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Universidade Federal da Bahia

Campus Ansio Teixeira


Instituto Multidisciplinar em Sade

MICROBIOLOGIA DE
ALIMENTOS

ROTEIRO DE PRTICAS

Professora: Jssica Bomfim de Almeida

2014

RECOMENDAES GERAIS
O estudante dever usar em aula prtica "OBRIGATORIAMENTE" o jaleco. Lembre-se
que de alguma forma voc estar em contato com micro-organismos, e, portanto deve
tomar todo cuidado para evitar se contaminar, ou transmitir infeco s pessoas do
seu convvio. A bancada de trabalho deve estar livre, portanto adequado que no se
coloque nela cadernos e bolsas que no sero utilizados durante a fase experimental,
evitando assim acidentes.
Em todos os trabalhos prticos, observe os seguintes critrios:
a) Bico de Bunsen com chama azulada - A utilizao deste, visa flambar a ala ou a
agulha bacteriolgica e propiciar um ambiente assptico ao redor do material que
voc manusear, evitando assim resultados indesejveis e diminuindo o risco de
infeco por aspirao de partculas.
b) Ala ou agulha bacteriolgica - Devem ser flambadas at o rubor, antes e aps cada
experimento. Saiba que antes elas so flambadas, para evitar resultados indesejveis
ao seu estudo, pois micro-organismos contaminantes do ar podem estar assentados
sobre o material; e depois, a flambagem obrigatria, pois esse material
posteriormente poder contaminar outras pessoas. Procure executar esse
procedimento colocando o instrumento sobre a chama, numa posio vertical e nunca
em posio horizontal, pois desta ltima forma voc estar esterilizando apenas a
poro final.
c) Abrir o tubo de cultura - Segure o tubo com a mo esquerda e retire a tampa com os
dedos mnimo e anelar da mo direita, deixando livres os dedos mdio, indicador e
polegar para manuseio da ala bacteriolgica ou pipeta, evitando assim deixar a tampa
sobre a bancada o que levaria sua contaminao.
e) Sempre que houver algum acidente, como quebra de tubos ou placas com microorganismos, contato com material contaminado, etc. Avise ao professor no local, para
que ele tome providncias imediatas, dependendo do caso ou acidente, e jamais seja
relaxado com os cuidados pessoais.
d) Ao final de todo trabalho prtico alm de organizar o seu local de trabalho e passar
lcool 70 na bancada. No se esquea de lavar as mos com gua e sabo e
posteriormente, lcool.

SUMRIO
PRTICA I - CONSERVAO DE ALIMENTOS..................................................................... 3
PRTICA II TCNICAS DE SEMEADURA E MEIOS DE CULTURA ...................................... 4
PRTICA III DILUIO E CONTAGEM DE UFC................................................................. 7
PRTICA IV - CONTAGEM TOTAL DE AERBIOS MESFILOS, PSICROTRFICOS,
BOLORES E LEVEDURAS .................................................................................................... 9
PRTICA V - CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM ALIMENTOS ................... 11
PRTICA VI - ANLISE DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS .............................................. 13
PRTICA VII - PROVAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICAO DE E. COLI ....................... 16
PRTICA VII - DETECO DE SALMONELLA SPP. EM ALIMENTOS .................................. 19
PRTICA VIII - CONTAGEM TOTAL DE BACTRIAS LTICAS EM LEITES FERMENTADOS 21

PRTICA I - CONSERVAO DE ALIMENTOS


1. INTRODUO
Os mtodos de conservao tm o objetivo de aumentar a vida til dos
alimentos atravs de tcnicas que evitam alteraes microbianas, enzimticas,
qumicas e fsicas, mantendo seus nutrientes e suas caractersticas organolpticas. As
alteraes mais importantes so as de origem microbiana, pois alm de deteriorar
os alimentos tambm podem provocar doenas. Sendo assim, os fatores intrnsecos e
extrnsecos so utilizados nos processos de conservao com intuito de
eliminar os micro-organismos ou inibir o crescimento microbiano.
2. OBJETIVOS
Avaliar a importncia dos fatores extrnsecos e intrnsecos na conservao de
alimentos e identificar qual forma de conservao de alimentos usuais no cotidiano
mais eficiente.

3.MATERIAIS:
7 bqueres,
1 pedao de parafilme para vedao;
10 ml de vinagre;
2 colheres de sal;
1 panela pequena;
4 colheres de amido de milho;
500 ml de gua.

4. PROCEDIMENTO:
Em uma panela dissolva o amido de milho em gua, misture bem e leve ao fogo
at engrossar. Adicione at a metade de cada bquer em seguida siga o procedimento
a seguir:
- Bquer 1- Deixe aberto em temperatura ambiente.
- Bquer 2 - Cubra com o filme plstico, vede-o, e deixe-o em temperatura ambiente.
- Bquer 3 - Adicionar vinagre e deixar em temperatura ambiente.
- Bquer 4 - Adicionar sal e deixar em temperatura ambiente.
- Bquer 5 - Coloc-lo na geladeira, sem cobertura.
- Bquer 6 - Coloc-lo na geladeira, com cobertura.
- Bquer 7 - Coloc-lo no freezer, sem cobertura.
5. RESULTADOS E DISCUSSO
Qual dos mtodos testados o mais eficiente e o menos eficiente para a
conservao dos alimentos? Por qu?

