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1.

Fluorometra o fluoroscopia
Dr.

Alberto

Martn Lasa

Definicin:
Fluorometra
o
fluoroscopia:
Utilizacin del fenmeno de fluorescencia (ver fluorescencia) para el estudio de ciertos
tejidos, rganos o funciones; por ejemplo, examen de los tegumentos que se han hecho
fluorescentes por la accin de los rayos ultravioletas. Por este procedimiento se descubren
las alteraciones epidrmicas antes de que sean aparentes con la luz blanca. Despus de
la inyeccin de fluorescena en una vena o en una arteria, permite el estudio de la red
vascular con luz ultravioleta.

2. Espectrometra de fluorescencia
La espectrometra de fluorescencia (tambin llamada fluorometra o espectrofluorimetra)
es un tipo de espectroscopia electromagntica que analiza la fluorescencia de una
muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los
electrones de las molculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una
menor energa, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una tcnica
complementaria
es
la espectrometra
de
absorcin.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluormetros o fluormetros.
TEORA
DE
LA
FLUORESCENCIA
Las molculas tienen diferentes estados llamados niveles de energa. La espectrometra de
fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrnicos. En general,
las especies objeto de examen tendrn un estado electrnico basal (un estado de baja
energa) de inters, y un estado electrnico excitado de mayor energa. Dentro de cada
uno de estos estados electrnicos hay diferentes estados vibracionales.
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorcin
de un fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos estados
vibracionales del estado electrnico excitado. Las colisiones con otras molculas causan
que la molcula excitada pierda energa vibracional hasta que alcanza el estado
vibracional
ms
bajo
del
estado
electrnico
excitado.
La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibracin del estado
electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas pueden caer a
cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los fotones emitidos
tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias. As pues, mediante el anlisis de
las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometra de fluorescencia, junto con sus
intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de
vibracin.
En un experimento tpico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida
por una muestra, manteniendo la luz de excitacin a una longitud de onda constante. A
esto se le llama espectro de emisin. Un espectro de excitacin se mide mediante el
registro de una serie de espectros de emisin utilizando luz de diferentes longitudes de
onda.
INSTRUMENTOS
En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos:
* Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
* Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de difraccin para aislar la luz
incidente
y
la
luz
fluorescente.
Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de
excitacin pasa a travs de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una

parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las molculas de la


muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las
direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a travs de un segundo filtro o
monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90 con
respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o
transmitida
llegue
al
detector.
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitacin, incluyendo el
lser, fotodiodos y lmparas; arcos de xenn y lmparas de vapor de mercurio. Un lser
slo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por
lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitacin o el filtro.
La desventaja de este mtodo es que la longitud de onda de un lser no se puede
cambiar mucho. Una lmpara de vapor de mercurio es una lmpara lineal, lo que
significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de
xenn tiene un espectro de emisin continuo con intensidad casi constante en el rango
de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima de
200
nm.
En los fluormetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite
luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo ms comn de monocromador
utiliza un retculo de difraccin; es decir, la luz colimada entra en una rejilla y sale con un
ngulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El monocromador puede
entonces seleccionar qu longitudes de onda transmite. Para permitir mediciones de
anisotropa se aaden dos filtros de polarizacin: uno despus del monocromador de
excitacin o filtro, y otro antes del monocromador de emisin o filtro.
Como se mencion antes, la fluorescencia se mide ms a menudo en un ngulo de 90 en
relacin a la luz de excitacin. Esta geometra se utiliza en lugar de colocar el sensor en la
lnea de la luz de excitacin en un ngulo de 180 a fin de evitar la interferencia de la luz
de excitacin transmitida. El monocromador no es perfecto y transmitir la luz con otras
longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un monocromador ideal slo transmite
luz en el rango especificado y tiene una transmisin independiente de la longitud de
onda. Al medir en un ngulo de 90, slo la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se
traduce en una mejor relacin seal-ruido, y reduce el lmite de deteccin a un factor de
aproximadamente 10000, si se compara con la geometra de 180. Por otra parte, la
fluorescencia tambin puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se
utiliza
a
menudo
para
las
muestras
turbias.
El detector puede ser de un solo canal o de mltiples canales. El detector de un nico
canal slo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento,
mientras que el de mltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de
onda simultneamente, con lo que el monocromador de emisin o filtro es innecesario.
Los
diferentes
tipos
de
detectores
tienen
sus
ventajas
y
desventajas.
El fluormetro ms verstil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de excitacin
continua, puede registrar tanto un espectro de excitacin como un espectro de
fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de
excitacin se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta
absorcin, y el monocromador de emisin escanea el espectro. Para medir los espectros
de excitacin, la longitud de onda que pasa a travs del filtro o monocromador de
emisin se mantiene constante y el monocromador de excitacin va escaneando. El
espectro de excitacin generalmente es idntico al espectro de absorcin, ya que la
intensidad
de
la
fluorescencia
es
proporcional
a
la
absorcin.
ANLISIS DE LOS DATOS
A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a
la
concentracin
del
fluorforo.

