Alessandra Abro Resende

MECANISMOS GERAIS DE DEGRADAO BACTERIANA DOS

COMPOSTOS HIDROCARBONETOS MONOAROMTICOS:
BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO E XILENO (BTEX)

Belo Horizonte
2007

Alessandra Abro Resende

MECANISMOS GERAIS DE DEGRADAO BACTERIANA DOS

COMPOSTOS HIDROCARBONETOS MONOAROMTICOS:
BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO E XILENO (BTEX)

Monografia apresentada ao Departamento de

Microbiologia do Instituto de Cincias Biolgicas
da Universidade Federal de Minas Gerais, como
parte dos requisitos para obteno do ttulo de
Especialista

em

Microbiologia

Ambiental

Industrial.

ORIENTADORA: Prof. Vera Lcia dos Santos

Belo Horizonte
2007

AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente a Deus por sempre iluminar meus caminhos e pela proteo nos
momentos difceis.
A minha me Neuza, meu pai Welington e irmzinha Dani, por todo apoio, carinho e amor de
uma vida. Sem eles, nada disso teria sido possvel. Aos avs, padrinhos, tios e primos, por
sempre terem acreditado em mim e por todo o amor e mimo de sempre.
Ao Lorenzo e s amigas queridas, Taty, Carolinas (Little e Degols), Fabi, Nana, Bia, pelo
amor e compreenso, principalmente nos momentos de ausncia, pela fora, nos momentos
mais difceis. Obrigada por fazerem minha vida mais repleta de alegria.
A minha orientadora, Profa. Vera Lcia dos Santos, agradeo pela orientao e incentivo a
percorrer novos caminhos, e aos demais professores do curso de Especializao, pela
contribuio para minha formao, pela pacincia e dedicao.
A todos os colegas do curso de Especializao, em especial, Lcia, Clber, Vivi e Lo, por
terem tornado as sextas e sbados de estudo momentos menos rduos. Obrigado pela tima
convivncia, amizade e cooperao.
Aos colegas do Laboratrio de Sade Pblica / gua e do FAS, pela alegria do dia-a-dia e
pela compreenso e apoio nos momentos de sufoco.
A Universidade Federal de Minas Gerais pela bolsa de estudo, tornando possvel a
concretizao de mais uma etapa da minha vida profissional.
A todos que de alguma forma contriburam para que este momento fosse possvel, meu muito
obrigado.

RESUMO
RESENDE, A.A. (2007) Mecanismos gerais de degradao bacteriana dos compostos
hidrocarbonetos monoaromticos: benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX). Belo
Horizonte, 2007. Monografia (Especializao), Departamento de Microbiologia do Instituto
de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais.

Os compostos benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX) so hidrocarbonetos

monoaromticos, cuja origem no meio ambiente, em geral, est relacionada s atividades de
extrao e refino de petrleo e derivados. Tais compostos so contaminantes comuns de solos
e guas, entretanto, devido elevada toxicidade e carter mutagnico e carcinognico a seres
humanos, fauna e flora locais, vrios esforos tm sido feitos para desenvolver estratgias de
sua remoo do meio. A biorremediao, como mtodo de remoo destes hidrocarbonetos
aromticos, tem sido alvo de muitas pesquisas h mais de meio sculo. Consequentemente, o
entendimento dos mecanismos de biodegradao desses compostos orgnicos tem sido
aprimorado desde ento. de conhecimento que os BTEX podem ser biodegradados,
servindo como fonte de carbono e energia para os microrganismos, sob condies aerbias e
anaerbias, incluindo neste ltimo caso condies nitrificantes, ferro e sulfato-redutoras. Na
degradao bacteriana desses compostos, sob ambas as condies, podem ser observadas duas
vias distintas: uma inicial, que leva formao de intermedirios centrais comuns, entre eles o
catecol e o benzoil-CoA; e uma segunda, que promove a transformao dessas molculas em
metablitos centrais que possam ser utilizados pela clula. Os genes que codificam as enzimas
relacionadas s vias de degradao dos BTEX esto sob constante regulao por protenas
especficas moduladas por substratos e intermedirios das vias e por mecanismos de regulao
globais, permitindo uma resposta coordenada ao estado fisiolgico e metablico da clula. O
entendimento das vias de degradao dos BTEX, de sua gentica e seus mecanismos de
regulao gerais de grande relevncia para o avano das tcnicas de biorremediao. Sendo
assim, este trabalho se prope a fazer uma reviso das principais vias de degradao
bacteriana dos hidrocarbonetos monoaromticos do grupo BTEX descritas na literatura, bem
como dos aspectos relacionados citados anteriormente, e sumarizar brevemente algumas de
suas aplicaes biotecnolgicas em processos de biorremediao e potenciais implicaes
ambientais.

SUMRIO
1 INTRODUO ............................................................................................................. 01
2 DESENVOLVIMENTO ............................................................................................. 03
2.1 Os BTEX e suas principais fontes .................................................................................. 03
2.2 Tratamento de stios contaminados ............................................................................... 06
2.2 A BIODEGRADAO DOS COMPOSTOS BTEX ................................................................... 08
2.2.1 As bactrias como agentes da degradao dos compostos BTEX ..................... 08
2.2.2 As vias de degradao bacteriana dos BTEX ...................................................... 12
2.2.2.1 Vias aerbias de biodegradao do BTEX ..................................................... 13
2.2.2.1.1 Etapas iniciais de degradao aerbia dos BTEX ..................................... 14
2.2.2.1.2 Oxidao dos intermedirios centrais da degradao aerbia dos BTEX ..19
2.2.2.2 Vias anaerbias de biodegradao do BTEX .................................................. 21
2.2.2.2.1 Etapas iniciais de degradao anaerbia dos BTEX ................................. 23
2.2.2.2.2 Oxidao dos intermedirios centrais da degradao anaerbia dos BTEX
................................................................................................................................... 28
2.2.3 Mecanismos de regulao enzimtica das vias catablicas relacionadas
degradao bacteriana dos BTEX ................................................................................ 29
2.3 A

BIORREMEDIAO

COMO

ALTERNATIVA PARA

TRATAMENTO

DE

REAS

CONTAMINADAS POR BTEX ................................................................................................... 36

2.3.1 Tcnicas de estudo de microrganismos com potencial aplicao em processos de

biorremediao ................................................................................................................ 37
2.3.2 Exemplos de processos de biorremediao em diferentes ambientes
contaminados por BTEX ................................................................................................ 40
2.4 PERSPECTIVAS

QUANTO AO USO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA CONSTRUO DE

LINHAGENS COM AMPLA CAPACIDADE DE DEGRADAO ...................................................... 42

3 CONCLUSO ............................................................................................................... 44
4 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................. 46

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estruturas qumicas das molculas dos compostos BTEX. ................................... 03

Figura 2 Ataque inicial do benzeno por oxigenases ............................................................ 14
Figura 3 - Reaes envolvidas na primeira etapa das vias de degradao aerbia de tolueno.16
Figura 4 Primeira etapa da via de degradao aerbia do etilbenzeno..................................18
Figura 5 Primeira etapa da via de degradao aerbia do meta-xileno .................................18
Figura 6 Degradao do catecol, intermedirio comum das vias de degradao dos BTEX,
pelas vias de orto e meta clivagem............................................................................................20
Figura 7 Desenho esquemtico da utilizao microbiana dos hidrocarbonetos aromticos,
evidenciando o rendimento energtico do metabolismo aerbio ou anaerbio da molcula, em
funo do aceptor de eltrons utilizado.....................................................................................22
Figura 8 Potenciais reaes iniciais da via de degradao anaerbica do benzeno:
carboxilao, metilao ou hidroxilao, com seus respectivos produtos, benzoato, tolueno e
fenol ........................................................................................................................................ 24
Figura 9 - Primeira etapa da via de degradao anaerbia do tolueno .................................... 25
Figura 10 Etapas iniciais da via de degradao anaerbia do etilbenzeno .......................... 26
Figura 11 Etapas iniciais das vias de degradao das molculas m-xileno e o-xileno ........ 27
Figura 12 Esquema da via de degradao anaerbia do intermedirio central comum das
vias: benzoil-CoA ................................................................................................................... 28
Figura 13 Esquema ilustrativo da rede de processos e sinais que regulam a capacidade
metablica de degradao bacteriana dos compostos aromticos, evidenciando os trs tipos de
regulao gnica: mecanismos de resposta especfica a reguladores transcricionais,
mecanismos de resposta global e mecanismos de respostas comportamentais ..................... 30

LISTA DE TABELAS

Tabela

Parmetros fsico-qumicos de

importncia

para

mobilidade

de

hidrocarbonetos........................................................................................................................ 06
Tabela 2 Principais grupos de bactrias envolvidas na degradao dos hidrocarbonetos
monoaromticos do grupo BTEX ........................................................................................... 10
Tabela 3 Protenas regulatrias representativas envolvidas no metabolismo dos
BTEX....................................................................................................................................... 31

1 INTRODUO

Os compostos benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX) so hidrocarbonetos

monoaromticos, cuja origem est relacionada, em geral, s atividades de extrao e refino de
petrleo e derivados. Alm de participarem em boa parte da composio de combustveis
fsseis, esses compostos so utilizados em vrios setores industriais, como a produo txtil e
produo de pesticidas, entre outros. Os BTEX so contaminantes comuns de solos e gua.
Esses compostos podem chegar ao meio ambiente atravs de descarga dos efluentes
industriais, acidentes durante o processo de produo, transporte e estocagem de produtos
qumicos e de produtos derivados do refino do petrleo, em especial a gasolina.
A poluio causada pelos compostos BTEX um tpico de grande relevncia para a sade
humana, da flora e da fauna ambientais. Esses compostos apresentam elevada toxicidade, em
geral, relacionada s suas propriedades mutagnicas e carcinognicas. Alm disso, tais
compostos aromticos podem causar distrbios neurolgicos, alteraes nas funes do
sistema endcrino e leses em rgos como os rins e o fgado.
Considerando as grandes quantidades de hidrocarbonetos contaminantes no ambiente e sua
elevada toxicidade, existe uma grande preocupao em remover tais compostos do meio. Os
mtodos qumicos e fsicos disponveis, muitas vezes, no so capazes de promover a
remoo efetiva dos poluentes. Uma alternativa promissora a esses processos, devido ao seu
custo relativamente baixo e alta eficincia, a degradao biolgica dos contaminantes,
chamada

de

biorremediao.

biorremediao

fundamenta-se

na

utilizao

de

microrganismos capazes de degradar os compostos orgnicos, decompondo os mesmos em

molculas mais simples como CO2, CH4 e H2O.
Aps os carboidratos, os compostos aromticos so uma das classes de compostos orgnicos
mais largamente distribudos, que constituem uma fonte importante de carbono e energia para
os microrganismos. As bactrias, em especial, so um grupo de microrganismos muito
versteis, capazes de transformar uma grande variedade de compostos hidrocarbonetos, o que
as torna uma poderosa ferramenta para a biorremediao de stios contaminados por BTEX.
A degradao bacteriana dos compostos BTEX pode ocorrer sob condies aerbias, em que
o aceptor de eltrons o oxignio, e em condies anaerbias, em que o ferro (III), o nitrato e

o sulfato constituem os principais aceptores de eltrons. Em ambas as condies, as primeiras

reaes de modificao do substrato apresentam certas particularidades, com relao aos
mecanismos e enzimas participantes. Entretanto, tais reaes levam formao de um nmero
restrito de intermedirios centrais, como por exemplo, o catecol e o protocatecuato, nas vias
de degradao em condies aerbias, e o benzoil-CoA, nas vias de degradao em condies
anaerbias. Os intermedirios centrais das vias so, ento, catabolizados por vias de
degradao comuns, que levam formao dos metablitos centrais, como acetil-CoA,
acetato e piruvato, que participam de processos importantes na clula, como o ciclo de Krebs.
O aprimoramento dos conhecimentos relativos aos microrganismos potencialmente
degradadores de compostos BTEX e das vias envolvidas neste tipo de metabolismo de
grande relevncia para o avano das tcnicas de biorremediao de stios contaminados por
BTEX. Primeiramente, porque permite a obteno de inoculantes promissores, capazes de
promover a degradao dos poluentes com rapidez e eficincia. Segundo, porque permite a
utilizao de tcnicas moleculares para manipulao dos componentes genticos relacionados
s vias, como genes que codificam enzimas e protenas regulatrias e promotores ligados aos
operons catablicos. Alm disso, as tcnicas moleculares possibilitam a obteno de
microrganismos geneticamente modificados que renam caractersticas que os tornem
capacitados para promover a degradao de substratos diferentes em condies ambientais
diversas.
A proposta deste trabalho fazer uma reviso das principais vias de degradao bacteriana
dos hidrocarbonetos monoaromticos do grupo BTEX descritas na literatura, sua gentica e os
mecanismos de regulao gerais, e sumarizar brevemente algumas de suas aplicaes
biotecnolgicas em processos de biorremediao e potenciais implicaes ambientais.

