CONTENIDO

1. Introduccin
2. Principios de crecimiento celular
3. Diseo de medios de cultivo
4. Esterilizacin de medios y de equipo de proceso
5. Bioreactores
6. Bioseparaciones de productos
7. Bioprocesos tpicos

2. Principios de crecimiento celular
Crecimiento
replicacin
Cambio del tamao
de clulas
Los microorganismos pueden crecer bajo una variedad de
condiciones
Fsicas
Qumicas
Nutricionales
Intracelular Extracelular Clula
P r o d u c t o s
Medio de
cultivo
nutrientes
Componentes
biolgicos
Produccin de
energa
Biosntesis y
formacin de
productos
Sustratos + clulas productos extracelulares + ms clulas
P + + S N nN
2.1 Crecimiento Balanceado (= Equilibrado)
Su caracterstica es que los constituyentes aumentan proporcionalmente por un
mismo factor en la unidad de tiempo.
Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (), que es
caracterstico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.
EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO
a) En funcin del aumento de masa celular:
(1)
( )
m
m
0
ln = t - t
0
dm
= m
dt
( )
m
m
0
ln
=
t - t
0
b) En funcin del aumento del nmero de clulas.


divisin (generacin celular) = 2 clulas, dos divisiones = 4 celulas, etc:
una serie geomtrica. 1, 2, 2
2
, 2
3
, 2
4
, ... 2
n
( n es el nmero de generaciones
transcurridas).
Si en vez de partir de una clula partimos de N
0
clulas iniciales, tenemos:
N = N
0
2
n
; por lo tanto:

n
0
N
= 2
N
(2)
El nmero de generaciones (n) se puede determinar teniendo en cuenta el
tiempo transcurrido y con el tiempo medio de generacin (g):
0
t - t
n=
g
Considerando que

(3)
( )
0
t -t
g
0
N
= 2
N
(4)
En crecimiento balanceado, la expresin de crecimiento celular en funcin
de masa celular, ec. (1) y la expresin en funcin al nmero de clulas,
ec. (5), son equivalentes:
( )
0
0
N ln2
ln = t - t
N g
(5)
n
0
N
= 2
N
( )
m
m
0
ln = t - t
0
( )
0
0
t - t
N
ln = ln2
N g
ln2
=
g
De donde el valor del coeficiente de crecimiento exponencial, (), en funcin
del tiempo medio de generacin (g):o tiempo de doblado
En un medio ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente es =
mx
, o
sea, el mximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es
decir, es un crecimiento balanceado no restringido.
(6)
( )
0
0
t - t
N
ln = ln2
N g
2.2 Cultivo en Sistemas Cerrados (Batch)
no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de clulas ni de sustancias de
desecho.
lquidos slidos
El medio de cultivo estril se siembra con el inculo y se incuba el tiempo
de determinado
Fase
Lag
Fase
exponencial
(Log)
Fase
estacionaria
Fase de
muerte
l
n

d
e

N
o
.

d
e

c

l
u
l
a
s

v
i
a
b
l
e
s

tiempo
2.2.1 Curva de crecimiento en sistema cerrado lquido
1) Fase de retardo (fase lag): Es el perodo de tiempo durante el que el
inculo se adapta a las condiciones del medio fresco.
Es un perodo de ajuste metablico. Su duracin depende de varios
factores:
tamao del inculo;
Estado metablico previo del inculo
si el inculo procede de clulas en fase estacionaria de un cultivo
anterior, la fase lag es larga.
si las clulas estn daadas por algn agente, la fase lag tambin es
larga,.
si las clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase
logartmica, la fase lag es ms corta.
medio del que procede el inculo:
.

