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Fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyente y su

caracterizacin
Gabriel Morales y Andrs Benavides
Programa de Qumica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Nario, Ciudad Universitaria
Torobajo, San Juan de Pasto-Colombia.
Realizado 19 y 26 de agosto de 2008; entregado el 3 de septiembre de 2008
Resumen
A partir de una muestra de hgado de vaca (Bos Tauros), se aislaron los principales constituyentes
(cidos nucleicos, carbohidratos, lpidos y protenas), usando para ello las tcnicas de centrifugacin y
solubilidad diferencial. Los diferentes productos aislados, se caracterizaron usando pruebas de anlisis
cualitativo, tales como: prueba de Molisch, prueba de Lugol, prueba para colesterol, reaccin de Biuret,
reaccion de Millon, prueba para fosfatos, prueba para pentosas, entre otras. Los resultados de la
caracterizacin, coincidieron con la informacin tericamente. Por tanto, se concluy que el
procedimiento proporciona resultados satisfactorios y est bien elaborado.
Palabras clave: Centrifugacin, diferencia de solubilidad, biomolculas e hgado de vaca.
1. Introduccin
La bioqumica puede ser definida como la
ciencia que estudia las bases qumicas de la
vida. Siendo la clula la unidad estructural de
los sistemas vivos. El mayor objetivo de la
bioqumica es el completo entendimiento a nivel
molecular de todos los procesos qumicos
asociados a las clulas vivas. Para lograr ese
objetivo, la bioqumica busca aislar las
numerosas molculas encontradas en las
clulas, determinar su estructura y analizar su
funcin. Para esto se utilizan diferentes
tcnicas. [1]
Los constituyentes principales encontrados en la
materia viva corresponden a: cidos nucleicos,
carbohidratos, lpidos y protenas. Los cuales
cumplen numerosas funciones.
Los cidos nucleicos que actan como
depositarios y transmisores de la informacin
gentica de cada clula, tejido y organismo, son
macromolculas constituidas por monmeros
llamados nucletidos, los cuales a su vez estn
conformados por un azcar de cinco carbonos,
una base nitrogenada y un grupo fosfato. [2]
Los carbohidratos los cuales cumplen con una
gran variedad de funciones en los organismos
vivos, en donde la ms representativa es su
funcin energtica. Presentan una estructura,
conformada por monosacridos los cuales
corresponden a: Aldosas (polihidroxialdhidos) y
Cetosas (polihidroxicetonas), los cuales por la
unin de varios de estos, por medio de enlaces
glucosidicos conforman a los oligosacridos y
polisacridos. [2]
Las protenas las cuales desempean una
enorme variedad de funciones: unas transportan
y almacenan molculas pequeas, otras
constituyen gran parte de la organizacin
estructural de las clulas y los tejidos,
anticuerpos y quizs la funcin mas importante
de todas es la cataltica. Presentan estructuras
extremadamente complejas, conformadas por
monmeros llamados aminocidos. [2]
Los lpidos a diferencia de las otras
biomolculas no son polmeros. Se tratan ms
bien de molculas pequeas que presentan una
fuerte tendencia a asociarse mediante fuerzas
no covalentes. Los lpidos cumplen dos
funciones principales, la primera es una funcin
de reserva energtica y la segunda quizs ms
importante esta involucrada en la formacin de
membranas lipidias, los tabiques que dividen los
compartimientos y separan a la clula de sus
alrededores, su estructura de derivan a partir de
los cidos carboxlicos. [2]
2
En este trabajo se presentan los resultados del
fraccionamiento de los tejidos en sus principales
constituyentes usando las tcnicas de:
solubilidad diferencial y centrifugacin. La matriz
de partida fue el hgado de vaca (Bos taurus).
Las muestras aisladas se caracterizaron usando
diferentes pruebas cualitativas. El procedimiento
se eligi por su sencillez.
