Analitika liposolubilnih

vitamina

Retinol - Vitamin A
CH3
5
4 2 6
3 1
3 4 5 61
2

CH3
CH3
7
9 11
15
13
12
9 8 7 10 5
3 14 1 OH
8
6
4
2
CH3
CH3
All trans

trans - 3, 7 - dimetil - 9 - ( 2, 6, 6 - trimetil - 1 - cikloheksen - 1 - il ) - 2, 4, 6, 8 - nonatetraen 1 - ol

trans - 9, 13 - dimetil - 7 ( 1, 1, 5 - trimetilcikloheksen - 5 - il - 6 ) - 7, 9, 11, 13 - nonatetraen - 15 - ol

Osobine

ALKOHOL- bezbojno,viskozno ulje, ovrsne na 8C

u bledo-ukaste kristale kakav je i acetat (t.t. 60C)
ESTAR - palmitat je svetlo-uta mast (t.t. 26C)
ESTAR - propionat je crveno-braon ulje

termostabilan u odsustvu kiseonika,

Fotosenzibilan i oksidabilan u prisustvu kiseonika
(kiselina i 3-en).
uva se u ampulama sa azotom

Sva

ispitivanja moraju da se rade

zatieno od svetlosti, kiseonika,
katalizatora oksidacije (Cu i Fe),
kiseline, toplote i uvek sa svee
pripremljenim rastvorima.

Izomeri vitamina A
9

24= 16
H

OH

9 - cis retinol
( izovitamin Aa )
izolovana moguca 4 !

13

OH
13 - cis - retinol
neo - vitamin Aa

9, 13 bicis retinol
izo - vitamin Ab

H
13
OH

Ph. Eur. IDENTIFIKACIJA

Ostala ispitivanja i testovi

Carr-Price r-ja - kolor reakcija (USP)

TLC metode:
Detekcija mrlja - Carr-Price sprej reagens (Ph.
Eur.) ili fosfomolibdenskom kiselinom (USP)

Identifikuju se oficinalni estri i prisustvo slobodnog

retinola (dozvoljeno do 1%) uz butilhidroksitoluen
kao stabilizator

RP HPLC metode (identifikacija aktivnih i

srodnih supstanci)
Karakteristini UV spektri (300-370nm) sa tri
apsorpciona maksimuma, 326nm
najintenzivniji
T.t. estara acetata i palmitata

UV spektar retinol palmitata

U metanolu:
326nm

IR spektar retinol palmitata

Carr-Price reakcija

1.

+
CH2

SbCl5
Lewis kis.

SbCl3OH

CH2

max

587 nm (plave boje u CHCl3)

15
CH2

C15

adicija

Anhidroretinol

max

= 368 nm)
C4

CH2SbCl3

max

= 619 nm

Cl3Sb

CH2
+

max

= 586 nm

Reakcija je kvantitativna! Nije specificna za odredjivanje vitamina A iz prirodnih proizvo

R-ja sa p-toluen sulfonskom kis.

1.+ H3C

CH2

SO3H
max = 368nm

anhidroretinol
( narandzasto crvena boja )

Odreivanje po Ph.Eur.
Spektrofotometrijski na 326nm se odreuje
aktivnost u IU/ml
Srodne supstance: UV
A300/A326 = 0.60
A350/A326 = 0.54
A370/A326 = 0.14
Ispitivani rastvor

ili
RP HPLC metoda: C18, voda:metanol
(5:95)

Ergokalciferol - Vitamin D2
CH3
CH3
12

18

22

CH3

13 17 16
14
9
15
8
7

6
5
4
3

HO

CH3

25

23

11

24

R
CH3

11
19

H
100
19

8 14 15

10
7
4

6
cis

1
2

CH2

10 CH2

12
13 17

1.