2 DESENVOLVIMENTO

2.1 OS BTEX E SUAS PRINCIPAIS FONTES

Os hidrocarbonetos so uma classe de substncias orgnicas, cujas molculas so compostas

exclusivamente por tomos de hidrognio e carbono. Entre os hidrocarbonetos, podemos
distinguir duas classes distintas: hidrocarbonetos alifticos e hidrocarbonetos aromticos. Os
compostos alifticos podem ser divididos em aqueles de cadeia linear, cadeia ramificada e
cicloalcanos. J os compostos aromticos so aqueles que possuem em sua estrutura um ou
vrios anis aromticos, caracterizados pelas duplas ligaes alternadas originando um
fenmeno chamado de ressonncia. O benzeno e outros alquilbenzenos so compostos
aromticos que possuem apenas um anel aromtico. Entre esses hidrocarbonetos
monoaromticos, encontra-se uma classe particular de compostos denominados BTEX:
benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (Figura 1).
(a)

(b)

(c)

CH3

CH2 CH3

Benzeno

Tolueno

Etilbenzeno

(d)

(e)

(f)

CH3

CH3

CH3

CH3
CH3
CH3
orto-xileno

meta-xileno

para-xileno

Figura 1 Estruturas qumicas das molculas dos compostos BTEX. (a) Benzeno, (b) tolueno,
(c) etilbenzeno (d) orto-xileno, (e) meta-xileno e (f) para-xileno.

Os compostos BTEX so contaminantes comuns de solos e guas. Os BTEX so comumente

utilizados em uma srie de atividades industriais, possuindo aplicaes nas mais diversas
reas: extrao de metais, pintura, txtil, processamento de madeira, produtos qumicos,
pesticidas, detergentes e produtos do tabaco (CHAKRABORTY & COATES, 2004). Esses
hidrocarbonetos podem chegar ao meio ambiente atravs da descarga dos efluentes industriais
e tambm atravs de acidentes durante o processo de produo, transporte e estocagem.
Entretanto, a grande parcela do processo de contaminao pode ser atribuda s atividades de
refinarias de petrleo e seus derivados, em especial, a gasolina, cuja composio pode variar
de 10 a 60% de compostos BTEX (GLENSOY & ALVAREZ, 1999).
No perodo de 1975 a 2001, foram relatados pela comisso mista que analisa acidentes da
Petrobrs/ Repar (CREA-PR) trinta e trs acidentes envolvendo derramamento de petrleo e
seus derivados no Brasil, somando milhes de litros que contaminaram solos, rios e mares.
Em julho de 2000, um acidente ocorrido durante a transferncia de petrleo entre terminais no
litoral de Santa Catarina foi o responsvel pela contaminao dos rios Barigi e Iguau, por
cerca de 4 milhes de litros de petrleo, provocando danos significativos flora e fauna
aquticas e srio risco sade dos moradores locais (revisado por TIBURTIUS et al., 2004).
Talvez, mais importante do que os grandes acidentes sejam os pequenos acidentes, na maioria
das vezes, no notificados, e que quando somados, apresentam um dano muito superior aos
outros de maior porte. Entre esses pequenos acidentes, encontram-se principalmente a
contaminao de lenis subterrneos de gua por vazamentos de derivados de petrleo em
solos de garagens de caminhes e nibus e em postos de combustvel. A Agncia de Proteo
Ambiental Norte Americana (EPA) estima que existam mais de 1,5 milhes de tanques
subterrneos de armazenamento de gasolina nos Estados Unidos, entre os quais pelo menos
30% esto com problemas de vazamento (SILVA et al., 2002). No Brasil, existe cerca de 30
mil postos de combustveis, muitos sob risco de ocorrerem vazamentos devido ao longo
tempo de vida (alguns tm mais de 25 anos), o que aumenta a probabilidade de apresentarem
rachaduras ou corroso (SILVA et al., 2002).
Quando ocorre uma contaminao de um curso de gua ou de um solo por petrleo ou alguns
de seus derivados, eles se espalham pelo ambiente, ficando sujeitos a vrias modificaes,
principalmente, em relao sua composio. Entre os fenmenos envolvidos nesse processo
encontram-se a evaporao de fraes de baixo peso molecular, dissoluo de alguns

componentes hidroflicos, adsoro s partculas presentes em sedimentos ou solos, oxidao

fotoqumica e biodegradao (HARAYAMA et al., 2004).
Tais compostos relacionados ao petrleo e seus derivados tambm apresentam uma cintica
especfica quando presentes no meio. Durante migrao atravs de solos e sedimentos em
cursos dgua, a frao mais polar (compostos nitrogenados, sulforados e oxigenados, nalcanos de pequena cadeia e pequenos hidrocarbonetos aromticos) capaz de maior
espalhamento em superfcie e em profundidade, enquanto a frao menos polar permanece
adsorvida s partculas do solo (JOVANCICEVIC et al., 2005).
Em um derramamento e/ou vazamento de combustvel, uma das principais preocupaes a
contaminao dos aqferos que so usados como fonte de abastecimento de gua para o
consumo humano. Os maiores problemas de contaminao so atribudos aos hidrocarbonetos
monoaromticos, que so os constituintes mais solveis e mveis da frao da gasolina. Esses
compostos tm maior mobilidade em sistema solo-gua devido ao menor coeficiente de
partio entre octanol-gua (Tabela 1), o que leva a uma lenta adsoro no solo e um
transporte preferencial pela gua, provocando a contaminao de mananciais de
abastecimento. Essa mobilidade aumentada pela adio de lcool na gasolina
comercializada no Brasil, devido ao efeito de cossolvente do lcool (SILVA et al., 2002,
TIBURTIUS et al., 2004).
A contaminao de mananciais de abastecimento particularmente problemtica devido alta
toxicidade dos compostos BTEX e outros alquilbenzenos. Tal toxicidade est relacionada ao
potencial carcinognico e mutagnico desses compostos (SILVA et al., 2002).
Os valores mximos permitidos para os diferentes hidrocarbonetos monoaromticos em guas
destinadas para consumo humano, de acordo com o estabelecido pela Portaria 518/2004 do
Ministrio da Sade (BRASIL, MINISTRIO DA SADE, 2004), so 5g.L-1 para o
benzeno, 170g.L-1 para o tolueno, 200g.L-1 para o etilbenzeno e 300g.L-1 para o xileno.
No Brasil, o benzeno reconhecido oficialmente como um agente cancergeno pela Portaria
da Secretaria de Segurana e Sade no Trabalho n 14 de dezembro de 1995 (BRASIL,
SECRETARIA DE SEGURANA E SADE NO TRABALHO, 1995). Entre os casos de
cncer relatados, as leucemias so as mais freqentes, resultado dos danos cromossmicos
provocados pelo benzeno, principalmente em linfcitos e clulas da medula ssea de humanos
e outros seres vivos. Alm do potencial carcinognico e mutagnico, os BTEX so poderosos

Tabela 1 - Parmetros fsico-qumicos de importncia para a mobilidade de hidrocarbonetos

(modificada de WATTS et al., 2000).
Composto
Benzeno
Tolueno
Xileno
Nonano
Decano
Dodecano

Solubilidade em gua (mg/L)a

1760
532
163-185
0,122
0,021
0,005

Log Kaow
2,12
2,73
2,95-3,26
4,67
6,69
7,24

Kaow: Coeficiente de partio octanol-gua

depressores do sistema nervoso central, podendo levar a alteraes nas capacidades motoras e
neurolgicas, bem como alteraes nos sistemas endcrinos e enzimticos (revisado por
TIBURTIUS et al., 2004).
No apenas o contato direto com os hidrocarbonetos monoaromticos prejudicial sade do
homem. Organismos aquticos (flora e fauna) so capazes de absorver ou ingerir tais
compostos, armazenando os mesmos em suas molculas proticas e reservas lipdicas. No
tecido adiposo, os hidrocarbonetos encontram-se inalterados, levando a um processo de
transferncia na cadeia alimentar, at atingir o homem. A ingesto e acmulo de
hidrocarbonetos em doses muitas vezes pequenas podem acarretar em processos de
intoxicao crnica, trazendo srias implicaes para a pesca, sade pblica e meio ambiente
(SILVA et al., 2002).

2.1.1 TRATAMENTO DE STIOS CONTAMINADOS

O tratamento dos stios contaminados por BTEX de grande relevncia considerando os

problemas ambientais e de sade pblica que tais compostos podem ocasionar e o tempo que
os mesmos permanecem no ambiente quando nenhum procedimento a mais realizado para
auxiliar a degradao natural destes compostos.

O tratamento desses poluentes pode ser realizado atravs de processos fsicos, qumicos e
biolgicos. s vezes, o tratamento exige a remoo do solo ou gua contaminados, podendo
ser realizado, em outras circunstncias, no prprio local.
O carvo ativado muito utilizado para remoo de contaminantes orgnicos, por meio do
processo de adsoro. Outro processo utilizado para remoo de compostos orgnicos pouco
polares, chamado air striping, consiste na injeo de ar dentro do aqfero contaminado, a
transferncia dos contaminantes volteis para a fase gasosa e sua separao por um sistema de
extrao de vapor. Esses processos so eficientes, entretanto, no so destrutivos. O carvo
ativado gera fases slidas saturadas com contaminantes, enquanto o air striping libera gases
txicos (TIBURTIUS et al., 2004).
Um processo qumico muito usado a oxidao cataltica, em que o ar aquecido a 300500C por um tempo curto. Esse processo dispendioso pelo alto gasto de energia e uso de
catalisadores de elevado custo, como a platina (KIM, 2002). Entre outros processos fsicos e
qumicos existentes, podemos citar: a utilizao de radiao, como microondas (CHIH-JU &
TAI, 1998); e o emprego de radicais livres hidroxilas (OH) em processos oxidativos
avanados, utilizando oznio, perxido de hidrognio, semicondutores, reagente de Fenton e
radiao ultravioleta (FREIRE et al., 2000; WATTS et al., 2000).
Devido s limitaes dos diferentes mtodos citados anteriormente, para que a remoo seja
efetiva, vrios processos devem ser usados em conjunto, o que acaba elevando o custo e
tempo do tratamento. Uma alternativa promissora aos processos citados anteriormente a
degradao biolgica dos contaminantes, chamada de biorremediao. Segundo Tiburtius et
al. (2004), a biorremediao um dos processos mais utilizados para a remoo dos BTEX e
fundamenta-se na utilizao de microrganismos capazes de degradar os compostos orgnicos,
decompondo os mesmos em molculas mais simples como CO2, CH4 e H2O (mineralizao).
um processo de custo relativamente baixo e alta eficincia.
A biorremediao s possvel graas versatilidade microbiana, no que diz respeito s vias
catablicas, enzimas envolvidas e capacidade de adaptao. As principais vias catablicas de
degradao dos compostos BTEX por bactrias sero abordadas nos captulos posteriores. No
captulo 3 tambm ser abordado o tema da biorremediao com maior ateno.

2.2 A BIODEGRADAO DOS COMPOSTOS BTEX

2.2.1 AS BACTRIAS COMO AGENTES DA DEGRADAO DOS COMPOSTOS BTEX

Durante a primeira metade do sculo XX, um extenso nmero de vias bioqumicas, tanto de
biossntese quanto de degradao, foi elucidado, e os microrganismos se tornaram exemplos
primos da versatilidade da vida. Apenas entre estes seres vivos podem ser observados
exemplos de tolerncia a ambientes extremos, cujas temperaturas beiram as de congelamento
e ebulio da gua, ou cujos valores de pH so capazes de ir de um ponto extremo a outro na
escala.
No apenas a capacidade de sobreviver em ambientes extremos ilustra a versatilidade
microbiana, mas tambm a rapidez com a qual os microrganismos so capazes de se adaptar e
modificar seu aparato enzimtico face s novas mudanas ambientais, produzindo uma larga
variedade de tipos fisiolgicos conhecidos hoje (PALLERONI, 1995). Somente entre os
microrganismos, possvel encontrar atividades catablicas de grande interesse, que
permitam, por exemplo, atividades como a biorremediao de ambientes altamente
contaminados por compostos orgnicos recalcitrantes que so txicos para outras formas de
vida superiores.
Desde 1945, Claude Zobell j afirmava que os mltiplos efeitos das bactrias na formao e
transformao dos hidrocarbonetos do petrleo seriam uma nova fronteira de conhecimento
(revisado por CHAKRABORTY & COATES, 2004). Hoje, de conhecimento que grande
parte das modificaes na composio dos compostos orgnicos presentes no ambiente,
incluindo componentes do petrleo e produtos de seu processamento, acontece devido
atividade microbiana. Em geral, os hidrocarbonetos do petrleo so degradados na seguinte
ordem: n-alcanos > alcanos monocclicos > alquil benzenos > alcanos isoprenides > alquil
naftalenos > alcanos bicclicos > esteranos > hopanos (SUN et al., 2005). Essa alterao pode
dar-se em espaos de tempo relativamente curtos, desde alguns meses at alguns anos
(JOVANCICEVIC et al., 2005).
Diversos estudos tm relatado os processos de biodegradao de hidrocarbonetos aromticos e
os microrganismos envolvidos na degradao desses compostos sob condies ambientais