PRTICA II TCNICAS DE SEMEADURA E MEIOS DE


CULTURA
1. INTRODUO
O estudo dos micro-organismos necessita normalmente do seu prvio
isolamento e identificao. Para tanto diversos meios de cultura so utilizados e
define-se meio de cultura como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de
carbono, nitrognio, sais minerais e gua, que propiciam o crescimento in vitro dos
micro-organismos.
A semeadura visa transferir para o meio de cultivo o material que se deseja
avaliar. Semear um micro-organismo coloc-lo em um ambiente adequado, em meio
de cultura apropriado ao seu desenvolvimento e reproduo. Ao semear, preciso
levar em conta as tcnicas de assepsia nas manipulaes, esterilidade do instrumento
e dos meios de cultura empregados. A finalidade isolar do material uma ou mais
espcies microbianas, (repicar) uma cepa pura, visando conserv-la ou estudar as suas
caractersticas morfolgicas e bioqumicas. A semeadura, plantio ou inoculao de
bactrias em meios de cultura pode ser feita mediante diversos procedimentos.
2. OBJETIVOS
Introduzir tcnicas de isolamento de bactrias.
3.

MATERIAIS:
Tubo com cultivo ativado por 24 horas
Agar nutritivo em placas
Tubo com caldo nutritivo
Tubo com Agar nutritivo inclinado
Placa de Petri esterilizada
Ala bacteriolgica (ou de platina)
Ala de Drigalski
Pipetas
Ponteiras estereis
Agar fundido a 45C
Estufa de incubao

4. PROCEDIMENTO
4.1 Inoculao em superfcie por esgotamento - estrias ou espalhamento em placas
a) ESTRIAS
1) Flambar a ala na chama do bico de Bunsen, colocando-a verticalmente, at atingir a
cor rubra. Repita este procedimento, se necessrio.

2) Resfriar a ala de platina calibrada na tampa do tubo de ensaio ou na lateral do


tubo, no qual encontra-se a amostra a ser inoculada;
3) Realizar a inoculao primria, fazendo uma estria que cruza o centro da placa.
Espalhar o inculo uniformemente.
4) Girar a placa em ngulo de 90 e disseminar o inculo at cobrir toda superfcie,
produzindo uma esteira de crescimento.
5) Identificar a placa e incubar a 35-37C por 24 horas. As placas devem ser incubadas
em posio invertida para evitar que a gua de condensao formada caia sobre o

Agar.
b) ESPALHAMENTO Spread plate
1) Com auxlio da pipeta, transferir 0,1ml da cultura para o centro da placa contendo o
meio slido;
2) Com auxlio da ala de Drigalsky estril espalhar todo o inculo at que seja todo
absorvido pelo meio de cultura.
3) Entre o espalhamento de uma placa e outra, a ala de Drigalsky dever ser flambada
embeber no lcool a 70% e levar a chama. (ATENO: redobrar o cuidado e ateno
durante este procedimento, para evitar acidentes);
4) Identificar a placa, incubar em posio invertida por 35-37C por 24 horas. As
placas devem ser incubadas em posio invertida para evitar que a gua de
condensao formada caia em cima do agar.

4.3 Inoculao em Profundidade (pour plate)

1) Com auxlio da pipeta, adicionar assepticamente 1mL do inculo fora do centro


(para facilitar a homogeneizao) da placa de Petri, estreis e vazias (abrindo a placa
apenas o suficiente para inserir a pipeta, prximo ao bico de Bunsen);
2) Adicionar 15 a 20 ml do gar previamente fundido e resfriado a 45C.
3) Misturar delicadamente o inculo com o meio de cultura, em movimentos circulares
no sentido horrio e anti-horrio.
4) Esperar solidificar completamente, incubar em posio invertida a temperatura de
35-37C, por 18 a 24 horas.
4.2 Tcnica da inoculao em tubo de ensaio - Agar inclinado
1) Flambar a ala de platina na chama do bico de Bunsen, colocando-a verticalmente,
at atingir a cor rubra. Repita este procedimento, se necessrio.
2) Resfriar a ala no meio de cultura, de preferncia nas bordas do meio, caso amostra
a ser inoculada esteja em suspenso resfriar na tampa do tubo de ensaio ou na lateral
do tubo;
3) Introduzir a agulha no meio at 2 a 3mm do fundo do tubo, em seguida retira-se a
agulha e estria a superfcie do meio, em movimento em s, de baixo para cima.

4.3 Tcnica da inoculao em tubo com caldo - difuso


1)Flambar a ala de platina na chama do bico de Bunsen, colocando-a verticalmente,
at atingir a cor rubra. Repita este procedimento, se necessrio.
2) Resfriar a ala no meio de cultura, de preferncia nas bordas do meio, caso amostra
a ser inoculada esteja em suspenso resfriar na tampa do tubo de ensaio ou na lateral
do tubo;
3)Inclinar e inocular na lateral do tubo prximo ao nvel do meio de cultura;
4)Recolocar o tubo na posio vertical;
5)Homogeneizar o tubo no agitador de tubo.