2. Procedimiento experimental
3.1. Materiales, reactivos y equipos
Reactivos: Muestra de hgado de vaca (Bos
Taurus) fresco, cido tricloroactico (ATA),
arena lavada, hielo, mezcla de etanol: ter:
cloroformo (2:2:1), etanol al 95%, cloruro de
sodio al 10%, reactivo de Molisch (0,5 g de -
naftol en 10 ml de etanol 95%), cido sulfrico
concentrado, reactivo de Lugol (solucin acuosa
de I
2
al 1% y KI al 2 %), Fehling A (7 g de sulfato
cprico monohidratado en 100 ml de agua
destilada), Fehling B (35 g de tartrato de sodio y
10 g de hidrxido de sodio en 100 ml de agua
destilada), reactivo de Barfoed (50 ml de cido
actico y 100 ml de acetato cprico al 6.6 % en
agua destilada), colorante de sudan III
((diazenil)naftalen-2-ol), anhdrido actico,
hidrxido de sodio al 25%, sulfato cprico, cido
ntrico concentrado, reactivo de Millon (10 g de
mercurio disueltos en 20 ml de cido ntrico,
diluido todo en 4 volmenes de agua), nitrito de
sodio, acetato de plomo al 5%, cido actico
glacial, molibdato de amonio, cloruro estannoso,
reactivo de Bial (3 g de orcinol en 1 L de HCl
concentrado y FeCl
3
al 1 %) y agua destilada.

Materiales: Vidrio de reloj, mortero, pipeta de 5
mL, beaker de 400 mL, beaker de 150 mL, placa
refractaria, 1 probeta de 200 mL, gradilla de
tubos de ensayo y tubos para guardar muestras.
Equipos: Balanza analtica, centrifuga y estufa.
3.2. Preparacin de la muestra
Se pes 5,395 g de hgado de vaca fresco y fri,
se dividi en trozos pequeos y se depositaron
en un mortero fri. Se adicionaron 7,5 mL de
cido tricloroactico (ATA) al 10% fri y 0,5 g de
arena lavada. Se macero en fri hasta obtener
una pasta homognea.
3.3. Separacin de carbohidratos
La pasta anterior se centrifug a 3.000 rpm
durante 10 minutos. El sobrenatante generado
(A) se guard y al residuo se le adicionaron 7,5
mL de ATA al 10% fri. Se mezcl bien y se
centrifug nuevamente a 3.000 rpm durante 10
minutos, el sobrenatante generado se mezcl
con A y el residuo (R1) constituido por lpidos,
protenas, cidos nucleicos y arena, se utiliz en
la siguiente etapa.
3.4. Separacin de glucgeno
A 10 mL de A se le adicionaron dos volmenes
de etanol al 95%, se enfri en un bao de hielo
durante 5 minutos y finalmente se centrifug a
1.000 rpm por 10 minutos. Puesto que no se
obtuvo un residuo como se esperaba, la mezcla
se llev a evaporacin hasta obtener 1 mL y se
guard el producto final (B) para su
caracterizacin.
3.5. Separacin de lpidos
Al R1 se le adicionaron 7,5 mL de la mezcla
etanol: ter: cloroformo (2:2:1) y se centrifug a
3.000 rpm durante 10 minutos. Al residuo
generado se le adicionaron 7,5 mL ms de la
mezcla etanol: ter: cloroformo, se mezcl bien
y se centrifug a 3.000 rpm durante 5 minutos.
Los dos sobrenadantes generados se mezclaron
y se llev al procedimiento de evaporacin a
bao mara. El producto final (C) se guard para
su caracterizacin. El residuo (R2) constituido
por cidos nucleicos, protenas y arena, se
guard para ser utilizado en la siguiente etapa.
3.6. Separacin de protenas y cidos
nucleicos
Al R2 se le adicionaron 5 mL de NaCl al 10% y
se calent a bao mara durante 40 minutos. En
seguida se centrifug a 8.000 rpm durante 10
minutos. El residuo generado constituido por
protenas desnaturalizadas y arena, se sec en
la estufa a 50 C y el producto final (D) se
guard para su caracterizacin.
Por otra parte, al sobrenadante se le
adicionaron dos volmenes de etanol al 95%
fri, la mezcla se llev a un bao con hielo por
3
10 minutos y a continuacin se centrifug a
1.000 rpm por 10 minutos. Puesto que no se
precipit un slido como se esperaba, la mezcla
se someti a evaporacin hasta 1 mL
aproximadamente y el producto final (E) se
guard para su caracterizacin.
Las anteriores muestras obtenidas (A, B, C, D y
E), se guardaron por una semana a una
temperatura de aproximadamente 8 C.
Despus de este tiempo se hicieron las
correspondientes pruebas de caracterizacin.
