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III
II
Laboratorio N 2

Tema: CATABOLISMO DE LOS AMINOCIDOS: TRANSAMINACIONES.

Contenidos conceptuales: Digestin de protenas y absorcin de aminocidos.
Catabolismo aminoacdico: Desaminaciones oxidativa y no oxidativa.
Transaminaciones.

Contenidos procedimentales: Desarrollo del mtodo colorimtrico para el dosaje de
la enzima glutmico-oxalactico-transaminasa (GOT, AST, ASAT) humana.
Determinacin de la actividad de la glutmico-oxalactico-transaminasa en sueros
humanos normales controles, sueros de pacientes con hepatopatas y cardiopatas.

Contenidos actitudinales: Integracin en trabajo grupal. Predisposicin para la
resolucin de problemas con espritu crtico y rigor cientfico. Bioseguridad en el
laboratorio. Autoconfianza. Precisin, sistematizacin y coherencia en los
planteamientos. Responsabilidad para con las tareas encomendadas.

Objetivos:
Comprobar la actividad biolgica de la enzima glutmico-oxalactico-transaminasa en
sueros humanos normales controles, y en sueros de pacientes con hepatopatas y
cardiopatas.
























Qumica Biolgica II Laboratorio N 2
FACENA, UNNE 2013

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Fundamentos Tericos
Los aminocidos tienen un rol fundamental en los seres vivientes, ya que
constituyen las protenas y son precursores de algunas hormonas y otros compuestos
de inters biolgico (neurotransmisores, histamina, anillos porfirnicos, nucletidos,
etc.). El organismo puede sintetizar una parte de los -aminocidos necesarios para
el suplemento proteico y otra parte proviene de la dieta (aminocidos esenciales).
Las transaminaciones son reacciones de intercambio de un radical NH
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entre
dos grupos carbonados, siendo reemplazado el radical amino por una funcin cetona.
El papel de las reacciones de transaminacin es doble:
1. Permiten realizar la interconversin de los aminocidos.
2. Posibilitan la separacin de la parte nitrogenada de los aminocidos aportados en
exceso, constituyendo el primer paso del catabolismo de muchos aminocidos.
Las dos transaminasas ms activas son la glutmico-oxalactico-transaminasa
(GOT) (aspartato-aminotransferasa (ASAT, AST)) y la glutmico-pirvico-transaminasa
(GPT) (alann-aminotransferasa (ALAT, ALT)).
Se presentan en muchos rganos, principalmente en hgado y msculo
cardaco. Existen isoenzimas en citosol y mitocondria con K Michaelis= 1. Son de
gran inters clnico, ya que aumentan anormalmente sus niveles plasmticos en
patologas hepticas (GOT y GPT), como tambin en cardiopatas (GOT).

Mtodo colorimtrico de determinacin cuantitativa de la actividad biolgica
(dosaje) de la GOT

Fundamento Qumico del Mtodo

Las transaminasas o aminotransferasas implican la interconversin de un par de
aminocidos y un par de cetocidos. Las reacciones son de carcter reversible y poseen como
cofactor el fosfato de piridoxal (derivado activo de la vitamina B6).
La reaccin ntima implica la formacin de aldiminas y cetiminas (bases de Schiff) con
los grupos amino transportados desde el aminocido reaccionante al cetocido aceptor.
La transaminasa glutamato-oxalactica cataliza la siguiente reaccin:

COONa COONa COONa COONa

CO HCNH
2
HCNH
2
CO

CH
2
+ CH
2
CH
2
+ CH
2

CH
2
COONa CH
2
COONa

COONa COONa

-cetoglutarato de sodio L-aspartato de sodio L-glutamato de sodio oxalacetato de sodio

El oxalacetato formado se determina fotocolorimtricamente mediante la formacin de
la 2,4-dinitrofenilhidrazona, que en medio alcalino posee color rojo, y se mide entre 500 y 550
nm.
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El oxalacetato se descarboxila en parte a piruvato, y cuando se trata la mezcla de
reactantes y productos con 2,4-dinitrofenilhidrazina se forman, adems de la 2,4-
dinitrofenilhidrazona del oxalacetato, las correspondientes al -cetoglutarato y piruvato, que en
solucin alcalina tambin poseen color rojo.
Para reducir la contribucin de la 2,4-dinitrofenilhidrazona del -cetoglutarato al color
total de la mezcla, la cantidad del mismo en el sustrato es subptima (L-aspartato/-
cetoglutarato = 50/1) y se mide a una longitud de onda comprendida entre 500 y 550 nm, donde
las absortividades molares de las 2,4-dinitrofenilhidrazonas del oxalacetato o del piruvato son
mayores que las del -cetoglutarato.
Debido a esa inestabilidad del oxalacetato, que se descarboxila en parte a piruvato, es
la 2,4-dinitrofenilhidrazona de este ltimo (que en solucin alcalina posee el mismo color que la
del oxalacetato) la que se utilizar para la realizacin de la curva de calibracin.

Materiales y Reactivos

Equipamiento necesario:
Espectrofotmetro
Bao termostatizado
Muestras de sueros humanos normales y con patologas hepticas y cardacas

Cada alumno debe traer papel milimetrado.


Bibliografa:
- Bioqumica de Harper. Murray R. B. 12da. Edicin. Editorial El Manual Moderno. 2001.
- Bioqumica. Lehninger A. L. 2da.edicin. Editorial Omega. 1995.
- Bioqumica. Rawn J. D. Tomos I y II. 1ra. Edicin. Ed. Interamericana - McGraw-Hill. 1989.
- Qumica Biolgica. Blanco A. 7ma. Edicin. Editorial El Ateneo. 2000.
- Clinical Chemistry. Richterich R. Academic Press, 1969
- Actas de Bioqumica Clnica Argentina. Vol. VI N 1, 1972
- American Journal of Clinical Pathology. Reitman S., Frankel F. 28:56, 1957
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Tcnica:



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Informe:
Absorbancia blanco: ..............................
Absorbancia desconocido: .....................
Valor obtenido de la curva: ....................
Valor obtenido de la tabla de conversin:

Alumno: ............................................................ Comisin N: ...... Grupo: ...... Fecha: ...........