TUGAS BIOTEKNOLOGI FARMASI

VEKTOR KLONING

Disusun Oleh:

Nisa Masyitah 260110120036

Fifi Fitriawati

260110120060

UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2014

VEKTOR KLONING
1. Vektor Bakteriofage
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya
yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning
pada sel inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai
vector kloning, diantaranya adalah bakteriofag dan M13.
a. Bakteriofag
Bakteriofag atau fag merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E.
coli. Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya
sebagai vector kloning semenjak masa-masa awal perkembangan rekayasa genetika.
DNA yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai ganda
dengan panjang 48,5 kb. Namun masing-masing ujung fosfatnya barupa untai tunggal
sepanjang 12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA
untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkulet, tempat
bergabungnya kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos.
Diantara kedua masam vektor tersebut, vektor substitusi lebih banyak
digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb.
Salah satu contohnya adalah WES, yang mempunyai mutasi pada tiga gen esensial,
yaitu W, E, dan S. vektor ini hanya dapat digunakan pada sel inang yang dapat
menekan mutasi tersebut. Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi.
Jika suatu enzim restriksi memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka
segmen DNA di antara kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya
digantikan oleh fragmen DNA asing. Jika pembuatan segmen DNA tidak diikuti
oleh subastitusi fragmen DNA asing maka akan terjadi religasi vektor DNA yang
kehilangan segmen pada daerah nonesensial. Vektor religasi semacam ini tidak akan
mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi
otomatis yang akan membedakan antara sel inang dengan vektorrekombinan dan sel
inang dengan vektor religasi.
Bakteriofag mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase
lisogenik. Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah trasnsformasi untuk DNA fag)

dimulai dengan masuknya DNA yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan
mengalami replikasi secara indenpenden atau tidak bergantung kepada kromosom sel
inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA sirkuler, masingmasing DNA ini akan melakukan transkripsi dan translasim membentuk protein
kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas dalam kapsid sehingga
menghasilkan partikel baru yang akan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel
inang lainnya. Sementara itu, pada fase lisogenik DNA akan terintegrasi kedalam
kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang.
Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang.
Didalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak
berupa daerah bening diantara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh karena itu,
seleksi vector rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak tersebut.
b. Bakteriofag M13
Ada jenis bakteri lain yang dapat menginfeksi bakteri E.coli. berbeda dengan
yang mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini mempunyai struktur
berupa filament. Contoh yang paling penting adalah M13, yang mempunyai genom
berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408 basa. Infeksinya pada sel inang
berlangsung melaui pili, suatu penonjolan pada permukaan sitoplasma. Ketika berada
didalam sel inang genom M13 berubah menjadi untai ganda sirkuler yang dengan
cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100 salinan. Salinan-salinan ini
membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke permukaan sel
inang.
Dengan cara seperti ini DNA M13 akan terselubungi oleh membran dan keluar
dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa menyebabkan lisis. Oleh karena
fag M13 terselubungi denngan cara pembentukan kuncup pada membrane sel inang,
maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang dapat disisipkan kepadanya. Inilah
salah satu keuntungan penggunaan M13 sebagai vektor kloning bila dibandingkan
dengan plasmid dan . Keuntungan lainnya adalah bahwa M13 dapat digunakan untuk
sekuensing (penentuan urutan basa) DNA mutagenesis tapak terarah (site directed
mutagenesis) karena untai tunggal DNA M13 dapat dijadikan cetakan (template)
didalam kedua proses tersebut. Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit
sekali daerah pada DNA-nya yang dpat disisipi oleh DNA asing. Disamping itu

tempat pengenalan restriksinyapun sangat sedikit. Namun sejumlah derivat M13 telah
dikonstruksi untuk mengatasi masalah tersebut.
Seluruh untai basa DNA telah diketahui. Secara alamiah terdapat lebih dari
satu tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan.
Oleh karena itu, DNA tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor
kloning. Akan tetapi saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA yang
memenuhi syarat sebagai vektorkloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal
dari DNA , yaitu vektor insersional dan vektor substitusi. Vektor insersional adalah
vektor yang dnegan mudah dapat disisipioleh fragmen DNA asing. Sedangkan vektor
substitusi adalah vektor yang untuk membawa fragmen DNA asing sebagian atau
seluruh urutan basanya yang terdapat didaerah nonesensial dan menggantinya dengan
urutan basa fragmen DNA asing tersebut.