diversas, tais como: ambientes marinhos (HARAYAMA et al., 2004; COHEN, 2002; HEAD
& SWANNELL, 1999) e continentais, guas de superfcie (ANTIC et al., 2006) e
subterrneas, solos e sedimentos (CAVALCA et al., 2000; PHELPS & YOUNG, 1999),
condies aerbias e anaerbias (ZHANG & BENNETT, 2005; CHAKRABORTY &
COATES, 2004; HOLLIGER & ZEHNDER, 1996), ambientes extremos (MARGESIN &
SCHINNER a,b, 2001).
As bactrias possuem uma ampla capacidade de degradar os hidrocarbonetos aromticos do
grupo BTEX. Muitos outros microrganismos apresentam a capacidade de degradao desses
compostos, entre eles organismos eucariotos como fungos, algas, entre outros, que tambm
tm um papel importante nos processos de detoxificao de ambientes contaminados. Devido
s facilidades de estudo sob condies laboratoriais das propriedades bioqumicas e genticas
nas bactrias, grande parte das vias foram elucidadas atravs de investigaes utilizando esse
grupo de microrganismo. Alm disso, as alteraes genticas so rapidamente expressas nos
procariotos, devido natureza haplide de seus genomas. Essa caracterstica favorece a
realizao de testes genticos, com a finalidade de elucidar a funo de genes e protenas
envolvidas nas vias de degradao bacteriana (PALLERONI, 1995).
Na literatura, encontram-se descritos vrios processos de degradao utilizando bactrias em
culturas puras ou em consrcios. Os consrcios bacterianos tm especial importncia na
degradao de compostos aromticos considerados recalcitrantes, na detoxificao de stios
contaminados por vrios compostos diferentes (misturas) e na degradao de contaminantes
em ambientes adversos (ZHANG & BENNETT, 2005). Isso porque, muitas vezes, uma nica
espcie no possui todo o aparato enzimtico capaz de promover a degradao completa do
composto orgnico, gerando intermedirios que so metabolizados por outras espcies.
A Tabela 2 traz alguns exemplos de bactrias que, em cultura pura, foram capazes de
metabolizar alguns dos compostos BTEX. Algumas delas apresentaram a capacidade de
metabolizar at mais de um composto.
Como ser observado posteriormente, grande parte das vias de degradao aerbia dos
compostos BTEX foram elucidadas atravs de investigaes utilizando as bactrias do gnero
Pseudomonas, que acabaram se tornando modelos de estudo. As bactrias desse gnero
apresentam grande versatilidade metablica relatada na literatura desde o incio do sculo,
podendo utilizar at 100 diferentes fontes de carbono, incluindo hidrocarbonetos alifticos,

Tabela 2 Principais grupos de bactrias envolvidas na degradao dos hidrocarbonetos

monoaromticos do grupo BTEX.
Bactria (linhagem)
Benzeno
Dechloromonas spp.
Linhagens RCB e JJ
Arthrobacter sp. HCB
Burkholderia pickettii pK01
Planococcus sp. ZD22
Tolueno
Pseudomonas putida F1
Burkholderia pickettii pK01
Pseudomonas mendoncina
KR1
Pseudomonas stutzeri OX1
Arthrobacter sp. HCB
Pseudomonas putida mt-2
Cycloclasticus pugetti PS-1
Geobacter grbicium
Thauera aromtica linhagens
K172 e T1
Azoarcus spp.
Desulfobacula toluolica
Desulfobacterium cetonicum
Geobacter metallireducens
linhagem GS-15

Condies
Anaerbia Nitrato
redutoras
Aerbia
Aerbia
Aerbia

Referncia
Coates et al (2001)
Alvarez & Vogel (1991)
Kukor & Olsen (1996)
Li et al. (2006)

Aerbia
Aerbia

Gibson et al. (1968)

Kukor & Olsen (1996)

Aerbia

Whited & Gibson (1991)

Aerbia
Aerbia
Aerbia
Aerbia
Anaerbia Fe(III)
redutora
Anaerbia Fe(III) e
nitrato redutoras

Arenghi, et al. (1999)

Alvarez & Vogel (1991)
Williams & Murray (1974)
Dyksterhouse et al. (1995)
Anders et al. (1995)
Evans et al. (1991)
Chakraborty & Coates (2004)

Anaerbia Fe(III) e
sulfato redutoras

Rabus et al. (1993)

Harms et al. (1999)

Anaerbia Fe(III)
redutora

Chakraborty & Coates (2004)

Lovley et al (1989)

Anaerbia Nitrato
redutoras

Rabus & Widdel (1995)

Ball et al. (1996)

Etilbenzeno
Linhagens EbN1 e EB1,
relacionadas ao gnero
Thauera
Proteobacteria marinha,
linhagem EbS7
Pseudomonas sp. NBM21

Anaerbia Sulfato
redutoras
Aerbia

Kniemeyer et al. (2003)

Jeong et al. (2006)

Xilenos
Linhagem oXyS1, relacionadas
s espcies Desulfobacterium
acetonicum e
Desulfosarcina variabilis
Linhagem mXyS1, do grupo
Proteobacteria
Thauera spp. e Azoarcus spp.
Pseudomonas sp. NBM21

Anaerbia Sulfato
redutoras

Harms et al. (1999)

Anaerbia Nitrato
redutoras

Hess et al. (1997), Rabus &

Widdel, (1995).

Aerbia

Jeonq et al. (2006)

mono e poliaromticos, alm dos compostos substitudos, contendo na molcula tomos de

cloro, fsforo, entre outros. Algumas das molculas podem ser degradadas utilizando mais de
uma via catablica (PALLERONI, 1995).
Os genomas das bactrias Pseudomonas esto entre os maiores genomas bacterianos j
seqenciados e contm uma grande proporo de genes regulatrios descritos na literatura.
Boa parte dos genes est relacionada ao metabolismo, transporte e efluxo de compostos
orgnicos, o que explica a grande capacidade de adaptao dessas bactrias em ambientes
diversos (PALLERONI, 1995).
Os plasmdeos associados s vias catablicas das pseudomonas tambm esto entre os mais
estudados. Esses componentes genticos muito comuns nas bactrias contribuem bastante
para a grande versatilidade deste grupo de organismos. Grande parte dos genes relacionados
s vias catablicas de degradao descritos na literatura encontra-se presente em plasmdeos,
como pWW0 de P. putida e pWW53 de P. putida MT53 (ASSINDER & WILLIAMS, 1990).
Os plasmdeos catablicos, em geral, somente so mantidos em clulas bacterianas que se
encontram sob presso seletiva. Esta uma importante justificativa de se trabalhar com a
microbiota indgena na biorremediao de locais contaminados.
Muito pouco conhecido sobre como as comunidades microbianas se tornam adaptadas
presena de compostos xenobiticos. Anlises comparativas de sequncias de DNA e estudos
em microcosmos experimentais tm demonstrado que a transferncia gnica entre espcies
possa ter um grande impacto na evoluo bacteriana. Os efeitos da transferncia gnica so
dependentes da expresso do novo material gentico nos organismos receptores e das
conseqentes mudanas nas suas caractersticas fenotpicas frente aos processos de seleo
natural.
Uma estratgia para investigar o impacto da transferncia gnica rastrear a distribuio de
genes para a biodegradao de contaminantes ambientais sob vrias condies seletivas
(FULTHORPE & WYNDHAM, 1991; WYNDHAM et al., 1997). Como os genes catablicos
esto frequentemente associados com plasmdeos conjugativos e, em alguns casos, com
transposons, eles so ideais para investigar a influncia da mobilidade gentica no
metabolismo microbiano (WYNDHAM et al., 1997; ELSAS & SMIT, 1997).

2.2.2 AS VIAS DE DEGRADAO BACTERIANA DOS BTEX

A biodegradao a capacidade metablica de organismos transformarem ou mineralizarem

contaminantes orgnicos em substncias simples, que possam ento se integrar aos ciclos
biogeoqumicos. A intensidade da biodegradao depende de uma srie de fatores como
disponibilidade de nutrientes, oxignio, valores de pH, concentrao e caractersticas dos
contaminantes. Este processo, juntamente com outros processos fsicos e qumicos,
responsvel pela descontaminao de ambientes contaminados por compostos orgnicos
txicos como os BTEX (MARGESIN & SCHINNER, 2001).
Nem sempre possvel combinar em nico microrganismo todas as caractersticas requeridas
para promover a descontaminao de um ambiente. Nesse caso, a sintropia do consrcio
bacteriano muito importante, pois cada membro do grupo especializado em determinada
etapa da via de degradao de certo poluente (DAZ, 2004).
Muitas vezes, um substrato orgnico s metabolizado na presena de outros substratos
capazes de serem metabolizados pelo microrganismo. Esse tipo de processo, chamado cometabolismo, degrada parcialmente o composto orgnico, que, por sua vez, no serve como
fonte de carbono para o microrganismo. O co-metabolismo comum em consrcios
bacterianos que degradam hidrocarbonetos aromticos, como o benzeno (BOSSERT &
COMPEAU, 1995).
A biodegradao aerbia e anaerbia de hidrocarbonetos monoaromticos tm caractersticas
comuns. Para a biodegradao dos compostos essencial uma reao redox, em que o
hidrocarboneto oxidado (doador de eltron) e um aceptor de eltron reduzido. Existem
diferentes compostos que podem agir como aceptores de eltron, entre eles o oxignio (O2),
utilizado pelas bactrias aerbias, e o nitrato (NO3-), os xidos de Fe (III), o sulfato (SO42-),
entre outros, utilizados pelas bactrias anaerbias (BORDEN et al., 1995).
Em geral, a degradao dos hidrocarbonetos aromticos mais eficiente e rpida em
condies aerbias. O oxignio o aceptor de eltrons mais comum na respirao microbiana,
e o processo aerbio fornece uma grande quantidade de energia para as clulas. Em condies
anaerbias, a estabilidade desses compostos grande, basta pensar no tempo de vida dos
reservatrios de petrleo cru. Na degradao dos hidrocarbonetos aromticos, o oxignio

molecular atua no apenas como um aceptor de eltrons na cadeia respiratria, mas tambm
como um agente reativo na oxidao da molcula (BOSSERT & COMPEAU, 1995). Por
outro lado, os processos de degradao de hidrocarbonetos em condies anaerbias tm
grande importncia, principalmente em ambientes contaminados, com depleo de oxignio.
Nos itens a seguir, sero descritas as principais vias de degradao dos hidrocarbonetos
aromticos BTEX, em ambas as condies: aerbia e anaerbia.

2.2.2.1 VIAS AERBIAS DE BIODEGRADAO DO BTEX

As enzimas envolvidas nos processos de transformao de compostos aromticos, em geral,

no so distribudas em muitas classes diferentes de enzimas; as hidrolases e oxidoredutases
so as mais utilizadas nas vias. As oxidoredutases so enzimas complexas, usualmente,
compostas por multicomponentes proticos, que requerem cofatores como o NADH, e so, na
maioria das vezes, utilizadas em vrias etapas da biocatlise (DAZ et al., 2001).
Os hidrocarbonetos monoaromticos do grupo BTEX so degradados aerobicamente por
microrganismos atravs de um processo oxidativo em que a primeira etapa da via d-se
atravs de reaes catalizadas por enzimas oxigenases do anel aromtico que introduzem
tomos de oxignio no anel aromtico ou em seus substituintes alquil (CAVALCA et al.,
2000, CHAKRABORTY & COATES, 2004).
As primeiras etapas das vias de degradao possuem suas particularidades para cada substrato
BTEX diferente. Aps essa etapa, os hidrocarbonetos monoaromticos so transformados em
intermedirios centrais comuns: os catecis e os protocatecuatos. Tais compostos
intermedirios so substratos de enzimas oxigenases responsveis pela clivagem do anel
aromtico, que atuam diferentemente, gerando produtos que sero metabolizados por vias
centrais distintas: orto e meta clivagem. As vias centrais envolvem uma srie de reaes que
produzem metablitos que participam do ciclo de Krebs, acetato e succinato, ou substratos
que podem ser facilmente convertidos a intermedirios do ciclo, como o piruvato e
acetaldedo (DIAZ, 2004).

2.2.2.1.1 ETAPAS INICIAIS DE DEGRADAO AERBIA DOS BTEX

Todos os compostos monoaromticos do grupo BTEX so derivados do benzeno. Sendo

assim, a quebra do anel aromtico uma etapa comum a todas as vias de degradao desses
compostos. Para ocorrncia da clivagem do anel aromtico necessrio diminuir a sua
estabilidade termodinmica, que dificulta o ataque enzimtico, o que pode ser realizado
adicionando grupos eletroflicos estrutura do anel (DIAZ, 2004).
Na oxidao do benzeno pelas bactrias aerbias, essa barreira qumica foi superada por meio
da utilizao do oxignio molecular, no apenas como aceptor de eltrons, mas tambm como
um co-substrato na reao mediada pelas oxigenases. O ataque da molcula pode ser
catalisado pelas monooxigenases, enzimas que incorporam um tomo de oxignio ao anel
(Figura 2a), ou pelas dioxigenases, que incorporam dois tomos de oxignio (Figura 2b). O
produto dessa reao inicial um benzeno dihidrodiol (1,2-dihidroxiciclohexa-3,5-dieno),
cuja isomeria espacial (cis ou trans) depende de qual enzima catalisar a reao (RIBBONS &
EATON, 1982). O benzeno dihidrodiol, por sua vez, convertido a catecol por uma
desidrogenase (Figura 2).
(a)

O2

H2 O

H2 O

O
NADH

NAD +

Benzeno

OH

H
xido Areno

O2

(b)

Benzeno

NAD +

NAD

NADH

OH

H
Cis-dihidrodiol

OH
Catecol

Trans-dihidrodiol

OH
OH
NADH

OH

OH
H

NAD

NADH

OH
Catecol

Figura 2 Ataque inicial do benzeno por oxigenases. (a) A reao catalisada por uma
monooxigenase, que introduz um tomo de oxignio no anel aromtico, produzindo um xido
areno, que, atravs de uma hidratao, forma um trans-dihidrodiol, convertido posteriormente
a catecol. (b) A reao catalisada por uma dioxigenase, que introduz dois tomos de
oxignio no anel, formando diretamente o cis-dihidrodiol, convertido por uma desidrogenao
a catecol. As molculas de catecol produzidas so degradadas pelas vias de orto e meta
clivagem.