PRTICA III DILUIO E CONTAGEM DE UFC


1. INTRODUO
Em alguns ensaios microbiolgicos, em especial os destinados contagem, se
faz necessrio diluir a amostra com o intuito de reduzir a populao para facilitar a
contagem. Para tanto, chamamos esta etapa inicial durante o ensaio microbiolgico de
Diluio Seriada a amostra diluda sucessivamente em ordem decimal em um
diluente, podendo ser: gua peptonada, gua estril, soluo salina 0,85% e outros.
Diluio o procedimento de adio de uma substncia a outra para reduzir a
concentrao de uma das substncias. O uso mais comum da palavra diluio ocorre
no sentido de que tantas partes de um material esto sendo diludas em um nmero
total de partes do produto final (diluente + material). Diluies decimais seriadas: So
diluies decimais preparadas em srie e que possuem um fator de diluio nico e
igual a 10. A contagem em placa consiste em nada mais que inocular a amostra que se
deseja quantificar em um meio slido no seletivo para que, aps incubao
adequada, possam ser contadas as colnias, que na verdade chamamos de UFC
(unidade formadora de colnia). A semeadura em placas ou plaqueamento revela o
nmero de microrganismos capazes de se multiplicarem e formarem colnias em
meios de cultivo apropriados e sob condies de incubao adequadas. Cada colnia
de bactria desenvolvida supostamente originada a partir de uma unidade vivel, a
qual pode ser um organismo ou muitos.
2. OBJETIVO
Entender a metodologia das diluies e a contagem de UFC viveis.

3. MATERIAL
3 Tubos com 9 ml de gua peptonada 1%
3 Placas de Petri com Agar PCA
3 Placas estreis
Frasco com Agar PCA fundido
Ala de Drigalski
Pipetas de 1ml
Pipeta de 0,1ml
Ponteiras
Cultura bacteriana em caldo
4. PROCEDIMENTO

4.1 Diluio seriada


Preparar diluies de 10-1 at 10-3 da amostra com gua peptonada 0,1%. A partir da
cultura bacteriana, inocular 1 mL em 9 mL de gua peptonada, homogeneizar, retirar
1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina obtendo assim, as diluies 1/10,
1/100, 1/1000.
4.2 Plaqueamento em superfcie
1. Inocular 0,1 mL de cada diluio nas placas contendo o meio solidificado PCA;
2. Com o auxlio de ala de Drigalski, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a
superfcie do meio, at sua completa absoro.
3. Incubar as placas invertidas em estufa.
4.3 Plaqueamento em profundidade
1. Inocular 1,0 mL de cada diluio em placas de Petri estreis vazias.
2. Verter nas placas inoculadas 20 mL do Agar Padro para Contagem (PCA),
previamente fundido e resfriado a 45 C. Homogeneizar. Esperar solidificar;
3. Incubar as placas invertidas em estufa.
Contagem das colnias:
Plaqueamento em superfcie:
Calcular o nmero de unidades formadora de colnia (UFC) por mL ou grama,
multiplicar pelo inverso da diluio inoculada e depois por 10 (j que foi inoculado 0,1
ml e no 1 ml)

Plaqueamento em profundidade:
Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colnias. Calcular o nmero de unidade
formadora de colnia (UFC) por mL ou grama, multiplicar pelo inverso da diluio
inoculada.

5. RESULTADOS

PRTICA IV - CONTAGEM TOTAL DE AERBIOS


MESFILOS, PSICROTRFICOS, BOLORES E
LEVEDURAS
1. INTRODUO
O alimento quem determina qual micro-organismo capaz ou incapaz de se
desenvolver. Conhecendo-se as caractersticas do alimento, podemos predizer a flora
microbiana que nele poder se multiplicar. Da se d a importncia da anlise
microbiolgica, pois inmeros mtodos laboratoriais podem ser utilizados para
investigar a ausncia ou presena destes micro-organismos.
Segundo a ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications
for Foods) micro-organismos indicadores podem ser agrupados em: (I) Microrganismos
que no oferecem um riscos direto a sade: contagem padro de mesfila, contagem
de psicrotrficos e termfilos, contagem de bolores e leveduras. (II) Microrganismos
que oferecem um risco baixo ou indireto sade: coliformes totais, coliformes fecais,
Enterococcus, Enterobacteriaceae totais e Escherichia coli. Os nmeros e tipos de
micro-organismos presentes dentro ou sobre os alimentos produzidos podem ser
usados para avaliar com segurana a qualidade microbiolgica dos mesmos.
A segurana determinada pela ausncia ou presena de micro-organismos
patognicos ou suas toxinas, a quantidade do inculo, e o tempo de controle ou
destruio desses agentes. Os seguintes tpicos so importantes no estudo dos
mtodos de anlise microbiolgica de alimentos: amostragem, preparao da amostra
para anlise, mtodos de contagem de microrganismos e isolamento e identificao de
patgenos.
2. OBJETIVO
Compreender os fundamentos da contagem de micro-organismos em placa,
atravs das tcnicas de contagem total de mesfilos, psicotrficos, bolores e leveduras
em amostra de alimento.

3. MATERIAL
Frasco com 225 ml de gua peptonada 0,1%.
Esptulas estreis
Placa estril para pesagem.
3 Agar batata glicose 2% em placa para fungos
3 Agar PCA em placa para contagem total de psicrotrficos
2 Tubos com 9 ml de gua peptonada 0,1%
3 Placa de Petri esterilizada para contagem total mesfilos
Agar PCA fundido a 45C para contagem total mesfilos
Ala de Drigalski
Pipetas

Ponteiras
Estufa de incubao.