3.7. Caracterizacin de carbohidratos
Las muestras A y B se diluyeron con
aproximadamente 3 mL de agua destilada y
fueron utilizadas en las siguientes pruebas de
caracterizacin.
Prueba de Molisch: a 1 mL de la solucin de
A, se le adicionaron 3 gotas del reactivo de
Molisch, se agit y se le adicion por las
paredes del tubo 1 mL de H
2
SO
4
concentrado.
Prueba de Lugol: a 1 mL de la solucin de B,
se le adicionaron 2 gotas del reactivo de
Lugol y se agit.
Prueba de Fehling: a una mezcla de 2 mL de
Fehling A y 2 mL de Fehling B, se le
adicion 1 mL de la solucin de A, la mezcla
se llev a un bao de agua hirviendo por 1
minuto.
Prueba para monosacridos y disacridos: a
2 mL del reactivo de Barfoed, se le adicion
1 mL de la solucin de A, se agit y calent
en un bao de agua hirviendo por 1 minuto.
3.8. Caracterizacin de lpidos
La muestra C se disolvi con etanol y esta
solucin fue utilizada para las siguientes
pruebas de caracterizacin.
Prueba de lpidos en general: sobre un papel
filtro se coloc una gota de la solucin de C
y a continuacin sobre esa gota se coloc
una gota del colorante sudan III.
Prueba para colesterol: a 2 mL de la
solucin de C, se le adicionaron 0,5 mL de
anhdrido actico y 1 mL de H
2
SO
4
concentrado, la mezcla se agit y se dej
reposar a temperatura ambiente por 20
minutos.
3.9. Caracterizacin de protenas
La muestra D se disolvi en agua destilada y
esta solucin se us para las siguientes pruebas
de caracterizacin.
Reaccin de Biuret: a 1 mL de la solucin de
D, se le accionaron 2 mL de NaOH al 25%,
se mezcl cuidadosamente y se le
agregaron 3 gotas de sulfato cprico al 1% y
se mezcl.
Reaccin de Xantoproteica: a 1 mL de la
solucin de D, se le adicion 1 mL de HNO
3
concentrado. A continuacin se calent a
bao mara por un minuto. Se dej enfriar la
mezcla y se le adicionaron 3 mL de NaOH al
25%.
Reaccin de Millon: a 1 mL de la solucin de
D, se le adicionaron 0,5 mL del reactivo de
Millon, se agit y en seguida le adicionaron
0,5 mL de NaNO
2
, se agit y finalmente se
calent a bao mara por minuto.
Prueba para aminocidos azufrados: a 1 mL
de la solucin de D, se le adicion 1 mL de
hidrxido de sodio al 25%, se calent a bao
mara por 10 minutos. En seguida se enfri
con agua fra y se le adicionaron 2,5 mL de
acetato de plomo al 5%, se agit y se
calent a bao mara por varios minutos.
Prueba para triptfano (reaccin de cido
glioxlico): a 1 mL de la solucin de D, se le
adicion 1mL de cido actico glacial y 1 ml
de H
2
SO
4
concentrado suavemente por las
paredes del tubo.
3.10. Caracterizacin de cidos nucleicos
La muestra E se disolvi con agua y se acidifico
con H
2
SO
4
hasta un pH de aproximadamente 4.
La solucin se us para las siguientes pruebas
de caracterizacin.
Prueba de fosfatos: a 1 mL de la solucin de
E, se le adicionaron 2 mL de molibdato de
amonio y 1 mL de cloruro estannoso, se
agit y dej reposar.
Prueba de pentosas: a 1 mL de la solucin
de E, se le adicionaron 2 mL del reactivo de
Bial y a continuacin se calent en bao
mara por varios minutos.
4
3. Resultados y discusin
3.1. Aislamiento de los principales
constituyentes
En el aislamiento de los diferentes
constituyentes principales del hgado, se
presentaron resultados no esperados en las
siguientes partes:
El glucgeno no fue posible aislarlo como
slido y se dej en solucin alcohlica.
Los cidos nucleicos tampoco fueron
posibles de obtenerse como slidos y
tambin fueron dejados en solucin
alcohlica.
Estos resultados son atribuidos a la temperatura
a la que se trabaj, la cual no corresponda a 4
C, si no a aproximadamente 10 C. Si embargo,
lo anterior no afect las pruebas de
caracterizacin, ya que todas presentaron
resultados positivos o esperados. Los
resultados de la caracterizacin se resumen en
la tabla 1.