As oxigenases que catalisam a hidroxilao do anel do benzeno requerem co-substratos

doadores de eltrons, como o NADH (Figura 2). Entre os multicomponentes dessas enzimas,
h um flavoprotena que recebe os eltrons do NADH e os transfere atravs da ferredoxina
para a oxigenase. A oxigenase reduzida reage com o oxignio molecular e o substrato
aromtico (revisado por WRENN, 1998).
Como relatado anteriormente, reaes de orto ou meta clivagem do continuidade ao processo
de degradao, atravs do metabolismo da molcula de catecol, produzindo intermedirios
que participam do ciclo de Krebs.
A degradao de compostos alquil benzenos, tais como o tolueno, etilbenzeno e xilenos, pode
ocorrer inicialmente atravs da oxidao direta do anel ou, muito comumente, atravs da
oxidao dos grupos laterais. Esses compostos tm sido utilizados como fonte de carbono e
energia para uma grande variedade de bactrias, incluindo as pertencentes aos gneros
Pseudomonas, Achromobacter e Nocardia (WRENN, 1998).
Diferentes vias catablicas do tolueno encontram-se descritas na literatura, como as vias TOL,
TOD, TOM, T4MO e TBU (Figura 3). Tais vias foram estudadas primeiramente em bactrias
pseudomonas, mas no so exclusivas dessas bactrias.
A via catablica TOL foi elucidada a partir do estudo de um plasmdeo isolado de
Pseudomonas putida mt-2, que inicia o metabolismo do tolueno oxidando o seu grupo metil.
Pela ao de uma monooxigenase, o tolueno convertido a benzil lcool, oxidado em seguida
a benzaldedo e, conseguinte, a cido benzico, por uma desidrogenao. A hidroxilao do
anel d-se a partir do cido benzico, formando um cis-benzoato dihidrodiol, convertido em
seguida a catecol (WILLIAMS & MURRAY, 1974). A clivagem do catecol obtida pela
meta-clivagem (Figura 3a).
Bactrias contendo o plasmdeo TOL so capazes de degradar, alm do tolueno, as molculas
de p-xileno e m-xileno. Comparando as habilidades de biodegradao dos compostos BTEX e
naftaleno de diversas linhagens bacterianas, Glensoy & Alvarez (1999) observaram que
esses trs compostos foram os mais frequentemente degradados (75% das linhagens) e
sugeriram que possivelmente o plasmdeo TOL apresenta um papel muito importante na
degradao dos BTEX e naftaleno.

CHO

CH2OH

COO

COO OH

OH
H

OH

(a)
Benzillcool
TOL

Benzaldedo

Benzoato

Cis-benzoato
dihidrodiol

H
OH

(b)

OH

OH
Cis-tolueno
dihidrodiol

3-M etilcatecol

CH3
OH

TOM

OH

(c)
3-M etilcatecol

Tolueno
CH3

CH3
OH

(d)
m-cresol
T4MO

CH3

Metaclivagem

OH

o-cresol

TBU

Metaclivagem

OH

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

TOD

Catecol

Metaclivagem

OH

Metaclivagem

OH

3-M etilcatecol

CH2OH

CHO

COO

COOH
Ortoclivagem

(e)
OH
OH
p-cresol

OH
p -Hidroxi
benzil lcool

OH
p-Hidroxi
benzaldedo

OH
p-Hidroxi
benzoato

OH
Protocatecuato

Figura 3 Reaes envolvidas na primeira etapa das vias de degradao aerbia de tolueno.
(a) A via TOL tem como produto inicial um benzil lcool, que aps oxidao a cido
benzico, convertido a dihidrodiol e consecutivamente, a catecol. As via TOD (b), TOM (c)
e TBU (c) so iniciadas pela oxidao direta do anel, formando produtos convertidos
posteriormente a 3-metilcatecol. Tambm a via T4MO (e) iniciada por hidroxilao do anel,
formando, no entanto, uma molcula de protocatecuato. As molculas de catecol, 3metilcatecol e protocatecuato so metabolizadas por meta ou orto clivagem, produzindo
intermedirios centrais do ciclo de Krebs (Modificada de GLENSOY & ALVAREZ, 1999).

Nas vias descritas a seguir, a degradao do tolueno iniciada pela hidroxilao do anel
aromtico, levando formao dos intermedirios centrais 3-metilcatecol (vias TOD, TOM e
TBU), degradado posteriormente pela via de meta clivagem, e protocatecuato (via T4MO)
degradado pela via de orto clivagem.
A via catablica TOD, descoberta na bactria P. putida F1, inclui a enzima tolueno
dioxigenase, que adiciona dois tomos de oxignio ao anel benznico. Essa reao leva
formao do cis-tolueno dihidrodiol, que convertido a 3-metilcatecol por uma reao de
desidrogenao (GIBSON et al., 1968) (Figura 3b).
A via catablica TOM foi elucidada em Burkholdderia cepacia G4 (inicialmente denominada
P. cepacia G4), que utiliza a enzima tolueno orto-monooxigenase no ataque inicial da
molcula, originando um o-cresol (SHIELDS et al., 1989) (Figura 3c). De forma similar, na
via catablica TBU, descrita em B. pickettii PK01 (inicialmente denominada P. pickettii
PK01), esta etapa catalisada pela enzima tolueno meta-monooxigenase para formar um mcresol (KUKOR & OLSEN, 1996) (Figura 3d).
Finalmente, a via catablica T4MO ocorre em P. mendocina KR1, que utiliza a enzima
tolueno para-monoxigenase para formar um p-cresol (WHITED & GIBSON, 1991) (Figura
3e). O p-cresol convertido a p-hidroxibenzil lcool, que, assim como na via TOL, oxidado
a p-hidroxi benzoato. Essa molcula convertida posteriormente a protocatecuato.
Alquil benzenos maiores como o etilbenzeno, isopropil, n-butil, entre outros, so degradados
por Pseudomonas putida atravs da oxidao do anel benznico. Em geral, esse processo
lento, e os produtos formados inicialmente so cis-dihidrodiis, como descrito na via TOD de
degradao de tolueno. No caso do etilbenzeno, o produto da primeira etapa da via o
etilcatecol, metabolizado pela via de meta clivagem (WRENN, 1998) (Figura 4).
Quanto aos benzenos dialquil substitudos, como os xilenos, existem algumas diferenas
quanto degradao de seus ismeros orto, meta e para. As molculas de m-xileno e p-xileno
so convertidas a dimetilcatecis, que no so clivados pela catecol 2,3 dioxigenase de P.
putida, e, portanto, no so metabolizados pela via de meta clivagem. J a Nocardia corallina
capaz de metabolizar pela via de orto clivagem o produto inicial da degradao do p-xileno,
o 3,6-dimetilcatecol. Entretanto, apresenta como produto final da via o 2,5-dimetil-cis,ciscido mucnico, no atingindo a mineralizao do composto aromtico (JAMISON et al,
1969).

CH2CH3

CH2CH3

CH2CH3
H
OH

OH
Metaclivagem

OH

OH

H
Cis-etilbenzeno
dihidrodiol

Etilbenzeno

3-etilcatecol

Figura 4 Primeira etapa da via de degradao aerbia do etilbenzeno. A via de degradao

do etilbenzeno, assim como a via TOD do tolueno, iniciada pela oxidao direta do anel,
formando como produto intermedirio o 3-etilcatecol, posteriormente metabolizado pela via
de meta clivagem.

Nocardia sp. capaz de crescer em o-xileno, degradando inicialmente esse composto atravs
da hidroxilao do anel, produzindo 3,4-dimetilcatecol. Essa bactria capaz de oxidar o 3,4dimetilcatecol pela via de meta-clivagem, formando cido actico, propionaldedo e piruvato.
Entretanto, esta bactria uma exceo tanto em relao sua capacidade de oxidao de
dimetilcatecis pela via de meta-clivagem, quanto capacidade de crescer em o-xilenos
(WRENN, 1998).
Quanto degradao dos meta e para xilenos, a primeira etapa da via de degradao
compreende a oxidao do grupo metil, produzindo 3-metil benzoato, e a conseguinte
oxidao do anel aromtico, mecanismo semelhante ao observado na via TOL de degradao
do tolueno. A insero do oxignio ocorre no tomo de carbono ligado ao grupo carboxila. As
reaes de descarboxilao e desidrogenao que se seguem, transformam o diol em
metilcatecol (RIBBONS & EATON, 1982) (Figura 5).

CH2OH

CH3

CH3
m-xileno

CHO

CH3

CH3
3-metil benzil
lcool

COO

3-metil
benzaldedo

COO OH

CH3
3-metil
benzoato

OH
H

OH

CH3

OH

3-metil
cis-benzoato
dihidrodiol

Metaclivagem

CH3
3-metilcatecol

Figura 5 Primeira etapa da via de degradao aerbia do meta-xileno. Aps a oxidao do

grupo metil, o anel aromtico oxidado, atravs de um mecanismo semelhante ao observado
na via TOL de degradao do tolueno. O produto intermedirio dessa via o 3-metilcatecol.

2.2.2.1.2 OXIDAO DOS INTERMEDIRIOS CENTRAIS DA DEGRADAO AERBIA DOS BTEX

Os compostos monoaromticos estruturalmente diferentes so degradados aerobicamente

atravs de vias iniciais diversas. No entanto, os produtos intermedirios formados so comuns
s vias, limitando-se a algumas molculas dihidroxi aromticas: catecis e protocatecuatos.
Esses intermedirios so oxidados por vias centrais especficas que produzem intermedirios
centrais do metabolismo da clula: vias de orto ou meta clivagem.
Na via de meta clivagem, a quebra do anel se d prximo s duas hidroxilas do anel
aromtico, sendo as reaes subsequentes ditadas pela natureza do produto da fisso do anel.
Na via de orto-clivagem, a quebra do catecol se d entre as hidroxilas do catecol, sendo que
um grupo inteiramente diferente de enzimas requerido para o metabolismo dos distintos
produtos do anel clivado.
Na via de orto-clivagem (Figura 6a), a enzima catecol 1,2-dioxigenase catalisa a incorporao
de um dioxignio entre os dois grupos hidroxilas da molcula de catecol. O produto formado
o cido cis,cis-mucnico (GIBSON, 1968), que convertido em mucolonato pela ao da
enzima de lactonizao de cis,cis-muconato (4-carboximetil-4-hidroxi-isocrotolactona liase).
Este produto, pela ao de uma isomerase, convertido a -cetoadipato enol lactona, que por
sua vez constitue-se num substrato para a oxoadipato enol-lactona hidrolase formando 3oxoadipato. Finalmente, o 3-oxoadipato convertido a succinato e acetil-CoA pela ao de
uma transferase (4-carboximetil-4-hidroxi-isocrotolactona liase) (ORNSTON & STANIER,
1966; KEMP & HEGEMAN, 1968).
Em Pseudomonas putida, atravs da via de meta-clivagem, o catecol convertido a cido 2hidroximucnico semialdedo (DAGLEY et al., 1960) que pela ao da enzima semialdedo
desidrogenase dependente de NAD+ origina 4-oxalocrotonato (NISHIZUKA et al., 1962). Na
segunda via (Figura 6b), o cido 2-hidroximucnico semialdedo metabolisado pelo sistema
hidrolase a 2-oxi-penta-4-enoato (SALA-TREPAT et al., 1971), o qual descarboxilado a 4hidroxi-2-oxi-valerato, pela ao de outra hidrolase. Este produto clivado pela ao de uma
aldolase originando acetaldedo e piruvato.

OH
(a)

Catecol 1,2dioxigenase

ORTOCLIVAGEM

Catecol 2,3dioxigenase

OH
COOH

(b)

CHO
COOH

Catecol

O2

O2

METACLIVAGEM

COOH
OH

Cis,cis-muconato

2-hidroximucnico
semialdedo

H2O
O

COOH

HCOOH

C O

COOH

Muconolactona

O
2-oxipenta-4-enoato

COOH

H2O

3-oxoadipato enol-lactona

COOH
O

HO

COOH

4-hidroxi-2-oxi-valerato

COOH
3-oxoadipato

COOH

CH2
COOH

Succinato

CH3

Acetaldedo

CO

SCoA

COOH
O
Piruvato

Acetil-CoA

Figura 6 Degradao do catecol, intermedirio comum das vias de degradao dos BTEX,
pelas vias de orto e meta clivagem. (a) Na via de orto-clivagem, a quebra do catecol se d
entre as hidroxilas do catecol, enquanto na via de meta clivagem (b), a quebra do anel se d
prximo s duas hidroxilas do anel aromtico, sendo as reaes subsequentes ditadas pela
natureza do produto da fisso do anel.