4. PROCEDIMENTO
Adicionar 25g ou ml do alimento em 225 ml de gua peptonada e preparar
diluies de 10-1 at 10-3 da amostra com gua peptonada 0,1%. Mesma diluio para
todas as contagens.
a) Contagem total de aerbios mesfilos
1. Inocular 1,0mL de cada diluio em placas de Petri estreis vazias.
2. Verter nas placas inoculadas 20 mL do Agar Padro para Contagem (PCA),
previamente fundido e resfriado a 45 C. Homogeneizar. Esperar solidificar;
3. Incubar as placas invertidas a 35C/48h. - Leitura: Selecionar as placas que
contenham entre 25 e 150 colnias.
b) Contagem total de aerbios psicrotrfilos
1. Inocular 0,1 mL de cada diluio nas placas contendo o meio solidificado PCA;
2. Com o auxlio de ala de Drigalski, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a
superfcie do meio, at sua completa absoro.
3. Incubar as placas invertidas a 7C/10 dias. - Leitura: Selecionar as placas que
contenham entre 25 e 250 colnias.
c) Contagem de bolores e leveduras
1. Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata
glicose 2% acidificado.
2. Com o auxlio de ala de Drigalski, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a
superfcie do meio, at sua completa absoro.
3. Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 C por 3 a 5 dias, em incubadora de
B.O.D. - Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.

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PRTICA V - CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS


AUREUS EM ALIMENTOS
1. INTRODUO
A contagem de S. aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos, um
relacionado com a sade pblica, para confirmar o envolvimento em surtos de
intoxicao alimentar, e outro relacionado com o controle de qualidade
higinico-sanitria dos processos de produo de alimentos, condio em que S.
aureus serve como indicador de contaminao ps-processo ou das condies de
sanificao das superfcies destinadas ao contato com alimentos.
A contagem baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras em
gar Baird-Parker, cuja composio evidencia a habilidade desse micro-organismo de
crescer na presena de 0,01 a 0,05% de telurito de potssio em combinao com 0,2 a
0,5 % de cloreto de ltio e 0,12 a 1,26% de glicina. O Staphylococcus aureus reduz
anaerbia e aerobiamente o telurito de potssio, produzindo colnias negras. O
gar Baird-Parker suplementado com soluo de gema de ovo possibilita a verificao
das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus, por meio do
aparecimento de um halo de transparncia e um de precipitao ao redor da colnia,
respectivamente.
2. OBJETIVO
Avaliar a presena de Staphylococcus coagulase positiva em alimentos, por
meio da tcnica de contagem em placas.
3.

MATERIAL
225 mL de gua peptonada estril.
2 tubos com 9 ml de gua peptonada estril
Pipeta graduada (10 ou 25ml)
Micropipeta 0,1 ml
3 placas com Agar BP- Baird-Parker
1 ala de Drigalski
3 lminas
Perxido de hidrognio
Plasma bovino
Kit para colorao de gram

4. PROCEDIMENTO
1. Triturar 25g ou diluir 25ml de amostra em 225 mL de gua peptonada estril.
2. Fazer 3 diluies 10-1,10-2 e e 10-3
3. Pipetar 0,1 mL de suspenso de cada diluio e colocar em placa contendo gar BPBaird-Parker e espalhar com uma ala de Drigalski at completa absoro.

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4. Incubar a 35C por 48h


5. Contar as colnias tpicas de S. aureus selecionando as placas que tenha entre 25 a
250 colnias.
Colnias tpicas: colnias circulares, pretas, pequenas, lisas, convexas, com bordas
perfeitas, massa de clulas esbranquiadas nas bordas, rodeadas por uma zona
opaca e/ou um halo transparente se estendendo para alm da zona opaca.
Colnias atpicas: cinzentas, sem um ou ambos os halos tpicos.
Selecionar colnias tpicas e realizar as provas bioqumicas.
PROVAS BIOQUMICAS:
1. Teste de catalase: colocar a massa celular em uma lmina e gotejar
perxido de hidrognio, se houver desprendimento de gs o teste catalase +.
Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o perxido de hidrognio,
liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas.
2. Teste de coagulase: adicionar 1 gota de soro bovino e depois adicionar uma
colnia de clulas se houver formao de cogulo coagulase +. Baseia-se na
comprovao da capacidade de coagular o plasma de coelho pela ao da enzima
coagulase produzida pelo micro-organismo.
3.
Colorao de Gram:
Baseia-se na verificao das caractersticas
morfolgicas e tintoriais do micro-organismo. O esfregao feito em lmina e
fixado, em seguida realizada a colorao adicionando o cristal de violeta de
genciana deixando agir por 1 minuto escorre e adiciona-se o lugol deixando mais 1
minuto, lava com gua e adiciona lcool-cetona (descorante) e deixa 30 segundos,
depois adiciona fucsina e deixa mais 30 segundos. Lave a lmina em um filete de gua,
seque a lmina com auxlio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar livre e
aplique uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e observe no microscpico
com objetiva de imerso (100 X).
Ser considerado Staphylococcus coagulase positiva se apresentarem
Coagulase +, Catalase + e Gram +.

RESULTADOS
Calcular os resultados em UFC/g ou mL

UFC/mL = n col. x diluio x 10

Pare e pense:
a) O alimento analisado encontra-se dentro dos padres baseado na RDC n12?
b) Qual a importncia da pesquisa de S.aureus em alimentos?