2. Vektor Kosmid
Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggunakan kos dari DNA
lamdha dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32
hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag dan plasmid.

Cosmid merupakan vektor hibrida yang merupakan kombinasi sifat-sifat yang

menguntungkan antara plasmid dan bagian dari faga.

Relatif kecil namun mampu membawa fragmen DNA berukuran besar ( 50 kb).
Lambda bakteriofag penting dalam biologi molekuler karena digunakan dalam

membangun vektor untuk kloning gen. Plasmid melakukan ini juga, tapi bakteriofag memiliki
keuntungan lebih plasmid. Plasmid adalah lingkaran, indpendently mereplikasi, doublestranded DNA, paling sering ditemukan pada bakteri. Mereka meniru cepat dan mudah
dimanipulasi di laboratorium. Plasmid biasanya 2-10000 pasangan basa dalam ukuran
(Corbley, 1999). Sementara ukuran kecil ini memungkinkan plasmid dua atribut tersebut di
atas, sedap berarti bahwa plasmid terbatas dalam fragmen DNA mereka dapat mengkloning.
Mereka biasanya terbatas pada fragmen sekitar 5 ribu pasangan basa (Raja, 2002). Sementara
plasmid adalah kendaraan vektor besar bagi banyak usaha molekul, jika fragmen akan di
kloning lebih besar dari ruang penyisipan tersedia plasmid, vektor plasmid mungkin tidak
akan mentransfer fragmen DNA berhasil.

Lambda Bacteriaphage mengandung DNA beruntai ganda dan termasuk ujung

kohesif, penting dalam pembangunan kosmid

Lambda bakteriofag berfungsi sebagai alat molekuler dalam beberapa cara. Hal ini
dapat digunakan bersama dengan plasmid ketika kedua plasmid dan fag dipotong oleh enzim
restriksi. Segmen potongan DNA fag dimasukkan ke dalam plasmid strandad ganda yang
bereplikasi di E.Coli. Titik-titik di mana segmen lambda bakteriofag dipotong disebut cos
(kohesif) situs. Vektor yang dihasilkan disebut kosmid a. Ini adalah vektor hibrida, bagian
fag, bakteri bagian, yang dapat digunakan untuk mengkloning gen yang lebih besar atau
fragmen DNA. Lebih DNA dapat dikloning dalam kosmid daripada di plasmid karena situs
kohesif kosmid memungkinkan sistem kemasan lambda untuk inset lebih DNA ke kepala
lambda. Kapasitas pemuatan kosmid biasanya 40-45.000 pasangan basa.

Situs kohesif mendapatkan nama mereka dari kecenderungan untuk mengikat ujung
(pasangan basa) dengan eachother. Situs cos adalah satu-satunya bagian dari lambda yang
termasuk dalam plasmid untuk vektor kosmid. Tidak ada gen virus termasuk dalam vektor
ketika plasmid diperkenalkan ke E coli, sehingga membangun bereplikasi sebagai plasmid.
DNA diamplifikasi dapat diisolasi dari sel yang terinfeksi. Vektor kosmid tidak hanya
mentransfer potongan yang lebih besar dari DNA sel E. Coli, tetapi juga menginfeksi sel-sel
ini lebih efisien daripada plasmid biasa (Sofer, 1999). Kedua kosmid dan plasmid
tramsformations terdeteksi dengan memilih koloni antibiotik resistensi yang menunjukkan
DNA disisipkan pada situs resistensi antibiotik.

Prosedur dasar produksi kosmid meliputi:

Memasukkan DNA 33-47 kbases panjang ke situs fragmen cos menggunakan tertentu
restriksi endonuklease