2.2.2.2 VIAS ANAERBIAS DE BIODEGRADAO DO BTEX

A biodegradao anaerbia dos hidrocarbonetos aromticos BTEX foi negligenciada at a

dcada de 80, particularmente por ser considerada pouco favorvel energeticamente, quando
comparada degradao aerbia. Entretanto, esses compostos so utilizados como fonte de
carbono por diversas bactrias anaerbias, sob condies nitrato redutoras, ferro redutoras,
sulfato redutoras e condies metanognicas.
O uso de outros aceptores de eltrons diferentes do oxignio baseado na disponibilidade dos
compostos aceptores e na competio de diferentes tipos de microrganismos pelos doadores
de eltrons. Por exemplo, a reduo de Fe (III) o mecanismo de oxidao de matria
orgnica mais frequentemente observado em ambientes subsuperficiais. O nitrato um dos
ons mais encontrados em guas naturais, ocorrendo geralmente em baixos teores nas guas
superficiais, mas podendo atingir altas concentraes em guas subterrneas. J o sulfato o
principal aceptor de eltrons para degradao anaerbia em ambientes marinhos, devido a sua
alta concentrao em gua do ar (DIAZ, 2004, BORDEN et al., 1995).
Em termos de energia, enquanto a degradao de compostos aromticos utilizando o nitrato e
o Fe (III) como aceptores de eltrons quase to eficiente quanto a degradao aerbia, em
condies sulfato redutoras e metanognicas, a quantidade de energia gerada
comparativamente muito menor (DIAZ, 2004) (Figura 7).
A biodegradao anaerbia o processo que prevalece em situaes onde a atividade da
microbiota indgena aerbia resulta em uma rpida depleo do oxignio dissolvido, como em
guas subterrneas contaminadas,

solos,

sedimentos e

biorreatores,

entre

outros

(CHAKRABORTY & COATES, 2004).

A biodegradao anaerbia encontra-se extensivamente revisada por vrios autores
(CHAKRABORTY & COATES, 2004; SPERMAN & WIDDEL, 2000; PHELPS &
YOUNG, 1998; HOLLIGER & ZEHNDER, 1996; COLBERG & YOUNG, 1995). Esse
processo apresenta algumas vantagens sobre a biodegradao aerbia, tornando-se uma boa
alternativa para processos de biorremediao. Os processos aerbios tm um custo elevado,
pois requerem sistemas de injeo de oxignio caros e a manuteno e o gasto de energia
acabam por onerar mais o processo (ZHANG & BENNETT, 2005).

Respirao
Processo
aerbio

O2

Potencial
redox (mV)

Energia
G0 (kJ)

H2O

Aerbia
(Pseudomonas)

+ 800

- 3174,4

Desnitrificao
(Azoarcus)

+ 430

- 2977,3

Reduo Fe (III)
(Geobacter)

+ 100

- 3043,3

Reduo Sulfato
(Dessulfobacterium)

- 270

- 185,4

Metanognese
(Methanospirillium)

- 400

- 124,3

CO2
Massa celular

Processo
anaerbio
NO3

NO2 (N2)
CO2

Massa celular

3+

Fe

Hidrocarbonetos
aromticos

2+

Fe

CO2
Massa celular

SO4

Compostos
orgnicos

H2S
CO2

Massa celular

Massa celular
+

Fermentao

2-

H , CO2

H2, CH4

cidos orgnicos
(ex. acetato)

CO2
Massa celular

Figura 7 Desenho esquemtico da utilizao microbiana dos hidrocarbonetos aromticos,

evidenciando o rendimento energtico do metabolismo aerbio ou anaerbio da molcula, em
funo do aceptor de eltrons utilizado. Gneros de bactrias representativos de cada tipo de
metabolismo so mostrados em parnteses.

Com relao aos principais mecanismos de biodegradao anaerbia de hidrocarbonetos

monoaromticos, uma importante diferena em relao aos mecanismos aerbios a
introduo do oxignio atravs da gua, ao invs do uso do oxignio molecular, para
formao de compostos monoaromticos oxigenados, susceptveis posterior clivagem do
anel. Algumas variaes existentes entre as vias catablicas, como, por exemplo a adio do
fumarato na etapa de ativao da molcula, ocorrem devido aos diferentes aceptores de
eltrons utilizados (CHAKRABORTY & COATES, 2004).
Assim como ocorre nas vias de degradao aerbias dos BTEX, as primeiras etapas da
degradao so diferentes para cada hidrocarboneto monoaromtico com cadeias laterais

distintas. Da mesma forma, as vias de degradao apresentam um produto intermedirio

comum, o benzoil-CoA. O benzoil-CoA degradado, formando intermedirios do
metabolismo central como o acetil-CoA (ZHANG & BERNNETT, 2005).

2.2.2.2.1 ETAPAS INICIAIS DE DEGRADAO ANAERBIA DOS BTEX

O benzeno um dos hidrocarbonetos aromticos mais resistentes degradao sob condies

anxicas. O deslocamento da nuvem de eltrons estabiliza as ligaes carbono-carbono,
tornando o benzeno altamente resistente ao ataque qumico. Embora um grande nmero de
artigos relate a degradao anaerbia de outros hidrocarbonetos aromticos, entre eles tolueno
e xilenos, algumas investigaes anteriores descreveram o benzeno como recalcitrante
(PHELPS et al., 1996).
A degradao anaerbia do benzeno j foi demonstrada sob condies nitrato redutoras,
Fe(III) redutoras, sulfato redutoras e metanognicas, mas, at pouco tempo atrs, nenhum
organismo especfico ou gnero tinha sido associado com tal habilidade. Tambm, tal
metabolismo tinha sido observado apenas em estudos envolvendo sedimentos ou consrcios
microbianos (revisado por CHAKRABORTY & COATES, 2004, HOLLIGER & ZEHNDER,
1996).
Em 2001, Coates et al. isolaram e descreveram duas linhagens bacterianas, RCB e JJ,
intrinsecamente relacionadas com membros do gnero Dechloromonas. Essas linhagens de
Proteobacterias foram capazes de degradar rapidamente o benzeno a CO2 na ausncia de
oxignio, acoplando a oxidao do benzeno reduo do nitrato.
A via bioqumica da degradao anaerbia do benzeno ainda no est elucidada, mas algumas
possibilidades tm sido sugeridas (Figura 8). Entre elas esto carboxilao inicial,
hidroxilao, metilao ou reduo do anel aromtico com subseqente formao do produto
intermedirio, benzoil-CoA, e posterior clivagem do anel (COATES et al., 2002). Alguns
estudos utilizando consrcios bacterianos degradadores de benzeno, tem apontado fenol e
benzoato como possveis produtos de uma etapa inicial de degradao do benzeno
(CALDWELL & SUFLITA, 2000, PHELPS et al., 2001, WEINER & LOVLEY, 1998).

Figura 8 Potenciais reaes iniciais da via de degradao anaerbica do benzeno:

carboxilao, metilao ou hidroxilao, com seus respectivos produtos, benzoato, tolueno e
fenol. As reaes subseqentes levam a formao do intermedirio central benzoil-CoA,
clivagem do anel e oxidao a dixido de carbono.
Entre os compostos BTEX, o tolueno o hidrocarboneto cujo processo de biodegradao
anaerbia provavelmente o mais conhecido. Esse composto pode ser biodegradado
utilizando um grande nmero de aceptores de eltrons: nitrato, Mn(IV), Fe(III), sulfato, CO2,
acoplado reduo de substncias hmicas e oxi-nions clorinados (revisado por
CHAKRABORTY & COATES, 2004).
A primeira etapa da via de degradao anaerbia do tolueno a ativao dessa molcula pela
adio do fumarato ao grupo metil, formando o produto benzilsuccinato. Esta reao
catalisada pela benzilsuccinato sintase BSS - (Figura 9). Esta etapa foi descrita inicialmente
por Biegert et al. (1996), que demonstraram a presena de benzilsuccinato livre como um
produto intermedirio transiente nas culturas de T. aromatica contendo tolueno. Aps a
formao do benzilsuccinato, este convertido ao seu derivado CoA, benzilsuccinil-CoA por
uma enzima transferase, para ser ento oxidado a benzoil-CoA e succinil-CoA (LEUTWEIN
& HEIDER, 1999).

COO

COO

2[H]

Succinato

COOH

CO

CoA

Fumarato

CH3

COO

COO

2[H]

COOH

Tolueno

COOH

Fenilitaconato

Belzilsuccinato

CO

CoA
H2O

COO

Succinil-CoA

CoA

CO

CoA

CO
HS

CoA
HO

COO

CO2
Benzoil-CoA

2[H]

2-carboximetil3-hidroxifenilpropionil-CoA

Figura 9 - Primeira etapa da via de degradao anaerbia do tolueno. A primeira etapa

envolve a ativao do tolueno pela adio do fumarato ao grupo metil. O produto formado, o
benzilsuccinato, convertido ao seu derivado CoA, benzilsuccinil-CoA por uma enzima
transferase, para ser ento oxidado a benzoil-CoA e succinil-CoA.

O etilbenzeno degradado por bactrias sob condies desnitrificantes e sulfato-redutoras.

Em condies desnitrificantes, o etilbenzeno inicialmente ativado para a degradao atravs
de uma reao de desidrogenao do carbono ligado ao anel pertencente ao grupo etil da
cadeia lateral, pela etilbenzeno desidrogenase, produzindo (S)-1-feniletanol, cujo grupo
hidroxila proveniente de uma molcula de gua. O (S)-1-feniletanol sofre uma segunda
oxidao, formando uma acetofenona que, em seguida, metabolizada a 3-fenil-3oxopropionato (benzoil acetato), tioesterificada com CoA e, tioliticamente clivada em acetilCoA e benzoil-CoA (Figura 10a), (RABUS et al., 2002).

(a)

OH
O

OH

SCoA

SCoA

CO 2
H2O 2[H]

(b)

COO

benzoil
acetil-CoA

benzoil acetato

acetofenona

(S)-(-)-1-feniletanol

etilbenzeno

Acetil-CoA

CO 2

2[H]

COO

HSCoA
COO
etilbenzeno

COO

COO

SCoA

2-(fenilpropil)
malonil-CoA

succinil-CoA

CO 2

SCoA
degradao
posterior

O
2-fenilpropionil-CoA

Ciclo
de
Krebs

SCoA
O

1-(feniletil) O

fumarato

COO

Rearranjo

1-(feniletil)
succinato

Benzoil-CoA

HSCoA

SCoA
O
3-oxo-4-fenilpentanoil-CoA

H2O

SCoA
O

2[H]

2[H]

4-fenilpentanoil-CoA

SCoA
acetil-CoA

Figura 10 Etapas iniciais da via de degradao anaerbia do etilbenzeno. (a) Via proposta
para degradao anaerbia sob condies denitrificantes. (b) Via proposta para degradao
anaerbia sob condies sulfato redutoras. Figura modificada de Harayama et al. (2004).

Na via de degradao anaerbia, em condies sulfato redutoras, as modificaes das cadeias

laterais assemelham-se s sugeridas para a degradao anaerbia de n-alcanos. O etilbenzeno
ativado pela adio de uma molcula de fumarato, formando (1-fenil-etil) succinato. Esse
produto tioesterificado sob condies energticas, transformado em 1-(fenil-etil)-succinilCoA, cujo esqueleto de carbono do tioester rearranjado para permitir uma descarboxilao, formando ento 4-fenilpentanoil-CoA (Figura 10b). A rota metablica para
degradao desta ltima molcula ainda no est completamente elucidada. Essa via regenera
o fumarato que pode ser reutilizado na ativao de outras molculas de etilbenzeno. A etapa
de ativao da molcula nessa via metablica alternativa, similar quela do tolueno descrita

anteriormente, pode ser justificada pela diferena entre os potenciais de redox dos respectivos
aceptores de eltrons nitrato e sulfato (Figura 7) (KNIEMEYER et al., 2003).
A degradao anaerbia dos trs ismeros estruturais do dimetilbenzeno (meta, orto e para
xilenos) tem sido predominantemente estudada sob condies nitrato e sulfato redutoras. A
completa mineralizao por culturas microbianas tem sido relatada para todos os xilenos, com
exceo do p-xileno, cujos estudos de biodegradao na ausncia de oxignio esto
relacionados a consrcios bacterianos (ZHANG & BENNETT, 2005).
As reaes iniciais envolvidas na oxidao anaerbia do m-xileno so similares s de
degradao do tolueno e envolvem a adio inicial de uma molcula de fumarato em um dos
grupos metil para formar 3-metilbenzilsuccinato, que posteriormente oxidado a 3metilbenzoato (Figura 11). A adio do fumarato catalisada pela enzima 3metilbenzilsuccinato sintase, que, assim como a benzilsuccinato sintase (degradao do
tolueno), retm um tomo de hidrognio do grupo metil durante a reao. De forma
semelhante o o-xileno oxidado (Figura 11) (KRIEGER, 1999).
-

OOC

CH

CH2

COO

fumarato
CH3

OOC

CH

COO

CH

CH3

CH2

CH3
3-metilbenzilsuccinato

m-xileno
-

OOC

CH

CH2

CH2

COO

fumarato
CH3

OOC

CH

CH

CH3

o-xileno

COO

CH3

2-metilbenzilsuccinato

Figura 11 Etapas iniciais das vias de degradao das molculas m-xileno e o-xileno. A
degradao dos xilenos ocorre inicialmente atravs da reao de adio do fumarato a um dos
grupos metil, produzindo o metilbenzilsuccinato correspondente. A formao do
intermedirio benzoil-CoA, a partir dessa molcula, semelhante ao ocorrido na via de
degradao anaerbia do tolueno (Figura 9).

