PEWARNAAN ALIZARIN RED

Oleh:
Nama
NIM
Rombongan
Kelompok
Asisten

: Danik Dian Budiarti

: B1J012129
:I
:2
: Ilham Amrulloh

LAPORAN PRAKTIKUM STRUKTUR DAN PERKEMBANGAN HEWAN II

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2013

I.

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Alizarin Red merupakan suatu metode untuk mengetahui pembentukan tulang

pada embrio atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio.
Penggunaan emrbrio mencit disebabkan karena embrio mudah didapat dan
embrionya mudah diamati. Tulang yang diwarnai oleh Alizarin Red akan berwarna
merah tua, yang menandakan bahwa tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi.
Warna merah tua terbentuk karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium
pada matriks tulang. Proses kalsifikasi pada embrio ayam dapat diamati ketika mulai
umur inkubasi 9 hari (Villee et al. 1988).
Tulang yang menyusun sistem rangka berkembang dari skelerotoma yang
merupakan derivat dari mesoderma dorsal. Tulang terbentuk melalui dua cara dimana
keduanya melibatkan transformasi dari jaringan mesenkim menjadi jaringan tulang.
Cara pertama adalah konversi langsung dari jaringan mesenkim menjadi jaringan
tulang. Proses pembentukan tulang semacam ini disebut osifikasi intra membran dan
khas bagi pembentukan tulang pipih yang menyusun tengkorak. Cara kedua, sel-sel
mesenkim berdiferensiasi terlebih dulu menjadi kartilago (jaringan rawan) kemudian
berubah menjadi jaringan tulang. Proses pembentukan tulang semacam ini disebut
osifikasi endokondral. Tulang yang dibentuk secara endokondral misalnya tulang
panjang yang terdapat pada alat gerak tubuh, ruas tulang belakang dan pelvis
(Setyawati, 2011).
Menurut Setyawati (2011), tulang dapat dibentuk dengan dua cara, yaitu
melalui mineralisasi langsung pada matriks yang disekresi oleh osteoblast (osifikasi
intra membranosa) atau melalui penimbunan matriks tulang pada matriks tulang

rawan sebelumnya (osifikasi endokondral). Baik osifikasi intra membranosa atau

osifikasi endokondral, jaringan tulang yang pertama kali dibentuk adalah jaringan
primer atau muda. Tulang primer adalah jaringan yang bersifat sementara dan tidak
lama kemudian diganti oleh jenis tulang berlamela yang tetap, disebut tulang
sekunder. Menurut Huffman et al., (2007) tulang esteoid diperkaya dalam
fosfoprotein, asam glikoprotein dan proteoglikan, beberapa yang mirip dengan BSP
atau fragmen nukleator dari kristal hidroksiapatit.
Pewarnaan alizarin red ini digunakan untuk mendeteksi proses klasifikasi
pada tulang embrio. Tulang yang diwarnai menggunakan alizarin red akan berwarna
merah tua apabila tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul
karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang (Jasin,
1989).
Teknik pewarnaan pada tulang dengan zat warna alizarin red. Bagian dalam
modifikasi akan berwarna merah. Bagian tersebut seperti: tulang dahi (frontal),
tulang rahang, radius ulna, tulang ujung jari, scapula, tulang rusuk, femur, tibia, serta
fibula (Sukra, 2000).

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum Alizarin Red adalah dapat mengerjakan prosedur

pewarnaan Alizarin dan menerangkan proses klasifikasi tulang pada fetus mencit
(Mus musculus).

II.

MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan pada acara praktikum ini adalah cawan petri, baki, 8
botol sampel, kertas label, tissue, spuit injeksi tanpa jarum, kamera dan pipet tetes.
Bahan yang digunakan pada acara praktikum ini adalah fetus mencit, larutan
alkohol 96%, akuades, KOH 1%, KOH 2%, larutan pewarna AR, NaCl fisiologis dan
larutan penjernih A, B, C.

