LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Disusun oleh :
Kelompok 9
Arini Dyah S.P.D

(1306377316)

Desta Andriyani

(1306377083)

Sekar Pramesti Artha (1306397034)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS INDONESIA
2014

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Hari, tanggal praktikum

: Kamis, 25 September 2014

Waktu

: 10.00 12.00

Tempat

: Laboratorium Mikrobiologi lantai 3

Gedung Fakultas Farmasi UI

I. PENDAHULUAN
Bakteri sukar sekali dilihat dengan jelas dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri
tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri. Dalam upaya memahami dan mempelajari
struktur, penggolongan sifat, dan morfologi bakteri, dapat dilakukan pewarnaan bakteri.
Asam nukleat bakteri mengandung gugus fosfat bermuatan negatif yang dapat mengikat
zat warna basa yang bermuatan positif. Zat warna asam tidak dapat mewarnai sel bakteri dan
dipergunakan untuk mewarnai latar belakangnya. Zat-zat warna umum dipergunakan untuk
mempelajari morfologi bakteri.
Zat warna terikat dengan protoplasma bakteri secara kimia dan zat warna yang
dipergunakan berbentuk garam. Zat warna bisa mengandung kation pewarna dan anion bukan
pewarna, sedangkan zat pewarna asam mengandung kation bukan pewarna dan anion
pewarna. Ada 5 macam jenis pewarnaan yang dapat dilakukan, dan pada praktikum kali ini
digunakan salah satu cara yaitu Pewarnaan Gram.
II. PRINSIP
Dalam praktikum pewarnaan bakteri kali ini, digunakan cara Pewarnaan Gram dimana
prinsip dari pewarnaan ini yaitu dengan memberikan warna bakteri tersebut dengan 3 zat
warna yaitu Zat Karbol Kristal Ungu, Lugol, dan Air Fuchsin.

Setelah pewarnaan tersebut, akan didapatkan 2 kelompok bakteri yaitu bakteri Gram Positif
dan Gram Negatif hal itu karena Zat Kristal Karbol Ungu dan larutan Lugol akan membentuk
senyawa kompleks yang berwarna ungu pada bakteri, kemudian setelah dilakukan pencucian
dengan

alkohol

96%

barulah

dapat

terlihat

perbedaannya.Bakteri

yang

masih

mempertahankan zat warna ungu merupakan Gram Positif sedangkan yang tidak dapat
mempertahankan zat warna ungu disebut Gram Negatif lalu setelah diberi Air Fuchsin, Gram
Negatif akan berwarna merah sedangkan Gram Positif akan tetapberwarna biru.

III. TUJUAN
Membedakan dan mengidentifikasi bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif
menggunakan metode pewarnaan Gram.
IV. ALAT DAN BAHAN
A. Alat
1.

Spirtus

4. Kaca objek

2. Korek api

3. Pinset

5. Pensil pewarna

6. Inokulum

7. Bak pewarnaan

8. Mikroskop Cahaya

B. Bahan

2. Biakan bakteri

Escherichia coli
Staphylococcus
Salmonella typhosa
Pseudomonas araginosa
Bacillus subtilis

3. Zat warna

Karbol kristal ungu 0,5 %

Cairan Lugol

Alkohol 96 %

Minyak Immersi

Air Fukhsin 0,5 %

Aquadest

V. PROSEDUR KERJA
1. Nyalakan api dalam Bunsen. Pijar alat-alat yang mau digunakan seperti inokulum, dan
bahan seperti tabung reaksi berisi bakteri.
2. Membuat preparat
-

Bersihkan objek gelas dengan tissue, kemudian lewatkan di atas api untuk
menghilangkan lemak lalu biarkan dingin sebelum dipakai.

Buat batas bulatan untuk menempatkan bakteri pada objek gelas menggunakan pensil
gelas.

Jika kuman yang diperiksa dalam media cair, ambil satu sengkelit letakkan di atas
gelas objek gelas, sebarkan seluas 1-2cm2 atau seluas daerah yang tekah ditandai
dalam objek gelas.

Jika kuman yang diperiksa ditanam pada media padat maka dibuat suspensi kuman
dengan satu sengkelit NaCl fisiologis.

Biarkan mongering di udara atau dipercepat dengan melewatkan di atas api

(difiksasi).

