BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS (HETEROTRFICAS) TOTALES EN AGUA.

1- Objetivo:
Determinar bacterias heterotrficas en aguas.
- C!"#o $e !#%i&!&i'(:
El recuento hetertrofo de placa, anteriormente denominado recuento estndar en placa, es
un procedimiento cuyo objeto consiste en calcular el nmero de bacterias vivas hetertrofas
que existen en el agua y medir los cambios que se producen a ra! del tratamiento y
distribucin de las aguas y en las piscinas. "as colonias pueden surgir en pares, cadenas,
grupos o c#lulas nicas, todas ellas englobadas bajo el t#rmino de unidades formadoras de
colonias $%&'(. El nmero final depende de la interaccin entre las colonias en desarrollo.
)- *o&+"e(to, $e -e.e-e(&i!:
Re&+e(to $e /ete-'t-o.o, e( #%!&! .%+0$! -112 A 3 B- St!($!-$ Met/o$, Fo-
T/e E4!"i(!tio( o. 5!te- !($ 5!,te6!te-7 1
,t
E$itio( 882. A9HA7 A55A7
59CF.
:- 9-o&e$i"ie(to:
:-1. I(t-o$+&&i'(:
;-e! $e t-!b!jo
)e deber disponer de una mesa o de un banco de amplia superficie no porosa en una
habitacin limpia $sala de siembra(, sin corriente de aire, bien iluminada o una cmara de
flujo laminar hori!ontal. "a superficie de la mesada debe desinfectarse antes y despu#s de
reali!ar el anlisis.
M+e,t-!,:
*eali!ar el anlisis lo antes posible para reducir al mnimo las alteraciones de la poblacin
bacteriana. El tiempo mximo recomendado que debe transcurrir entre la toma de muestra y
su estudio es de + horas $mximo tiempo de intervalo, , horas- mximo tiempo de
procesamiento, . horas(. )i el anlisis no puede iniciarse en las primeras + horas, mantener
la muestra a una temperatura inferior a /0', pero sin congelar. 1o ha de permitirse que el
intervalo mximo entre la toma de muestra y el anlisis supere las ./ horas.
:- I(,t-+&&io(e,
M<TO*O *E LA 9LACA FLU=*A:
:--1-A#!-!to, 3 "!te-i!%e,.
Estufa de cultivo 'ontrolada termostticamente para mantener una temperatura de
230' 4 0'.
p5 metro 6pto para medicin de p5 de medios de cultivo a .3 0'
7ipetas de 4 y 48 ml. Esterili!ar en estufa a 498 : 48 0' durante . horas, a partir de los
4980'.
7lacas de 7etri
est#riles
Esterili!ar en estufa a 498 : 48 0' durante . horas, a partir de los
4980', o placas descartables est#riles.
:--- Re!&tivo,.
7late 'ount 6gar $ 6gar ;riptona glucosa,
levadura(
o 6gar 1<*= $6*57(.
4> 7reparar de acuerdo a las indicaciones del
fabricante.
.> Esterili!ar 43 min. a 4 atm $4.40'(.
)olucin de ;iosulfato de sodio al 2? 4> Esterili!ar 43 min. a 4 atm. $4.40'(.
6gua peptonada al 8,4? para dilucin
$&rasco con @@ ml y tubos con @ ml(
4> Esterili!ar .8 min. a 4 atm. $4.40'(.
:-)- 9-o&e$i"ie(to $e e(,!3o:
A>+! #!-! &o(,+"o
4. =dentificar cada placa con el nmero de muestra, dilucin, fecha o cualquier
otra informacin necesaria.
.. =nactivar el cloro agregando 8.4 ml de una solucin est#ril de ;iosulfato de
sodio al 2?, para 4.8 ml de muestra.
2. 7reparar cada volumen de muestra o dilucin , como mnimo, por duplicado
/. 5omogeni!ar las muestras y las diluciones, utili!ando un agitador mecnico o
vortex.
3. 6gregar 48 > 4. ml de 6gar 7late 'ount, temperado a /3>/,0 ', para evitar un
choque t#rmico significativo durante la exposicin de la muestra al calor.
,. Ae!clar y dejar solidificar el agar.
9. =ncubar las placas a 230 : 40' $/+ hs(, en caso de no poder incubar a la
temperatura anterior elegir algunos de los tiempos y temperaturas recomendados
para el control de cambios en la calidad del aguaB >;emperaturaB .8 > .+0' o
temperatura ambiente >;iempoB 3 > 9 das
A>+!, "+3 &o(t!"i(!$!,.
'uando se sospecha que el nmero total de bacterias hetertrofas es muy elevado reali!ar
diluciones de forma que el nmero de colonias en una placa sea de 28 a 288. 7or ejemplo,
cuando se sospecha que el recuento de hetertrofos en placa alcan!ar 2888, se prepararn
placas con diluciones de 48
>.
.
En la mayora de las muestras de agua potable se obtendrn placas adecuadas para reali!ar
el recuento sembrando 4 y 8,4 ml. de muestra no diluida y un 4 ml de la dilucin.
4 ml @@ ml de agua peptonada al 8,4 ?.
Muestra
4ml 8,4 ml 4ml 8,4 ml