Sealing dengan ligase

Kemasan DNA menjadi partikel dengan kemasan invitro

Menginfeksi sel, yang memungkinkan kosmid untuk meniru

Mengisolasi DNA kloning dari kosmid

3. BACTERIAL ARTIFIAL CHROMOSOME (BAC)

Kromosom buatan bakteri juga dikenal sebagai BAC (Bacterial Artifial Chromosome)
adalah vektor yang digunakan untuk mengkloning sepotong DNA target dan ditanam di
kandungan bakteri. Vektor adalah pembawa yang juga terbuat dari DNA. Vektor
bertindak sebagai tuan rumah induk, yang banyak bertindak seperti panduan untuk
melaksanakan gen dari kloning. Untuk memperkuat gen, urutan DNA harus diekstrak
dari sumber yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi untuk membelah
vektor dan DNA target dan melampirkan ke dalam bakteri inang. Plasmid bakteri
biasanya memainkan peran penting dalam proses kloning karena mereka juga terbuat

dari DNA dan mereka dapat kompatibel dengan gen eksperimental. Vektor juga
mengandung asal replikasi di mana replikasi dimulai di lokasi vektor dan lanjutkan
dengan sampel terpasang.
Bakteri Buatan Kromosom (BAC) telah dikembangkan untuk menahan potongan jauh
lebih besar dari DNA dari plasmid bisa. Vektor BAC awalnya diciptakan dari bagian dari
plasmid yang tidak biasa hadir di beberapa bakteri yang disebut plasmid F '. F 'plasmid
memungkinkan bakteri untuk memiliki "seks" (semacam: F' membantu bakteri
memberikan genom bakteri lain
tapi ini hanya terjadi jarang
ketika bakteri berada di bawah
banyak stres). F 'telah dipelajari
secara ekstensif dan ditemukan
bahwa hal itu bisa menampung
sampai satu juta pasangan basa
DNA dari bakteri lain. Juga, F
'memiliki asal-usul replikasi dan
bakteri

memiliki

cara

untuk

mengontrol bagaimana F' disalin.

Pada

tahun

1992,

Hiroaki

Shizuya mengambil bagian F

'yang

penting,

membersihkan

diri, dan mengubahnya menjadi

vektor.

Gambar 1. Transforming a
bacterium using a BAC vector
bakteri

Vektor BAC mampu menyimpan hingga 350 kb DNA dan memiliki semua alat yang
vektor perlu untuk bekerja dengan baik, seperti asal-usul replikasi, gen resistensi
antibiotik, dan tempat-tempat yang nyaman di mana DNA clone dapat menyisipkan
dirinya sendiri. Dengan vektor ini adalah mungkin untuk mempelajari gen yang lebih
besar, beberapa gen sekaligus, atau seluruh genom virus. Dengan menggunakan vektor
yang dapat menyimpan potongan-potongan yang lebih besar dari DNA, jumlah klon

yang dibutuhkan untuk menutupi genom manusia enam kali secara teoritis bisa turun dari
1,8 miliar menjadi sekitar 50 juta.
Para peneliti telah dimodifikasi vektor BAC menjadi lebih nyaman untuk digunakan
dan lebih berguna dalam situasi khusus. Selain gen resistensi antibiotik yang
ditambahkan untuk mengidentifikasi bakteri transfected, gen ditambahkan yang
memungkinkan untuk mengubah substansi berwarna X-gal / IPTG biru. Zat ini
ditemukan dalam media ayam-sup seperti di mana bakteri berkolonisasi. Gen ini berubah
warna, disebut lacZ, yang terpecah ketika DNA clone dimasukkan ke vektor, sehingga
memungkinkan untuk mengatakan tidak hanya jika bakteri telah transfected (artinya
dimasukkan ke dalam sel), tetapi juga jika bakteri itu transfected dengan vektor yang
mengandung DNA insert atau hanya vektor saja (mengingat bahwa jika vektor telah
benar memasukkan DNA clone, itu akan kehilangan kemampuannya untuk mengubah Xgal / IPTG biru) (Gambar 2).

Gambar 2. Selecting for transformed bacteria

Beberapa modifikasi vektor BAC membuat mereka lebih khusus. Misalnya, ada
peneliti mempelajari virus herpes yang telah membuat vektor BAC yang dapat
dibudidayakan dalam sel bakteri dan kemudian ketika dimasukkan ke dalam sel mamalia,

langsung melepaskan DNA insert nya - dalam hal ini, seluruh genom virus herpes.
Dengan vektor seperti itu, lebih mudah untuk tumbuh jumlah yang cukup dari virus
herpes untuk penelitian, karena dapat hidup dalam budaya bakteri, bukan membutuhkan
kultur sel mamalia endemik mereka, yang sangat sulit untuk mempertahankan. Hal ini
pada gilirannya membuat lebih mudah untuk membuat modifikasi terhadap virus dan
mempelajari apa setiap gen yang dapat dilakukan.

