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Fluorometra o fluoroscopia
Dr.
Alberto
Martn Lasa
Definicin:
Fluorometra
o
fluoroscopia:
Utilizacin del fenmeno de fluorescencia (ver fluorescencia) para el estudio de ciertos
tejidos, rganos o funciones; por ejemplo, examen de los tegumentos que se han hecho
fluorescentes por la accin de los rayos ultravioletas. Por este procedimiento se descubren
las alteraciones epidrmicas antes de que sean aparentes con la luz blanca. Despus de
la inyeccin de fluorescena en una vena o en una arteria, permite el estudio de la red
vascular con luz ultravioleta.
2. Espectrometra de fluorescencia
La espectrometra de fluorescencia (tambin llamada fluorometra o espectrofluorimetra)
es un tipo de espectroscopia electromagntica que analiza la fluorescencia de una
muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los
electrones de las molculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una
menor energa, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una tcnica
complementaria
es
la espectrometra
de
absorcin.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluormetros o fluormetros.
TEORA
DE
LA
FLUORESCENCIA
Las molculas tienen diferentes estados llamados niveles de energa. La espectrometra de
fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrnicos. En general,
las especies objeto de examen tendrn un estado electrnico basal (un estado de baja
energa) de inters, y un estado electrnico excitado de mayor energa. Dentro de cada
uno de estos estados electrnicos hay diferentes estados vibracionales.
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorcin
de un fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos estados
vibracionales del estado electrnico excitado. Las colisiones con otras molculas causan
que la molcula excitada pierda energa vibracional hasta que alcanza el estado
vibracional
ms
bajo
del
estado
electrnico
excitado.
La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibracin del estado
electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas pueden caer a
cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los fotones emitidos
tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias. As pues, mediante el anlisis de
las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometra de fluorescencia, junto con sus
intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de
vibracin.
En un experimento tpico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida
por una muestra, manteniendo la luz de excitacin a una longitud de onda constante. A
esto se le llama espectro de emisin. Un espectro de excitacin se mide mediante el
registro de una serie de espectros de emisin utilizando luz de diferentes longitudes de
onda.
INSTRUMENTOS
En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos:
* Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
* Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de difraccin para aislar la luz
incidente
y
la
luz
fluorescente.
Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de
excitacin pasa a travs de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una
A
diferencia
de
la espectrometra
visible
o
ultravioleta 'estndar',
los espectros independientes del dispositivo no son fciles de alcanzar. Son varios los
factores que influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para
lograr el espectro 'verdadero', es decir, independiente de la mquina.
Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relacin al instrumento o a la
muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto
de partida, la intensidad de las fuentes de luz y las caractersticas de la longitud de onda
varan con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lmpara tiene
una intensidad constante en todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un
haz separador despus del filtro o monocromador de excitacin, para dirigir una porcin
de
luz
a
un
detector
de
referencia.
Adems, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisin de los monocromadores y
los filtros, ya que tambin puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisin del
monocromador vara dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razn por la que
debe colocarse un detector de referencia despus del filtro o monocromador de
excitacin. El porcentaje de fluorescencia recogido por el detector tambin depende del
sistema. Por otra parte, la eficiencia cuntica del detector, es decir, el porcentaje de
fotones detectados, vara entre los diferentes detectores, segn la longitud de onda y el
tiempo.
La correccin de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estndar" del
espectro es un proceso tedioso, que slo se aplica en la prctica cuando es estrictamente
necesario. Es el caso de las mediciones de rendimiento cuntico o cuando se encuentra
la longitud de onda con la mayor intensidad de emisin, por ejemplo.
Como se mencion anteriormente, tambin surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto,
algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta tambin. En primer lugar, la
fotodescomposicin puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La
dispersin de la luz tambin debe tenerse en cuenta. Los tipos ms importantes de
dispersin en este contexto son la dispersin de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por
dispersin de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que
en la dispersin Raman la luz cambia a longitudes de onda ms largas. La dispersin de
Raman es el resultado de un estado electrnico virtual inducido por la luz de excitacin. A
partir de este estado virtual, las molculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del
estado basal. En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de
nmero de onda constante en relacin con la excitacin; por ejemplo, en el agua el pico
aparece a un nmero de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitacin.
Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorcin,
que ocurre porque otra molcula o parte de una macromolcula absorbe las longitudes
de onda en la que el fluorforo emite radiacin. Si este es el caso, una parte o la totalidad
de los fotones emitidos por el fluorforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto del
filtro interno se produce a causa de las altas concentraciones de absorcin de las
molculas, incluyendo el fluorforo. El resultado es que la intensidad de excitacin de la
luz no es constante a lo largo de la solucin. Como resultado, slo un pequeo porcentaje
de la luz de excitacin llega a los fluorforos que son visibles para el sistema de deteccin.