A
diferencia
de
la espectrometra
visible
o
ultravioleta 'estndar',
los espectros independientes del dispositivo no son fciles de alcanzar. Son varios los
factores que influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para
lograr el espectro 'verdadero', es decir, independiente de la mquina.
Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relacin al instrumento o a la
muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto
de partida, la intensidad de las fuentes de luz y las caractersticas de la longitud de onda
varan con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lmpara tiene
una intensidad constante en todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un
haz separador despus del filtro o monocromador de excitacin, para dirigir una porcin
de
luz
a
un
detector
de
referencia.
Adems, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisin de los monocromadores y
los filtros, ya que tambin puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisin del
monocromador vara dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razn por la que
debe colocarse un detector de referencia despus del filtro o monocromador de
excitacin. El porcentaje de fluorescencia recogido por el detector tambin depende del
sistema. Por otra parte, la eficiencia cuntica del detector, es decir, el porcentaje de
fotones detectados, vara entre los diferentes detectores, segn la longitud de onda y el
tiempo.
La correccin de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estndar" del
espectro es un proceso tedioso, que slo se aplica en la prctica cuando es estrictamente
necesario. Es el caso de las mediciones de rendimiento cuntico o cuando se encuentra
la longitud de onda con la mayor intensidad de emisin, por ejemplo.
Como se mencion anteriormente, tambin surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto,
algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta tambin. En primer lugar, la
fotodescomposicin puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La
dispersin de la luz tambin debe tenerse en cuenta. Los tipos ms importantes de
dispersin en este contexto son la dispersin de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por
dispersin de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que
en la dispersin Raman la luz cambia a longitudes de onda ms largas. La dispersin de
Raman es el resultado de un estado electrnico virtual inducido por la luz de excitacin. A
partir de este estado virtual, las molculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del
estado basal. En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de
nmero de onda constante en relacin con la excitacin; por ejemplo, en el agua el pico
aparece a un nmero de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitacin.
Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorcin,
que ocurre porque otra molcula o parte de una macromolcula absorbe las longitudes
de onda en la que el fluorforo emite radiacin. Si este es el caso, una parte o la totalidad
de los fotones emitidos por el fluorforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto del
filtro interno se produce a causa de las altas concentraciones de absorcin de las
molculas, incluyendo el fluorforo. El resultado es que la intensidad de excitacin de la
luz no es constante a lo largo de la solucin. Como resultado, slo un pequeo porcentaje
de la luz de excitacin llega a los fluorforos que son visibles para el sistema de deteccin.
Los efectos del filtro interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por
tanto, deben ser considerados al analizar el espectro de emisin de luz fluorescente.
APLICACIONES
La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisis bioqumicos, mdicos, qumicos y
de investigacin de compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para diferenciar los
tumores
malignos
de
piel
de
los
benignos.
La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientar los fotones.

Fluorescencia del triptfano


Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser usada para estimar la
naturaleza del microambiente del triptfano (un aminocido). Cuando se realizan
experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras molculas anfiflicas, el
microambiente del triptfano puede cambiar. Por ejemplo, si una protena que contiene
un nico triptfano en su ncleo "hidrofbico" se desnaturaliza con el aumento de
temperatura, aparece un cambio de color en el espectro de emisin del rojo. Esto se
debe a la exposicin del triptfano a un medio ambiente acuoso en contraposicin a una
protena hidrofbica interior. En contraste, la adicin de un tensioactivo a una protena
que contiene triptfano, que se encuentra expuesto al solvente acuoso, causar un
cambio al espectro azul de emisin si el triptfano est incrustado en la vescula o micela
de surfactante. Las protenas que carecen de triptfano puede ser enlazadas a un
fluorforo.
A 295 nm, el espectro de emisin del triptfano es dominante sobre la fluorescencia ms
dbil de la tirosina y fenilalanina.