BACs telah memungkinkan peneliti untuk melihat DNA mikroba tanpa harus benarbenar tumbuh organisme, karena DNA disimpan dalam kultur bakteri mudah tumbuh.
Vektor BAC juga berguna untuk mempelajari patogen, dan membantu dalam
pengembangan vaksin. Banyak patogen menjadi resisten terhadap semua antibiotik yang
tersedia untuk obat-obatan dan vektor BAC memainkan peran besar dalam menemukan
antibiotik baru dan kuat di lingkungan. Menemukan enzim yang dapat membantu
membersihkan tumpahan minyak atau membantu petani berkembang biak hewan ternak
sehat atau bahkan mengolah limbah radioaktif hanya beberapa contoh dari apa Bakteri
Buatan Kromosom dapat dilakukan. Vektor BAC adalah alat yang berguna dan metode
untuk bekerja dengan mereka dikembangkan cukup baik. Melanjutkan kemajuan
modifikasi seperti hewan percobaan hanya akan meningkatkan berbagai macam
kegunaan untuk BACs buruk besar.

Kegunaan untuk Model Penyakit

a. Penyakit Keturunan (Inherited disease)
BACs sedang sangat digunakan dalam pemodelan penyakit genetik untuk mempelajari
efek mereka dalam eksperimen pada tikus transgenik. Karena gen yang kompleks sering
memiliki banyak urutan peraturan hulu dari urutan pengkodean, termasuk banyak urutan
promotor yang akan mengontrol tingkat mengekspresikan gen ini, BAC telah ditemukan
sangat berguna dalam wilayah studi ini. Ketika diuji dengan tikus, BAC telah mampu
membantu dengan studi penyakit saraf, seperti penyakit Alzheimer atau sindrom Down.
BAC juga telah baru-baru ini digunakan untuk mempelajari onkogen tertentu, yang
berhubungan dengan berbagai jenis kanker yang berbeda. BAC ditransfer ke modelmodel penyakit genetik melalui penggunaan elektroporasi / transformasi, yang pada
dasarnya adalah transfeksi dengan virus yang kompatibel atau injeksi mikro. BAC juga
telah digunakan untuk mendeteksi gen atau urutan besar bunga, dan kemudian digunakan
untuk memetakan mereka ke kromosom manusia menggunakan BAC array. Karena
proses ini mampu menampung urutan jauh lebih besar tanpa risiko penataan ulang, itu
adalah metode yang disukai dari jenis studi genetik dan juga lebih stabil daripada jenis
lain dari vektor kloning.

b. Penyakit Infeksi
BAC juga dapat bertindak sebagai klon virus DNA besar serta virus RNA. Klon ini
dikenal sebagai "infeksi klon," sebagai transfeksi dari BAC membangun ke dalam sel
inang cukup untuk memulai infeksi virus di host. The menular properti yang BACs berisi
telah membantu dalam penelitian virus seperti virus herpes, poxvirus, dan coronavirus.
Menggunakan pendekatan genetik bermutasi dan mengubah BAC sementara ia berada di
bakteri, studi molekuler virus ini dapat dilakukan.

4. Yeast Artificial Chromosome (YAC)

Kromosom buatan ragi (YACs) direkayasa secara genetik berasal dari DNA ragi,
Saccharomyces cerevisiae, yang kemudian diikat menjadi bacterialplasmid a. Dengan
memasukkan fragmen besar DNA, dari 100-1000 kb, urutan yang dimasukkan dapat
dikloning dan secara fisik dipetakan menggunakan proses yang disebut kromosom
berjalan. Ini adalah proses yang awalnya digunakan untuk Human Genome Project,
namun karena masalah stabilitas, YACs ditinggalkan untuk penggunaan kromosom

buatan bakteri (BAC). Dimulai penelitian awal Rankin et al, Strul et al, dan Hsaio et al,
kromosom inheren rapuh distabilkan dengan menemukan urutan penting yang
bereplikasi secara otonom (ARS). YAC halus menggunakan data ini yang dijelaskan
pada tahun 1983 oleh Murray et al. Komponen utama dari YAC adalah ARS, sentromer,
dan telomere dari S. cerevisiae. Selain itu, gen penanda dipilih, seperti resistensi
antibiotik dan penanda terlihat, yang digunakan untuk memilih sel ragi berubah. Tanpa
urutan ini, kromosom tidak akan stabil selama replikasi ekstraseluler, dan tidak akan
dibedakan dari koloni tanpa vektor.
Ciri-ciri YACs
1.