O processamento do metilbenzilsuccinato formado semelhante ao descrito para o

benzilsuccinato, formado durante a degradao anaerbia do tolueno (Figura 9). Os produtos
formados so metablitos centrais da clula (LEUTWEIN & HEIDER, 1999).

2.2.2.2.2 OXIDAO

DOS INTERMEDIRIOS CENTRAIS DA DEGRADAO ANAERBIA DOS

BTEX

O produto intermedirio comum das vias de degradao anaerbia dos BTEX o benzoilCoA. O anel aromtico do benzoil-CoA reduzido pela benzoil-CoA redutase e,
posteriormente, clivado por hidrlise (HARAYAMA et al., 2004). A molcula formada
degradada por -oxidao, produzindo trs moles de acetil-CoA, um metablito central do
ciclo de Krebs, e um mol de CO2 para cada mol de hidrocarboneto, como mostrado na Figura
12 (HOLLIGER & ZEHNDER, 1996).

SCoA

SCoA
C

SCoA

SCoA
C

C
O

COOH

3 Acetil-CoA
+ CO
2

Benzoil-CoA

4e

REDUO

H2O
HIDRLISE

-OXIDAO

Figura 12 Esquema da via de degradao anaerbia do intermedirio central comum das

vias: benzoil-CoA. O benzoil-CoA sofre reduo, produzindo produtos alicclicos, para
posteriormente, ser clivado por hidrlise. Os produtos lineares formados so transformados no
metablito central, acetil-CoA, por meio da -oxidao.

2.2.3 MECANISMOS DE REGULAO ENZIMTICA DAS VIAS CATABLICAS RELACIONADAS

DEGRADAO BACTERIANA DOS BTEX

As bactrias regulam o metabolismo em resposta a uma ampla variedade de flutuaes

ambientais, incluindo alteraes de temperatura, pH, nvel de oxignio, nutrientes e at
variaes na densidade populacional. Existem dois mecanismos bsicos de regulao em uma
clula. Um destes controla a atividade de uma enzima pr-existente, denominado regulao
ps-traducional. O outro tipo de regulao controla os nveis da protena, ou mesmo sua
presena e ausncia, sendo o controle, portanto, ao nvel transcricional ou traducional.
A inibio da atividade enzimtica pode ser obtida atravs de vrios processos, entre eles:
processamento de enzimas sintetizadas na forma inativa, inibio por retroalimentao
(feedback) e modificao enzimtica pela adio covalente de grupos especficos, como o
adenosina monofosfato (AMP) e o desoxiadenosina monofosfato (DMP). A inibio por
retroalimentao um dos principais mecanismos de regulao da atividade enzimtica.
Nesse caso, o produto final de uma via pode vir a inibir a atividade de uma enzima do incio
da via, regulando sua prpria biossntese. A ligao desse produto em um stio diferente do
stio ativo da enzima, chamado stio alostrico, modifica a estrutura da protena, reduzindo
sua eficincia de ligao ao substrato. Esse processo revertido, quando o nvel do produto
final cai, alterando o equilbrio da reao (MADIGAN et al., 2004).
A inibio da atividade enzimtica um mecanismo de regulao bastante refinado, muito
comum para enzimas constitutivas, essenciais no metabolismo da clula, sendo sintetizadas
continuamente, mantendo concentraes semelhantes em todas as condies de crescimento.
Por outro lado, as enzimas induzidas, so necessrias apenas em determinadas reaes
enzimticas. Sendo assim, a sntese dessas enzimas ocorre somente sob condies especficas,
sofrendo uma grande influncia dos mecanismos de controle da expresso gnica
(MADIGAN et al., 2004).
As bactrias apresentam um extensivo repertrio de genes metablicos e regulatrios,
responsveis pela grande capacidade de adaptao desses microrganismos a diferentes
ambientes aerbios e anaerbios. Os genes relacionados s vias de degradao de
hidrocarbonetos monoaromticos e outros xenobiticos expressam, em geral, enzimas
induzidas, e esto sujeitos a pelo menos trs tipos de regulao da sntese enzimtica:

mecanismos de resposta especfica a reguladores transcricionais, mecanismos de resposta

global e mecanismos de respostas comportamentais (Figura 13) (SHINGLER, 2003).

Figura 13 Esquema ilustrativo da rede de processos e sinais que regulam a capacidade

metablica de degradao bacteriana dos compostos aromticos, evidenciando os trs tipos de
regulao gnica: mecanismos de resposta especfica a reguladores transcricionais,
mecanismos de resposta global e mecanismos de respostas comportamentais (modificado de
SHINGLER, 2003).
Primeiramente, diversos reguladores transcricionais tm as atividade controlada por sinais
ambientais, entre eles, os compostos aromticos. As protenas regulatrias especficas e
promotores permitem que os operons catablicos sejam transcritos apenas e em nvel
suficiente para garantir uma adequada resposta metablica ao substrato particular presente em
abundncia no meio, que possa servir como fonte de carbono e energia.
So vrias as protenas regulatrias de transcrio envolvidas no metabolismo dos BTEX
(Tabela 3). Estas protenas so capazes de responder a uma gama de compostos, em geral,
substratos especficos ou intermedirios das vias de degradao, denominadas molculas
efetoras. A ativao de sinal para os membros da famlia LysR, por exemplo, relativamente
especfica, estando relacionada a algum intermedirio produzido no incio da via. No caso do
CatR, protena regulatria da via de orto-clivagem de degradao do catecol, a sntese de

Tabela 3 Protenas regulatrias representativas envolvidas no metabolismo dos BTEX

(adaptada de SHINGLER, 2003).
Protena

Via de degradao

Bactria/Plasmdeo

Referncia

54

Famlia -dependente

TbuT
TouR

Tolueno
Tolueno

XylR

Tolueno/xileno

R. pickettii PKO1
P. stutzeri OX1
P. putida mt-2 (TOL
pWW0)

Byrne & Olsen (1996)

Arenghi et al. (1999)

P. putida F1

Lau et al. (1997)

Bertani et al. (2001)
Spooner et al. (1986)

Rothmel et al. (1990)

Inouye et al. (1988)

Sistema de dois componentes

TodS/
TodT

Tolueno

Famlia AraC / XylS

PobC
XylS

4-Hidroxibenzoato

BenR

Benzoato

P. putida WCS358
P. putida mt-2 (TOL
pWW0)
P. putida

Catecol

P. putida

Tolueno

Cowles et al. (2000)

Famlia LysR

CatR

R. Ralstonia e P. Pseudomonas

catecol 1,2-dioxigenase induzida pelo produto de sua ao, o cis,cis-muconato (SHINGLER,

2003).
J as protenas regulatrias que respondem a substratos primrios podem ser menos
especficas, respondendo a vrios compostos estruturalmente anlogos, no susceptveis
metabolizao, como, por exemplo, o XylR. A protena XylR, codificado por gene do operon
TOL presente no plasmdeo pWWO do catabolismo de tolueno e xileno, pertence a uma
extensa famlia de ativadores transcricionais, a famlia 54-dependente. Ela atua se ligando a
elementos enhancer e regulando a transcrio a partir de um grupo distinto de promotores
reconhecidos pela holoenzima RNA polimerase - 54 (Tabela 3). Os fatores correspondem a
subunidades da RNA polimerase responsveis pelo reconhecimento do promotor. A protena
XylR ativa o promotor Pu do operon do plasmdeo pWW0 para converso do tolueno e m/pxilenos a benzoato e alquilbenzoatos correspondentes, mas tambm responde a compostos
anlogos estruturalmente, como benzil lcoois e benzil aldedos cloro e alquil substitudos
(SHINGLER, 2003).
Os mecanismos de resposta especfica respondem no apenas a sinais especficos presentes no
meio, mas tambm aos mecanismos de resposta global, que constituem um segundo nvel de

regulao da expresso gnica. Os circuitos de regulao global podem sobrepor os

mecanismos regulatrios especficos, acoplando os nveis de transcrio gnica ao estado
fisiolgico e metablico da bactria (Figura 13) (PRIETO et al., 2004).
Os mecanismos de resposta global so mecanismos regulatrios que respondem aos sinais
ambientais regulando a expresso de muitos genes. Um dos mecanismos de resposta global
mais estudado a represso catablica. Na represso catablica, a sntese de vrias enzimas
no relacionadas, principalmente as catablicas, inibida quando as clulas encontram-se em
um meio contendo uma fonte de carbono mais prontamente utilizvel, tal como a glicose. A
represso catablica foi inicialmente denominada efeito glicose, porque a glicose foi a
primeira substncia descrita com capacidade de iniciar a represso enzimtica. O exemplo
deste sistema mais bem caracterizado est relacionado ao catabolismo da lactose em
Escherichia coli, em que a glicose atua desde o controle da entrada da lactose na clula at a
inibio da transcrio das enzimas catablicas (MADIGAN et al., 2004).
No caso das bactrias pseudomonas, os substratos preferenciais que exercem a represso
catablica so o acetato e os intermedirios do ciclo de Krebs, como o succinato, piruvato,
succinil e acetil-CoA (COLLIER et al., 1996). O succinato tem sido usado como o
componente modelo para estudar a represso catablica de compostos aromticos (DUETZ et
al., 1994). Em Pseudomonas putida mt-2, succinato reprime a expresso da via para o
catabolismo de tolueno e xileno ao nvel transcricional e, numa menor extenso, a via de
meta-clivagem (DUETZ et al., 1994). Mller et al. (1996) demonstrou que succinato tambm
reprime a transcrio da via de meta clivagem codificada por genes cromossmicos de P.
putida linhagem H.
A glicose reprime a transcrio de genes da via de degradao do tolueno (operon TOL)
presentes no plasmdeo pWW0. Esse mecanismo de represso catablica est relacionado
ao de genes pts, que codificam componentes de um sistema PTS (sistema fosfotransferase)
alternativo no ligado geneticamente ao operon da via, provavelmente interceptando o
circuito de regulao XylR por uma rota diferente. Apesar de serem mecanismos
frequentemente observados na regulao das vias catablicas de pseudomonas, pouco se
conhece sobre seus mediadores ou detalhes do processo (revisado por SHINGLER, 2003).
Poucas protenas j foram relatadas como participantes da represso catablica em
pseudomonas, mas sabe-se que o controle desse mecanismo independente de cAMP

(MAcGREGOR et al., 1991). Morales et al. (2004) demonstrou que a protena Crc
(catabolite repression control), a primeira descrita, est envolvida no apenas no controle da
expresso de genes implicados no metabolismo de alguns acares e compostos nitrogenados,
mas tambm na expresso de genes pertencentes a vias centrais relacionadas com o
metabolismo de compostos aromticos. Entre os genes modulados negativamente pelo Crc
esto alguns requeridos para assimilao do benzoato, pela via do catecol, e do 4-OHbenzoato, pela via do protocatecuato.
Alm dos mecanismos de resposta especfica e global, Shingler (2003) relata um terceiro
nvel de regulao em que os compostos aromticos podem impactar o desempenho do
catabolismo provocando respostas comportamentais. Respostas quimiotticas presena de
compostos aromticos tm sido descritas sendo induzidas coordenadamente com os genes
relacionados ao seu catabolismo, sugerindo uma estratgia bacteriana integrada para se
locomover em direo aos compostos aromticos e degrad-los (Figura 13) (PANDEY &
JAIN, 2002, PARALES & HARWOOD, 2002).
O mecanismo da quimiotaxia complexo e envolve muitas protenas. As bactrias empregam
um tipo de sistema de dois componentes para detectar as alteraes na concentrao de um
agente qumico, regulando assim, a movimentao flagelar. No sistema de dois componentes,
o sinal externo no diretamente transmitido protena regulatria, sendo detectado
primeiramente por uma protena sensora especfica e, ento, transmitido de forma alterada a
uma protena reguladora de resposta (MADIGAN et al., 2004).
As protenas sensoras envolvidas no mecanismo da quimiotaxia so denominadas protenas
quimiotticas aceptoras de metil (PQM), sendo todas protenas transmembranas. A
maquinaria quimiottica de algumas bactrias envolve vrias protenas: em P. putida j foram
relatadas 25 ou mais PQMs, em comparao com as cinco enzimas relatadas em E. coli
(PARALES & HARWOOD, 2002). As enzimas PQMs esto em contato com as protenas
citoplasmticas, CheA e CheW. Ao se ligar a um agente qumico, as PQMs transmitem o sinal
detectado, juntamente com CheW, atravs de mudanas conformacionais para a protena
citoplasmtica CheA, uma enzima histidina autoquinase que atua como doadora do grupo
fosforil para outras protenas reguladoras de resposta, que atravs de uma cascata de
fosforilao, afetam o movimento de rotao flagelar (MADIGAN et al., 2004).

