kurva dan lainnya.
Data prosesor dapat berupa integrator atau
komputer.

Data Prosesor
Berfungsi untuk membawa analit melalui kolom dan
mencapai detektor yang harus memiliki syarat :
Kemurnian tinggi
Mudah didapat dan murah
Titik didih 20-50 C diatas suhu kolom
Viskositas rendah
Tidak bereaksi dengan analit dan fase diam
Tidak melarutkan fase diam maupun pelapisnya
Sifatnya berbeda dengan analit pada detektor
Tidak berbahaya dari segi kebakaran dan keracunan

Fase Gerak (Mobile Phase)
Kromatografi
Normal
Kromatografi
Reverse
Packing material
Polar
Silica gel
Silica NH2
Silica CN

Non Polar
Silica C-18
Silica C-8
Silica Polimer
Mobile Phase
Non polar

Polar
Metanol
CH3CN/H2O
MeOH/Buffer sol
Tipe Kromatografi HPLC
Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran karena perbedaan kekuatan interaksi anata
solut-solut terhadap fasa daiam. Solut-solut yang kurang
kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari
kolom terlebih dahulu sehingga waktu retensi yang
dicapai lebih cepat. Begitu pula sebaliknya.

Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh
senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian puncak maksimum pada
grafik dari senyawa itu.
A. Alat
Seperangkat alat HPLC
Personal komputer
Alat suntik UV-VIS detektor
Printer
B. Bahan
Metanol
Air
Fenol
Toluena


Alat dan Bahan
Hidupkan detektor UV-VIS 200, atur panjang gelombang 254 nm, RANGE
(AUFS) pada 0,0005 RISE TIME pada 0,1 detik
Menghidupkan alat, menekan tombol on/off pada bagian belakang user
sebelah kanan
Mengisi botol penampung A ; Metanol : Air (15:85)
B ; Metanol : Air (85:15)
sebagai fase pembawa atau fase gerak
Skema Kerja
a. Persiapan
Hidupkan personal komputer, program windows 3,1 pilih menu
Chromatography, klik HPLC, klik OK, ketik Lab. Pada user name, ketik 1
pada password, klik OK, klik HPLC
Atur laju alir fasa pembawa pada3 ml/menit dengan menekan FLOW
A 100 ENTER. Tekan kembali FLOW 3 ENTER
Tunggu gelembung dan fasa pembawa keluar, tekan PUMP/STOP.
Tutup kembali kran purging
Lakukan purging untuk mengeluarkan gas dari saluran, dengan buka
tutup HPLC, putar ke kiri (membuka) kran purging, tekan tombol
PURGE D
b. analisis
Suntikkan sampel (min. 20 mikron) pada posisi tuas INJECT
Lakukan kembali dengan menyuntikkan sampel dan campuran pada langkah 4-6
Mengamati signal yang tergambar daam monitor
Aur menu mulai merekam monitor, menggerakkan tuas dari INJECT ke LOAD,
tekan PUMP dan ENTER (pada PC) secara serentak. Lihat petunjuk program
HPLC
Tentukan jenis dan kadar sampel setelah proses analisis selesai

Data Pengamatan
Inject 1 (Toluen)
Inject 2 (Fenol)



Inject 3(fenol+toluen)
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak,
dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa
dalam campuran yang melalui detektor dan menerap
sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,
anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh,
tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur
senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada
kondisi yang sama.
Interpretasi output dari detektor
Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil
dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin
disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi
dapat sama karena Y lebih polar daripada X. Ini mungkin
ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi kepolaran
lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.
Data Pengamatan
Waktu retensi pada 14 menit

Dari data dapat diketahui bahwa sampel yang keluar
terlebih dahulu (waktu retensi 9,325) adalah fenol dan yang
keluar berikutnya adalah toluena (waktu retensi 11,983). Hal
tersebut dapat diperoleh dengan cara membandingkan hasil
sampel dengan data inject toluena dan fenol standar.
Toluena standar mempunyai peak pada Rt 12,6 menit
sehingga pada data peak pada Rt 11,983 menit merupakan
toluena. Sedangkan fenol standar memiliki peak pada Rt
9,500 sehingga pada peak 9,325 menit adalah fenol.
Sehingga dari data sesuai dengan teori bahwa sampel yang
keluar terlebih dahulu adalah sampel yang lebih polar yaitu
fenol yang dilanjutkan dengan toluen karena fase diam
yang digunakan adalah nonpolar.

Dari data juga dapat diperoleh bahwa jumlah Fenol
lebih besar dibandingkan jumlah toluena pada sampel
hal tersebut diketahui dari % area Fenol sebesar
48,160 % dan % area Toluen sebesar 20 %. Dan sisa
persentasi lainnya yang dapat dilihat dari peak-peak
kecil yang muncul merupakan pengotor yang
mengontaminasi campuran, yang diakibatkan sample
campuran dipakai berulang-ulang untuk berbagai
kelompok,juga syringe yang dipakai secara
bergantian.
1. HPLC (High Performance Liquid Kromatografi)
merupakan suatu metode Kromatografi cair-cair
berdasarkan tingkat kepolaran
2. Senyawa yang sifatnya sama dengan kolomnya maka
interaksinya lebih kuat sehingga lebih lama di kolom,
sebaliknya senyawa atau komponen yang sifatnya
berbeda dengan fasa diamnya akan lebih cepat keluar
dari kolom karena interaksi antara sampel dengan fasa
diam
3. Senyawa yang keluar terlebih dahulu (Waktu
retensinya lebih pendek) adalah Fenol dengan Rt 9,326
yang lebih polar dibandingkan Toluena dengan Rt
11,983 karena kolom yang digunakan adalah kolom
nonpolar
4. Konsentrasi Fenol lebih besar dibandingkan dengan
konsentrasi toluena dalam sampel hal ini dapat
diketahui dari % area masing-masing peak komponen
dengan Fenol 48% dan Toluen 20 %..
Kesimpulan
Terimakasih