TAREA 1
Mtodos de medicin de crecimiento celular y como se
expresa la concentracin celular en cada caso
Directos
Indirectos

Enviar por correo para el 6 de febrero o antes
pguerrero@iq.uson.mx
2.2.2 Cintica de crecimiento en sistema cerrado lquido
( )
0
0
ln -
X
t t
X
=
0
t
X X e
A
=
m = masa celular a t = t
m
0
= masa celular a t = t
0


X = concentracin celular a t = t
X
0
= concentracin celular a t = t
0
Rendimiento en un cultivo batch
0
0
X S
X X X
Y
S S S
A
= =
A
S = concentracin de sustrato a t = t
S
0
= concentracin de sustrato a t = t
0
Al final del periodo de crecimiento batch, es rendimiento aparente
(7)
(9)
(8)
(10)
dX
= dt
X
( )
m
m
0
ln = t - t
0
EJEMPLO: Un cultivo de levaduras crece en un cultivo en matraz, se
obtuvieron los siguientes datos durante el tiempo de fermentacin.
Tiempo
(h)
Concentracin
celular
(g/L)
Concentracin de
glucosa
(g/L)
0 1.25 100.0
9 2.45 97.0
16 5.1 90.4
23 10.5 76.9
30 22.0 48.1
34 33.0 20.6
36 37.5 9.38
40 41.0 0.63
a) Calcule la velocidad especfica de crecimiento
b) Calcule el rendimiento del cultivo batch
c) Cul es la mxima concentracin celular que se podra esperar, s
150 g de glucosa se usaran a el mismo tamao de inculo?
d) Cul es el tiempo de doblado del cultivo?
2.2.3 Cuantificacin de la cintica de crecimiento

La descripcin completa de la cintica de crecimiento de un cultivo
involucra el reconocimiento:
La naturaleza estructurada de cada clula
la segregacin de el cultivo en las unidades individuales (clulas)

Los modelos para describir la cintica pueden tener las mismas
caractersticas

El modelo estructurado qumicamente divide la masa celular en sus
componentes
El modelo segregado se construye de unidades discretas semejantes
a la segregacin observada en los cultivos reales
Modelos No-Estructurado Estructurado
No-segregado
Caso ideal
Un solo componente.
Descripcin de las
clulas como promedio


Multicomponente.
Descripcin de las
clulas como promedio

Segregado
Un solo componente.
Poblacin celular
heterognea


Multicomponente.
Poblacin celular
heterognea, clulas
tratadas a nivel individual.
Caso real

A: Aproximacin que considera una poblacin celular promedio.
B: Aproximacin de crecimiento balanceado
A A
B
B
Modelos de crecimiento celular
2.2.3.1 Modelos no-estructurados y no-segregados para predecir
la velocidad especfica de crecimiento
= velocidad de crecimiento
S = sustrato limitante

mx
= velocidad especfica de crecimiento mximo (cuando S >> K
s
)

K
s
= constante de saturacin o de equilibrio



A) Influencia del sustrato limitante en el crecimiento
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 5 10 15 20
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

c
r
e
c
i
m
i
e
n
t
o

(
h
-
1
)
Concentracin de glucosa S (mM)
La ec. es similar a la ec. de Langmuir o de Michealis-Menten, cuando
se aplica a sistemas celulares estas cinticas se describen por la
Ec. de Monod
mx
s
S
K S

=
+
K
s
= S cuando =
mx

0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 2 4 6 8 10
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

c
r
e
c
i
m
i
e
n
t
o

(
h
-
1
)
Concentracin de glucosa S (mM)
K
s
= S
=
mx

En general:
=
mx
para S >> K
S

para S << K
S


La Ec. de Monod describe el
crecimiento influenciado por el
sustrato limitante cuando el
crecimiento es lento y la
densidad de poblacin es baja.
mx
s
S
K

=
Tarea 3
Investigar otros modelos para describir el crecimiento influenciado por
el sustrato limitante (indicando el significado, cuando se usa etc.)
(11)
3.2 Ecuaciones No-Lineales
Un modelo de crecimiento
exponencial inicia suponiendo que