3. Fluorescencia
La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias
que son capaces de absorber energa en forma de radiaciones electromagnticas y
luego emitir parte de esa energa en forma de radiacin electromagntica de longitud de
onda diferente.1
La energa total emitida en forma de luz es siempre menor a la energa total absorbida y la
diferencia entre ambas es disipada en forma de calor. En la mayora de los casos la
longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor energa- que la absorbida, sin
embargo, si la radiacin de excitacin es intensa, es posible para un electrn absorber
dos fotones; en esta absorcin bifotnica, la longitud de onda emitida es ms corta que la
absorbida, sin embargo en ambos casos la energa total emitida es menor que la energa
total absorbida.
En general las sustancias fluorescentes absorben energa en forma de radiacin
electromagntica de onda corta (p ej radiacin gamma, rayos x, UV, luz azul, etc), y
luego la emiten nuevamente a una longitud de onda ms larga, por ejemplo dentro
del espectro visible; los ejemplos ms notables de fluorescencia ocurren cuando la luz
absorbida se encuentra dentro del rango ultravioleta del espectro -invisible al ojo humanoy la luz emitida se encuentra en la regin visible.
El mecanismo de fluorescencia tpico implica tres pasos secuenciales, llamados
respectivamente absorcin (1), disipacin no radiativa (2) y emisin (3).
El ciclo completo es muy breve, transcurre en tiempos del orden de los nanosegundos, por
lo que puede considerarse prcticamente instantneo. Es este tiempo tan corto lo que
diferencia a la fluorescencia de otro conocido fenmeno luminoso, la fosforescencia. El
mecanismo de fluorescencia tambin se encuentra muy relacionado con el proceso
de quimioluminiscencia.
Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser excitadas por diferentes tipos de
radiacin se denominan fluorforos. Es posible obtener una una amplia variedad de
colores por fluorescencia, dependiendo de la longitud de onda que emita el compuesto
fluorescente.
El fenmeno de fluorescencia posee numerosas aplicaciones prcticas, entre las que se
encuentran por ejemplo anlisis enmineraloga, gemologa, sensores qumicos
(espectroscopia fluorescente), pigmentos y tintas, detectores biolgicos y lmparas
fluorescentes.
4. Historia
Una temprana observacin de la fluorescencia fue descrita en 1560 por Bernardino de
Sahagn y en 1565 por Nicols Monardes en la infusin conocida como lignum
nephriticum (del latn, "madera renal"). Fue derivado de la madera de dos especies de

rboles, Pterocarpus indicus y Eysenhardtia polystachya.2 3 4 5 El compuesto qumico


responsable de esta fluorescencia es la matlalina, que es el producto de oxidacin de uno
de los flavonoides que se encuentran en esa madera.2
En 1819, Edward D. Clarke6 y en 1822 Ren Just Hay7 describieron fluorescencia en las
fluoritas, en 1833 sir David Brewster describi el fenmeno en la clorofila 8 y en 1845 sir John
Herschel hizo lo mismo con la quinina.9
En un artculo de 1852 sobre la "refrangibilidad " (cambio de longitud de onda) de la
luz, George Gabriel Stokes describi la facultad del fluorspar y del cristal de uranio para
cambiar la luz invisible ms all del extremo violeta del espectro visible en luz azul. Llam a
este fenmeno fluorescencia (fluorescence): Casi me inclino a acuar una palabra, y
llamo la apariencia fluorescencia, de fluor-spar [es decir, la fluorita], como el trmino
anlogo opalescencia se deriva del nombre de un mineral.10 El nombre fue derivado del
mineral fluorita (difluoruro de calcio), que en algunas muestras tiene rastros
de europio bivalente, que sirve como activador fluorescente emitiendo luz azul. En un
experimento clave utiliz un prisma para aislar la radiacin ultravioleta de la luz solar y
observ la luz azul emitida por una solucin de etanol de quinina expuesto por ella.11
5. Mecanismo
Consideraciones previas
Para entender el mecanismo subyacente al proceso de fluorescencia es necesario
primero repasar el concepto de orbital atmico y de orbital molecular.
Los electrones en un tomo se organizan ocupando diferentes orbitales, esto es, regiones
en el espacio en torno al ncleo donde existe una cierta probabilidad de encontrarlos.
Existen orbitales de baja energa y orbitales de alta energa. Los electrones prefieren
ocupar primero, y siempre que sea posible, los orbitales de menor energa que se
encuentren desocupados. Sin embargo esto no significa que no puedan ocupar
transitoriamente orbitales de mayor energa.
Transiciones electrnicas
Para mover un electrn de un orbital de baja energa a un orbital de mayor energa es
necesario cubrir esa diferencia de energa con un aporte externo (es casi como llevar un
cuerpo de un lugar bajo a un lugar con cierta altura, con la diferencia de que a escala
atmica la diferencia de energa entre orbitales se encuentra cuantizada). Para cada tipo
de tomo la diferencia de energa entre dos orbitales dados es constante y los electrones
se pueden mover entre esos orbitales nicamente ganando o perdiendo esa cantidad fija
de energa. Este proceso se conoce como transicin electrnica. En el caso de tratarse de
tomos nicos esto provoca que cada tipo de tomo posea lneas de absorcin y lneas
de emisin muy caractersticas, es decir que sea capaz de absorber o emitir energa en
forma de cuantos de luz a determinadas longitudes de onda correspondientes a cada
uno de los procesos de salto de los electrones entre orbitales de diferente energa. En el
caso de tomos nicos las lneas espectrales son muy precisas y definidas porque las
transiciones entre diferentes orbitales poseen diferencias de energa muy marcadas y
precisas.
Espectros moleculares
Cuando los tomos se combinan para formar molculas, sus orbitales atmicos
desaparecen, combinndose para formar orbitales moleculares. Los electrones ahora
pueden ocupar regiones de probabilidad en torno a varios ncleos. La combinacin de
orbitales atmicos se produce en forma lineal, esto significa por ejemplo que si se
combinan dos tomos, cada uno de los cuales posee cuatro orbitales atmicos, la
molcula poseer como resultado ocho orbitales moleculares. Estos orbitales moleculares
poseern energas intermedias a las de los orbitales atmicos que se combinaron para
formarlos. La situacin se va tornando ms compleja cuantos ms tomos posea una
molcula. Como consecuencia molculas relativamente simples poseen un nmero muy
elevado de orbitales moleculares entre los cuales se pueden producir transiciones
electrnicas. Es por eso que las molculas poseen bandas de emisin y absorcin y no
lneas. Estas bandas se encuentran formadas por la superposicin de una gran cantidad
de lneas correspondientes a cada una de las transiciones posibles entre diferentes
orbitales dentro de la molcula. Y para complicar an ms la situacin, hay que
considerar que las molculas no son rgidas, sino que se trata de estructuras dinmicas que