3.2. Caracterizacin de carbohidratos
En todas las pruebas realizadas para la
identificacin de carbohidratos, se obtuvieron
resultados positivos.
La prueba de Molisch la cual es utilizada para
reconocimiento general de carbohidratos. En
donde, los polisacridos y los disacridos, se
hidrolizan con cido sulfrico concentrado hasta
monosacridos y se convirtierten en derivados
del furfural los cuales reaccionaron con -naftol
formando un color prpura violeta. [3] La
ecuacin qumica del proceso se indica a
continuacin (figura 1).
Figura 1. Ecuacin qumica de la prueba e Molisch.
En la prueba de Lugol, el reactivo que consiste
en una mezcla de yodo y yoduro, permiti
reconocer la presencia de glucgeno
(polisacrido), por formacin de una coloracin
rojiza. [4] Esto se debe a la formacin de un
complejo entre el polisacrido y el I
2
. [5]
La prueba de Fehling, indic la presencia de
azucares reductores (aldosas: glucosa, ribosa,
eritrosa, etc.). La prueba es una reaccin redox
en la que el grupo aldehdo (reductor) de los
azcares es oxidado a carboxilo por el Cu
2+
.
Tanto los monosacridos como los disacridos
reductores reaccionan con el Cu
2+
dando un
precipitado rojo correspondiente al xido
cuproso. Esto indic la presencia de azucares
reductores en la muestra. [6] La ecuacin
qumica que describe el proceso es la siguiente:
Figura 2. Ecuacin qumica de la prueba de Fehling.
La prueba para la diferenciacin entre
monosacridos y disacridos, tambin contiene
ion cprico que se reduce hasta xido cuproso
ms rpidamente con los monosacridos que
con los disacridos. [4] El resultado obtenido fue
la formacin casi inmediata de un precipitado
amarrillo rojizo, que se increment con el pasar
del tempo, esto permiti concluir que la muestra
contena tanto monosacridos como
disacridos.
En las vacas, el hgado es un principal productor
de glucosa, esta se sintetiza a partir de
propionato, el cual ha sido producido
previamente por la fermentacin ruminal. Por lo
tanto, era esperado que la prueba de Fehling
resultara positiva. [7]
El glucgeno es la forma de almacenamiento de
la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra
principalmente en el hgado y en el msculo
representando hasta con un 10% y un 1-2% de
su peso hmedo, respectivamente. Por tanto, el
resultado de la prueba de Lugol (identificacin
de polisacridos) coincide con lo esperado. [8]
5
Tabla 1. Resultados de la caracterizacin de las muestras aisladas (A, B, C, D y E)
Prueba Observacin
Carbohidratos (muestras A y B)
Prueba de Molisch Formacin de dos fases separadas por un anillo color violeta.
Prueba de Lugol Coloracin rojiza.
Prueba de Fehling Precipitado pardo rojizo.
Prueba para monosacridos y disacridos Precipitado color rojo.
Lpidos (muestra C)
Prueba para lpidos en general Formacin de una mancha color caf.
Prueba para colesterol Aparicin de un color verdoso.
Protenas (muestra D)
Reaccin de Biuret Solucin color violeta.
Reaccin de Xantoproteica Al final se obtuvo una solucin naranja.
Reaccin de Millon Precipitado color rojizo.
Prueba para aminocidos azufrados Precipitado negro.
Prueba para triptfano Formacin de dos fases separadas por un anillo color violeta.
cidos nucleicos (muestra E)
Prueba de fosfatos Solucin color azul.
Prueba de pentosas Solucin color azul.
3.3. Caracterizacin de lpidos
Los resultados positivos de las pruebas
cualitativas de identificacin de lpidos,
concuerdan con la teora, ya que el hgado
cumple con funciones metablicas de los
lpidos, entre ellas: la formacin de la mayor
parte de lipoprotenas y la formacin de
cantidades considerables de colesterol y
fosfolpidos. [9]
3.4. Caracterizacin de Protenas
La reaccin de Biuret, est dada por aquellas
sustancias cuyas molculas contienen dos
grupos carbamino unidos directamente o a
travs de un solo tomo de carbono o nitrgeno.
