NORMA VENEZOLANA DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE DE COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y DE Escherichia coli (2 Revision) COVENIN 1104:1996 COVENINPROLOGO La Comisign Verazolaaa de Normas Industiles (COVENIN), creada on 1958, ¢3 el organism ereargado de progremav y coordinar tas actividades de Nonmalizacis y Calidad enel pals. Pars lleva «cabo ol trabaja de eaboeacisn {d= normas, Jo COVENIN constinye Comnites y Comisiones Téenieas de Nocmalizacién, dende parcipsn organizaciones guhernameninles y. x6 _gubernanentals relacionadas eon un drea espotfica La presente norma sustinye totelmens a ia Norma Venezolana COVENIN 1104-84, fuselaborada bajo los linamantos del Comité Teenie de ‘Nommalizacién ©T10; Produstas Alimenticis, pore) Subcomité Técnica SC 3: Microbiologia de los alimentos, y aprobada por Ia COYENIN en su_ reunion No, 141 de fooka 14/0896, Fn Ia elaboracién de esta Norma participacon Ine sigintes emsidades Ministerio de Sand y Asistencia Social. Instituto Nacional de Higiere, Universidad Conical de Venezuela, Universidad Simés Bovivar, Pundacitn CIRPE, Aliven, S.A. FRICA, Laborstoriss Brolab SL., PARMALAT, EFE, S.A.y PROTINAL.NORMA VENEZOLANA ALIMENTOS. DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE DE COLIFORMES, COVENIN 1104:1996, DE COLIFORMES FECALES Y DE Escherichia coli 1 OBIETO. ‘Esta Norma Venezolana coniampla el métado de ensayo parm [a detrminacién del Nimere més Probable (NMP) de buacteres colformes, de colifonmes fecales y de Escheri= ‘his cali en alimancor, medisnte [a uiiaacidn de medie guides. 2 REFERENCIAS NORMATIVAS Las dguicrtes nceroas conticnen disposiciones que al ser ited en ext exto.constiuyen requisites de esta Nerma Venezolaas. Las elisiones indicadas estaban en vigencia cenel moment de este publicci6n. Como tods norma esté sujeta 2 rovisi6n, 6 resomienca a aquellos que realicen scuerdcs en base a ells, que anaicen iz. convenient de lunar Iae evisones re revientes de Ins nome eitadar seguhlamene. COVENIN 1126-89 Alimentos. denaleacicn y pre= ppuraciéa de mucsras para andisis microbioléeico. 3 PRINCIPIO DEL ENSAYO 1, método consiste ea inocular yolimenes conocidos de mucstas y/o sus luciones, en sada un de 3.6 5 ubos de ensayo con bos de fermentacion incorporados y un medion Se eulive apropie. Despuss del period de incubscién a la temperatura. cocrespondienie,s¢ toms roi de tas Wubos ‘que presenlan formeci6n de ga, ce confirman en un medio de cutive selective adecuad, y se obllene¢! Numero Mis, Probable de colformes,coliformes fecales y Escherichia ‘al uti2ardo las taba: ceficidas para tal fn 4 APARATOS 441 Equipo para Is proparcicn de mussras (vate norma ‘Verezolara 1125) 42 Tubos deensayo de 150 x 15 mn. 43 Tebos Dushamn o de fermentzcign de 10x 75 mm. 44 Tucubadora con egulador de ag 45 Baio de agua cow wpa, remmoregulacion y agiacion ceastante 46 Plcas de petri de 103 100 90 47 Equipo de uso coménen eb Laboratorio, 5 REACTIYOS 0 MATERIALES 5.1 Medios ds cutive (véas anex0 A) 51.1 Calo lau suf iiposs (CLS) 5.1.2 Caldo actos bibs verde bilan af 2% (LE.Y.B) 51.3 Caldo Mac Conkey. S14 