estn sometidas a deformaciones estructurales, debidas por ejemplo a vibraciones


trmicas o a rotaciones de determinadas partes de la molcula. Cuando se altera la
forma de una molcula, tambin se altera la forma de los orbitales moleculares que la
forman y como consecuencia se altera la energa de los mismos. Las deformaciones
estructurales provocan ligeras diferencias entre las energas de diferentes orbitales que
hacen que se modifiquen las energas de transicin electrnica entre ellas. Finalmente
cabe considerar que en una molcula en estado basal, muchos de los electrones se
encuentran en estado singlete, es decir, se encuentran complementados por otro electrn
dentro del mismo orbital con un espn antiparalelo. Una transicin electrnica tpica,
implica que un electrn en estado singlete, salta a un orbital de mayor energa
adquiriendo un estado doblete donde su espn no se encuentra complementado por otro
antiparalelo. Pero pueden ocurrir otro tipo de transiciones, en la cual dos electrones en
estado doblete, pueden ser promovidos a dos orbitales degenerados (de igual energa)
adquiriendo un estado triplete en el cual sus espines son paralelos. Las transiciones de
espn, tambin pueden absorber y emitir energa en forma de luz.
Mecanismo bsico y diagrama de Jablonski
Un diagrama de Jablonski es bsicamente una representacin simplificada de los niveles
electrnicos (orbitales) de una molcula y de las posibles transiciones electrnicas que se
pueden dar entre estos niveles. En un diagrama de Jablonski se agrupan verticalmente los
estados electrnicos de acuerdo a su energa y horizontalmente de acuerdo a
sumultiplicidad de espn. Las transiciones radiativas se representan con lneas rectas y las
no radiativas con lneas onduladas. A continuacin se presenta un diagrama de Jablonski
modificado para representar una molcula hipottica que posee un nivel electrnico
basal (S0) dos niveles electrnicos de alta energa (S1 y S2) y un nivel de dos orbitales
degenerados con espines paralelos (triplete T1) cada uno de estos niveles con varios
subniveles vibracionales debidos a las deformaciones trmicas de la molcula (Vb). En el
eje vertical se ubica la energa relativa de cada nivel electrnico, y en el eje horizontal
hemos considerado al tiempo y no a la multiplicidad de espn. Las flechas verticales
representan absorciones y emisiones de energa en forma de fotones y las flechas
diagonales implican disipacin de energa por medios no radiativos (en forma de calor).