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PRTICA VI - ANLISE DE COLIFORMES TOTAIS E


FECAIS
1. INTRODUO
O grupo de coliformes totais um subgrupo da famlia Enterobacteriaceae,
inclui bactrias na forma de bastonetes Gram negativos, no esporognicos, aerbios
ou anaerbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produo de gs, em
24 a 48 horas 35C. O grupo inclui cerca de 20 espcies, dentre as quais se
encontram tanto bactrias originrias do trato gastrintestinal do homem e dos animais
como espcies no entricas. O grupo de coliformes termotolerantes um subgrupo
dos coliformes totais, restringe-se aos membros capazes de fermentar a lactose com
produo de gs, em 24 horas 44,5-45,5C. Coliformes Totais: Habitat intestinal e
ambiental: Ex.:espcies de Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia,
etc. Coliformes Termotolerantes: representados principalmente pela Escherichia coli
e, tambm por algumas bactrias dos gneros Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter.
Dentre esses micro-organismos, somente a E. coli de origem exclusivamente fecal.
A tcnica do NMP um mtodo de quantificao indireta de micro-organismos.
Na realidade, no podemos contar UFCs, j que a anlise realizada em meio lquido,
o que se faz comparar o resultado encontrado com tabelas pr-escolhidas, obtendo
um resultado aproximado da quantidade de micro-organismos na amostra analisada.
Estas tabelas so elaboradas a partir de dados estatsticos, com os respectivos
intervalos de confiana (95%) para diversas combinaes de nmero de tubos
positivos em cada srie de diluio. Significa dizer que existe uma probabilidade de
95% de que o nmero verdadeiro de bactrias presentes na amostra se encontre
dentro dos intervalos mnimos e mximos em torno do NMP. Muito embora o mtodo
dos tubos mltiplos apresente sensibilidade elevada, permitindo a deteco de baixas
densidades de bactrias, o NMP no um valor preciso, e a preciso do teste depende
do nmero de tubos utilizados e dos volumes de amostra inoculados. Este mtodo
muito usado para quantificar coliformes, mas pode ser utilizado para microorganismos em geral, pois o meio utilizado adaptado ao micro-organismo que se
deseja quantificar, com agentes seletivos e indicadores.
2. OBJETIVO
Detectar a presena de coliformes totais e termotolerantes em gua e em
alimentos utilizando o mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP).

3. MATERIAL
225 mL de gua peptonada 0,1%
2 tubos com 9 ml de gua peptonada estril
9 Tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) (com tubos de Durham)
9 Tubos contendo Caldo Verde Brilhante (com tubos de Durham)
9 Tubos contendo caldo EC (com tubos de Durham)

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3 Placas de agar EMB eosina azul de metileno


Micropipeta 1 ml ou Pipetas estreis
1 ala bacteriolgica
Meios para prova bioqumica de E.coli Citrato de Simonns, Caldo triptona e
caldo VM-VP;

4. PROCEDIMENTO
PARTE 1:
A) Teste Presuntivo de NMP
(Amostra_alimentos)
- Presume-se que os micro-organismos que crescem e produzem gs a partir da lactose
sejam coliformes. Meio de enriquecimento: caldo LST.
1. Triturar 25g ou diluir 25ml de amostra em 225 mL de gua peptonada estril.
2. Fazer 3 diluies 10-1, 10-2 e 10-3, inocular 1 ml de cada diluio em srie de trs
tubos contendo caldo Lauril Sulfato Triptose (LST).
3. Incubar 35 - 37C por 24 a 48h.
4. Contar o nmero de tubos positivos: com produo de gs e turvao do meio.
B) Teste Confirmativo de Coliformes totais ou 35C
Meio seletivo caldo Verde Brilhante bile. Neste meio, os sais de bile tm a funo de
inibir o crescimento de bactrias no entricas e o verde brilhante de inibir as
bactrias Gram-positivas, selecionando desta forma os coliformes.
1. De cada tubo positivo de LST retirar 1 (uma) alada e inocular em tubo
correspondente contendo caldo Verde Brilhante.
2. Incubar a 35-37 C por 24 a 48h.
3. Considerar como positivos os tubos turvos com produo de gs nos tubos de
Durhan.
4. Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de
coliformes totais por grama ou mL correspondente aos tubos positivos.
PARTE 2:
C. Teste Confirmativo de Coliformes termotolerantes 45C.
Os coliformes termotolerantes tm em seu ambiente natural (trato intestinal)
temperaturas mais elevadas. Eles so capazes de crescer a 44,5 C, possibilitando,
assim, de uma forma prtica, serem avaliados separadamente.
1. De cada tubo positivo de LST retirar 1(uma) alada e inocular em tubo
correspondente contendo caldo EC.
2. Incubar a 45,5 C em banho-maria por 24h.
3. Considerar como positivos os tubos turvos com produo de gs nos tubos de
Durhan.
4. Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de
coliformes totais por grama ou mL correspondente aos tubos positivos.