Em alguns casos, os componentes sensoriais de resposta a compostos aromticos so cotranscritos com os genes requeridos para o seu catabolismo. Esse o caso do componente
sensorial NahY PQM-similar, relacionado ao sistema de quimiotaxia de P. putida direcionada
ao naftaleno. Em P. putida F1, o tolueno foi capaz de induzir respostas quimiotticas a uma
larga variedade de compostos, inclusive alguns no metabolizados pela via TOD. Nesse
sistema, mutantes defeituosos quanto ao catabolismo do tolueno retiveram a resposta
quimiottica, enquanto a inativao de sistema regulatrio TodS/TodT abolia a resposta
quimiottica (revisado por PARALES & HARWOOD, 2002, SHINGLER, 2003).
Existem vrios trabalhos e revises que tratam dos mecanismos de regulao das vias de
degradao de compostos aromticos (TROPEL & VAN DER MEYER, 2004, MORALES et
al., 2004, PRIETO et al., 2004, SHINGLER, 2003). Trabalhos experimentais de investigao
da capacidade catablica de microrganismos especficos ou grupos de microrganismos
relatam interaes entre substratos aromticos, capazes de aumentar ou diminuir a capacidade
metablica de uma linhagem.
Glensoy & Alvarez (1999) relataram a ocorrncia de interaes benficas ao testar a
capacidade de degradao de BTEX de 55 linhagens de bactrias. Esses autores observaram
que muitas linhagens apresentavam-se incapazes de degradar alguns desses compostos
quando eles estavam isolados no meio, apresentando tal capacidade apenas quando os
mesmos encontravam-se concomitantes, indicando a interao benfica entre os substratos.
As interaes benficas entre substratos podem aumentar a capacidade catablica de diversas
linhagens, possivelmente induzindo enzimas das vias de degradao ou por mecanismos de
co-oxidao. A molcula de tolueno , em geral, um bom indutor de enzimas, sendo capaz de
promover a degradao de outros BTEXs em condies aerbias e desnitrificantes.
Entretanto, j foi reportado que o tolueno, em alguns casos pode ser um inibidor competitivo
da degradao do benzeno (revisado por GLENSOY & ALVAREZ, 1999).
O conhecimento dos mecanismos regulatrios que controlam a expresso das vias catablicas
relacionadas degradao bacteriana dos BTEX de grande importncia para aplicao
desses microrganismos em processos de biorremediao. O entendimento desses mecanismos
permite a obteno de mutantes que perderam a capacidade de inibir a sntese de
determinadas protenas reguladoras e, portanto, que sejam capazes de produzir as enzimas das

vias de degradao de hidrocarbonetos aromticos, at ento enzimas induzidas, de forma

constitutiva.
Alm disso, algumas protenas regulatrias do catabolismo de compostos aromticos so
capazes de detectar no ambiente os nveis de substratos aromticos cujas vias de catabolismo
fazem parte do maquinrio celular ao qual pertencem. Por essa propriedade, essas protenas
reguladoras sensoriais podem ser incorporadas a biossensores celulares para o monitoramento
de poluentes biodegradveis em ambientes contaminados (KEANE et al., 2002, HAY et al.,
2000). Em geral, essas clulas utilizadas como biossensores acoplam promotores relacionados
a genes das protenas regulatrias com um gene reprter, cuja expresso detectada atravs
de fluorescncia ou bioluminescncia. Tais microrganismos constituem potenciais sistemas
para mensurar a qualidade de guas, solos e atmosferas (TROPEL & VAN DER MEER,
2004, SHINGLER, 2003).

2.3 A

BIORREMEDIAO

COMO

ALTERNATIVA PARA

TRATAMENTO

DE

REAS

CONTAMINADAS POR BTEX

As atividades antropognicas tm sido as principais responsveis pelo lanamento de

quantidades considerveis de hidrocarbonetos no ambiente. Muitos desses compostos so
altamente txicos aos seres humanos, fauna e flora locais e, por isso, a necessidade de
remoo desses hidrocarbonetos dos meios contaminados. Mtodos fsicos e qumicos
comumente usados, alguns deles j descritos neste trabalho, no so sempre efetivos na
remoo dos compostos e, muitas vezes, podem acabar gerando compostos poluentes
adicionais. Sendo assim, a remoo desses compostos atravs da atividade microbiana tem
sido estudada como uma alternativa bastante interessante, quando comparada aos tratamentos
convencionais, visto que economicamente vivel e, em geral, no deixa resduos
secundrios.
Um eficiente processo de biodegradao envolve fatores relacionados s condies
ambientais e microbiota disponvel. Entre as condies ambientais, alm dos fatores
requeridos para o crescimento microbiano (atividade de gua, temperatura, pH, presso,
fontes de C e N, entre outros), algumas caractersticas relacionadas aos compostos
contaminantes podem limitar o processo de biodegradao: biodisponibilidade, toxicidade e
concentrao (BOSSERT & COMPEAU, 1995).
A biodisponibilidade dos compostos de extrema relevncia, pois, para que ocorra a
degradao, o composto deve estar livre no meio, de forma que possa ser transportado para o
interior da clula. Entre os contaminantes orgnicos muito comum a adsoro dos
compostos em partculas do solo, ficando parcialmente indisponveis para o microrganismo.
Esse fenmeno comum entre compostos apolares, cuja solubilidade em gua muito baixa
(ex. n-alcanos de cadeia longa). No caso dos BTEX, a adsoro no to preocupante, visto
que tais compostos, como tratado na introduo deste trabalho, apresentam solubilidade
relativamente alta em gua (Tabela1).
A concentrao e a toxicidade do contaminante tambm devem ser estimadas, de forma a no
inibir o crescimento bacteriano. Alm disso, a presena de compostos bioquimicamente
incompatveis com o catabolismo efetivo do composto alvo, isto , misturas inibitrias,
podem inibir o processo.

Por fim, a microbiota disponvel deve apresentar resistncia aos compostos contaminantes e
possuir as vias metablicas para degradao dos mesmos. Todos os fatores citados
anteriormente devem ser analisados em conjunto a fim de decidir se o tratamento dos resduos
deve ocorrer in situ ou ex situ (ex. biorreator), alm de auxiliar na escolha do tipo de
estratgia adotada para o processo de biorremediao (bioestimulao, bioaumentao,
condies aerbias ou anaerbias etc).
A pesquisa de microrganismos com potencial de degradao dos BTEX e das vias
metablicas envolvidas de alta relevncia no apenas para a compreenso dos processos de
biorremediao, mas tambm para a obteno de microrganismos, que podem ser utilizados
como inoculantes, com alto potencial de degradao e caractersticas de adaptabilidade. Alm
disso, o estudo de interferentes dos processos de alta relevncia, visto que o uso dessa
microbiota potencialmente degradadora de hidrocarbonetos requer o entendimento de todos os
aspectos fisiolgicos, microbiolgicos, ecolgicos e bioqumicos envolvidos na transformao
dos poluentes. Assim, possvel desenvolver tcnicas que permitam o uso eficiente desses
microrganismos no campo.

2.3.1 TCNICAS

DE ESTUDO DE MICRORGANISMOS COM APLICAO POTENCIAL EM

PROCESSOS DE BIORREMEDIAO

Entre as tcnicas de estudo dos microrganismos com potencial uso em processos de

biorremediao encontram-se as tcnicas tradicionais de cultivo, isolamento e caracterizao
fisiolgica, morfolgica e bioqumica, e as tcnicas de Biologia Molecular. As tcnicas
tradicionais de cultivo apresentam uma grande limitao: apenas uma pequena porcentagem
de microrganismos presentes no ambiente capaz de crescer sob condies laboratoriais. A
necessidade de desenvolver novas tcnicas de cultivo com a finalidade de isolar algumas
bactrias que no so cultivveis em meios tradicionais eminente. Alguns pesquisadores tm
utilizado

preferencialmente

meios

de

cultura

oligotrficos

para

crescimento

de

microrganismos isolados de ambientes naturais, em detrimento dos meios ricos em fontes de

carbono. Button et al. (1993), utilizando como meio de cultura a gua do mar, foram capazes
de obter uma recuperao de 2-60% das bactrias presentes no ambiente marinho, taxa
superior encontrada normalmente utilizando mtodos de cultivo tradicionais (menor do que

0,1%). Wang et al. (1996) isolou a bactria oligotrfica Cycloclasticus oligotrophus capaz de
degradar hidrocarbonetos aromticos, utilizando a mesma tcnica.
Uma segunda explicao da incapacidade de serem cultivados poderia estar relacionada com
o fato de tais microrganismos no serem capazes de crescer em culturas puras, considerando
que requerem para seu crescimento substncias produzidas por outros microrganismos. Alm
desses dois fatores, muitos outros tm sido apontados como interferentes, entre eles a ausncia
de fatores de crescimento, danos por estresses oxidativos e induo da ao de fagos
lisognicos durante perodos de inanio (revisado por HARAYAMA et al., 2004).
Uma variedade de metodologias foi desenvolvida nos ltimos anos para o estudo da estrutura
da comunidade microbiana, dentre outras, a anlise de atividade enzimtica; a anlise de perfil
de protenas celulares, de componentes da parede celular ou da cadeia respiratria, como a
anlise de cidos graxos metil-ester e cidos graxos fosfolipdicos (RAJENDRAN et al.,
1992); e anlise de cidos nuclicos, DNA total ou RNA ribossomal da comunidade
(ANDERSON & CAIRNEY, 2004).
As tcnicas de Biologia Molecular tm permitido uma melhor estimativa da diversidade
microbiana nos ambientes, o que no foi possvel durante muito tempo utilizando apenas as
tcnicas tradicionais de cultivo. Vrias tcnicas moleculares que tm como alvo o estudo do
gene da subunidade 16S do RNA ribossomal (rDNA) de bactrias vm sendo utilizadas.
Os mtodos para a anlise comparativa de seqncias de rDNA incluem, geralmente, etapas
de extrao de DNA da amostra e amplificao das seqncias de interesse pela reao em
cadeia polimerase (PCR), utilizando iniciadores com a especificidade desejada. As seqncias
amplificadas podem ser clonadas e seqenciadas ou analisadas com base em seus perfis
eletroforticos. Por sua vez, os principais mtodos usados para a obteno de perfis
eletroforticos relacionados com a filogenia so a ARDRA ("Amplified rDNA restriction
analysis"), que se baseia no princpio de que os stios de restrio no operon do rRNA so
conservados; a DGGE/TGGE ("Denaturing or temperature gradient gel electrophoresis"), que
fornece informaes sobre a variao na seqncia em uma mistura de fragmentos de PCR de
comprimento idntico com base na mobilidade diferencial em um gel de acrilamida com
gradiente de desnaturante crescente ou de temperatura crescente (EICHNER et al., 1999); a
anlise de polimorfismo de conformao das fitas simples do DNA amplificado (SSCP), que
se baseia na mobilidade eletrofortica diferenciada das estruturas dobradas do ssDNA

(STACH et al., 2001); anlises de restrio do DNA ribossomal marcado terminalmente

(TRFLP); e a tcnica de hibridizao local FISH (fluorescence in situ hybridization), cujas
sondas tm como alvo molculas de rRNA. Essas tcnicas representam grandes avanos nesta
rea e tm sido introduzidas no estudo da ecologia microbiana, revelando uma enorme
diversidade antes inesperada, principalmente, em relao a ambientes pouco explorados como
o ambiente marinho (HARAYAMA et al., 2004).
Tcnicas moleculares que tm como alvo de estudo genes relacionados com metabolismo
especfico dos microrganismos tm sido muito utilizadas, juntamente com os testes de
biodegradao laboratoriais, para determinao do potencial catablico microbiano. Cavalca,
et al. (2000) estudaram populaes de microrganismos potencialmente degradadores de
BTEX em subsolos contaminados por esses compostos. Esses autores isolaram quinze
linhagens de bactrias dos gneros Pseudomonas e Alcaligenes, cujo DNA extrado foi
submetido PCR visando a amplificao de genes-chave no processo de biodegradao por
diferentes vias catablicas: catecol 2,3 dioxigenase (xylE), tolueno dioxigenase (subunidade
maior da enzima) (todC1) e (xylA,M). A amplificao desses genes conseguida atravs da
utilizao de iniciadores consenso, determinados atravs da anlise de seqncias gnicas
alvo de bactrias modelo.
Os resultados dos testes moleculares, tanto de identificao de microrganismos, quanto de
deteco da atividade biodegradadora devem ser sempre acompanhados de testes tradicionais.
Em um trabalho com linhagens isoladas de reservatrio de Petrleo, Cunha, et al. (2006)
obtiveram alguns resultados divergentes entre os testes moleculares e ensaios tradicionais de
cultivo e degradao, indicando que mais estudos devem ser realizados a fim de determinar
seqncias de oligonucleotdeos iniciadores para grupos de microrganismos potencialmente
degradadores, mas pouco explorados, e tambm, para novos genes (e, consequentemente,
novas enzimas) que podem estar envolvidos no catabolismo dessas espcies.
Para os testes tradicionais de biodegradao, as culturas isoladas so crescidas em meios
contendo indutores de enzimas das vias catablicas as quais se deseja explorar, e tambm
crescidas em meios contendo hidrocarbonetos como fonte exclusiva de carbono. Os testes de
biodegradao podem ser realizados atravs de mtodos qualitativos, que consistem na
observao a olho nu de alterao no meio pelo crescimento microbiano, como, por exemplo,
a alterao de uma pelcula de leo sobre a superfcie do meio de cultura, muito usado como
teste de triagem, e mtodos quantitativos, como a deteco inicial e final das concentraes

dos hidrocarbonetos adicionados ao meio atravs de tcnicas de cromatografia (ex.

cromatografia gasosa e cromatografia lquida de alta performance), deteco de produtos
intermedirios comuns a vrias vias catablicas, testes de cintica utilizando extratos
enzimticos das culturas induzidas, entre outros.
O monitoramento da ocorrncia de biodegradao de hidrocarbonetos aromticos pode ser
feito atravs de biomarcadores: intermedirios especficos de vias metablicas. Uma vez
detectados no ambiente, podem ser indicativos da presena de uma populao microbiana
ativa utilizando o composto contaminante. Para ser utilizado como biomarcador, a substncia
deve ser detectvel em amostras de solo, gua e sedimentos, deve ser especfica para uma via
catablica particular e no deve ser gerada, em geral, por atividade antropognica. Exemplos
de biomarcadores comumente utilizados so o benzilsuccinato, para oxidao de tolueno e
metilbenzilsuccinato, para xilenos (CHAKRABORTY & COATES, 2004).