La situacin aqu representada comienza por la promocin de un electrn que se


encontraba en estado basal S0a un nivel electrnico de alta energa S2 en un estado
vibracional alto (la lnea Vb ms alta de todas). Esta promocin se produce cuando la
molcula absorbe energa, en general en forma de un cuanto de luz (fotn). Este electrn
en un estado electrnico excitado vibracionalmente alto puede ceder parte de su
energa en forma de vibraciones que se transmiten al resto de la molcula (flecha amarilla
diagonal rotulada como NR). Esta energa aumenta la amplitud de las vibraciones de la
molcula, energa que es finalmente disipada cuando la molcula choca con otras
molculas cedindola en forma de calor.
El electrn puede ir cayendo como en una escalera entre diferentes estados vibracionales
cediendo en cada escaln parte de su energa en forma de calor, que aumenta las
vibraciones de la molcula. Tambin puede hacerlo cediendo toda su energa de golpe,

cayendo a un nivel inferior y emitiendo gran parte de la energa en forma de un nico


cuanto de luz (situacin representada por la primera flecha verde vertical).
Aunque en teora sera posible que el electrn cayera desde el estado vibracional alto al
estado basal S0, en la prctica esto no ocurre, pues la molcula rpidamente transfiere
parte de la energa absorbida a otros orbitales por medio de un mecanismo
de reconversin energtica interna, un proceso que ocurre usualmente en tiempos muy
cortos del orden de 10-15 segundos, por lo que resulta virtualmente imposible para el
electrn ceder nuevamente el total de la energa que recibi y como consecuencia la luz
emitida es siempre de menor energa y mayor longitud de onda que la recibida. A medida
que el tiempo se prolonga, mayor es la cantidad de energa que se pierde por procesos
no radiativos y mayor es la longitud de onda de la luz emitida. Eventualmente todos los
electrones en estados excitados caen hasta el estado basal ya sea emitiendo luz (FE) o
perdiendo energa por procesos no radiativos (NR) estos procesos se producen en la
fluorescencia en tiempos de hasta 10-9 segundos.
En algunas molculas sin embargo, existen orbitales degenerados con energas muy
similares a las de los niveles excitados. En estas molculas puede ocurrir que un electrn
con alta energa ceda parte de su energa a un electrn en estado basal para formar dos
electrones desapareados en dos orbitales degenerados (estado triplete) de energa
intermedia. El estado triplete es metaestable y puede existir por tiempos enormemente
largos si se lo compara con las transiciones entre estados dobletes; en el primer caso los
tiempos de decaimiento usualmente van desde las centsimas de segundo hasta las
horas. Cuando los electrones en estado triplete aparean sus espines ceden esa energa de
apareamiento en forma de luz, produciendo el fenmeno de fosforescencia.
La relajacin de un estado S1 tambin puede ocurrir a travs de una interaccin con una
segunda molcula mediante lo que se conoce como desactivacin (quenching
fluorescente) de la fluorescencia, en este caso la molcula excitada cede su energa a
otra y esta ltima la disipa en forma de calor. El oxgeno molecular (O2), por ejemplo, es
muy eficiente desactivando la fluorescencia de otras molculas debido a su inusual
estado triplete fundamental.
Finalmente algunas molculas que se excitan a travs de la absorcin de luz o por medio
de un proceso diferente (P. ej. a causa de una reaccin qumica) pueden transferir esta
energa a una segunda molcula sensibilizada por un mecanismo de paso intersistema
entre molculas. A travs de este mecanismo la segunda molcula es conducida a un
estado de excitacin electrnica y es finalmente esta ltima la que va a emitir
fluorescencia. En estos casos las diferencias de energa entre la radiacin excitadora y la
emitida son excepcionalmente grandes. Este mecanismo se utiliza por ejemplo en
los contadores de centelleo lquidos para producir luz visible a partir de radiaciones
nucleares de alta energa.
6. Ecuaciones
Fotoqumica
En resumen la fluorescencia ocurre cuando una molcula, tomo o nanoestructura vuelve
a su estado fundamental despus de haber sido excitada electrnicamente.
Excitacin:
Fluorescencia (emisin) :
Aqu,
es un trmino genrico para la energa del fotn con h = constante de Planck y
donde = frecuencia de la luz. (Las frecuencias especficas de la luz excitadora y emitida
son dependientes en cada sistema en particular.)
El estado S0 se llama estado fundamental de la molcula fluorescente y S1 es su primer
estado electrnico excitado.
Adems de estos estados electrnicos, que corresponden a la ubicacin de los electrones
de enlace de la molcula en diferentes orbitales moleculares, existen diferentes estados
vibracionales para estos orbitales moleculares, estos estados vibracionales corresponden a
las oscilaciones que experimentan los tomos que forman la molcula en torno a los
enlaces.