Caldotipionado 1.5 Cobo duato de Kose: 15.3.6 Caldo pace corguecinieato de Coiformes (EC) 5.1.7 Agua peptonadn 5.18 Agar Levine ocosin seul de metlena (MB) 519 Agee Bde 5.1.10 Caldoslucoss amponato (RMVP) S411 Agirettate de Simmons 51.12 Agu notitiva 52. Renctivos viase areca) 521 Reactive de Kovses 52.2 Solin do alfa natol al 5% 15.2.3 Soluson de ideo do de possion| 40 & 5.24 Solvcoa indicadora de rojo de wet 6 PROCEDIMIENTO 6.1 La muestra se idenuica y se prepara segua 40 indica. Udon la nora COVENIN 1125,62 Determinactén del NMP de coliformes vara lo ealeacicn de cot pace, se puede utilizar une de Jos métodos siguientes: 62.1 Primer méode, Prucba presuntiva 6.2.11 Taceular volUmenes de J ml de Is muestra ylo sus ditsciones en enda una de 3 6 § tabos ton calda fa sul- {aio uipiosa, Incubar 235°C 1 °C ducante 24h finalizada e periodo de incubacién agiar suavemente aida tubo yobservar Ie produccisn de gus yo oferveser: tla, si amas son negativas, reincubar por 24h 2a diclonalos 6.24.2 Considerar como twboe positives os fa pructs pre- suncive, aquellos que presenien gas en el tubo Durbam des pus de 48h de incubacidn, 6.2.2 Prueha ooofirmateria 62.2.1 Agiar suavemente cada uno de los tubos positives dela procba anterior, y- uansfere un asa del cultive evi tando tomar la pelicula si esté presente, a tubos que con teagan caldo bis verde brillante (2 %), 0 32 repican por (tis a placas cue contengan azar Levine (EMB) 0 agar Endo. Iscabar dararte 24 4 - 48h 62.2.2 Ceasiderac como tabos positvos on Ia prucba con ‘nnnateria, aguelios donde se obscrv@ is produeci6n de gas. Cuatdo se ailcen medios selectvos sélides, considersr ‘como positivas aguellas donde se observe It furmackin de coloniss carscterisicas: Agar Levine (EMBY colonias ne- 41480 con cl cenro negro, colenias muceides do color ost nuragja, 0 ptrpura oscar con o si brillo verde metic, y oncl Ager Endo: coloniar rojas rodzadcs de halo rojos. 6.2.2.3 Anotarel nimere de tubes contirmedas como posi- tivos y evar el valor alas (ablas de NMP que coresponda (vdarearoro ) 6.2.2 Segundo método 63.2. Tnooular volimanes de tml de la rruesira yo dil clones en cada uno de 3 6 5 bos ven calde Me Coney. Ineuhar 235°C £ | °C durante 24 h = 2h, Finalizedo el otiodo Je incabacicn, agitar sazvemente cada tubo y of servar la progucci6n de gas y/o efervescencia: si ambes son negativas, reincuber por 24 h:t 2k edisiorales 63.22 La produccién de gas despuds de 24 ba48 h doi ‘cubacisn st considera suficieme evidencia de In presencia decoliformes, 6.2.2.3 Pasa determinar ol nfinero mis probable de col fonmes, cantar los cubes positives obtenides y lievar el veer las bas de Nimero Mis Protable que correspon da (¥ease anex0C). GA Determinacién del NMP de coliformes Teeales 6A. Primer método (6A.L-1 De cada tubo con gas en caldo lau sufato trio 2 (5.1.1) inooular con un aza do 3 mm. a tabos que con. leagan ealdo para enriquecimienio ce cobtormes (E.C) previamsrte temperedoe a5 °C (42°C. GA.L.2 Incubar en bao de agua a 45 °C 2 0,2 °C durante 2ehs2h {64.1.3 Anoia los tubos con gas Hever 10s resultados Ja Tabla de Nmero Més Probable que