DNA besar (> 100 kb) yang diikat antara dua lengan. Setiap lengan berakhir dengan
telomer ragi sehingga produk dapat distabilkan dalam sel ragi. Menariknya, YACs
lebih besar akan lebih stabil daripada yang lebih pendek, mendukung kloning DNA
yang membentang besar.

2.

Satu lengan berisi urutan otonom replikasi (ARS), sentromer (CEN) dan penanda
aselectable (trp1). Lengan lain berisi penanda dipilih kedua (ura3).

3.

Penyisipan DNA ke dalam situs kloning menginaktivasi mutan, dinyatakan dalam

DNA vektor dan koloni ragi merah muncul.

4.

Transforman diidentifikasi sebagaimana halnya bila koloni merah yang tumbuh di

sel ragi yang mutan untuk trp1 andura3. Hal ini untuk memastikan bahwa sel telah
menerima kromosom buatan dengan kedua telomere (karena komplementasi dari
dua mutan) dan kromosom buatan mengandung DNA sisipan (karena sel merah)

Penggunaan bioteknologi
Vektor ekspresi ragi, seperti YACs, YIps (ragi pengintegrasi plasmid), dan YEps
(plasmid ragi episomal), memiliki keuntungan lebih dibandingkan kromosom buatan
bakteri (BAC) Mereka dapat digunakan untuk mengekspresikan protein eukariotik yang
memerlukan modifikasi pasca-translasi. Dengan kemampuan menyisipkan fragmen besar
DNA, YACs dapat dimanfaatkan untuk mengkloning dan merakit seluruh genom dari
suatu organisme. Dengan insersi YAC ke dalam sel ragi, mereka dapat diperbanyak
sebagai kromosom buatan linear, kloning yang dimasukkan dalam daerah DNA pada
prosesnya. Dengan menyelesaikan ini, dua proses dapat digunakan untuk memperoleh
urutan genom, atau wilayah yang menarik:

1. Pemetaan Fisik
2. Kromosom Berjalan
Hal ini penting yaitu dalam hal memungkinkan pemetaan rinci daerah tertentu dari
genom. Kromosom manusia seluruhnya telah diperiksa, seperti kromosom X
menghasilkan lokasi penanda genetik untuk kelainan genetik banyak sifat.
Sementara kloning DNA ke dalam plasmid memungkinkan penyisipan fragmen
DNA dari sekitar 10.000 pasangan basa nukleotida, kloning DNA menjadi YAC
memungkinkan penyisipan fragmen DNA hingga 1.000.000 pasangan basa
nukleotida. Mengapa begitu penting untuk dapat mengkloning urutan besar seperti
itu? Untuk memetakan seluruh genom manusia (3x1.000.000.000 pasangan basa
nukleotida) akan memerlukan lebih dari 100.000 klon plasmid. Pada prinsipnya,
genom manusia dapat diwakili pada sekitar 10.000 klon YAC.
Teknik untuk DNA genomik kloning ke dalam ragi kromosom buatan (YAC)
memungkinkan untuk menganalisis urutan DNA yang sangat panjang seperti gen
manusia. Kloning DNA genom manusia ke YAC:
1.

Genomik DNA sebagian dicerna oleh enzim restriksi EcoRI. Fragmen DNA
sangat besar diperoleh.

2.

YAC dicerna oleh dua enzim restriksi EcoRI dan BamHI.

3.

Kedua elemen bergabung di situs EcoRI dan kovalen dihubungkan oleh DNA
ligase.

4.

YAC vektor rekombinan, ragi kromosom buatan dengan DNA genomik

dimasukkan, diproduksi. Vektor ini dapat digunakan untuk menginfeksi sel-sel
ragi dan menghasilkan jumlah salinan yang tidak terbatas.

5. Human Artificial Chromosome (HAC)

Kromosom buatan manusia (HAC) adalah sebuah mini-kromosom yang dikonstruksi
secara buatan pada sel manusia. Dengan menggunakan replikasi diri dan pemisahan
sistem sendiri, sebuah HAC dapat berperilaku sebagai kromosom stabil yang independen
dari kromosom sel inang.
Unsur-unsur penting untuk pemeliharaan kromosom dan transmisi tiga daerah
berikut:
1. "replikasi asal," dari mana duplikasi DNA dimulai,
2. "sentromer," yang berfungsi dalam segregasi kromosom yang tepat selama
pembelahan sel, dan
3. "telomer," yang melindungi ujung kromosom linear.