3. Tuang larutan karbol kristal ungu sebanyak 2 tetes sambil objek gelas digoyang
perlahan sampai zat warna menutupi seluruh permukaan bakteri yang akan diuji. Biarkan
selama 1-2 menit untuk bakteri gram negatif dan 6-7 menit untuk bakteri gram positif.
4. Cuci dengan air lalu tuangkan cairan Lugol selama 40-60 detik, kemudian dicuci dengan
air.
5. Lalu cuci alkohol dengan cara dicelupkan ke dalam bejana yang berisi alkohol 96%
goyangkan selama 30 detik sampai zat warna tidak mengalir lagi.
6. Cuci dengan air.
7. Tuangkan air Fukhsin kira-kira 1 tetes sampai menutupi seluruh permukaan bakteri,
biarkan selama 1-2 menit, cuci dengan air lalu keringkan dengan tissue selama 30-40
detik sambil ditekan perlahan-lahan sampai semua air terserap.
8. Tetesi minyak immersi sebanyak 2 tetes diatas sediaan kemudian amati di bawah
mikroskop dengan menggunakan perbesaran awal 100 kali.

VI. HASIL PENGAMATAN

Hasil pewarnaan gram pada bakteri Staphylococcus, menunjukkan perubahan warna bakteri
menjadi ungu biru, sehingga Staphylococcus digolongkan sebagai bakteri gram positif.

Hasil pewarnaan gram pada bakteri Escherichia coli, menunjukkan perubahan warna
bakteri menjadi merah, sehingga Escherichia coli digolongkan sebagai bakteri gram negatif.

Hasil pewarnaan gram pada bakteri Salmonella typhosa, menunjukkan perubahan warna
bakteri menjadi merah sehingga Salmonella typhosa digolongkan sebagai bakteri gram negatif.

Hasil pewarnaan gram pada bakteri Streptococcus, menunjukkan perubahan warna

bakteri menjadi ungu biru, sehingga Streptococcus digolongkan sebagai bakteri gram positif.

Hasil pewarnaan gram pada bakteri Bacillus subtilis, menunjukkan perubahan warna
bakteri menjadi ungu biru. sehingga Bacillus subtilis digolongkan sebagai bakteri gram positif

Hasil pewarnaan gram pada bakteri Pseudomonas araginosa, menunjukkan perubahan

warna bakteri menjadi ungu merah, sehingga Pseudomonas araginosa digolongkan sebagai
bakteri gram negatif.

VII. PEMBAHASAN

Sumber gambar :
http://books.google.co.id/books?id=AIDbNCmkNtgC&pg=PA115&dq=pewarnaan+bakteri&hl=id&sa=X&ei=XQ
8oVOjqO4-yuATEuoDYDQ&ved=0CB4Q6AEwAA#v=onepage&q=pewarnaan%20bakteri&f=false

Mikroorganisme merupakan makhluk yang berukuran kecil dan hanya dapat dilihat
melalui mikroskop. Tidak semua mikroorganisme dapat dilihat melalui mikroskop secara
langsung, melainkan ada yang harus diidentifikasi jenisnya dengan pewarnaan, seperti beberapa
jenis bakteri. Bakteri adalah salah satu golongan organisme prokariotik (tidak memiliki membran
inti).
Bakteri dapat diidentifikasi dengan cara pewarnaan, meliputi :
1. Pewarnaan Sederhana
2. Pewarnaan Diferensial
3. Pewarnaan Gram
4. Pewarnaan Negatif
5. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan yang sering digunakan adalah pewarnaan gram. Berdasarkan pewarnaan
gram, bakteri dibagi menjadi dua macam, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta

safranin atau kristal violet. Bakteri yang tetap berwarna ungu dengan pewarnaan oleh kristal
violet disebut bakteri Gram positif, misalnya Staphylococcus aureus, sedangkan bakteri yang
warna ungunya hilang setelah dibilas dengan alkohol, tetapi tetap berwarna merah muda karena
menahan warna merah safranin disebut bakteri Gram negatif, misalnya Escherichia coli. Tidak
semua bakteri dapat terwarnai oleh pewarnaan Gram, misalnya Mycobacterium spp., karena
dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk
mengidentifikasi jenis bakteri ini. Pada sel bakteri ini akan berwarna merah muda, tetapi sel
jaringannya akan berwarna hijau.
Bakteri yang sudah diberi pewarnaan lalu diberi minyak immersi untuk diamati dengan
mikroskop cahaya. Bentuk bakteri juga dapat diidentifikasi melalui pewarnaan Gram, misalnya
bentuk sferis (kokus), bentuk batang (basilus), bentuk koma (vibrio). (James,Joyce.2006)