Los efectos del filtro interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por
tanto, deben ser considerados al analizar el espectro de emisin de luz fluorescente.
APLICACIONES
La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisis bioqumicos, mdicos, qumicos y
de investigacin de compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para diferenciar los
tumores
malignos
de
piel
de
los
benignos.
La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientar los fotones.
3. Fluorescencia
La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias
que son capaces de absorber energa en forma de radiaciones electromagnticas y
luego emitir parte de esa energa en forma de radiacin electromagntica de longitud de
onda diferente.1
La energa total emitida en forma de luz es siempre menor a la energa total absorbida y la
diferencia entre ambas es disipada en forma de calor. En la mayora de los casos la
longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor energa- que la absorbida, sin
embargo, si la radiacin de excitacin es intensa, es posible para un electrn absorber
dos fotones; en esta absorcin bifotnica, la longitud de onda emitida es ms corta que la
absorbida, sin embargo en ambos casos la energa total emitida es menor que la energa
total absorbida.
En general las sustancias fluorescentes absorben energa en forma de radiacin
electromagntica de onda corta (p ej radiacin gamma, rayos x, UV, luz azul, etc), y
luego la emiten nuevamente a una longitud de onda ms larga, por ejemplo dentro
del espectro visible; los ejemplos ms notables de fluorescencia ocurren cuando la luz
absorbida se encuentra dentro del rango ultravioleta del espectro -invisible al ojo humanoy la luz emitida se encuentra en la regin visible.
El mecanismo de fluorescencia tpico implica tres pasos secuenciales, llamados
respectivamente absorcin (1), disipacin no radiativa (2) y emisin (3).
El ciclo completo es muy breve, transcurre en tiempos del orden de los nanosegundos, por
lo que puede considerarse prcticamente instantneo. Es este tiempo tan corto lo que
diferencia a la fluorescencia de otro conocido fenmeno luminoso, la fosforescencia. El
mecanismo de fluorescencia tambin se encuentra muy relacionado con el proceso
de quimioluminiscencia.
Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser excitadas por diferentes tipos de
radiacin se denominan fluorforos. Es posible obtener una una amplia variedad de
colores por fluorescencia, dependiendo de la longitud de onda que emita el compuesto
fluorescente.
El fenmeno de fluorescencia posee numerosas aplicaciones prcticas, entre las que se
encuentran por ejemplo anlisis enmineraloga, gemologa, sensores qumicos
(espectroscopia fluorescente), pigmentos y tintas, detectores biolgicos y lmparas
fluorescentes.
4. Historia
Una temprana observacin de la fluorescencia fue descrita en 1560 por Bernardino de
Sahagn y en 1565 por Nicols Monardes en la infusin conocida como lignum
nephriticum (del latn, "madera renal"). Fue derivado de la madera de dos especies de
Los estados vibracionales altos pueden disipar energa en forma de calor, aumentando las
vibraciones de las molculas vecinas.
Una molcula en estado de excitacin electrnica, S1, puede adquirir un estado de menor
energa por diferentes mecanismos. Puede por ejemplo sufrir un 'decaimiento no radiativo'
en el cual la mayor parte de la energa de excitacin es disipada como calor
(vibraciones) hacia el disolvente. Las molculas orgnicas excitadas tambin pueden
relajarse mediante conversin a un estado triplete entregando energa a otro orbital
molecular para obtener al final dos orbitales con energas intermedias, finalmente alguno
de estos orbitales se relaja emitiendo un cuanto de luz, por fosforescencia o mediante un
segundo paso no radiativo de decaimiento.
Rendimiento cuntico
El rendimiento cuntico de un proceso de fluorescencia es una manera de interpretar
la eficacia del mecanismo.
Se define como la proporcin entre el nmero de fotones emitidos y el de fotones
absorbidos.
donde
es la tasa de emisin espontnea de radiacin y
es la suma de todas las
tasas de decaimiento.
Otras tasas de decaimiento del estado de excitacin se deben a mecanismos diferentes a
la emisin de fotones y con frecuencia se llaman, por lo tanto, tasas no-radiativas.
Entre estas ltimas podemos incluir: desactivacin por colisin dinmica, interaccin de
campo cercano dipolo-dipolo (o transferencia de energa de resonancia), conversin
internay paso de intersistema. Por lo tanto, si la tasa de decaimiento de cualquier va
cambia, esto afecta tanto al tiempo de vida del estado excitado, como al rendimiento
cuntico de la fluorescencia.