14

D. Teste confirmativo para E. coli


1. Dos tubos positivos do meio EC retirar uma alada e inocular em estrias em
esgotamento em placa contendo meio EMB para confirmao da presena de E. coli e
incubar a 35C por 24h.
E. Confirmao bioqumica para E. coli
1. Observar a formao de colnias de cor prpura com centro preto, e brilho
metlico verde no meio EMB, tpicas de E. coli.
2. Inocular as colnias tpicas em gar PCA 35C/24h;
3. Retirar inculo do meio PCA e transferir com ala e/ou agulha para os meios citrato
de Simonns, caldo VM-VP e caldo triptona, conforme esquema:

5.RESULTADOS

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PRTICA VII - PROVAS BIOQUMICAS PARA


IDENTIFICAO DE E. COLI
1. INTRODUO
Todas as subculturas positivas em caldo EC so repicadas para gar EMB, com
auxlio de ala de platina, fazendo estrias (por esgotamento). Para cada tubo positivo
em caldo EC corresponder uma placa de gar EMB, identificada para a perfeita
correspondncia;
OBS.: Meio EMB-Eosina e azul de metileno so corantes inibidores de Gram +.
O micro-organismo ao crescer fermenta a lactose, produzindo cido e precipitando a
eosina e o azul de metileno, que ao se interagir, fornecem o brilho verde metlico
caracterstico da E. coli.
- Incubar a 35C por 18-24h;
- Transcorrido este tempo, verificar o crescimento de
colnias com caractersticas de E. coli, ou seja, 2 a 3 mm de
dimetro, com brilho metlico esverdeado ou com o centro
escuro abrangendo praticamente toda a colnia;
- De cada placa de EMB correspondente a cada tubo de EC,
repicar de 2 a 3 colnias caractersticas para tubo com gar
nutriente inclinado, e incubar por 18-24h a 35-37C;
- Efetuar de cada cultura em gar nutriente, as seguintes
provas bioqumicas denominado IMVIC: Indol; Vermelho de
metila-VM; Voges-Proskauer-VP e Citrato.

2. METODOLOGIA
2.1 Prova do Indol
a) Procedimento: transferir o micro-organismo a ser testado para o meio de cultura
(caldo triptona). Adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs.
b) Objetivo: testar a habilidade de alguns micro-organismos de degradarem a molcula
de triptofano
c) Princpio: bactrias que possuem a enzima triptofanase so capazes de hidrolisar o
triptofano, produzindo indol, piruvato (cido pirvico) e amnia. Estes dois ltimos
produtos so utilizados diretamente no metabolismo da clula, enquanto o indol
acumula-se no meio. A presena de indol pode ser detectada pela adio do reativo de
Kovacs ao meio de cultura que resultar na formao de uma colorao vermelha na
superfcie do lquido.
Resultado: aps incubao a 37C por 48 horas e adio do
reativo, tem-se:

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Positivo: a presena de uma colorao vermelha na superfcie do lquido;


Negativo: a presena de uma colorao amarela (cor de reativo de kovacs) na
superfcie do lquido.

2.2 Vermelho de metila-VM.


a) Procedimento: transferir o micro-organismo a ser testado para tubos de ensaio com
caldo VM-VP (meio de Clark e Lubs). Incubar os tubos a 37C por 24 a 48 horas. Na
leitura adicionado 5 gotas de uma soluo de vermelho de metila.
b) Objetivo: determinar a habilidade de algumas bactrias em oxidar a glicose e levar
produo de cidos orgnicos como produto final.
c) Princpio: muitas bactrias utilizam glicose para suprir suas necessidades
nutricionais. Apesar disso, os produtos finais resultantes da oxidao da glicose podem
variar dependendo das vias metablicas presentes em cada micro-organismo. Algumas
bactrias, ao fermentarem a glicose, produzem cidos orgnicos (frmico, actico,
ltico, succnico, etc) que reduzem o pH do meio. Essas diferenas metablicas podem
ser evidenciadas, ento, pela adio de uma soluo de vermelho de metila (indicador
de pH) ao meio onde foi cultivado o micro-organismo de interesse. Em meios
acidificados, com pH menor que 4,0, o indicador torna-se vermelho. Em meios com o
pH maior ou igual a 6 o indicador adquire cor amarela
Resultado: aps a incubao a 37C por 48 horas, adicionar o reagente (vermelho de
metila), tem-se:
Positivo: colorao vermelha (pH menor que 4,0);
Negativo: cor original (amarela) do meio (pH maior ou igual a 6,0).

2.3 Prova do Voges Proskauer (VP)


a) Procedimento: transferir a bactria a ser testada para o meio VM-VP (meio de Clark
e Lubs). Incubar os tubos a 37C por 24 a 48 horas. Retirar 2ml da cultura para novo
tubo e adicionar a cada tubo 15 gotas do reagente -naftol 5% (reagente A) e 5 gotas
de soluo de KOH a 40% (reagente B); por cada mL de meio de cultura. Agitar
levemente o tubo.
b) Objetivo: evidenciar a produo de compostos no acdicos obtidos a partir da
fermentao da glicose.

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c) Princpio: bactrias que fermentam a glicose e levam produo final de compostos


no acdicos, como a acetona (acetilmetilcarbinol), podem ser identificadas pela
adio ao meio de cultivo dos reagentes A e B. Na presena deles, a acetona oxidada
transformando-se em diacetil, o que leva ao aparecimento de uma colorao rseoavermelhada, na superfcie do meio em torno de 15 a 20 minutos aps a adio dos
reagentes.
Resultado: para cada mL da cultura incubada durante 48 horas, adicionar os
reagentes, agitando sempre aps a incluso de cada soluo, deixar em repouso por 5
a 30 minutos.
Positivo: desenvolvimento de uma colorao rsea a vermelho rubro;
Negativo: ausncia de colorao rsea ou vermelha.