El modelo supone una tasa de
crecimiento constante, igual a = k
Es difcil encontrar casos reales de
crecimiento exponencial durante
largos periodos de tiempo, porque en
determinado momento el sustrato es
limitado
para 0
dX
X k
dt
= >
0.00
100.00
200.00
300.00
400.00
500.00
600.00
0 2 4 6 8 10 12
X
t
B) Modelo Logstico
Se utiliza para predecir la forma sigmoidal de la curva de
crecimiento
Si el medio de cultivo es capaz de sostener como mximo una
cantidad X de producto (clulas), de forma que



entonces se puede introducir el trmino



Redefiniendo las constantes, resulta




La Ecuacin logstica se puede resolver por separacin de variables
e integracin por fracciones parciales



* 1
dX X X
kX kX kX
dt X X

| |
= =
|
\ .
( )
dX
f X X
dt
=
max
constante de crecimiento aparente, equivale a
constante que limita el crecimiento en , equivale a
k
X t

=
=
Llamada Ecuacin logstica
X

( )
1
1
dX X
kX
dt X
dX
kdt
X
X
X
X dX dX
kdt
X X X
X X
X
X

| |
=
|
\ .
=
| |

|
\ .
= =
| |
|
\ .
Separando por fracciones parciales
( )
( ) ( )
( )
1, 1
1 1
X dX
kdt
X X X
X dX a b
X X X X X X
donde
a b
dx kdt
X X X

= +

= =
+ =

( )
( )
0
0
0
0
integrando
1 1
y resolviendo
1 1
X t
X
kt
kt
dx k dt
X X X
X e
X
X
e
X

+ =

=

} }
Esta ecuacin representa el
modelo de la Ecuacin logstica
integrada
La constante de crecimiento aparente k se calcula
primero suponiendo crecimiento logartmico
max
constante de crecimiento aparente, equivale a
constante que limita el crecimiento en , equivale a
k
X t

=
=
( )
0
0
1 1

=

kt
kt
X e
X
X
e
X
para 0
dX
X k
dt
= >
Ejemplo:
En la tabla se encuentran los datos de cierto proceso de
crecimiento celular a lo largo del tiempo, en un proceso por lotes.
Determine el valor de la constante de crecimiento k, que equivale a
y el valor de
max =X

t X
0 3.900
10 5.300
20 7.200
30 9.600
40 12.860
50 17.090
60 23.192
70 31.433
80 38.550
90 50.156
100 63.800
110 75.996
120 91.972
130 105.711
140 122.775
150 131.669
170 135.890
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 50 100 150 200
X
t
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 50 100 150 200
X
t
X experimental
( )
0
0
1 1
kt
kt
X e
X
X
e
X

=

Solucin en
excel
Ejemplo 2.
La produccin de etanol a partir de glucosa se realiza en un cultivo por lotes
con Saccharomyces cerevisiae y se obtuvieron los siguientes datos
t Biomasa (X) Glucosa (S) Etanol (P)
h g/L g/L g/L
0 0.5 100 0.0
2 1 95 2.5
5 2.1 85 7.5
10 4.8 58 20.0
15 7.7 30 34.0
20 9.6 12 43.0
25 10.4 5 47.5
30 10.7 2 49.0
a) Determine el valor del coeficiente k, o constante de crecimiento.
b) El valor de
max
c) Determine los coeficientes de rendimiento Y
P/S
y Y
X/S
2.3 Cultivo Continuo
Es cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto
de flujo que se compone de:
una cmara de cultivo de volumen constante,
un suministro de nutrientes,
un dispositivo de rebosadero por la que se eliminan los productos txicos
de desecho