correspond (véase axcx00) 6.2 Segundo méode 6 A241 A porte de los tubes com gus en caldo Bac Conkey (622), inocutar con un asa de 3 mm ea cade uno 6 10s sigeiontes medivs, 18) Colin Taste bli verde brillans 2% (6.2.1), bb) Agun peplonada (51.7) 0 ealéotripronaio (51.4), 6422 Iucubae en bao de agua 44,0 °C 4 6,1 °C aa. rante 24248 b GA23 Observar si hay formacisn de gas en los mbes do caldo LBVB (5.1.2), Investigar la formacién de indol, fadiendo 02 ml 20,3 nl de reativo de Kovavs al eukive ‘agua peptoneds 0 calde triptonada después de 24h La aparielén de un color ojo oscuro en le superfiie indica gueel reseliadoes postive, GA24 Para determiner e} NMP de coliformes feeales omar lo tutos positivos obtsnidos en amas pruebas y evar ese valor ab abla le NMP (Véase anexo C) 65 Determinaciindel NMP de Escherichia coll [La dejeainacisn se cfsctéa en base los tbo positives btenidos.en los puntos 64.1.3 y64 24 65.1 Pars sister Escherichia coli a partic de los caldos EC o LBYB, seabrar por esas en placas con agarLevi- rhe (EMB) 0 con agar Sedo prevismente seeas (5.18 y 5.19) 65.11 Incubarles plecas a35°C_4 1°C durane 2th a ash.5.1.2 Scteacioner lz colonies coler violet o=cu0 6 n6- ‘qo, con o sin brill verde metdlico ex el agar Levine {EMB) 0 coloias cojas ene] agar Endo 9 tepiear en tubos que eontengun ager uuivo para la obtenelén de un cull voptro 65.1.3 Incubara 35°C £1 °C dante 74 6.42 65.14 Procecer a realizar un colorscign de Gram,» par tir dal calivo obwoido on 4.5.1.3, u fin de observar in ‘mertotogfa y pureza del esra0, GS.L5 Realizar les pruebas de prxduccion de indol, roo relia, Voges Proskauer y utllzccisn del citaig (VIC), 4 partir de fos cultives ptres y Ge morfolota caacterist- cen obtenidos en 6.5.1. para ello sera con un asa de Dlatino en los med Ue culuvo indieadcs en cada una de Jas pruebas quo se mencionan a cartinuacién 65.1.6 Preducci6n de [nel 65.1.6 Too-tlar 1s tos con cade triptona o agua pep- tomada 2 icubee a 35 °C PC durante 24 4.2 65.162. Afadiracada cultivo 0,2 10.033 ml del east ‘ode Movacs, agxar y observa el tipo de reaccion: ‘Resccién positiva: Aparicign de un colar rojo oscuro ea 1a supeficle del medio Resecién dudose: Aparicidn de un color anaranjedo, in- cand la posible presencia. de eveatel, Reaecién negativa: Aparicion de color amit, 54,7 Pructa de Voges Proskauer y rojo ce mete, 65.7.1 Inosuler los tubos con caldo glucoss tamponad, cincubara 35°C + 1"C durante 48h +2 8, GSA7.2 ‘Transtecir | mel coltive antetice un tubo fo, y afsdir 0,5 ml de soluciGn de alfa ratel 5% y 02 ml de solucioa det hidroxico de porasie 40 % y mezckr, Aejarls en reposo duraste 2h adh y obserearin ecerien Reaceién pasitiva: Apariciéa de un color rosa¢o 0 rojo carmest Reaccién negative; marrén Apuiei6e de color amatiio 65:17.3 Reincubar el cutive cbienido en 6.5.1.7 235°C £1°C duane 48h 2h adicionales, Atadir 5 gotas de solucion rojo de metilo,agitary observa: la eaccidn, Reaosién positiva: Apsrisién de color rojo bien definido Recesién nagativa: Apaicién de oor amarilo 651.8 UilizaciGn dal citesto 65.1.8.1 Transierir un pequedio inceulo a tubos con caldo crate de