7lacas de 7etri con el medio
de cultivo.
4 ml 48
>4
ml 48
>.
ml 48
>2
ml



Columen real de muestra
en placa.
2- C?%&+%o, 3 e4#-e,i'( $e %o, -e,+%t!$o,:
a( 6l preparar las placas colocar volmenes de muestras que proporcionen entre
28>288 colonias por placa. El objetivo consiste en disponer al menos una
dilucin que proporcione recuentos entre los lmites.
b( 7or lo general no sembrar ms de . ml de muestra- por tanto, cuando el
nmero total de colonias que se desarrollan con . ml sean inferior a 28.se
anotaran los resultados obtenidos.
c( )i con . ml de muestra el recuento est entre 28>288 colonias, expresar el
resultado de la siguiente formaB
U F C @ "% A &o%o(i!, &o(t!$!, @ vo%+"e( $e %! "+e,t-! +ti%iB!$o ("%)
d( Despu#s de la incubacin contar todas las colonias de las placas
seleccionadas. )i hay que retrasar el recuento, guardar las placas a 3>480'
durante Dno ms de de ./ horasE
e( )i se reali!a el recuento en formal manual utili!ar un instrumento de recuento
adecuado, como un contador de colonias Fu#bec, si no se dispone de este
tipo de instrumento utili!ar cualquier otro contador, siempre que proporcione
aumento o iluminacin equivalente.
f( )e cuentan las colonias individuales, y aquellas que posean aspecto de
colonias y cre!can muy cerca unas de otras, aunque sin tocarse, siempre que
la distancia entre ellas sea al menos igual al dimetro de la colonia ms
pequeGa. ;ambi#n se contaran como colonias individuales adyacentes con
aspecto distinto en lo que se refiere a forma, color, etc.
g( Expresar el resultado en %&' H ml de agua.
h( )i ninguna de las placas de una muestra tiene colonias, comunicar un
recuento inferior a una a $I4( %&' H ml.
i( 'uando el nmero de colonias supere ampliamente las 288.
4. 7ara menos de 48 coloniasHcm
.,
contar las que existen en 42
cuadrados del contador de colonias, representativos de la distribucin de
colonias. )i es posible seleccinese 9 cuadrados consecutivos hori!ontales
a trav#s de la placa y , cuadrados consecutivos verticales con la
precaucin de no contar ms de una ve! un mismo cuadrado. Aultiplicar la
suma del nmero de colonias de los 42 cm
.
representativos por cinco para
calcular el nmero de colonias por placa. 'uando el rea de #sta, sea de
,3 cm
.
.
.. )i hay ms de 48 coloniasHcm
.
, cu#ntese / cuadrados significativos,
calclese la media por centmetro cuadrado y multiplquese por el factor
adecuado para obtener el nmero de colonias por placa. El factor es de 39
para las placas desechables de plstico y ,3 para las de vidrio. 'uando los
recuentos bacterianos superen las 488 coloniasHcm
.
, comunquese el
resultado mayor de $J( ,.388 veces, en el caso de placas de vidrio y mayor
de 3988 veces, en el caso de las placas de plstico. El resultado se
expresar como recuento estimado de unidades formadoras de colonias
calculadas por mililitros.
'uando deban contarse colonias en expansin, contar como una unidad cada uno de
los siguientes tiposB cadenas de colonias que pare!can ser consecuencia de la
desintegracin de un grupo de bacterias al me!clar el agar y la muestraB expansiones que se
desarrollen como placas de crecimiento entre el agar y el suelo de la placa de 7etri
)i hay exceso de crecimiento expansivo en una placa, se considera como
DdiseminantesE.
En caso de que las placas resulten incontables porque se haya perdido el factor de
dilucin, se hayan cado accidentalmente, est#n contaminadas o las placas de control
indiquen que el medio, otros materiales o el instrumental est#n contaminados, referir en el
informe como Daccidente de laboratorioE.
Evitar una precisin y seguridad ficticias al calcular las unidades formadoras de
colonias, registrando slo los dos primeros dgitos de la i!quierda. 'uando el tercer dgito es
3,,,9,+, o @, se aumentar en un unidad el segundo dgito de la i!quierdaB usar ceros para
cada uno de los dgitos hacia la derecha a partir del segundo. 7or ejemplo, comunicar un
recuento de 4/. como 4/8 y uno de 433 como 4,8, mientras que uno de 23 se informar
como 23.
A>+! "+3 &o(t!"i(!$!,B
a( *eali!ar el recuento de colonias como est determinado para agua para
consumo, en las placas que presenten entre 28 a 288 colonias.
b( 7romediar los resultados del recuento de las dos placas de la dilucin que se
cuente entre 28 y 288 colonias y multiplicar por el factor de dilucin.
c( Expresar el resultado en %&' H ml de agua.