Tipos:
Quimiostato
Turbidiostato

lquidos
Cultivos Batch o por lotes
Controlador de pH
Contenedor de
cido
Filtro de aire
Rotmetro
Aire
comprimido
Agitador
magntico
Bomba de
alimentacin y
efluente
Medio estril
Filtro de aire
Salida de aire
Muestreo
2.3.1 Quimiostato ideal
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el nmero de clulas y la
concentracin de nutrientes en la cmara permanecen constantes, y
entonces se dice que el sistema est en estado estacionario, con las
clulas creciendo exponencialmente.
Los parmetros a tener en cuenta son:
flujo (F),
volumen de cultivo (V
R
)
concentracin celular en el tanque (bioresctor) (X)
factor de dilucin o rapidez de dilucin D = F/V
R

Quimiostato ideal
F
S
0

X
0
= 0
P
0
= 0
S
,
X, P
F
S
X
P
V
R

( )
0
R
R R d
d V X
FX FX V X V k X
dt
= +
Velocidad de
acumulacin
Velocidad de
entrada
Velocidad de
salida
Velocidad de
formacin
Velocidad de
consumo
(20)
2.3.1.1 Relacin entre la rapidez de dilucin y la concentracin celular
( )
0 d
dX
DX k D X
dt
= +
Donde D = F/V
R
, D es el recproco del tiempo de residencia.
Generalmente el medio alimentado es estril X
0
= 0, s el metabolismo es
endgeno la velocidad de decaimiento es despreciable comparada a la
velocidad de crecimiento (k
d
<< ) y en el sistema en estado estable dX/dt =
0, entonces
= D (s k
d
= 0)
Esta propiedad permite manipular la velocidad de crecimiento como un
parmetro independiente en el quimiostato

(21)
(22)
( )
0
R
R R d
d V X
FX FX V X V k X
dt
= +
Dado que la velocidad de crecimiento est limitada por al menos un sustrato,
una descripcin simple del quimiostato puede ser sustituyendo en la Ec. de
Monod Ec. (11), la Ec. (22):


S D >
mx
se produce lavado
Para D <
mx



S = concentracin de sustrato en estado estable
El balance de sustrato en ausencia de metabolismo endgeno, produce:



q
p
= velocidad especfica de formacin de producto extracelular

= =
+
mx
s
S
D
K S
(23)

s
mx
K D
S
D
0
1 1
=
R R R P
M
P S X S
dS
V FS FS V X V q X
dt Y Y
(24)
(25)
2.3.1.2 Relacin entre la rapidez de dilucin y la concentracin de sustrato
Cuando la formacin de producto es despreciable y en el sistema en estado
estable dX/dt = 0, entonces



Dado que = D en estado estable y s k
d
= 0


Usando la concentracin celular en estado estable, Ec. (24) combinada con
la Ec. (27):


( )
0
1
=
M
X S
D S S X
Y
( )
0
=
M
X S
X Y S S
(26)
(27)
0

| |
=
|

\ .
M S
X S
mx
K D
X Y S
D
(28)
Generalmente YX/S varia con el nutriente limitante S y la velocidad de
crecimiento . S se considera el metabolismo endgeno, (en lugar de = D,
si k
d
= 0, velocidad de decamiento)
= D + k
d

Se sustituye en la Ec. de balance e sustrato sin formacin de producto (Ec.
26)

= Mximo coeficiente de rendimiento
Este es un valor constante independiente de la velocidad de
crecimiento, esta aproximacin no permite la conversin directa de sustrato
en energa. El sustrato incorporarse primero en la masa celular, donde es
degradado por el metabolismo endgeno (Modelo no-estructurado)
(29)
( )
0
1
=
M
X S
D S S X
Y
( )
( )
0
d
M
X S
D k
D S S X
Y
+
=
(30)
M
X S
Y
La ec. (30) puede escribirse:


Se define

= rendimiento aparente, es variable con las condiciones de crecimiento
s k
d
> 0
La Ec. (32) es diferente de la Ec. (27) donde el coef. de
rendimiento mximo es cte s k
d
= 0
Sustituyendo la Ec. (32) en la Ec. (31):