Koscr, 6 ager cirato de Simmons. $i ata éte sSimo, sembrar una linea recta en ef centro dl hse. 65.8.2 Incubar a 35 °C i 1 °C durante 72h a 96 h si Uiliza € caldo ciuato de Koser, 6 durante 48 b 2h si Uutlizé el spar eato de Simmons y observar la reac’ ‘Reaceién positira: 4) aldo eitrato de Koser: apericion de tmoitez >) ager citato de Simmons: aparicion de crecimiento ¥ cambio dl color varda clare del meio « aul. 6.5.2 Considerar como &. cali, lo vutivos que preseten Jas Siguiente caracersieas Fermeniacin de Ja taciosa con producciin de gas 235 *c.44 90645 °C + Aspetto de cocobacilos 6 bacilos coms Gran negatives cn ln coloreeiéa de Gram. Cstiene uno de Jos siguientes reeeltadoe en les prucbas TMvic Micrcorganismos [Tedot] RNC [VP Citrate Eotid +]+l- : [eco an ~[+[- 2 63 Los tubos que generancultives con tas carcteist- «as mencionadas en 6.3.2 © arolan come positiva vse le- van a la abla de NMP que sorvesgenda, a fin de deiermirar e: NMP ce L cl 7 Exprestin de resultados: ‘TA Los resultados ds NMP de Coltformes, Collformss f- ‘ales yE. coi, S© expretan per en 6g, eegin se tate ce mvestas gules ¢ sSidas 7.2. Paca la expresin dclos resultados, se deben tomar en ‘cuenia las siguientes consiceraciones: 7.2.1 Lievar a le abla los valores obtenidos en tes dtu.7.2.2 Si nose emplean porviones correspondientes a aque tas expresedas etl ibls (0.1, 0.01 y 0.001}, se debe ob- {ener el resultado aplicando ta siguiente rormula, nip oy = MSP Sbascaaee tr 7.23. Si todos los. tubos incculados son positives, repar- larelvilorde la tebla para ol méaximo de tubos postivor G-3-3.6 5-5 -5) antoponiendo la expresicn “més de * y considerando las poreiores de mucsira uiizadas (véase anexo D,ciesanlos3.4y'5). 7.24 Sino se obtione cubes positivos reportar el valor de 1 tabla para la comrbinscign 0.0-0. antepeniendo fa expe sin "menos de", y consideranda ls purciones de muestas ‘noculadas. (vésseareno Duejomplas 6, 7y 8) 728 Si ain después de repatir el ensiyo, se obtienes combinaciones de tos posuyos que no se encteeran ea Ja tbl se puede obtener el serultsdlo por extvapalacion a ‘tra combinasion, donde se tengan igual némeio de thos positives. (véase anexoD ejemplo 9) 7.26 Cuando se han inocula mis de tes series conse+ ccatvas de mucatiasy us dilusioves, lor valores que a0 e- var a Ia tabla son los corespondientes a tees series ‘carscoutves, tomoadh on cuantalazsiguiones negli 7.2.61 Llevar ala tabla Jp dilycién mais alts (6 a menor porcion de muestra] donde se obtengan tados Ios lubes 90 Stivos y las dos dilucioes superiores siguientes. (¥éase sexo D, ejemplos 10, 1112, 7.2.62. Si ninguna de ts diluclones presenta los tres ur bos positvos, seleccionar I 3 diluciones ms elas, con alga tube peshivo.(réase anex0 D, ejampl |3), 72.463 $i se diene wns cBluciGn con tos Loe tubes 9e- sitves, seguida d algunos tubes positives en las res dlu- cones siguientes, afar el riimero de tubos postvos de Ih mayor diluciSr ale mis alta Ge las wes dilsciones com sceutvas seleccionados.(véase anexo D, sjenplo 14) 7.2.64 Cuando se obtensa tubos positives solo on alguna elas diluciones medias, selecciens las tes permerasdilu- clones cqnsecusivae pam las cual I dlueign media eng fe resultado postivs. (séase axexo D, empl 15). 