B. Metode

Metode yang dilakukan dalam praktikum kali ini adalah:

1. Fetus diletakkan di Cawan Petri.
2. Bagian Amnion fetus dibuang.
3. Fetus mencit dibersihkan dengan cara dimasukkan ke dalam NaCl fisiologis
selama 10 menit.
4. Fetus mencit dimasukkan ke akuades (untuk membilas).
5. Fetus mencit dimasukkan ke dalam alkohol 96% direndam selama 12 jam.
6. Kemudian diganti dengan akuades (selama 10 menit).
7. Setelah itu diganti dengan KOH 1% (selama 3 jam).
8. Kemudian diganti lagi dengan Pewarna AR (selama 4 jam).
9. Setelah direndam di pewarna AR diganti lagi dengan KOH 2% (30 menit).
10. Terakhir dipindahkan ke dalam larutan penjernih A, B dan C masing-masing
selama 1 jam.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

(A)

(C)

(E)

(B)

(D)

(F)

(H)

(G)

(I)
Keterangan:

a. Foto fetus mencit sebelum diberi perlakuan

b. Foto fetus mencit di dalam larutan NaCl fisiologis
c. Foto fetus mencit setelah dimasukkan alkohol 96%
d. Foto fetus mencit setelah dimasukkan akuades
e. Foto fetus mencit setelah dimasukkan KOH 1%
f. Foto fetus mencit setelah dimasukkan Alizarin Red
g. Foto fetus mencit setelah dimasukkan larutan penjernih A
h. Foto fetus mencit setelah dimasukkan larutan penjernih B
i. Foto fetus mencit setelah dimasukkan larutan penjernih C
j. Skematis Gambar Tulang Mencit

Gambar 1. Skematis Tulang Mencit

Tabel 1. Data Pengamatan Tulang Yang Terklasifikasi
No.

Kelompok

Tulang Yang Terwarnai

Tulang yang terwarnai : Vertebrae, humerus dan ribs.

Tulang yang terlihat : radius, ulna, tulang tengkorak, tulang

ekor, femur, tibia dan servical vertebrae.
Tulang yang terlihat : Sternum, thoracic, vertebrata, tulang
ekor, lubar vertebrae, sacrum, incisors, mandible (dentary),

2
caudal vertebrae, metatarsals, femur, tibia, cervical vertebrae
(axis dan atlas), skull, radius, ulna, carpals dan phalangers.

Ribs, sternum, clavicle, scapula

Tulang yang terwarnai : atlas, axis, lavicle, scapula dan
humerus.
Tulang yang terwarnai : ribs, mandibulla, humerus, axis,

5
lumbar vertebrae, sacrum, scapula, atlas, radius dan ulna
Tulang yang terwarnai : lumbar vertebrae, sternum, skull,
mandibulla dan carpal. Tulang yang terlihat : radius, ulna,

6
metacarpal, phalanges, femur, patella, fibula, tibia, tarsals,
metatarsals dan caudal vertebrae.

Pembahasan

Praktikum Alizarin Red kali ini menggunakan larutan alkohol 96%, akuades,
KOH 1%, Alizarin Red, larutan penjernih A, larutan penjernih B dan larutan
penjernih C. Langkah awal metode pewarnaan Alizarin Red dengan cara merendam
fetus mencit ke dalam larutan alkohol 96% selama 12 jam. Pemberian alkohol ini
berfungsi sebagai fiksatif agar mematikan sel-sel fetus tanpa merusak struktur selnya.
Langkah selanjutnya adalah pemberian akuades selama 10 menit berfungsi untuk
menetralkan fetus dari pengaruh alkohol 96%. Selanjutnya, akuades diganti dengan
KOH 1% selama 3 jam, larutan KOH 1% berfungsi untuk membuat otot-otot pada
fetus menjadi transparan. Langkah selanjutnya pemberian Alizarin Red selama 3
jam, Alizarin disini sebagai pemberian warna pada tulang yang telah terkalsifikasi
dan terikat pada matriks tulang sehingga tulang terwarnai. Perlakuan yang dilakukan
tidak menggunakan KOH 2% dikarenakan fetus sudah tidak berbentuk,
dikhawatirkan fetus akan makin sulit untuk diidentifikasi. Selanjutnya diberi larutan
penjernih A, larutan penjernih B dan larutan penjernih C masing-masing 1 jam
bertujuan untuk menghilangkan kelebihan larutan Alizarin Red pada tulang hewan
uji. Hal ini sesuai dengan pendapat Partridge et al. (2009) menyatakan bahwa
Alizarin Red digunakan untuk mencari deposit kalsium.
Dari hasil perlakuan diketahui beberapa tulang yang terlihat, yaitu Sternum,

