Analisis Glukosamin

1. Preparsi dari glukosamin standar

Glukosamin hidroklorida digunakan sebagai standar, ditimbang
secara akurat untuk membuat larutan stok dalam air pada
konsentarsi 0,3065 dan 1,063 mg/ml. Konsentrasi yang tepat dari
larutan standar digunakan untuk mengkomper kandungan
glukosamin dari suplemen makanan dengan menggunakan L-Trp
dan 5-MTP berkisar antara 30-155 mikrogram/ml.

2. Preparasi glukosamin yang terkandung dalam suplemen makanan.

Untuk sediaan berbentuk solid berupa tablet atau kapsul dilarutkan
di dalam beakerglass menggunakan 300ml air deionisasi dengan
pengadukan, lalu larutan tersebut didiamkan selama 30 menit.
Larutan dimasukan ke labu ukur 500ml dan ditambahkan air
deionisasi samapai batas (tanda) pada labu ukur, menghasilkan
larutan stok yang mengandung paling tidak 3 mg/ml glukosamin.
Aliquot dari larutan stok ini disaring menggunakan syringe filter dan
dilusi untuk menghasilkan larutan 0,15 mg/ml glukosamin yang siap
untuk dianalisis. Sedangakan untuk sediaan liquid dimasukan ke
labu ukur 25ml dan dilusi menghasilkan larutan glukosamin dengan
konsentrasi 0,15mg/ml kemudian di saring.

3. Prosedur untuk mereaksikan glukosamin dengan OPA-MPA

Campurkan larutan OPA dalam metanol (10.798 mg/mL), 100 L
MPA, 800 L larutan glukosamin hidroklorida (1.023 mg/mL),dan
9580 L buffer borat (80mM, pH=9,5). Untuk memonitor stabilitas
dari glukosamin-OPA-MPA, 600 mikroliter dari campuran larutan
tersebut dicampurkan dengan 2400 mikroliter buufer borat (80mM,
pH=9,5) dan dimasukan ke spektofotometer uv-vis.

4. Prosedur reaksi derivatisasi precolumn dalam glukosamin dengan

PITC (pre column)
1ml dari larutan glukosamin 0,15mg/ml dan 1ml buffer phosfat
0,3M pada pH 8,3 serta 1 ml phenylisothiosyanat 5% dalam
metanol dimasukan ke vial 20 ml dan dicampurkan. Vial ditutup
rapat dan ditempatkan ke water bath pada suhu 600 C. Lalu vial
dipindahkan dari water bath dan di vortex selama 1 menit tiap 20
menit. Setelah 120 menit vial dimasukan ke ice bath selama 10
menit dan kemudian disimpan di suhu ruangan. Larutan disaring
menggunakan syringe filter 0,45 m. Sampel blank untuk reaksi
derivat precolumn disiapkan mengikuti prosedur yang dijelaskan
sebelumnya, tetapi tidak measukan 1ml air ke 1 ml glukosamin.

5. Kondisi kromatografi
-Metode fluoresensi tidak langsung
Fase geraknya adalah sodium borat pH 9, kecepatan alir 1 ml/min;
interaksi poscolumn 2 105 M Cu(L-Trp)2 pada 40mM sodium borate
di pH 9.0 atau 2105M Cu(5-MTP)2 dalam 40mM sodium borate pada
pH 8.4; menggunakan kolom strong anion exchange; spektroflow 980
fluoresence panjang gelombang eksitasi 280 nm dan panajang
gelombang emisi 320 nm atau 340 nm.
-Metode precolumn derivatisasi
Fase gerak metanol-air-asam asetat (10:89,96:0,04 v/v/v); kecepatan alir
1ml/min; column, fase terbalik; detector, waters 484 tunable
absorbance dengan panjang gelombang 254 m.