Los estados vibracionales altos pueden disipar energa en forma de calor, aumentando las
vibraciones de las molculas vecinas.
Una molcula en estado de excitacin electrnica, S1, puede adquirir un estado de menor
energa por diferentes mecanismos. Puede por ejemplo sufrir un 'decaimiento no radiativo'
en el cual la mayor parte de la energa de excitacin es disipada como calor
(vibraciones) hacia el disolvente. Las molculas orgnicas excitadas tambin pueden
relajarse mediante conversin a un estado triplete entregando energa a otro orbital
molecular para obtener al final dos orbitales con energas intermedias, finalmente alguno
de estos orbitales se relaja emitiendo un cuanto de luz, por fosforescencia o mediante un
segundo paso no radiativo de decaimiento.
Rendimiento cuntico
El rendimiento cuntico de un proceso de fluorescencia es una manera de interpretar
la eficacia del mecanismo.
Se define como la proporcin entre el nmero de fotones emitidos y el de fotones
absorbidos.

El mximo rendimiento cuntico de fluorescencia es por lo tanto 1 (100%); esto significa


que cada fotn absorbido resulta en un fotn emitido. Sin embargo compuestos con
rendimientos cunticos de 0,10 se consideran an bastante fluorescentes.
Otra forma de definir el rendimiento cuntico de un mecanismo de fluorescencia es
mediante las tasas a las cuales decae el estado de excitacin:

donde
es la tasa de emisin espontnea de radiacin y
es la suma de todas las
tasas de decaimiento.
Otras tasas de decaimiento del estado de excitacin se deben a mecanismos diferentes a
la emisin de fotones y con frecuencia se llaman, por lo tanto, tasas no-radiativas.
Entre estas ltimas podemos incluir: desactivacin por colisin dinmica, interaccin de
campo cercano dipolo-dipolo (o transferencia de energa de resonancia), conversin
internay paso de intersistema. Por lo tanto, si la tasa de decaimiento de cualquier va
cambia, esto afecta tanto al tiempo de vida del estado excitado, como al rendimiento
cuntico de la fluorescencia.
El rendimiento cuntico de fluorescencia se mide comparndolo con un patrn; la sal
sulfato de quinina disuelta en cido sulfrico es un patrn comn para la medicin de
fluorescencia.
Tiempo de vida
El tiempo de vida de la fluorescencia depende bsicamente del tiempo promedio que
permanece la molcula en su estado de excitacin antes de emitir un fotn.
La fluorescencia tpicamente sigue una cintica de primer orden:
donde

es la concentracin de molculas en estado de excitacin en el tiempo

,
es la concentracin inicial y es la tasa de decaimiento o el inverso del tiempo de
vida de la fluorescencia.
Este es un ejemplo de decaimiento exponencial. Varios procesos radiativos y no radiativos
pueden despoblar el estado excitado. En ese caso, la tasa de decaimiento total es la
suma de todas las tasas:
donde
es la tasa de decaimiento global,
es la tasa de decaimiento radiativo
y
la tasa de decaimiento no radiativo.
La ecuacin es muy similar a una reaccin qumica de primer orden en la cual la tasa
constante de primer orden es la suma de todas las tasas (un modelo cintico paralelo). Si

la tasa de emisin espontnea, o cualquiera de las otras tasas, son rpidas el tiempo de
vida es corto.
Para compuestos fluorescentes que emitan fotones con energas desde el UV hasta el
infrarrojo cercano, los tiempos tpicos de decaimiento del estado excitado se encuentran
entre 0.5 a 20 nanosegundos. El tiempo de vida de un fluorforo es un parmetro
importante para las aplicaciones prcticas de la fluorescencia tales como la transferencia
de energa de resonancia.
7. Reglas
Existen algunas reglas para predecir los comportamientos de la fluorescencia. La Regla de
Kasha, por ejemplo, dicta que el rendimiento cuntico de luminiscencia es independiente
de la longitud de onda de la radiacin.
Esto no es siempre cierto y se contradice a menudo en muchas molculas simples. Una
declaracin un tanto ms confiable, aunque an con excepciones, podra ser que el
espectro de fluorescencia muestra muy poca dependencia con la longitud de onda de la
radiacin.
El diagrama de Jablonski describe la mayor parte del mecanismo de relajacin para las
molculas en estado excitado.
8. Aplicaciones
Existen muchos compuestos naturales y sintticos que exhiben fluorescencia, y tienen un
sinnmero de aplicaciones prcticas, desde la simple decoracin fluorescente hasta
aplicaciones en qumica analtica tales como FPIA. En la naturaleza hay mltiples ejemplos
de organismos que utilizan la fluorescencia y en especial la quimioluminiscencia para
atraer alimento o pareja, o bien para espantar a los depredadores.
Iluminacin