( 5Z, 7E, 22E ) - 9, 10 - sekoergosta - 5, 7, 10 ( 19 ), 22 - tetraen - 3

ol

16

Osobine

beo ili slabo ukast, kristalan praak ili

beli kristali, nerastvoran u vodi, rastvoran
u alkoholu i uljima
nestabilan u O2, t i svetlosti
Oficinalan: alkohol u obliku kapi i
injekcija

Identifikacija:

IR spektri (Ph.Eur.)
Karakteristine r-je na sekundarni alkohol
i triensku strukturu
Odreivanje: HPLC metode normalnih
faza, kolona silikagel, m.f.
Pentanol:heksan (3:997)

Testovi

[], + 103 do +107 ,

Hidrohinon antioksidans
Ispituje se u VIS oblasti - r-jom sa
tetrazolijum plavim na 525nm,
Ergosterol
TLC met., na ploama Silkagela G,
m.f. cikloheksan : etar u istim odnosima,
0.1g/l butilhidroksitoluen, na tamnom mestu,
detekcija mrlja sa SbCl3,

Test istoe
na hidrohinon
2+

N
N

OH

N
N

C6H5
OCH3

+
-

2Cl

OH -

OH
OCH3
C6H5

N N
N

H 5C 6

N
N

R-ja kvantitativna!
Odreivanje prema standardu
hidrohinona koji se tretira istim reagensom.

C6H5

H
OCH3

limit:20ppm

OCH3
uti formazan!
525nm

N
H
N
H 5C 6

N
C6H5

Carr - Price reakcija / VIS i TLC identifikacija

R

1.

SbCl3
CH3Cl2

CH2
SbCl3

CH2 SbCl3

max=500nm

Kvantitativna reakcija!!

zuto narandzasta boja

koja prelazi u pink

TLC ispitivanje:

boja mrlje ergokalciferola: uto

narandasta, dok je
ergosterola ljubiasta, i
javlja se ispod glavne mrlje
ergokalciferola, manja je i manje
intenzivna od one sa standardnom
supstancom za limit od O,2% ergosterola

Ostale Identifikacije:

COOH

COO

CH2
+
HO

O2N

NO2

3, 5 - dinitro benzoeva
kiselina

O2N

NO2

T. T. 120

Estar t.t. 120 C

Oksidacija i izomerija na istoj t., Potrebno

postaviti aparat na 5 C niu temperaturu!

R-ja sa sumpornom kiselinom

3.

1.

R
+H+

R
+H+

H2C
OH

OH
crveno obojen
izotahisterol

Ispitivanje neistoa

NP HPLC u okviru odreivanja

Trans vitamin D2
Ergosterol
Lumisterol2
Tahisterol2
Izotahisterol2

Analitika vitamina E
CH3
HO

3 1'

7
H3C

4
3'

*
2'
O 2
1
CH3

8
CH3

5'
*

4'

6'

CH3

3, 4 - dihidro - 2, 5, 7, 8 - tetrametil - 2 2H - 1 - benzopiran - 6 - ol

6 - hromanol
5, 7, 8 - trimetil tokol
2R, 4'R, 8'R

9'

7'
*
8'

CH3

11'
10'

CH3
12'
CH3

4', 8', 12' - trimetiltridecil

1.

Osobine

Bistra, ukasta, viskozna tenost, rastvorna

u organskim rastvaraima
Nestabilan u prisustvu O2, svetlosti, t , u H+ i
OH- sredini.
Lako se oksidie u prisustvu soli tekih
metala i svetlosti!

Oficinalan: acetat, sukcinat i

nikotinat

Identifikacija - Ph.Eur.

UV i IR spektri
[]
TLC uz detekciju mrlja na sil.GF254 prema Rf
standardu
Testovi: UV (max 292nm ili 284nm), srodne
supstance (GH), teki metali
Odreivanje:

GC uz plameno-ionizacioni detektor zajedno

sa srodnim supstancama

UV spektar tokoferol acetata

U metanolu: i minimum na
254nm, pregib na 278nm, a
aps. Maks. 284nm

IR spektar tokoferola

Identifikacija po USP
CH3

A.

1.

