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Electroforesis

El trmino electroforesis proviene de los vocablos griegos lektron que

significa mbar y hace referencia a la electricidad y phoros que significa
llevar o trasladar, por tanto etimolgicamente puede definirse como un
transporte o traslado bajo la accin de la electricidad. Ms propiamente, la
electroforesis se define como un mtodo analtico para la separacin de
molculas segn la movilidad de stas en un campo elctrico a travs de una
matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga
elctrica, dependiendo de la tcnica que se use.

En 1937 el bioqumico sueco Arne Tiselius dio a conocer un nuevo mtodo para separar las protenas de una mezcla. ste
consista en colocar un cierto volumen de una solucin de dos o ms protenas en un tubo de vidrio en forma de U, sin
llenarlo completamente. Despus el espacio restante en cada extremo se ocupaba con el
volumen necesario de una solucin de electrolitos libre de protena, que actuaba como
amortiguador. Luego se sumerga un electrodo en la solucin amortiguadora libre de
protena de cada extremo, se conectaban los electrodos a una fuente de electricidad y se
someta todo el sistema a un campo elctrico. Los componentes de la mezcla de protenas
comenzaban a moverse a diferente velocidad hacia el electrodo de carga opuesta. Se
formaban frentes de movimiento que reflejaban la movilidad electrofortica de cada
componente, o grupos de componentes de la mezcla, por lo que se le dio el nombre de
electroforesis de frentes en movimiento o moving boundary electrophoresis a este
sistema.
Este fue uno de los pocos mtodos
analticos poderosos disponibles para
los investigadores en la poca del
desarrollo inicial de la qumica de
protenas y a pesar de que presentaba importantes desventajas como
escaso poder de resolucin, exigir gran cantidad de muestra, ser
muy laborioso y en la prctica no permitir la separacin total de los
componentes de la mezcla, el sistema de Tiselius dio paso a aquellos
que usaban un soporte slido o gelatinoso, embebido en la solucin
amortiguadora de pH, sobre el que ocurra la separacin
electrofortica y dadas las cantidades relativamente pequeas de
muestras que podan aplicarse, la separacin total de los
componentes en bandas o zonas discretas se converta en algo
realizable. Al desconectar el campo elctrico, cada componente de la
mezcla se mantena por un tiempo suficiente para fines prcticos, en
la zona del soporte que haba alcanzado durante la electroforesis. Se les llam genricamente electroforesis de zona.

Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan
una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se desplazaran hacia el
nodo (el polo positivo).

El movimiento de las molculas est gobernado tambin

por dos fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con
el solvente dificultar este movimiento originando una
fuerza que se opone, por otro lado las molculas poseen
energa cintica propia por lo que tienden a moverse en
forma aleatoria o movimiento browniano. La suma de
todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren
de una manera homognea, de tal manera que, si las
molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin,
los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente se reduce el movimiento de las molculas empleando un medio que le oponga
resistencia, por ejemplo un gel. ste es un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y
forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las
molculas ser ms lenta, pero el ensanchamiento del frente se ver reducido tambin. se aplica un potencial de corriente
continua a travs del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de
corriente y las especies separadas se tien para visualizarse.

ELECTROFORESIS LIBRE
En esta, el campo elctrico se aplica a disoluciones o suspensiones.
Histricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy se
conoce y fue desarrollada por Arne Tiselius en 1937. Actualmente
est en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se
desarrolla, tiene poco poder de resolucin.
ELECTROFORESIS EN ZONA

Es una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica y biologa

molecular por su elevada resolucin. El campo elctrico se aplica a
un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo.

Para llevar a cabo una separacin electrofortica zonal se necesitan:

Fuente de alimentacin. Proporciona el campo elctrico mediante
dos electrodos, uno positivo (nodo) y otro negativo (ctodo) entre los que se establece una diferencia de potencial.
Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se sitan los electrodos.
Soporte electrofortico.

Cuando se utiliza la electroforesis en zona, la muestra se dispone inicialmente en una pequea zona del soporte, y
posteriormente lo va recorriendo impulsado por el campo elctrico.
Para que esta situacin sea estable, tanto al comienzo como a lo largo del
proceso de separacin, es necesario contrarrestar el efecto de la difusin
y las posibles corrientes de conveccin. Para ello se utilizan reticulados
moleculares (el soporte de la electroforesis), que forman un entramado
tridimensional que impide o reduce dicha difusin y permite la entrada de
agua en sus poros; el tamao de estos poros debe permitir el paso de
molculas voluminosas como son los cidos nucleicos y las protenas.
Adems, el soporte debe ser inerte, es decir, no debe tener cargas que
interfieran con la migracin de las molculas de la muestra. Los
diferentes tipos de soportes se clasifican en dos grupos: Restrictivos y No
restrictivos.

