ASSISTANT ONLY

PRAKTIKUM PENGECATAN BAKTERI

- Pengecatan bakteri dilakukan untuk mempermudah pengamatan morfologi sel bakteri
dengan cara mengkontraskan sel bakteri dengan lingkungannya.
- Pengacatan bakteri menggunakan cat biologic yang terdiri dari tiga penyusun yaitu gugus
benzene, gugus auxochrome, dan gugus chromophore. Gugus auxochrome merupakan
gugus yang akan berikatan dengan bagian komponen sel, sedangkan gugus chromophore
merupakan molekul pembawa warna warna.
- Jenis pengecatan bakteri
1. Pengecatan negatif :
- untuk mengkontraskan sel bakteri dengan warna latar belakangnya
- cat biologic yang dipakai bermuatan negatif sehingga tidak dapat berikatan dengan
dinding sel bakteri yang juga bermuatan negatif yang terwarnai latar belakangnya.
- cat biologic yang dipakai yaitu tinta cina yang bermuatan negatif.
- pengecatan negatif dapat digunakan untuk melihat bentuk dan ukuran sel karena
pada pengecatan ini sel bakteri tidak mengalami fiksasi.
- cara kerja :
Gelas objek dibersihkan dengan alkohol untuk menghilangkan kotoran maupun
lemak/lilin pada gelas kaca. . Nigrosin diteteskan di atas gelas objek. Biakan bakteri
diambil dan diletakkan pada tetesan nigrosin dan dicampur sehingga trebentuk
suspensi. Nigrosin diratakan dengan gelas objek lain dengan cara ujung gelas objek
digerakkan ke depan sepanjang gelas objek yang berisi larutan sehingga membentuk
lapisan tipis. Biarkan mengering lalu amati di mikroskop.

2. Pengecatan sederhana :
- untuk mewarnai sel bakteri sehingga menjadi kontras dengan latar belakangnya.
menggunakan satu macam biological dye.
- biological dye yang dipakai yaitu crystal violet yang bermuatan positif.
- crystal violet yang bermuatan positif akan terikat pada dinding sel bakteri yang
bermuatan negatif sehingga sel terwarnai.
- Cara kerja :
Buat preparat olesan bakteri dengan cara akuades diteteskan pada gelas objek.
Biakan bakteri diambil, diletakkan dan dicampur pada tetesan akuades. Suspensi sel
diratakan agar bakteri menyebar sekitar 1 x 2 cm. Biarkan mengering lalu difiksasi
dengan melewatkan di atas api. Safranin diteteskan pada preparat olesan. Preparat
dicuci dengan air mengalir hingga sisa safranin tercuci,dan keringkan dengan tisu,
amati.
- Fungsi fiksasi : untuk membunuh sel dengan cepat tanpa merusak struktur,
melekatkan sel bakteri pada gelas objek, mereaktifkan bagian sel yang akan di cat.


3. Pengecatan differensial (Gram) :
- untuk membedakan kelompok bakteri yang satu dengan kelompok bakteri lainnya
(membedakan antara bakteri gram positif dengan gram negatif) berdasrkan
komposisi dinding selnya.
- pengecatan differensial menggunakan beberapa macam cat biologik.