Sumber gambar :
http://books.google.co.id/books?id=AIDbNCmkNtgC&pg=PA115&dq=pewarnaan+bakteri&hl=id&sa=X&ei=XQ
8oVOjqO4-yuATEuoDYDQ&ved=0CB4Q6AEwAA#v=onepage&q=pewarnaan%20bakteri&f=false

Jamur dan ragi tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan Gram dan biasanya diidentifikasi
dengan pewarnaan jaringan yang terinfeksi untuk melihat struktur tipikal. Kultur murni dapat
diwarnai dengan metilen biru untuk menunjukkan struktur reproduksinya.
Virus dapat dilakukan dengan pewarnaan imunogenik khusus yang dapat memberi label
pada virus sehingga adanya virus dapat terdeteksi pada sel.
Reagen yang digunakan dalam pewarnaan Gram :

Zat warna utama (C.Gention Violet)

Lugol(zat Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama
memperkuat reaksi

Pencuci / peluntur zat warna (alkohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
untuk melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (air fukhsin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.
Identifikasi bakteri dilakukan dengan 4 tahap, yaitu :

1. Pemberian cat warna utama (C.Gention Violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan Lugol
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna air fukhsin

Sumber gambar : http://biobakteri.files.wordpress.com/2009/06/pewarnaan-gram.jpg

Identifikasi bakteri dapat dibedakan menjadi beberapa perbedaan, yaitu :

1. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat

didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Endotoksin

Bakteri Gram negatif

Bakteri Gram- negatif berbentuk batang (Enterobacteriaceae)
Bakteri Gram-negatif berbentuk batang habitat alaminya berada pada sistem usus
manusia dan binatang. Keluarga Enterobacteriaceae meliputi banyak jenis (Escherichia,
Shigella, Salmonella,Enterobacter,Klebsiella,Serratia,Proteus,dll). Beberapa organisme,
misalnya Escheria coli merupakan flora normal dan menyebabkan penyakit, sedangkan
yang lain seperti Salmonella dan Shigella merupakan patogen yang umum bagi manusia.
Pseudomonas, Acinetobacter, dan Bakteri Gram-negatif lain
Pseudomonas aeruginosa bersifat invasif dan toksigenik, mengakibatkan infeksi
pada pasien dengan penurunan daya tahan tubuh, dan merupakan patogen nosokomial
yang penting. Chromobacteria dan Chryseobacteria ditemukan di tanah dan air dan
merupakan

bakteri

patogen

yang

oportunistik

bagi

manusia.

Bakteri

lain,

Capnocytophaga, Eikenella corrodens, Kingella, dan Moraxella tumbuh normal pada

manusia namun dapat menyebabkan variasi infeksi yang luas.

 Vibrio, Campylobacter, Helicobacter, dan Bakteri lain yang berhubungan.

Mikroorganisme ini merupakan spesies berbentuk batang gram-negatif yang tersebar luas
di alam. Vibro ditemukan di daerah perairan dan permukaan air. Aeromonas banyak
ditemukan di air segar dan terkadang pada hewan berdarah dingin. Plesiomonas terdapat
pada hewan berdaeah dingin dan panas. Campylobacter ditemukan di banyak spesies
hewan, termasuk hewan peliharaan.
Haemophilus, Bordetella, dan Brucella
Merupakan kelompok bakteri pleiomorfik kecil, gram-negatif. Haemophilus influenzae
tipe b merupakan patogen manusia yang penting.
Yersinia, Francisella dan Pasteurella
Merupakan bakteri berbentuk batang pendek Gram-negatif yang pleimorfik. Organisme
ini bersifat katalase positif, oksidase, positif, dan merupakan bakteri mikroaerofilik atau
anaerob fakultatif.
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

Tidak peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Bakteri Gram-positif

Bakteri gram-positif pembentuk spora : spesies Bacillus dan Clostridium

Basil gram-positif pembentuk spora mencakup spesies Bacillus dan Clostridium.
Kedua spesies ini ada di mana-mana, membentuk spora sehingga dapat hidup di
lingkungan selama bertahun tahun. Spesies Bacillus bersifat aerob, sedangkan
Clostridia bersifat anaerob obligat.