( )
0 d
M
X S
D k S S
D
X Y
+ | |
=
|
\ .
( )
0
AP
X S
X
Y
S S
=

(32)
(31)
( )
0
M
X S
X
Y
S S
=

AP
X S
Y
1
d
AP M M
X S X S X S
k D
D
Y Y Y
| |
= + |
|
\ .
1 1 1
d
AP M M
X S X S X S
k
D Y Y Y
= +
1 1 1
d
AP M M
X S X S X S
k
D Y Y Y
= +
1 1 1
s
X
P M
S
A
X S
D Y
m
Y
= +
d
s
M
X S
k
m
Y
=
(33)
Es el coeficiente de mantenimiento,
constante
1
AP
X S
Y
1
M
X S
Y
d
s
M
X S
k
m m
Y
= =
1
D
En presencia de metabolismo endgeno
= D + k
d

Sustituyendo en la Ec. de Monod


mx
s
S
D+k =
K +S
d
(34)
1
s
mx
K +S
=
D+ k S
d
1
s
mx mx
K S
=
D+ k S S
+
d
1 1 1
s
mx mx
K
=
D+k S
+
d
1
d
D k +
1
mx

s
mx
m
K

=
1
S
2.3.1.3 Rapidez crtica de dilucin D
C


El valor D
C
es el valor ms bajo al cual ocurre el agotamiento
En general D
C
mx
Cuando S = S
0
, D
C
=
porque en el agotamiento no hay clulas permanentes en el quimiostato y no se
consume sustrato, por lo tanto:



En cultivo continuo, la productividad de biomasa, PX se define:
PX = DX


(30)
(29)
0
0
=
+
C mx
S
S
D
K S
C
o
n
c
.

d
e

b
i
o
m
a
s
a

X

C
o
n
c
.

d
e

s
u
s
t
r
a
t
o

S


y

p
r
o
d
u
c
t
i
v
i
d
a
d
a

P

Factor de dilucin D
DC
Relacin entre la biomasa, el sustrato la productividad y el
factor de dilucin en estado estable
X0 S0
TAREA 3
Una nueva cepa de levadura se est estudiando para la produccin de
biomasa. Los siguientes datos se obtuvieron usando un quimiostato. La
concentracin de sustrato alimentado fue de 800 mg/L, se uso un exceso de
oxgeno, pH de 5.5 y temperatura de 35 C. :calcule la velocidad mxima de
crecimiento (mx ), la constante de equilibrio (Ks), el rendimiento mximo de
conversin de sustrato a clulas ( ), la velocidad de decamiento o muerte (k
d
) y el
coeficiente de mantenomiento (m
s
). Suponiendo metabolismo endgeno.

M
X S
Y
Factor de Conc. de sustrato Conc. Celular
dilucin D carbn S X
h
-1
mg/L mg/L
0.1 16.7 366.0
0.2 33.5 407.0
0.3 59.4 408.0
0.4 101.0 404.0
0.5 169.0 371.0
0.6 298.0 299.0
0.7 702.0 59.0
2.3.2 Turbidiostato
Controlador de pH
Contenedor de
cido/base
Filtro de aire
Rotmetro
Aire
comprimido Agitador
magntico
Bomba de
alimentacin
Medio estril
Filtro de aire
Salida de aire
Muestreo
Fotomultiplicador
Tubo de
recirculacin
Luz
Regulador de la
Bomba
Turbidiostato
La concentracin celular en el bioreactor se mantiene constante monitorendo
la densidad ptica y controlando el flujo de alimentacin.
Si la turbidez excede del mximo se activa la bomba y agrega medio
fresco.
Se mantiene constante el volumen de cultivo.
Es til para seleccionar una poblacin acondicionada a condiciones
ambientales extremas (X constante).

2.4 Cultivo Intermitente Alimentado (Fed-batch)
TAREA 2
Comparacin de las ventajas y desventajas entre los tres tipos de cultivos:
Batch, continuo y semicontinuo
Para 19 de febrero, enviada por correo