El rendimiento cuntico de fluorescencia se mide comparndolo con un patrn; la sal
sulfato de quinina disuelta en cido sulfrico es un patrn comn para la medicin de
fluorescencia.
Tiempo de vida
El tiempo de vida de la fluorescencia depende bsicamente del tiempo promedio que
permanece la molcula en su estado de excitacin antes de emitir un fotn.
La fluorescencia tpicamente sigue una cintica de primer orden:
donde
,
es la concentracin inicial y es la tasa de decaimiento o el inverso del tiempo de
vida de la fluorescencia.
Este es un ejemplo de decaimiento exponencial. Varios procesos radiativos y no radiativos
pueden despoblar el estado excitado. En ese caso, la tasa de decaimiento total es la
suma de todas las tasas:
donde
es la tasa de decaimiento global,
es la tasa de decaimiento radiativo
y
la tasa de decaimiento no radiativo.
La ecuacin es muy similar a una reaccin qumica de primer orden en la cual la tasa
constante de primer orden es la suma de todas las tasas (un modelo cintico paralelo). Si
la tasa de emisin espontnea, o cualquiera de las otras tasas, son rpidas el tiempo de
vida es corto.
Para compuestos fluorescentes que emitan fotones con energas desde el UV hasta el
infrarrojo cercano, los tiempos tpicos de decaimiento del estado excitado se encuentran
entre 0.5 a 20 nanosegundos. El tiempo de vida de un fluorforo es un parmetro
importante para las aplicaciones prcticas de la fluorescencia tales como la transferencia
de energa de resonancia.
7. Reglas
Existen algunas reglas para predecir los comportamientos de la fluorescencia. La Regla de
Kasha, por ejemplo, dicta que el rendimiento cuntico de luminiscencia es independiente
de la longitud de onda de la radiacin.
Esto no es siempre cierto y se contradice a menudo en muchas molculas simples. Una
declaracin un tanto ms confiable, aunque an con excepciones, podra ser que el
espectro de fluorescencia muestra muy poca dependencia con la longitud de onda de la
radiacin.
El diagrama de Jablonski describe la mayor parte del mecanismo de relajacin para las
molculas en estado excitado.
8. Aplicaciones
Existen muchos compuestos naturales y sintticos que exhiben fluorescencia, y tienen un
sinnmero de aplicaciones prcticas, desde la simple decoracin fluorescente hasta
aplicaciones en qumica analtica tales como FPIA. En la naturaleza hay mltiples ejemplos
de organismos que utilizan la fluorescencia y en especial la quimioluminiscencia para
atraer alimento o pareja, o bien para espantar a los depredadores.
Iluminacin
Pintura y plstico fluorescentes iluminados por luz Ultravioleta. (artista: Beo Beyond)
El comn tubo fluorescente depende de la fluorescencia. Dentro del tubo de vidrio hay un
vaco parcial y una pequea cantidad demercurio. Una descarga elctrica en el tubo
causa que los tomos de mercurio emitan luz. La luz emitida se encuentra en el
rangoultravioleta (UV), y es por lo tanto invisible para nuestros ojos; pero el tubo se
encuentra revestido con una capa de un material fluorescente llamado fsforo, el cual
absorbe la luz ultravioleta y la reemite en el espectro visible. La iluminacin fluorescente es
energticamente mucho ms eficiente que la tecnologa incandescente, pero
el espectro producido puede hacer que ciertos colores no parezcan naturales, esto es as
porque el espectro de emisin no es continuo, sino que se encuentra formado por un
limitado nmero de longitudes de onda (lneas de emisin).
A mediados de los aos 1990, ya era tecnologa comn el LED de luz blanca, este tipo de
LED funciona a travs de un proceso similar. Tpicamente, en estos dispositivos el
semiconductor emisor produce luz en la parte azul del espectro, la cual choca con un
compuestofluorescente depositado en el chip; y este fluorescente emite en la regin
verde y roja del espectro. La combinacin de la luz azul que pasa a travs
del fluorescente y la luz emitida por el mismo produce una luz casi blanca.
9. La Lmpara fluorescente compacta (CFL) funciona de la misma forma que cualquier tubo
fluorescente tpica y con ventajas. Es utilizada para reemplazar lmparas incandescentes
en muchas aplicaciones. Producen un cuarto del calor por lumen emitido que los
bombillos incandescentes y duran hasta cinco veces ms. Estas lmparas contienen
mercurio y deben ser manejadas y dispuestas con cuidado. Las desventajas de que estas