2.4 Citrato
a) Procedimento: transferir a bactria a ser testada para gar citrato de Simmons.
Incubar os tubos a 37C por 24 a 48 horas. Aps a incubao, examinar as culturas
contidas nos tubos com o meio inclinado e avaliar a presena ou a ausncia de
crescimento da bactria, verificando qualquer alterao na cor do meio de verde para
azul.
b) Objetivo: caracterizar micro-organismos capazes de utilizar o citrato como a nica
fonte de carbono, os quais provocam a elevao do pH do meio de cultivo devido a
metabolizao de ons citrato.
c) Princpio: para utilizar o citrato como nica fonte de carbono, necessrio que a
bactria possua a enzima citrato permease que facilita o transporte do citrato pra o
interior da clula. Do metabolismo do citrato so produzidos piruvato e CO2. Este
ltimo, ao reagir com o sdio presente no meio, forma o carbonato de sdio, de
natureza alcalina. O meio gar citrato de Simmons possui o citrato de sdio como
nica fonte de carbono, e o azul de bromotimol como indicador de pH. Com o
aumento do pH do meio, o azul de bromotimol adquire uma cor azul,
o que indica resultado positivo para o teste de utilizao do citrato.
Resultado: aps a incubao a 37C, tem-se:
Positivo: o meio se torna azul intenso, principalmente no pice;
Negativo: a cor natural do meio no muda, permanecendo verde.

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PRTICA VII - DETECO DE SALMONELLA SPP. EM


ALIMENTOS
1.INTRODUO
Todas as salmonelas so consideradas potencialmente patognicas para o
homem. So bacilos gram-negativos, moveis e no fermentam lactose. A nica via de
entrada destes microrganismos no corpo humano a oral, por isso de suma
importncia a anlise dos alimentos para detectar sua presena. A metodologia
recomendada segue 4 etapas que podem ser aplicadas a qualquer tipo de alimentos:
2. METODOLOGIA
a) Pr-enriquecimento em caldo no seletivo:
Objetiva a recuperao de clulas injuriadas.
Adicionar 25g ou mL da amostra em 225 mL do caldo de pr-enriquecimento
(diluio 10-1). Homogeneizar e incubar a 35 C/ 24h. Para uso geral recomenda-se o
caldo lactosado ou a gua peptonada 0,1% tamponada.
b) Enriquecimento Seletivo:
Estimula a multiplicao de salmonelas e reduz ou inibe o crescimento dos
organismos competitivos, tais como coliformes, Proteus e Pseudomonas.
Alquotas de 0,1mL das amostras pr-enriquecidas sero pipetadas em tubo
contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis e 1,0 mL para tubo contendo
10mL de caldo Selenito-Cistina. Os tubos sero incubados a 37C por 24 horas.
c) Plaqueamento seletivo diferencial:
Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colnias de Salmonella,
com caractersticas tpicas que as distingam dos competidores, para posterior
confirmao sorolgica e bioqumica.
- Agitar o tubo de enriquecimento seletivo e estriar uma alada nos meios gar
Salmonella-Shigella, Agar entrico de Hectoen (HE) e gar xilose lisina descarboxilado
(XLD). Incubar as placas invertidas a 35 C/24h. Verificar se h desenvolvimento de
colnias tpicas de Salmonella:
Agar SS: Colnias com centro negro (H2S) ou colnias incolores, as colnias das
bactrias no fermentadoras de lactose so incolores.
Agar HE: colnias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto.
Agar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto.
Confirmao Preliminar das colnias tpicas de Salmonella
Com o auxlio de uma agulha de inoculao, remover uma poro da massa de
clulas, do centro da colnia tpica (no mnimo 2 colnias) e semear em tubos
inclinados de Agar Lisina Ferro (LIA) e gar Trplice Acar. A semeadura deve ser feita
por picada e estrias na rampa. Incubar os tubos a 35 C/24h. Observar reao tpica:
TSI- rampa alcalina (vermelha) e fundo cido (amarelo), com ou sem produo
de H2S (escurecimento do agar). Reao atpica que no deve ser descartada se as