thoracic, vertebrata, tulang ekor, lubar vertebrae, sacrum, incisors, mandible

(dentary), caudal vertebrae, metatarsals, femur, tibia, cervical vertebrae (axis dan
atlas), skull, radius, ulna, carpals dan phalangers. Kelompok 2 tidak ada tulang yang
terwarnai. Hal ini dimungkinkan karena umur fetus mencit terlalu muda atau karena
perendaman didalam alizarin rednya kurang lama. Titik awal osifikasi disebut sebagai

pusat osifikasi primer yang dimulai bila kelompok sel-sel berdeferensiasi menjadi

osteoblas dan matriks tulang yang baru terbentuk diikuti kalsifikasi mengakibatkan
terkurungnnya beberapa osteoblas yang kemudian menjadi osteosit. Titik awal
osteofikasi ditandai dengan adanya suatu masa homogen yang kecil dan epsinifilik,
yang dikelilingi osteoblas-osteoblas karena serat kolagen tertutup oleh substansi
dasar sehingga kelihatan homogen. Warna tersebut terbentuk karena terikatnya
pewarna Alizarin Red pada kalsium yang ada pada tulang (Said, 2011).
Hasil praktikum kelompok 1 tulang yang terwarnai yaitu Vertebrae, humerus dan

ribs. Hasil praktikum kelompok 2 yaitu Sternum, thoracic, vertebrata, tulang ekor,
lubar vertebrae, sacrum, incisors, mandible (dentary), caudal vertebrae,
metatarsals, femur, tibia, cervical vertebrae (axis dan atlas), skull, radius, ulna,
carpals dan phalangers. Hasil praktikum kelompok 3 yaitu Ribs, sternum, clavicle,
scapula. Hasil praktikum kelompok 4 yaitu atlas, axis, lavicle, scapula dan humerus.
Hasil praktikum kelompok 5 yaitu : ribs, mandibulla, humerus, axis, lumbar vertebrae,

sacrum, scapula, atlas, radius dan ulna. Hasil praktikum kelompok 6 lumbar
vertebrae, sternum, skull, mandibulla dan carpal.
Hasil yang didapat tiap kelompok berbeda-beda mungkin dikarenakan faktor
goncangan mekanik yang terjadi saat membawa fetus dan tingkat ketelitian dalam
penambahahan larutan. Menurut Huffman et al. (2007), tulang merupakan jaringan vaskuler
unik yang mengalami mineralisasi sebagai bagian dari proses perkembangannya. Mineral
pada tulang memiliki peran penting terhadap fungsi tulang belakang, termasuk menyokong
struktural, penyimpanan reversibel kalsium dan fosfor, dan tempat menyimpan kandungan
logam dan karbon.

Tulang yang diwarnai dengan alizarin red akan berwarna merah tua apabila
tulang tersebut telah mengalami klasifikasi. Warna ini muncul karena zat warna yang
diberikam terikat oleh kalsium pada matriks tulang. Pembentukan system rangka
dimulai pada inkubasi hari ke 5 ditandai dengan kondensasi mesenkim prekartilago.