Sebuah studi daerah fungsional kromosom dilakukan pertama kali pada tunas ragi.
Sebuah ragi kromosom buatan ragi(YAC) dengan DNA yang dikonstruksi secara buatan
meliputi tiga wilayah yang disebutkan di atas dihasilkan dalam sel ragi. Pada prokariot,
kromosom buatan bakteri (BAC) dibangun atas dasar tersebut yang terjadi secara alami F
plasmid E. coli.
Dengan demikian, berdasarkan studi wilayah fungsional dari kromosom, "teknologi
kromosom buatan" yang direkonstruksi dalam mekanisme vivo pemeliharaan kromosom dan
transmisi ini didirikan. Karena fragmen DNA genom yang sangat besar dapat dikloning ke
BACs dan YACs, rute kromosom buatan telah digunakan secara luas sebagai vektor pada
teknologi dasar rekayasa genetika, seperti analisis genom dan produksi hewan transgenik,
sejak tahun 1990-an.
Di sisi lain, urutan DNA tertentu menentukan asal replikasi dan sentromer yang
belum terselesaikan pada eukariota lebih tinggi seperti mamalia. Kelompok riset Tsuneko
Okazaki, Ph.D., pendiri Chromo Penelitian, menyelidiki urutan ini dan berhasil membangun
HAC dengan tipe I alphoid DNA dari kromosom manusia 21. HAC, yang dipertahankan
sebagai kromosom ekstra, duplikasi serentak dengan sel inang kromosom pada setiap
pembelahan sel inang dan hal ini diteruskan secara stabil untuk sel anak.

Produksi HAC berdasarkan strategi pembangunan bottom-up

"Konstruksi bottom-up" strategi Chromo Penelitian melibatkan pembangunan de novo
HACs dengan memperkenalkan unsur-unsur DNA yang yang diperlukan untuk pemeliharaan
fungsi kromosom dalam sel. Di sisi lain, "konstruksi top-down" mengacu pada pemotongan
kromosom alami menjadi ukuran yang lebih kecil dengan menggunakan penargetan vektor
yang mengandung urutan telomerik.

Konstruksi vektor HAC dan berbagai aplikasi yang berguna

Dalam konstruksi bottom-up, multimerisasi DNA transfeksi terjadi selama
pembentukan HAC. Dengan demikian, HACs yang mengandung transgen yang dihasilkan de
novo dari prekursor BAC atau vektor YAC yang mengandung transgen dan serangkaian
alphoid pada vektor terpisah. Transgen di HAC dapat diekspresikan dalam sel mamalia
dengan cara promotor-dependant di bawah kendali stabil yang diinginkan.
Mikro-dimediasi yang mentransfer kromosom (MMCT) memungkinkan HACs akan
ditransfer menjadi berbagai jenis dan dipelihara secara stabil. Saat ini, telah dipelajari
pemeliharaan stabil HACs dalam baris sel berikut: tikus induk embrionik (ES) sel,
mesenchymal stem cell manusia, hamster ovarium Cina (CHO) sel, ayam B (DT40) sel, babi
ginjal (Pk15) sel , dan sel K562. HACs dapat ditransfer ke tikus sel induk embrionik
berdasarkan MMCT, sehingga tikus transgenik yang mengandung gen eksogen dapat dengan
mudah dibuat. Pembentukan metode yang dapat diandalkan untuk membuat hewan
transgenik akan memungkinkan pemanfaatan vektor HAC untuk terapi gen dan obat-obatan
regeneratif.

6. Ti Vector
Ti atau tumor penginduksi plasmid adalah plasmid melingkar yang sering, namun
tidak selalu, merupakan bagian dari peralatan genetik yang digunakan oleh Agrobacterium
tumefaciens dan Agrobacterium rhizogenes untuk mentransduksi materi genetik tanaman. Ti
plasmid hilang ketika Agrobacterium tumbuh di atas 28 C. Para Ti plasmid diklasifikasikan
ke dalam jenis yang berbeda berdasarkan jenis opine yang diproduksi oleh gen mereka. Para

opines berbeda ditentukan oleh pTi, yaitu octopine, nopaline, succinamopine dan
leucinopine.
Plasmid ini memiliki 196 gen yang mengkode 195 protein. Ada satu RNA struktural.
Panjang Plasmid tersebut adalah 206.479 nukleotida, terdiri dari GC 56% dan 81% bahan
pengkode gen. Tidak ada pseudogen.
Modifikasi plasmid ini sangat penting dalam penciptaan tanaman transgenik.