1.2.6.5. $1 190Ks las diluciones mnuestran todos los cubes ponkives, seleceionar is 3 diluciores més alias inocals- as, (¥éase anexe D, ejemplo 16) 7.2.66 Caso se cmplean series de $tubos, se tomnan en ‘venta Tas mismas considerscsones anteriores, eto util zando la Tabla NMP correspondiznte, 3, INFORME Bl inforine del ensayo debe indicar come miaimo la si- alent informacion: 4.1 Fecha del ensayo. 18.2 kdemaiccoion complete de a muestra 433 Resultado det unisisreallza, ‘3 Nimero y dale de la Norma Venezolana COVENIN wilinada 8.$ Norrbre del salts 8.6 Oncervaciones BIBLIOGRAFIA, APHA 1992 Compendium of Metiads for the Microbiologiesl Examination of Food. 3 Bd. American Public Heallh sociation, Faitor M. Speck. Washington De. Becieiolopical Avalytical Manual. 1932, Food and Drug Administration. 7 Editi, US. International ICMSP 1974. Microorganims in Poo’s, 1. Tacie significance and Methods of enumeration’ 2 nd Est. The Inicinstional—Commissien on Microbiological Specifications for Foods, Univesity. of Toronto Pres. Cena,ANEXO A EORMULA ¥ PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS REQUERIDOS PARA LA DETERMINACION DEL NMP DE COLIFORMES, DE COLIFORMES FECALES Y DE Essherichia call * ~ MEDIOS DE CULTIVO: 1.4 Caldo Lauri Sulfato Triptase (LST) (6.41) 1d Formula ‘Triptosa tiptona o Tripticase 00 ¢ Lactess 50g Fosfato Dipotisico 25 & Fosfato Monopotisice 25 g ‘Clocuro de Sodio So g Laue! Sullito de Sado Ol g ‘Aguadesituaa 1.000, 1.12 Freparaciin 1424. Disolver completamente los ingrediemes en el agua destlada y repanir en porcianes de 10 ml en whos dde 150 mmm x 15 mum eon tubes de Durham incorporados. 1122. Eawsilizaron ef autoclave a 121 °C pee 15 itu: tes (15 libras de preston). El pH final debe ser aproxima- dumente 2.638 A2 Cale Lactosa Bile Verde Brillante al 2% (LDvB). (5.1.3) 121 Pérmula Pepiona 190 ‘ Lactose Do 8 Bilis dobouey deshidestada 20.0 2 Verde billate (Sat. Acuosa 05% ply) 266 al ‘Agua destileda 1000 al 12.2 Preperscisn 1.2.2. Disolver a peptona y In news en $00 ml de ago aproximadamente. 122.2. Disolverbilis de bucy seshicratada en 200 mi de ‘aga destilada y- mezclar con la solecisn de peproray lac sal pl de lasoluci6n deve serde 7,02 7,5) 1.224 Ajustrel pHa 74 22d Afsir 2,66 ml de solucign scuasa de Verde Bul- Name al 0.5% y Vovar el volumes final asia wa fie com agus cestlada 1.22.5. Repanic cantdades do 10 ml por tbo de ensayo {on tubo de Duenam incorporaco} 1.2.2.6 Esteriizac en autoclave 2 121°C per 15 minutes, FI pH Final debe enter etre 7,1 y 74. 1.3 Calda Mae Cenkey (5.1.3) 132 Rérmata Peptona 200 0g Lectosa og Sales Biliaes 50 g Cloruro de Sodio 50g Purpura de Beornossesol 1%" 1,0 mi Rojo neuro 0% = 55 ml Agua destiads 10) « Pairpura de Bromocresal 1, Peser Ig. del colorune {yaad 19 mL hsOxido de sodiu QL Ny 81 mh do agua ‘esttae, * Rojo Neutro 0,1 %, Disoler 1 g de! ealorane en 100 mi, de un disolvente compuesto por 90 % alcoho) ein 10% ceatua. 