Bakteri

Gram-positif

tidak

membentuk

spora

spesies

Corynabacterium,

Propionibacterium,Listeria,Erysipelothrix, Actinomycetes
Beberapa

anggota

genus

Corynebacterium

dan

kelompok

spesies

Propionibacterium merupakan flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia.
Corynebacterium diphtheriae memproduksi

eksotoksin yang sangat kuat dan

menyebabkan difteria pada manusia. Listeria monocytogenes dan Erysipelothrix

rhusiophathiae ditemukan pada binatang dan kadang menyebabkan penyakit yang berat
pada manusia. Golongan Listeria dan Erysipelothrix tumbuh dengan baik di udara,

Staphylococcus
Merupakan sel gram-positif berbentuk bulat, biasanya tersusun dalam bentuk
bergerombol yang tidak teratur seperti anggur. Beberapa spesies merupakan anggota flora
normal pada kulit dan selaput lendir manusia; yang lain menyebabkan supurasi dan
bahkan septikemia fatal. Staphylococcus yang patogen sering menghemolisis darah,
mengkoagulasi plasma dan menghasilkan berbagai enzim ekstraseluler dan toksin yang
stabil terhadap panas. Stapgylococcus cepat menjadi resisten terhadap beberapa
antimikroba. Genus Staphylococcus sedikitnya memiliki 30 spesies. Tigas spesies
Staphylococcus

yang

berkaitan

dengan

medis

adalah

Staphylococcus

auerus,

Staphylococcus epidermidis dan Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus

bersifat koagulase positif, dan merupakan patogen utama pada manusia. Staphylococcus
koagulase negatif merupakan flora normal manusia dan kadang kadang menyebabkan
infeksi, misalnya Staphylococcus epidermidis.

Streptococcus
Streptococcus merupakan bakteri gram-positif berbentuk bulat yang mempunyai
karakteriristik dapat membentuk pasangan atau rainta selama pertumbuhnannya. Bakteri
ini beberapa di antaranya merupakan anggota flora normal manusia; sedang
Streptococcus yang lain berhubungan dengan penyakit pada manusia.
Ada 20 jenis Streptococcus, di antaranya Streptococcus pygones (Group A),
Streptococcus agalactiae (Group B) dan jenis Enterococcus (Group D). Mikroorganisme
tersebut memiliki berbagai tampilan yang bervariasi dalam hal karakteristik koloni
pertumbuhna, pola hemolisis pada meda agar darah, komposisi antigen dalam substansi
dinding sel, dan reaksi biokimia. Jenis Streptococcus pneumoniae diklasifikasikan
komposisi antigen polisakarida pada kapsul.

VIII. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan Pewarnaan Gram yang telah kami lakukan, kami dapat menarik
kesimpulan bahwa pada bakteri gram positif ketika dilakukan pewarnaan gram (ditetesi karbol
kristal ungu, lugol, dan air fukhsin) akan menunjukkan warna ungu kebiruan karena struktur
dinding sel bakteri gram positif mengandung lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga ketika
dilakukan pewarnan, zat warna akan terperngkap dalam lapisan tersebut dan sukar dihilangkan
ketika dicuci dengan air maupun alkohol, sehingga zat warna dapat mewarnai bakteri jenis ini.
Contoh bakteri dalam percobaan kami yang termasuk ke dalam bakteri gram positif adalah
Staphylococcus, Streptococcus, dan Bacillus subtilis. Sedangkan bakteri gram negatif ketika
dilakukan pewarnaan gram (ditetesi karbol kristal ungu, lugol, dan air fukhsin) akan
menunjukkan warna ungu kemerahan karena bakteri tersebut tidak mengandung lapisan
peptidoglikan sehinga ketika dlakukan pewarnaan kemudian dicuci dengn air maupun alkohol,
zat warna tidak menempel dan akan larut saat dicuci. Contoh bakteri dalam percobaan kami yang
termasuk ke dalam bakteri gram negatif adalah Escherichia coli, Pseudomonas araginosa dan
Salmonella typhosa.

DAFTAR PUSTAKA
1. Radji, Maksum. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Depok: Fakultas
Farmasi UI
2. Joyce,James.et al.2006.Prinsip Prinsip Sains untuk Keperawatan.(diterjemahkan oleh:
dr. Indah Retno .Jakarta:Erlangga
3. Radji, Maksum. 2013. Buku Ajar MIKROBIOLOGI : Panduan Mahasiswa Farmasi &
Kedokteran. Jakarta:EGC
4. http://lib.ui.ac.id/file?file=digital/123049-S09076fk-Pola%20resistensi-Literatur.pdf