El Cu
2+
del reactivo de Biuret forma un complejo
de coordinacin. En donde, los pares de
electrones no compartidos del nitrgeno que
forma parte de los enlaces peptdicos, se
coordinan al metal (figura 3), esto provoca un
cambio de coloracin que depende de la
naturaleza de la protena. Dado que ocurri un
cambio de coloracin en la prueba realizada, se
concluy que la muestra contena polipptidos.
La reaccin de Xantoproteica, caracteriza a los
aminocidos aromticos. Esta reaccin se debe
a la presencia de un grupo fenilo en la molcula
proteica. Los aminocidos de la molcula
proteica que son de importancia en esta
reaccin son la tirosina y el triptfano. Para esta
prueba, se produce la nitracin del anillo
bencnico de los aminocidos aromticos,
obtenindose nitrocompuestos de color amarillo,
que se vuelven anaranjados en medios
fuertemente alcalinos. [3] Tanto el triptfano
como la tirosina, esta presente en el hgado.
Estos aminocidos, son degradados
por enzimas hepticas denominadas
aminotransferasas o transaminasas (ALAT y
ASAT). [10] [11] [12] Por tanto, era esperado
que la prueba de Xantoproteica resultara
positiva.
Figura 3. Complejo de coordinacin formado en la
prueba de Biuret.
La reaccin del Milln se debe a la presencia del
grupo hidroxifenilo en la molcula proteica. Esta
prueba confirm la presencia de tirosina en la
muestra. Ya que los compuestos mercricos en
un medio fuertemente cido, se condensan con
el grupo fenlico formando un compuesto de
color rojo ladrillo o rojizo. [3] Lo que concuerda
con el resultado obtenido en la prctica.
6
La reaccin de cido glioxlico, confirm la
presencia de triptfano en la muestra, ya que
present un resultado positivo.
Dado que el hgado cumple una funcin
metablica con las protenas, los aminocidos
azufrados tambin deben estar presentes en el
hgado. En la prctica se obtuvo un resultado
positivo en la identificacin de aminocidos
azufrados.
3.5. Caracterizacin de cido nucleicos
El resultado positivo en la prueba de fosfatos, se
justifica por la reaccin del grupo fosfato con el
cido molbdico, para formar el cido 12-
molibdofosfrico, este a su vez es reducido por
el cloruro de estao a azul de molibdeno,
compuesto de composicin desconocida que
contiene una mezcla de Mo (VI) y Mo (V) y
absorbe a 690 nm del espectro
electromagntico. La intensidad del color azul
formado depende de la concentracin de
fosfatos encontrados en la muestra. [13] las
ecuaciones qumicas del proceso se indican en
la figura 4.
El resultado de la identificacin de pentosas
tambin fue positivo, esto se justifica por la
formacin de un complejo. El cual se forma de la
siguiente manera: el ADN que contiene en su
estructura la desoxiribosa (furanosa), despus
de una hidrlisis y la adicin de orcinol en
presencia de iones frricos, se forma un
complejo que torna la solucin de un color verde
oscuro. Las ecuaciones qumicas involucradas
en le proceso se muestran el la figura 4.
Figura 4. Ecuaciones qumicas de la caracterizacin
de cidos nucleicos.
4. Conclusin
El desarrollo de la prctica fue satisfactorio, ya
que se obtuvieron los resultados tericamente
esperados. Aunque no fue posible la obtencin
de las muestras slidas de glucgeno y cidos
nucleicos. Sin embargo, esto no fue
impedimento para su caracterizacin.
El procedimiento manejado en la practica esta
bien elaborado, ya que permiti el aislamiento
de los diferentes constituyentes principales de
una muestra de hgado de vaca y las diferentes
pruebas de anlisis cualitativo usadas en la
prctica, siguen siendo una buena herramienta
para la caracterizacin e identificacin de
diferentes sustancias.
Observamos en el desarrollo de la prctica, el
constituyente principal mayoritario del hgado,
corresponda a protenas. Lo que nos hace
clasificarlo como una buena fuente de
aminocidos para la dieta alimenticia.
Para completar la prctica seria interesante
realizar o tener en cuenta la parte cualitativa, la
cual no fue posible hacerse para este trabajo.
Tambin seria interesante una identificacin
ms detallada de los productos aislados, usando
tcnicas ms especificas, que permitan
diferenciar las diferentes clases de sustancias
presentes en cada constituyente aislado.
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