1.32 Proparcion 1.22.1 Disolver compleiamente los ingredientes en el agen, sustarel pH x76 y repartren cantidades de 10m} or tubo, (c0a tubo d= Durham incery9r840), LA2E Everilzar a 120°C por 1S minutos. 14 Caldo triptonado (5.1.4) 144 Férmala Tripeona 8 Agia 100m 12 Preparacién 142.1 Discs las ingredismes en el agua destilads ¥ ‘uustarel pH del medio de manors que desputs de la eto- lfeacin ea de ,2 4 0,1 1.422 Disiribuiren porctones de 3 me. os tubos de ene15 Caldo citrato de Koser 152 Formula Posfato deamon y sesio 1s 2 Fostato monopotssica 10s Sulfate dermagnesionepiahidratida 0.2 Cirato de soda din datada 235 8 Anal de bromotinc (solucin ol 0.2)" 80 zd ‘Agua cestiada 990. ml * Opcional 152 Preparaci6n 1.52.1 Disolve los ingradiontes en el agus, distebuir ea tubos er yohimmenes ce 3 mn y eseriizar a 121°C por 13 sin, E] pi final debe cor apeoxitmadamene 63 16 Caldo para enriquecimiento de coliformes (F: (S16) 162 Foenwula Trptosa mos Lactosa 50 8 Mercladle Sales Biliaes Is 8 Fosfao Dipotisico 40 § Fosfaio Monopotisico IS E Clerure de Sodio 30 8 ‘Agua destlada 1000 ml 192 Preparecion 1.6.21 Divolver tus ingredientes complements por agi- tasiéa en agia dastlals, celentur suevernente si fnese 1462.2 Repautie 10 wi de 1s soluctnn en ube (20 rom x 15 a (41.1) dcom thas Durham Inceeporadoe)y esteri= Nizar co aujoclave a 121 °C por 15 minutos. El oll ral Gohe ser de 68 17 Agua peptonada (61.7) 172 Koreas eptons 190 Cleruro de soaio 59 Aun desilidh eo a 172 Prepataci6n L721. Dielver los ingrodientes en cl agus dextilada y ajustar #t medio de mareia que el pH después dela esteri- Tizacign ses de 7.2 0. 17.22. Distibuic en porciones de 10) en los twos de ensayo (4.1.0 y esiellar 2121 Cpor 15 nie 6 18 Agar Levine 6 Eosina Azul de Metiloxo (EMB) G18) 181. Formula Peptoaa 100g Laisa 109g Fosiao Dipotision a0 8 Agar 150g Eosina ¥ (Solusién acuaes 25 wi) 200 al ‘Azul de Maileng (Sol acuota 025% pi) 250 mt ‘Agua destileds 1000 ml 182 Preparicidn 1.82.1. Prepuror una sclucién eovosa de Eosing Y at 2 % Yuna solucitin acuosn de zal de moiteno ol 0.25 & 1.82.2. Agreger codes loz ingredients 2 955 ral de agua desilaca y afadir 20 mide te solucion de Eosina ¥ 5 25 imi dels eolucién de s2ul » mtilene, 1.823. Calewvar em ebviliciSn baste diver completa. mente ona hasta 50°C - 69°C, mezslar bien y repaie sangin se requiera(geacralmente en poreiones de 100 ml a 200 m1) 1.82.4 Bxestlizar en el nutodlave © 121 °C durante 15 minutos 19 Agar Endo (5.19) 191 Formals Doptene wD Laviosa we Fosatode Dipotttica 35g Suity de socko 10 % 23° ml Factina lsiea (eclucibn ald % enalcohol de 85 %) 19 at Agr 32 ‘Aguadzsilds 100) nt 1.92 Preparecidn 1.9.21 BI medio debe usurs el nino dia de su prepars- cid, Agregar los ingredieotes al agua destlada excep- luando et sulfite de sodio y la fucsina Coleaur 3 ebulliciéa bast ¢isolicin completa, Reporte volumenes de 1001 en matacesy coerliow 2 121 °C por 1S min 19.2.2 imediatamente anes de gu uso, fund of agar y fied a cada OU rl, [em de Ia slucton de fucsine, basi- €9 70,95 tl de una soluciin aeuosa de elite de soci al 10 % fel subita de socio debe preperase inmediauuente nies del uso), Mezelar conveniertemmate y verti enpoceiones de 15 1120 ml en placasde Peri. Bl pH final debeser 75. 