Pintura y plstico fluorescentes iluminados por luz Ultravioleta. (artista: Beo Beyond)
El comn tubo fluorescente depende de la fluorescencia. Dentro del tubo de vidrio hay un
vaco parcial y una pequea cantidad demercurio. Una descarga elctrica en el tubo
causa que los tomos de mercurio emitan luz. La luz emitida se encuentra en el
rangoultravioleta (UV), y es por lo tanto invisible para nuestros ojos; pero el tubo se
encuentra revestido con una capa de un material fluorescente llamado fsforo, el cual
absorbe la luz ultravioleta y la reemite en el espectro visible. La iluminacin fluorescente es
energticamente mucho ms eficiente que la tecnologa incandescente, pero
el espectro producido puede hacer que ciertos colores no parezcan naturales, esto es as
porque el espectro de emisin no es continuo, sino que se encuentra formado por un
limitado nmero de longitudes de onda (lneas de emisin).
A mediados de los aos 1990, ya era tecnologa comn el LED de luz blanca, este tipo de
LED funciona a travs de un proceso similar. Tpicamente, en estos dispositivos el
semiconductor emisor produce luz en la parte azul del espectro, la cual choca con un
compuestofluorescente depositado en el chip; y este fluorescente emite en la regin
verde y roja del espectro. La combinacin de la luz azul que pasa a travs
del fluorescente y la luz emitida por el mismo produce una luz casi blanca.
9. La Lmpara fluorescente compacta (CFL) funciona de la misma forma que cualquier tubo
fluorescente tpica y con ventajas. Es utilizada para reemplazar lmparas incandescentes
en muchas aplicaciones. Producen un cuarto del calor por lumen emitido que los
bombillos incandescentes y duran hasta cinco veces ms. Estas lmparas contienen
mercurio y deben ser manejadas y dispuestas con cuidado. Las desventajas de que estas

lmparas tengan un balastro es que no encajan adecuadamente en todos los aparatos


de luz. Todas las lmparas fluorescentes tienen un retraso significativo al momento de ser
encendidas comparadas con las lmparas incandescentes, una desventaja en algunas
aplicaciones. Adicionalmente, la tecnologa que les permite ser usadas tambin reduce
significativamente su vida til y su fiabilidad en aplicaciones de luz crepuscular, por
ejemplo al utilizarlas con los famosos atenuadores o dimmers.
Qumica analtica
La fluorescencia puede ser detectada con un monocromador para encontrar emisiones
tpicas de compuestos presentes en una cromatografa lquida de alta eficacia. Adems,
permite visualizar las manchas producidas por una TLC si los compuestos o los reactivos de
reveladores son fluorescentes.
La fluorescencia es ms efectiva cuando hay una gran proporcin de tomos en los
niveles bajos de energa en una distribucin de Boltzmann. Existe entonces una mayor
probabilidad que los tomos con energa baja sean excitados y liberen a su vez fotones,
permitiendo as un anlisis ms eficiente.
Las huellas dactilares pueden visualizarse con compuestos fluorescentes como
la ninhidrina.
Vanse tambin: Fluormetro y Espectrofluorimetra.
Bioqumica y medicina
Las biomolculas pueden marcarse con un grupo qumico fluorescente (fluorocromo)
mediante una reaccin qumica simple, lo cual permite una deteccin sensible y
cuantitativa de la molcula. Algunos ejemplos:
La microscopa de fluorescencia de tejidos, clulas o estructuras subcelulares se consigue
marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que aqul encuentre su
antgeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios anticuerpos con
diferentes fluorocromos se puede lograr la visualizacin de mltiples objetivos dentro de
una misma imagen.
Secuenciacin automtica de ADN por el mtodo de terminacin de la cadena: cada
uno de los cuatro ddNTP se encuentra marcado con un fluorocromo especfico, de tal
forma que se generan cadenas de diferente longitud que al ser sometidas a una fuente
de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cada cadena debido a la
longitud de onda emitida caracterstica de cada fluorocromo.