Kondrifikasi dimulai pada hari ke 8 sedangkan osifikasi dimulai pada hari ke 9

(Soeminto, 2000)
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi proses kalsifikasi pada fetus
mencit, yaitu:
1. Hormon paratiroid, kalsitonin, dan vitamin D yang bertanggung jawab terhadap
tingkat kadar kalsium darah yang normal, yang akan mempengaruhi proses
kalsifikasi. Kalsitonin adalah hormon yang berasal dari sel-sel parafolikuler dari
kelenjar tiroid. Hormon tersebut mempunyai aksi dalam menurunkan kadar
kalsium darah dan menghambat resorpsi tulang sehingga mempengaruhi proses
kalsifikasi.
2. Makanan juga berpengaruh dalam proses kalsifikasi. Hal ini khususnya berlaku
terhadap cukupnya persediaan dan tersedianya mineral-mineral seperti kalsium
dan fosfor, yang merupakan komponen-komponen anorganik utama dari tulang.
Kekurangan kalsium atau fosfor dalam makanan mengakibatkan pelanggaran dan
kerapuhan tulang.
3. Waktu yang diperlukan untuk mendapatkan mencit yang telah mengalami
penulangan yaitu pada umur 10-15 hari, mencit akan mengalami penulangan.
Bagian tulang yang terwarnai adalah tulang tengkorak, tulang panjang pada alat
gerak tubuh. Bagian tulang yang mengalami penulangan ditandai dengan adanya
warna merah atau ungu pada tulang tersebut (Togashi, 2007).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan

bahwa :
1. Pewarna alizarin red digunakan untuk mendeteksi proses klasifikasi pada tulang.
Prosesnya yaitu embrio mencit dibersihkan dari fetus, embrio direndam dalam
alcohol 96% selama 12 jam, direndam akuades selama 10 menit, direndam di
larutan KOH1% selama 3 jam, direndam larutan Alizarin Red 4 jam, setelah itu
direndam di larutan KOH 2% selama 30 menit, lalu direndam di larutan penjernih
A, B dan C, masing-masing selama 1 jam. Kemudian bagian-bagian tulang yang
terwarnai dapat diamati.
2. Proses kalsifikasi tulang adalah tahapan-tahapan pengerasan tulang melalui
pengendapan garam-garam mineral kalsium.

B. Saran

Saat perendaman menggunakan larutan-larutan untuk pewarnaan alizarin

praktikan diharapkan dapat lebih cermat karena butuh perhatian ekstra untuk
perendaman agar didapat hasil yang cermat pula, serta dalam perendaman diharapkan
praktikan dapat memperhatikan waktu perendaman dari setiap larutan agar spesimen
yang diujikan tidah hancur.

DAFTAR REFERENSI

Huffman, N, J.K Keightley, C. Chaoying, R. J Midura, D. Lovitch, P. A Veno, S. L

Dallas, J.P Gorski. 2007. Association of Specific Proteolytic Processing of
Bone Sialoprotein and Bone Acidic Glycoprotein-75 with mineralization
within Biomineralization Foci. The journal of biological chemistry. Vol.
282
Jasin, M. 1989. Sistematika Hewan (Invertebrata dan Vertebrata). Sinar Wijaya,
Surabaya.
Partridge, G. J., G.I.Jenkins, Doup, R. G., DeLestang, S., B. M. Ginbey and D.
French. 2009. Factors affecting mark quality of alizarincomplexone-stained
otoliths in juvenile black breamAcanthopagrus butcheri and a prescription for
dosage. Journal of Fish Biology (2009) 75 , 1518 1523.
Setyawati, I. 2011. Penampilan Reproduksi dan Perkembangan Skeleton Fetus
Mencit. Jurnal Veteriner. 12(3): 192-199.
Soeminto. 2000. Embriologi Vertebrata. Fakultas Biologi UNSOED, Purwokerto.
Sukra, Y. 2000. Wawasan Ilmu Pengetahuan Embrio Benih Masa Depan.
Departemen Pendidikan Nasional, Jakarta.
Sudaryani, T dan H. Santoso. 1995.
Jakarta.

Pembibitan Ayam Ras. Penebar Swadaya,

Togashi, A. Y., Cirano, F. R., Marques, M. M., Pustiglioni, F. E., Antonio, L. 2007.
Characterization of Bone Cells Obtained from the Calvaria of Neonatal Rats
(osteo-1) after Serial Subculture. Journal Appl Oral Sci. 2007;15(5):442-7.
Villee, C. A., Walker, W. F. and Barnes, R. D. 1988. Zoologi Umum. Erlangga,
Jakarta