1.10 Caldo glucasa tampensdo (6.1.10) 1.10 Eérmula Proteoss peptona 502 Glucose 508 Festa dpatisice 30 8 ‘Apo desta 3600 al 1.10.2 Preparsckin 1.1021. Suspenier los ingredientes en el agua, caleni: ssiovercute con agiacién haste obtcrer diselucidn complesa 4.10.2.2.Repartir In solucign en porciones de $ ml en tu- bos de ensoye y esteiizar en al cutoelave 4 121°C per |S sninuos. pH fal debe ser de 6 JAIL Agor eitruto de Simmons (6.1.11) LAL Pécs Sulfato de magnesio 02 2 Fosfaio monoarséaicoy 10 Fosiao Dipotésico 10 8 Girt de sod 20 5 Clorurode sie SD k Agr 150 § ‘Azul de Bromstinot (Soluciin acvos 02% py) 400 ml ‘Agua destiaca 090 at L.IL2I Saspencer fos ingredients en el agus y st callen- 1a hast ebulicién para disolyer el medio completamente, 1.11.22 Distriouir 10 mil del medio em tubos y extclizar en autoclave a 121°C por 15 min. Dejar solidifies en po- sicidn inlinada do maeora de obtener 2,5 om de column, pH final debe ser ce 0,8 2 1.0 12 Agar matritivo ($1.12) 121 Bormuta Exuacto deearie 30 Penton 50 ¢ Agee 150g ‘Agua destilads 10%) tol L122 Proparacion 142.21 Suspender los ingrediontes en el agua, clentara ebullcion hasta disever completamente y enfriat a 30 °C- 601°C, sjuctando el pH ge mavera que desputs de a esten- Naveisn sends 68 279, 1.12.22 Distritwie en tuhos o-en afones feta ce requie- ay esteriizae a 120°C po: 1S minutia * Totes medios de cutive pueden eossegairse ya prepa rados en las diferentes casas comercialesANEXOB. 2 REACTIVos 2A Renetivo de Koynes (6.2.2) 24.1 Rérasala Paradivetilaminovencakichido 50g Alesha Amflioe 750 mi ‘Acido Clorhiceiso (Cencenuado) 250 ml 242 Preparecion 2121 Disolver el paradimetilaninoberzaldehido ea el aleohol amilico y calenor a temperatura inferior d> 60 °C, ‘dejar eafidar colocando un recipient con histo y sBacke 61 ‘Acido clomidrica poco x poco, 22 Soluclinde alfanattel al $ % (5.2.2) Disolver 5 g de alfeesfiol (punto de fasi6n 92.5°C « més) {00 mi de aleonel eto absolute. 123 Soluei6n de hidroxido de poinsio de 40 % (6.2.3) Disolver 40 g hidrdxido de poxasio en agua desilada y We vara volumer en un mata aforado de [03 mt 2.4 Solucién indieadara de rojo de metilo (5:24) solver 0.1 de roo de metilo en 300 mt de zlookolett- 19095 %},y dias cox 200 ml de agua desilada,ANEXOC Mis Probable (NMP) y:Lirnte de Conflanza 95 %, en pruebas contubos de én euand son utllizades tres tubas con vollimenes de 6,33 0,015 y 6,001 g*- Te do toe poles 8 whos Limite de Contin 05% oie oats tig RNP Tafeioe ‘Seperer 2 0 ° <2 = ° T ° 3 a 7 1 ° ° 4 ai 2 1 @ H 7 z 2 5 1 0 7 2 8 1 2 0 i a Eg z 3 3 a 2 38 2 % 1 ies 5 a z 1 7 6 5 50 2 1 1 200 7 0 2 z a iz a ee o | 3 3 1 zo 1 9 1 1 A 1 ® 3) 20 A 1 1 5 7 20 3 2 0 B 30 30 3 i if I 150 30 500 3 2 a © eo 3 3 Cs ee 1400 3 A eT 2.405 3 3 2 L108 300) 4.800 3 Fi 3 311001 ‘2 Los cosultidos normales sbtenides an ol 95 & de les prusbas, no oe les ccloceal signa mas Lo resultados menos ro- taotes obenidos en el 4 %, de as prucbas son seguldos por el signo ms, Las combinsciones de tubus postivos que no Se smesttan, curren en menos del | & de Ios ensayos, y