- Perbedaan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif:
Komponen penyusun dinding
sel
Gram positif Gram negatif
Peptidoglikan Lebih tebal, terletak di bagian
luar outer membran
Tipis, terdapat di antara outer
membran dan inner membran
Lipopolisakarida - Tebal, terletak di bagian luar
outer membran
Jumlah layer membrane
phospho lipid
1 layer, yaitu inner membran
atau disebut pula cytoplasmic
membran
2 layer, yaitu inner membran
atau cytoplasmic membran,
Outer membran tersusun atas
lipid dan polisakarida yang
terikat pada cytoplasmic
membran sehingga disebut
lipopolisakarida (LPS)
*cytoplasmic membran berupa fosfolipid bilayer
- Biological dye yang dipakai antara lain kristal violet (Gram A) dan safranin (Gram D).
Reagen lainnya yang dipakai yaitu lugol iodine (Gram B) dan alkohol aseton (Gram C).
- Cara kerja:
Buat preparat olesan bakteri dengan cara akuades diteteskan pada gelas objek.
Biakan bakteri diletakkan pada tetesan akuades, dicampur pada tetesan akuades.
Suspensi sel diratakan agar bakteri menyebar sekitar 1 x 2 cm, keringkan, fiksasi di
atas api. Teteskan larutan Gram A, cuci dengan air mengalir,. Teteskan larutan Gram
B, cuci dengan air mengalir,. Teteskan larutan Gram C, cuci dengan air mengalir.
Teteskan larutan gram D, cuci dengan air mengalir, keringkan. Amati di mikroskop.
- Fungsi reagen:
a. Larutan gram A (kristal violet) berfungsi sebagai pewarna utama (main stain).
Larutan gram A akan berikatan dengan peptidoglikan pada dinding sel bakteri.
b. Larutan gram B (lugol iodine) berfungsi sebagai larutan penguat warna.
c. Larutan gram C (alkohol aseton) berfungsi sebagai decolorizer yang akan
menarik pewarna yang telah berikatan dengan lipopolisakarida.
d. Larutan gram D (safranin) berfungsi sebagai counter stain yang akan mewarnai
latar sehingga warna sel dan warna latar kontras.




- Hasil:
A. Jika bakteri berupa Gram positif
Bakteri + gram A gram A terikat pada peptidoglikan (peptidolglikan bakteri gram
positif tebal sehingga terikat kuat)
+ gram B gram B menguatkan warna
+ gram C gram C menarik pewarna telah terikat pada lipopolisakarida.
(gram positif tidak memiliki lipopolisakarida sehingga tidak memengaruhi
pewarnaan)
+ gram D gram D mewarnai latar. (gram D tidak memengaruhi warna sel
gram positif karena peptidoglikan yang tebal telah mengikat kuat larutan gram A
sebagai pewarna utama)

Hasil sel bakteri berwarna ungu warna dari kristal violet (gram A) bakteri
tersebut termasuk kelompok gram POSITIF

B. Jika bakteri berupa gram negatif
Bakteri + gram A gram A terikat pada LPS (lipopolisakarida pada bakteri gram
negatif tipis sehingga tidak berikatan secara kuat)
+ Gram B Gram B menguatkan warna
+ Gram C Gram C menarik pewarna telah terikat pada lipopolisakarida.
(pewarna yang terikat pada lipopolisakarida pada bakteri Gram negatif akan tertarik
oleh gram C sehingga sel bakteri menjadi tidak berwarna)
+ Gram D gram D mewarnai latar. (sel bakteri yang sudah tidak berwarna
akan terwarnai oleh gram D )

Hasil sel bakteri berwarna merah warna dari safranin (gram D) bakteri
tersebut termasuk kelompok Gram NEGATIF


4. Pengecatan struktur sel bakteri
1. Pengecatan spora
- untuk mengkontraskan warna spora dengan warna sel vegetative bakteri dan
latarnya sehingga spora dapat diamati dengan jelas.
- menggunakan dua jenis pewarna yaitu pewarna spora dan pewarna sel bakteri
- biological dye yang dipakai yaitu malachit green sebagai pewarna spora dan
safranin sebagai pewarna dinding sel bakteri. Malachit green yang bermuatan
negatif akan berikatan dengan dinding spora yang bermuatan positif, hasilnya
berwarna hijau. Safranin yang bermuatan positif akan berikatan dengan dinding
sel yang bermuatan negatif, hasilnya sel berwarna merah.
Spora:
- Berdasarkan letaknya, 1. Sentral, 2. Terminal, 3. Sub terminal
- Berdasarkan bentuknya, 1. Oval, 2. Rod, 3. Round


2. Pengecatan kapsul
- untuk mengkontraskan warna kapsul dengan warna sel bakteri dan latarnya
sehingga kapsul dapat diamati dengan jelas.
- menggunakan dua reagen yaitu pewarna utama (main stain) berupa kristal violet
dan decolorizer berupa CuSO4.
- Kristal violet akan mewarnai sel bakteri, namun kapsul bersifat non ionik
sehingga kristal violet tidak terikat pada kapsul. CuSO4 akan menarik warna
sehingga terbentuk clear zone pada daerah kapsul sedngakn sel bakteri
berwarna ungu.