H3C

HNO3

CH3
R

etanolni
rastvor

NH2
+
NH2

O
O

fenilen diamin
Nakon
saponifikacije
estra i ekstrakcije
etrom!

Tokoferol crveno 750nm

Crvena fluorescencija!!
r-ja je 10x osetljivija od ostalih
CH3

COOH

O HIN.

Ispitivanje optike rotacije USP

B. Etarski ekstrakt neesterifikovanog

tokoferola ili hidrolizovanog tokoferol acetata
sa K-fericijanidom u NaOH se muka 3min.
Isperu se etarski ekstrakti vodom, profiltriraju
preko bezvodnog Na-sulfata i upare. Rastvori
se u izooktanu i meri optika rotacija. Disomer treba da ima optiku rotaciju ne
manju od +24 , a dl- ne treba da ima optiku
rotaciju

C. Na osnovu retencionog vremena

dobijenog u odreivanju GC, prema
standardu
Odreivanje: GC uz plameno-ionizacioni
detektor

DRUGE REAKCIJE IDENTIFIKACIJE I

ODREIVANJA
CH3

1.

HCl i Fe (III)-hlorid

H3C

CH3
R

HO
H3C

CH3
H3C

O
+

R
O

OH
H3C
p-hinon

CH3

Fe (II)-hlorid

kvantitativna i oficinalna r-ja

Fe2+ + 3
N

1, 10 - fenantrolin

N
Fe2+

trifenantro.
2+
3 oranz Fe komplex.

Test istoe - na prisustvo slobodnog

tokoferola

1.

4+

p-hinon

Ce

4+

C6H5

visak

C6H5

Ce + HN

plavi hinon
imin

Vitamin E sa Ce(IV) ionom se oksidie i gradi phinon

Ukoliko je slobodan vitamin E prisutan u
oficinalnom estru u dozvoljenim granicama viak
Ce(IV) sulfata ce reagovati sa dodatim
difenilaminom i odmah e se pojaviti plava boja
nastalog hinin imina
Ukoliko se plava boja ne pojavi odmah onda je
preparat neispravan jer to znai prisustvo
slobodnog vitamina E vie od dozvoljene granice
pa se sav Ce(IV) potroio za nastajanje p-hinona

Analitika hidrosolubilnih
vitamina

Vitamin C
CH2OH
H

C*

OH
O
1

5*

H
HO

2
3

OH

-lakton 2, 3-dehidro-L-gulonske kiseline

(5R) - 5 (1S)-1, 2-dihidroksietil-3, 4-dihidroksi-2(5H)-furanon

Osobine

Bela kristalna supstanca, lako se

oksidie, rastvorna u vodi i etanolu, topi
se uz razgradnju na 190C, kiselog
karaktera pH 1% vodenog rastvora je 2.7
pKa C3 11.57, pKa C4 4.17
Vit. C je stabilan pri pH 5-7
Oficinalan: kiselina i estar palmitat

kisele osobine vitamina C

HO

R
O

-H

VINIL - pokretna grupa!

R
O

R
O

redukcione osobine vitamina C

1.
HO

-2H+, toC
+

+2H , t C
OH

O
H

HO

HC
H2C

OH

H2O

dehidroaskorbinska
kiselina

COOH

COOH
O

HO

COOH
oksalna
+ kiselina
COOH

OH
H

CH2OH
2, 3-diketo-Lgulonska kiselina

OH

HO

CH2OH
L-treoninska
kiselina

Oksalna kis. je takoe proizvod

fotohemijskog cepanja in vitro i in vivo
Ph. Eur. propisuje ispitivanje njenog
prisustva u farmaceutskoj supstanci kao
neistoe
Vit.C je nestabilan u anaerobnim
uslovima posebno u rastvorima - nastaje
furfural

HO

H2O

- H2O

1.
O

O
HO

HC
H2C

OH

O
O

C COOH
H
OH

CO2

- H2O

Identifikacija - Ph. Eur.