Ia frecuencia itdics que la Senica ex defectuces 0 la presuncion fan ddancatal en ALcdlculo de NMP ne se est cunplievdo. Ei eieulo de NEP, den obtener por exzapolacdn (o por la formule de Thomas) 6 la combinacn cercana més alla que este represeatado en la tabla. Per ejemplo, un rsuitado de 2.0.2 tendsia un NMP de apcoxinadancme 20, el cua es ef NMP parecido al resultado ee 24.1 bb = Toas las ctfas ajo el titulo "NMP/e", pueden ser mutiplieado por 100 pars ebtencr "NMP/LODe” are comblnaciones Que no se muestra se peANEXOC. ‘Tabla 2. Nimero Mis Probable (NMP) y limite de contianza 95 ‘o, en pruebas.con tubos de fermentaciin cuando se uflizan cinco tubas eon yolimenss do 0,1 0,15 y 0,601 a Nose bos poss 5 wos Timkede Conan 95 ue ool oat NMP inferior Seperior ro ° ° 2 = 2 [ ° 7 a a 0 ° 1 a a 0 1 ° @ 56 4 2 Lae 2 SANEXOC. Continuactin de ia Tabla 2 [Nimera Més Prokable (NMP) y limite de confianza 95 %,ex pruebas con tubos de Termentacin comndo sulla inc tubes cpu vimenss de 0,005 000g Nose eben posts tubes Tinie de Contomsa 95 7 tg 01g 001g NMP inferior ‘Superior 4 3 ¢ 2 2 a 4 3 1 Wet 1 7 + 4 © Mt 16 wo 5 ° © B 2 « s o 1 31 B 10 3 1 3 2 rm 120 3 1 1 6 FA 150 5 1 2 oe z 160 3 2 __o 8 zh ro] 5 2 es 2 2» 210 s 2 2 | oe 0 280 5 3 o |» 2 230 5 3 t m7 40 30 5 3 2 Ho. ao 360 4 0 120. 30 390 5 mi H 100 2 380 5 @ 2 20 io | so =|. 3 el 0 5 % 4 350" 10 0 5 5 2 20. 100 940 5 5 1 | 380 166 7200 5 3 2 500 20 2.000 5 3 3 oa 300 2900, 5 T 5 4 100 500) 200 | sf 3 1600 Los resultados eommales cbtenidos en el 95 % de las pruebas, no se es coloca el signo mus. Los resuliados menos pro- buahles cbenidos en ] 4 %, de las prusbas son seguidos por el signo mac. Las combinaciones de tabos posiivos que no ¢e muestra, ocurren en menos del I % de os eusayus, y la ftesuercia indica que le técnica es defectuosa 0 Ye presuncién tun: ‘dsmentil ene efleulo de NMP no se os curpliendo, El edleala de NMP, para combinaciones que ne se maestran ze pu {den obteast por calrapolacién (o por la fécmula de Thomés) o ls combiaasion cereana mds alt que ese representa en ‘abl, Por ejeraplo, un resuliado de 2.0.2 tendsfe un NMP de aproximadamente 20. cl cual es ef NMP parecito al resultado e241 b= Todas les cifras bajo e!ttule (NMP/2", puacon ser muiiplisade por 100 par obtener "NMP/1008"ort seam = i z = at i ° ° r 2 [3s st 1 z € io e 1 z t a i e os e a 9 1 € “2 nu | wae Se ee | o el ae g a oe @ o 3 a 3 > e E t O0rT 998 E | oe 7 ‘01 asa i 5 t oe T z t rw st 1] 1 Zo [ae t woo | io [wo fre [4 ~~ Warnonaatas svayzruunsvausain = aw NOIOWNTHWOD | _da-S4NOIOWOM SY1.3G Wh VaVO NE SOMINEIEO SOALLISOd SONI 70.8 WTAVHOU SYW OWA Ad SV IMYL SVT Ad NOLDYZITILA Aa SOTEWALI aoxanyCOVENIN CATEGORIA 1104:1996 C (2 Revision) COMISION VENEZOLANA DE NORMAS INDUSTRIALES MINISTERIO DE FOMENTO Av, Andrés Bello Edif. Torre Fondo Comén Pisos 11 y 12 TelF S75. 41.11 Foxe 57. 13.12 ‘CARACAS, ig publicacién de: Frovoma RESERVADOS TODOS LOS DERECHOS tes: 07.100.30 Probibida a reprodusci6e ‘ral o parcial, por cualquier medi ISBN: 980.06.1693-3 Deseriptores: Microbiclogia de alimentos, oiiforme fecal, Escherichia coli, reouento de hactorias.