2.3.2 EXEMPLOS

DE PROCESSOS DE BIORREMEDIAO EM DIFERENTES AMBIENTES

CONTAMINADOS POR BTEX

Existem vrios relatos na literatura de processos de biorremediao bem suscedidos em

diversos tipos de ambientes. Bradley & Chapelle (1995) demonstraram a aplicabilidade de
tcnicas de biorremediao em um aqufero no Alaska. Esses autores conseguiram observar
uma rpida mineralizao de tolueno, a 5C e sob condies aerbias, no sedimento do
aqfero contaminado por petrleo. As taxas de mineralizao conseguidas por estes autores
foram comparveis s descritas para aqferos temperados (~20C), indicando que o processo
de biorremediao in situ no prejudicado pela temperatura, nessa situao.
Em um trabalho de investigao da biodegradao de BTEX em solos alpinos a 10C, foi
observada uma reduo de contaminantes significativamente mais baixa (76%) do que a
observada em solos temperados (20C), ao contrrio do observado por Bradley & Chapelle
(1995) (revisado por MARGESIN & SCHINNER, 2001).
Trabalhos envolvendo bactrias termfilas demonstraram que, predominantemente, os
bacilos, possuem um grande potencial para a converso de poluentes ambientais, incluindo
todas as grandes classes (MLLER et al., 1998). Taylor et al. (1998) patentearam um

processo de descontaminao onde h o acoplamento da tcnica de stripping tcnica de

biorremediao utilizando microrganismos termfilos, para rpido tratamento de solos a
grandes profundidades. Uma descontaminao primria realizada submetendo uma parcela
do solo a aquecimento (atravs da injeo de vapor e resistncia eltrica) para vaporizao de
parte dos contaminantes, removidos por extrao a vcuo. A parcela residual, no extrada
com a vaporizao, ento metabolizada por microrganismos termfilos, visto que o
ambiente ficaria aquecido por um tempo longo aps a primeira etapa de remoo dos
contaminantes.
Processos de biorremediao intrnseca em solos ridos de desertos tm sido estudadas,
principalmente em reas onde ocorrem comumente guerras e onde existe grande atividade de
extrao de petrleo. Um grande problema nesses locais a necessidade de irrigao
constante do meio. O uso de gua do mar para o processo de irrigao prejudicial por
aumentar a salinidade, inibindo o processo de biodegradao, enquanto o uso de gua
continental nos solos desrticos leva a um processo de lixiviao, reduzindo a salinidade do
solo. O uso de gua salina diluda (0,5%m/v) e reflorestamento tm sido testados como
alternativas aprazveis na biodegradao dos hidrocarbonetos contaminantes de solos
desrticos (revisado por MARGESIN & SCHINNER, 2001).
Alguns trabalhos na literatura relatam a eficincia dos processos de biorremediao, em
condies anaerbias, em aquferos cuja concentrao de oxignio muito baixa (BAKER et
al., 1987, BATTERMAN, 1983). Os processos anaerbios so muito utilizados para
depurao de guas residurias municipais e industriais, principalmente em biorreatores,
devido ao seu menor custo e eficincia comprovada. Entretanto, eles tm recebido menor
ateno em relao aos aerbios, quanto a detoxificao de stios contaminados por petrleo e
derivados (ZHANG & BERNETT, 2005).
Os exemplos anteriores justificam a necessidade de mais pesquisas relacionadas s tcnicas de
biorremediao, no apenas em reas cujas caractersticas do meio so adversas ao
crescimento microbiano, mas em todos os tipos de ambientes, em condies aerbias e
anaerbias, visto que cada situao nica, e generalizaes nem sempre so satisfatrias.
Demonstraes da biodegradao dos BTEX no campo, em ambientes continentais e
marinhos, so necessrias para aumentar nossos conhecimentos sobre a eficincia desse
processo.

2.4 PERSPECTIVAS

QUANTO AO USO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA CONSTRUO DE

LINHAGENS COM AMPLA CAPACIDADE DE DEGRADAO

A utilizao de microrganismos como alternativa para o tratamento de ambientes

contaminados tem sido bem vista por boa parte dos estudiosos, levando em considerao a
grande capacidade microbiana de adaptao e utilizao de vrios tipos de compostos como
fonte de carbono. As vrias evidncias de detoxificao natural de ambientes contaminados
nos levam a reconhecer o papel da microbiota indgena na degradao dos compostos
contaminantes. Entretanto, cada vez mais, a quantidade de resduos lanados no ambiente tem
sido maior, bem como o nmero de compostos recalcitrantes que acompanham essa
contaminao, o que dificulta a ao microbiana.
A utilizao da tecnologia do DNA recombinante para obteno de microrganismos
geneticamente modificados (MGMs) com mltiplas capacidades de degradao tem sido vista
como uma alternativa para biorremediao de ambientes contaminados por xenobiticos
recalcitrantes, a maioria associada s reas de despejo de resduos industriais. Linhagens
recombinantes, apesar de alguns resultados de sua aplicao ainda serem discutveis, tm sido
exploradas e apresentaram algum sucesso no aumento do desempenho de bactrias da
microbiota indgena.
Como discutido na seo anterior, a presena de poluentes no ambiente altera a estrutura das
comunidades microbianas indgenas estimulando, principalmente, o aumento de classes de
microrganismos resistentes aos contaminantes. Essa resistncia, especialmente em relao aos
compostos orgnicos aromticos, d-se, por exemplo, por alteraes na composio das
membranas lipdicas bacterianas (citoplasmtica e membranas externas). Equipar bactrias
solvente-tolerantes com maquinarias catablicas apropriadas pode ser um avano promissor
para os propsitos da biorremediao (PIEPER & REINEKE, 2000).
A obteno de recombinantes utilizando bactrias adaptadas a ambientes especficos foi
realizada por Lange et al. (1998). Estes autores construram uma bactria recombinante
Deinococcus radiodurans, um dos organismos mais resistentes radiao que se conhece,
atravs da clonagem dos genes tod em seu cromossomo. Essa bactria recombinante capaz
de expressar a enzima tolueno dioxigenase (TOD) e apresenta a habilidade de degradar
tolueno, clorobenzeno, 3,4-dicloro-1-buteno e indol.

Outro exemplo de tentativas de obteno de bactrias recombinantes capazes de promover a

biorremediao em ambientes extremos poludos foi a clonagem de genes relacionados s vias
de degradao de hidrocarbonetos aromticos em bactrias acidfilas Acidophilium cryptum
(QUENTMEIER & FRIEDRICH, 1994),
A clonagem de genes de tolerncia em bactrias com potencial de degradao de
hidrocarbonetos aromticos tambm uma alternativa. Esta estratgia j foi realizada atravs
da transferncia do operon de E. coli pro U (um importante locus relacionado
osmorregulao) para linhagens de Pseudomonas capazes de degradar petrleo cru. O uso
desses microrganismos na remediao de ambientes salinos reduz os custos com diluies e
outros processos de purificao antes necessrios para reduo da salinidade (MARGESIN &
SCHINNER, 2001).
Uma outra estratgia para obteno de recombinantes com capacidade superior de
biodegradao a combinao de segmentos catablicos de diferentes organismos em uma
nica linhagem, levando obteno de vias metablicas completas em bactrias, antes
incapazes de degradar completamente um composto xenobitico, que produziam metablitos
intermedirios ou at mesmo txicos. Outras formas de otimizar a biodegradao consiste no
uso de mutaes sitio-dirigidas que aumentam a atividade de enzimas das vias catablicas,
alterao de promotores, tornando-os mais fortes, e a alterao de mecanismos de regulao a
favor dos processos de degradao dos contaminantes (PIEPER & REINEKE, 2000).
Talvez uma das dificuldades do uso das linhagens recombinantes seja a instabilidade dos
genes clonados quando os mesmos se encontram em plasmdeos. Uma soluo para esse
problema tem sido a utilizao de mini-transposons para integrar os genes nos cromossomos e
estabiliz-los nas linhagens (PIEPER & REINEKE, 2000).
Os avanos das tcnicas moleculares permitiro obter mais informaes sobre os mecanismos
de degradao dos compostos aromticos, estrutura e funo de genes, promotores, molculas
reguladoras e enzimas, bem como novas rotas metablicas, oferecendo maiores possibilidades
otimizao dos processos catablicos, atravs dos MGMs. Entretanto, apesar das linhagens
recombinantes constiturem uma boa alternativa para uso nos processos biorremediadores, so
necessrios mais estudos para aplicao dessa microbiota no campo, a fim de evitar a gerao
de outros impactos ambientais, alm da contaminao pelos xenobiticos pr-existentes.

3 CONCLUSO

A elevada taxa de mortalidade (cerca de 6,5 milhes de pessoas morrem de cncer

anualmente) e o fato de que os tratamentos para estas doenas serem dispendiosos, demorados
e normalmente trazerem muito sofrimento aos doentes, expem claramente os benefcios
potenciais do desenvolvimento de tcnicas eficientes para a remoo de agentes txicos como
os compostos BTEX do meio ambiente.
Tendo em vista que a grande maioria dos compostos orgnicos derivados do petrleo
presentes no meio ambiente sofre modificaes devido ao dos microrganismos, a
alternativa da biorremediao como processo de remoo desses resduos tem sido
amplamente aceita e estudada, considerando sua eficincia e custo relativamente baixo.
Ainda existe uma grande necessidade de estudos a fim de determinar quais so os
microrganismos biodegradadores, suas principais vias catablicas e as condies timas para
uma eficiente biodegradao desses poluentes (temperatura, nutrientes, presso de oxignio
etc). Tais estudos possibilitam o desenvolvimento de tcnicas que permitam o uso eficiente de
microrganismos com alta capacidade de degradao no campo.
Uma rea ignorada pelos pesquisadores a caracterizao de culturas enriquecidas. Os
consrcios bacterianos so particularmente importantes para a degradao de compostos
considerados recalcitrantes. Por esse motivo, a elucidao da ecologia desses grupos de
organismos crtica.
Tambm necessrio expandir as reas de conhecimento quanto s diversas condies
ambientais nas quais esses organismos podem estar presentes e que, eventualmente, podem
estar sujeitas contaminao por BTEX, entre elas encontram-se as condies extremfilas,
apontadas anteriormente neste trabalho: reas desrticas e reas polares, altas profundidades
no oceano, condies altamente salinas e de pHs variados.
Alm disso, tambm importante delegar maior ateno aos processos de degradao em
meios exauridos de oxignio. Apesar dos processos de degradao de BTEX sob condies
anaerbias serem mais lentos do que aqueles que ocorrem em condies aerbias, eles
constituem um componente significante na remoo de poluentes devido grande abundncia

de outros aceptores de eltrons em relao ao oxignio dissolvido e, em sistemas de

biorremediao, requerem menor interveno humana. O crescente interesse pelos processos
anaerbios, somado aos recentes avanos na tecnologia molecular e bioqumica e na
instrumentao analtica, permitiro que novas linhagens continuem sendo isoladas e novas
enzimas e vias metablicas, elucidadas.
O isolamento e caracterizao das enzimas e genes envolvidos no catabolismo de degradao
dos compostos BTEX possibilitam, atravs da engenharia gentica, a obteno de
microrganismos com potencial elevado de biodegradao, capazes de resistir bem s
condies do meio e competio com a microbiota natural do solo (SINGH & WALKER,
2006). Uma melhor compreenso dos mecanismos que controlam a expresso desses genes
tambm necessria por contribuir na descoberta de novos genes e protenas envolvidas na
regulao, podendo contribuir bastante na construo de MGMs com grandes habilidades para
degradao dos compostos BTEX, que possam ser utilizados para otimizao dos processos
de biorremediao. Alm disso, a maquinaria regulatria pode ser usada no desenvolvimento
de tcnicas de biomonitoramento, biosensores e dispositivos de biossegurana para controle
ambiental.

4 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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