UV apsorpcija (max 243nm u HCl)

IR spektri
pH
R-ja sa AgNO3
Obezbojavanje rastvora dihlorfenolindofenola

Testovi:

[]
oksalna kis. sa CaCl2,
Cu i Fe (kao katalizatori oksidacije) u
sirovini primenom AAS,
teki metali
Odreivanje: jodometrijski u prisustvu
H2SO4

UV spektar vitamina C

IR spektar vitamina C

Karakteristine r-je identifikacije:

1.

2AgNO3

O
HO

2Ag +2HNO3

HC
H2C

OH

dehidroaskorbinska
kiselina

kvantitatinva
r-ja

r-ja sa Tillmansovim reagensom

Tillmans-ov reagens
Cl

1. +

OH

dihidroaskorbinska +
kiselina

Cl
2, 6-dihlorfenol
indofenol
hinonimin-plav

Cl
HO

H
N

Cl

fenolamin
bez boje

OH

R-ja Turnbulovo plavo

R-ja sa FeCl3 i K3 Fe3+(CN)6

HO

OH
+

2+

3 Fe Cl2

O
3+

2+

2Fe Cl3
3+

2K3 Fe (CN)6

+ 2 Fe Cl2 +2 HCl
2+

Fe3

3+

Fe (CN)6
turnbulovo
plavo

+ 6KCl

R-ja sa CuSO4 i FeSO4

OH

HO

O
+

2CuSO4 +

2NH4SCN

O
+

2CuSCN +
rodanid
beo talog

(NH4)2SO4 + H2SO4
-

HO

OH

O
O

OH
2+

FeSO4 + 2NaHCO
3

Fe

O
O
2

feroaskorbinat
+
ljubicast-dodatkom H
boja iscezava

+ Na2SO4 + 2 H2O + 2CO2

Redukcija J2
Redukcija J2- r-ja je kvantitativna!!
HO

OH
O

+ J2

J2 + 2Na2S2O4 H2SO4

+ 2 HJ

2NaJ +

Na2S4O6

Indikator:Skrob u
Variamin plavo-indikator!
sumpornoj kiselini
ili

Felingova r-ja
HO

COONa

OH
O
O

H C O
Cu
H C O

H2O

O
O

COOK
COONa
+

H C OH
H C OH
COOK

+ Cu2O

R-ja sa 2,4-dinitro fenil hidrazinom

razlikovanje AK i DAK
R-ja sa 2, 4 - dinitrofenilhidrazinom
O
NO2

NO2

C
C

O
O

C
H

HO

O2N

C
O

-H O
2

O 2N

O 2N
NH

NH2
CH2 OH
dehidroaskorbinska
kiselina

NH

Ili upotrebom poliamidnih

Podloga na TLC ploama!

NH
NO2

HO

CH 2 OH
oosazon
crveno-narandzast

Odreivanje

Oksidoredukcione i netralizacione
titracije
Ph.Eur. jodometrijski uz indikator
Variamin umesto skroba
titracija sa N-brom sukcinimidom
titracija sa CeSO4 do zelene boje uz
difenilamin

Titracija sa cerijum (IV) sulfatom

HO

OH
4+

+ 2C e ( SO 4 )2

CH 3 CN
CH 3 CO OH

COOH
CO OH
CO OH
ok salna
kis elina

H C OH
+
+
HO C H
CH2OH
treoninska
kiselina

3+

Ce2 (SO 4)3

uz difenilamin do
zelene boje!!

H2SO 4

Titracija uz neutralizaciju sa NaOH

HO

OH

NaO

NaOH

OH

H2O +

O
O

uz indikator fenolftalein ili metiloranz

Analize askorbinske kiseline

primenom HPLC ionskih parova

Visoko polarna - neretenciona na RP

kolonama
Sa katjonskim reagensom - cetrimida za
formiranje JP uz elektrohemisku detekciju
M.F. 0,1M natrijumacetat, pufer pH 4,2 koji
sadri 0,03M cetrimid/ acetonitril (95:5)
Za selektivno odreivanje vitamina C u
multivitaminskim proizvodima