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demais reaes em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cidos (amarelos), com
ou sem produo de H2S. LIA fundo e rampa alcalinos (prpura, sem alterao da cor
do meio), com ou sem produo de H2S. Reao atpica, que no devem ser
descartada se as demais reaoes em TSI se apresentarem tpicas: fundo amarelado
com rampa alcalina, com ou sem produo de H2S.
3. Teste bioqumico
a) Meio SIM
Transferir com uma agulha atravs de picada a cultura de colnia tpica do TSI
para o meio. Incubar 35 C/24h.
Produo de H2S: escurecimento do gar. Salmonela pode produzir ou no
H2S.
Motilidade: crescimento na regio da picada imvel crescimento em todo
agar ou ao redor da regio da picada: mvel. Salmonela mvel.
Aps a leitura do H2S e da motilidade, adicionar 5 gotas de reativo de Erlich ou
Kovacs no tubo. Aparecimento de cor rsea: indol positivo e aparecimento de cor
amarelado: indol negativo. Salmonela indol negativo.
b) Teste do vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP):
Transferir uma alada com inoculo da cultura em TSI, para dois tubo com caldo
3mL VM-VP e incubar a 35 C/48h para VP e 96h VM. Aps o perodo de incubao, no
tubo VP adicionar 1,8 mL de soluo de alfa naftol 5% e agitar. Adicionar em seguida
0,6 mL de soluo KOH 40%, agitar. Observar at 1 hora. Desenvolvimento de cor
vermelha ou rosea teste positivo
Permanncia do meio na cor do reagente (amarelado ou ligeiramente
esverdeado) teste negativo. A maioria das Salmonelas so VP negativas. No tubo VM
adicionar 5 gotas de soluo vermelho metila e observar imediatamente se o meio
adquire uma colorao vermelha teste positivo ou amarela - teste negativo. A
maioria das cepas de Salmonela so VM positivas.
c) Teste do citrato:
Com uma agulha de inoculao, transferir um inoculo da cultura para um tubo
de agar citrato de Simmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a
35 C/ 96h. Observar o crescimento: Cor azul: citrato positivo: a maioria das cepas de
Salmonelas so citrato positivo. Cor do meio inalterado: citrato negativo.
d) Teste de urease:
Transferir uma alada da cultura crescida no TSI para um tubo com caldo uria
de Chistensen. Incubar 35 C/24h. Observar crescimento. Cor do meio original
(pssego): teste negativo. A maioria das cepas de Salmonelas so urases negativa. Cor
do meio rosa escuro: teste positivo.

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PRTICA VIII - CONTAGEM TOTAL DE BACTRIAS


LTICAS EM LEITES FERMENTADOS
1. INTRODUO
Segundo o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade de Leites
Fermentados (Instruo Normativa n46, de 23 de outubro de 2007 MAPA) entendese por Leites Fermentados os produtos adicionados ou no de outras substncias
alimentcias, obtidas por coagulao e diminuio do pH do leite, ou reconstitudo,
adicionado ou no de outros produtos lcteos, por fermentao lctica mediante ao
de cultivos de micro-organismos especficos. Estes microrganismos especficos devem
ser viveis, ativos e abundantes no produto final durante seu prazo de validade. De
acordo com este regulamento, os leites fermentados devem apresentar, no mnimo, o
nmero de 106 UFC/mL de bactrias lticas totais, no sendo esse valor alcanado, o
produto se encontra em no conformidade.
Para terem o apelo funcional devero conter probiticos - microrganismos
vivos capazes de melhorar o equilbrio microbiano intestinal produzindo efeitos
benficos sade do indivduo. Algumas bactrias lticas so consideradas microorganismo probiticos, a exemplo da Lactobacillus paracasei, Lactococcus lactis,
Bifidobacterium bifidum, entre outras. Segundo a ANVISA a quantidade mnima vivel
para os probiticos deve estar situada na faixa de 108 a 109 UFC/mL na recomendao
diria do produto pronto para o consumo, conforme indicao do fabricante. Valores
menores podem ser aceitos (mn. 106), desde que a empresa comprove sua eficcia e
atenda as legislaes vigentes.
2. OBJETIVOS
Avaliar diferentes marcas de leites fermentados atravs da contagem total de
bactrias lticas, para verificar se os mesmos esto em conformidade com o seu
Padro de Identidade e Qualidade PIQ.

3. MATERIAIS
5 placas com Agar MRS (Man, Rogosa e Sharpe) fundido a 45C
5 unid.- Tubos contendo 9mL gua peptonada 0,1%
5 unid.- Placa de Petri vazias esterilizadas
Pipetas e ponteiras estreis
Estufa de incubao

4. PROCEDIMENTO
Preparar diluies com a amostra de 10-1 at 10-5 em gua peptonada 0,1%.
Partir de 1mL da amostra para 9mL do diluente.
1. Inocular 1,0mL de cada diluio em placas de Petri estreis vazias;
2. Verter nas placas inoculadas 20 mL do Agar MRS, previamente fundido e resfriado
a 45 C. Homogeneizar cuidadosamente. Esperar solidificar e colocar uma
sobrecamada. Esperar solidificar novamente.
3. Incubar as placas invertidas a 35C/48h.
4.1 Confirmao

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a) Teste de catalase: colocar a massa celular em uma lmina e gotejar perxido de


hidrognio. Bactrias so CATALASE NEGATIVO.
b) Colorao de Gram: cocos ou bastonetes Gram positivos
Contagem: Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colnias. Calcular o nmero
de unidade formadora de colnia (UFC) por mL ou grama, multiplicar pelo inverso da
diluio inoculada. Ex: 100 colnias na diluio 10-2 = 100 x 102 = 10000 = 1,0 x
104UFC/g ou mL

5. RESULTADOS:

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

SILVA, N. da; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A.; TANIWAKI; SANTOS, M. H.;


R. F. S. dos; GOMES, R. A. R. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de
alimentos e gua. So Paulo: Livraria Varela, 2010. 630p.

DOWNES, F. P.; ITO, K. Compendium of methods for the microbiological


examination of foods (4aed.). Washington: American Public Health Association,
2001. 676p.

JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. 6. ed., Artmed, Porto Alegre, p. 712,


2005

FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. Atheneu, So


Paulo, 2002.

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