Karakteristik Ti

Agrobacterium disebut insinyur genetik alami.

Ukuran plasmid: ~ 250 kbp.

Berisi satu atau lebih daerah T-DNA.

Berisi daerah memungkinkan transfer conjugatif.

Berisi wilayah untuk sintesis opine dan katabolisme.

Bertanggung jawab untuk penyakit crown gall pada tanaman.

Vektor Tanaman Transformasi mengandung tiga elemen penting;

Plasmid Seleksi (menciptakan untai kustom melingkar DNA)

Plasmid Replikasi (sehingga dapat dengan mudah bekerja sama)

daerah T-DNA (memasukkan DNA ke dalam agrobacteria tersebut)

Ti plasmid berasal sistem vektor

Cara paling mudah untuk mengeksploitasi Ti plasmid mentransformasi genetik
tanaman hanya dengan memasukkan urutan DNA yang diinginkan ke wilayah T-DNA dan
kemudian menggunakan plasmid Ti dan A. tumefaciens untuk memberikan dan memasukkan
gen ini ke dalam genom sel tanaman yang rentan. Meskipun Ti plasmid adalah vektor alami
yang efektif mereka memiliki keterbatasan tertentu:

The phytohormone diproduksi oleh sel berubah tumbuh dalam budaya mencegah
regenerasi mereka menjadi tanaman dewasa. Oleh karena itu auksin dan sitokinin gen
harus dihapus dari Ti -plasmid berasal vektor kloning.

Gen sintesis opine harus dihilangkan karena dapat mengalihkan sumber daya tanaman
menjadi produksi opine di pabrik transgenik.

Secara umum, Ti-plasmid dalam ukuran besar (200-800 kb). Untuk kloning efektif,
segmen besar DNA yang tidak penting untuk kloning harus dikeluarkan.

Sebagai Ti plasmid tidak bereplikasi dalam E.coli, vektor berbasis Ti-plasmid

memerlukan ori yang dapat digunakan dalam E.coli

Untuk mengatasi kendala ini, vektor berbasis plasmid Ti yang digunakan harus memenuhi
komponen-komponen berikut:

Sebuah gen penanda dipilih yang dapat memberikan resistansi terhadap sel tumbuhan
bertransformasi. Sebagai gen penanda ini berasal dari prokariotik, perlu untuk
menempatkan mereka di bawah kontrol eukariotik (tanaman) dari sinyal regulasi pasca
transkripsi, termasuk promotor dan urutan adenylation poli termination-, untuk
memastikan bahwa itu efisien disajikan dalam sel tumbuhan berubah.

Perlu ORI yang memungkinkan plasmid untuk mereplikasi diri di E.coli.

Urutan Perbatasan kanan T-DNA yang diperlukan untuk integrasi T-DNA ke dalam DNA
sel tanaman.

Sebuah polylinker (MCS) untuk memfasilitasi penyisipan gen dikloning ke daerah antara
perbatasan urutan T-DNA.

Karena vektor kloning ini sangat terorganisir tidak memiliki gen vir, mereka tidak dapat
mempengaruhi transfer dan integrasi wilayah T-DNA ke dalam sel tanaman inang. Jadi dua
Ti-plasmid sistem vektor asal dikembangkan, yaitu:
1. Sistem vektor biner
2. Co-mengintegrasikan sistem vektor

Sumber
Ashfar Kurnia. 2011. DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN. Jakarta :
Departemen Farmasi, Universitas Indonesia, Depok, Indonesia
http://chromoresearch.co.jp/e/chromosome/
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/YAC.php
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/WilsonE/home.cosmi
ds.html
Kevinshe. 2004. The Big Bad Bac: Bacterial Artificial Chromosomes
Tersedia

di

http://

http://www.scq.ubc.ca/the-big-bad-bac-bacterial-artificial-

chromosomes/ [diakses pada 28 September 2014]

www.srmuniv.ac.in/.../ti_plasmid_derived_vector