Electroforesis en gel de agarosa teido con bromuro de etidio. El bromuro de etidio se


intercala en el ADN y fluoresce naranja cuando se expone a luz UV.
Deteccin de ADN: el compuesto bromuro de etidio, libre de cambiar su conformacin en
disolucin, tiene poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio se aumenta
enormemente cuando se une al ADN, de tal forma que este compuesto es muy til para
visualizar la localizacin de fragmentos de ADN en el mtodo de electroforesis en geles de
agarosa. El bromuro de etidio puede ser txico, por tanto una alternativa ms segura es
teir con SYBR Green.
Microarreglos
Inmunologa: los sitios de unin de un anticuerpo a un espcimen microscpico por
ejemplo, pueden ser vistos, e incluso cuantificados, empleando la fluorescencia si se le ha
unido previamente un grupo qumico fluorescente al anticuerpo especfico (IFI).
La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformacin del
ADN, as mismo como de protenas, con tcnicas como la transferencia de energa de

resonancia, la cual mide distancias a nivel de angstroms. Lo anterior es especialmente


importante en complejos de biomolculas mltiples.
Es utilizada en (Citometra) de flujo para identificar diferentes receptores en las clulas
estudiadas, marcando estas clulas con anticuerpos especficos conjugados a un
fluorescente.
La Protena Verde Fluorescente (GFP), de la medusa Aequorea victoria, se ha convertido
en una herramienta de investigacin muy importante. GFP y otras protenas relacionadas
son usadas como reporteros de un sin nmero de eventos biolgicos incluyendo aquellos
de localizacin subcelular. Los niveles de expresin gnica son medidos en algunas
ocasiones uniendo el gen de produccin de GFP con el gen de inters.
Tambin, diversas molculas biolgicas tienen fluorescencia intrnseca y por tanto, pueden
ser empleadas sin necesidad de unirlas a una etiqueta qumica. Algunas veces, esta
fluorescencia intrnseca cambia cuando la molcula se encuentra en un ambiente
especfico, de tal forma que la distribucin o el ligamiento de la molcula pueden ser
medidos. Labilirrubina, por ejemplo, es altamente fluorescente cuando se une a la
albmina srica en un sitio especfico. La protoporfirina zinc, la cual se encuentra en las
clulas sanguneas cuando la produccin del grupo hemo es inhibido por la existencia de
plomo o la ausencia de hierro en la sangre, tiene una fuerte fluorescencia y puede ser, por
tanto, empleada para detectar estos problemas.
El nmero de aplicaciones de la fluorescencia ha ido creciendo en el campo de la
biomedicina, la biologa y en otras ciencias relacionadas. Los mtodos de anlisis en estos
campos
tambin
han
ido
aumentando: FPIA, FLIM,
FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FRIPS, SHRIMP o TIRF. Muchas de estas
tcnicas se basan en los microscopios de fluorescencia. Los microscopios utilizan fuentes
de luz de alta intensidad, usualmente lmparas de mercurio o xenn, LEDs, o lseres, para
generar fluorescencia en las muestras bajo observacin. Posteriormente, los filtros pticos
separan la luz excitada de la fluorescencia emitida, para permitir que sea detectada a
simple vista, empleando una cmara o utilizando algn otro detector de luz como
espectrgrafos, etc. Muchas investigaciones se estn llevando a cabo para mejorar ya
sea el desempeo de estos microscopios, las sondas fluorescentes usadas, y las
aplicaciones de las mismas. De inters particular son los microscopios confocales, los
cuales utilizan un poro para lograr secciones pticas, proporcionando una vista
cuantitativa y en 3D de la muestra.
Gemologa, mineraloga, geologa y ciencias forenses
Las gemas, los minerales, las fibras y muchos otros materiales que pueden ser encontrados
en medicina forense, pueden tener una fluorescencia distintiva o pueden fluorecer
diferente bajo luz ultravioleta de onda corta, de onda larga, o rayos X: Muchos tipos
de calcita y mbar presentarn fluorescencia bajo luz ultravioleta de onda corta. Los
rubes, las esmeraldas y el diamante Hope exhiben fluorescencia roja bajo luz UV de onda
corta; los diamantes tambin emiten luz bajo rayos X.
El petrleo emite fluorescencia en un rango de colores, desde el marrn mate para
aceites pesados y alquitrn hasta el amarillento y blanco azulado para los aceites muy
livianos y condensados. Este fenmeno es usado en perforaciones hechas para la
exploracin de petrleo permitiendo identificar pequeas cantidades de crudo en las
perforaciones y en los poros de las muestras.
Lquidos orgnicos
Los lquidos orgnicos, como las mezclas de antraceno en benceno o tolueno, emiten
fluorescencia bajo la accin de radiacin UV o rayos gamma. Los tiempos de
decaimiento de esta fluorescencia se encuentran en el orden de los nanosegundos ya
que la duracin de la luz depende del tiempo de vida de los estados excitados del
material fluorescente, en este caso antraceno.