SOPORTES NO RESTRICTIVOS TIPO I

El Tamao de poro no opone impedimento al paso de las molculas. El agar es el ejemplo ms representativo y se
obtiene a partir de algas marinas y est formado por dos tipos de polisacridos: la agarosa y la agaropectina. La agarosa
se utiliza ampliamente sobre todo para la separacin de cidos nucleicos y para el anlisis de protenas. Los diferentes
tipos de agarosas se caracterizan por su punto de
fusin (entre 35-95C), su resistencia fsica y el grado
de electroendsmosis.

SOPORTES RESTRICTIVOS TIPO II

Soportes Restrictivos Tipo II. El tamao de poro opone resistencia al paso de
las molculas. El ejemplo caracterstico son los geles de poliacrilamida, que
no slo evitan la conveccin y minimizan la difusin, sino que adems
participan en el proceso de separacin. Estos geles son medios porosos en los
que el tamao de poro es similar al de las protenas, de tal modo que existe un
efecto de tamizado molecular y la separacin electrofortica depende de la
densidad de carga de las molculas y de su tamao.

ELECTROFORESIS EN PAPEL
La muestra se aplica sobre una tira de papel filtro
humedecido con una disolucin tampn, bien en el centro o
en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las
sustancias a separar y del pH del tampn. Los extremos de
la tira se sumergen en dos recipientes separados que
contienen la disolucin tampn y en los que se hallan
colocados los electrodos.
Se conectan los electrodos a una fuente de tensin continua
y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las molculas
cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de
emigracin de una molcula, depende preferentemente de su carga. Completada la electroforesis, se desconecta la fuente
de tensin y se secan las tiras sobre una superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc.).

El revelado se realiza empleando los mismos mtodos que

los utilizados en cromatografa sobre papel, mediante la
accin de los colorantes adecuados.
La electroforesis en papel se emplea principalmente en la
separacin de sustancias de bajo peso molecular como
aminocidos y pptidos.
Las electroforesis en papel tambin pueden hacerse en tiras
de acetato de celulosa, que son qumicamente ms
homogneas y tienen la ventaja de ser transparentes, con lo
que las sustancias a separar, una vez teidas o reveladas,
pueden cuantificarse por densitometra.
La principal aplicacin es la separacin de protenas del suero o lipoprotenas, conocindose el resultado como
proteinograma y lipograma respectivamente. Se han aplicado tambin para la separacin de isoenzimas de la lactato
deshidrogenasa y la creatn-quinasa.

ELECTROFORESIS EN GEL
Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido. Este tipo de electroforesis se
halla entre los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados en la separacin de
macromolculas. Los geles de uso ms generalizado son: poliacrilamida y agarosa. stos
poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de
traslado y molculas trasladadas durante el proceso electrofortico. De esta forma, la
separacin no se produce slo por las diferentes cargas de las molculas, sino tambin
por las diferencias de tamao. Los geles estn formados por un reticulado de polmeros
(constituyendo una red enmaraada) y el lquido intersticial en el que se encuentra
inmerso esta red.

Geles de agarosa
La agarosa es un polisacrido (originalmente
obtenido de algas) cuyas disoluciones (tpicamente
de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer
liquidas por encima de 50 C y formar un gel,
semislido al enfriarse. Este gel est constituido por
una matriz o trama tridimensional de fibras
polimricas embebida en gran cantidad de medio
lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa
usualmente para separar molculas grandes de
alrededor 20.000 nucletidos.

Geles de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) se
forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente
entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles
transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no
inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo
prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de
polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro,
lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su
neurotoxocidad.

La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los mtodos ms utilizados para la purificacin, anlisis y
caracterizacin de protenas. La tcnica permite separar molculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se
les somete a la accin de un campo elctrico. Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel de poliacrilamida,
que se pueden agrupar en dos categoras:
1. Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo)

PAGE-nativa
PAGE-desnaturalizante (SDS-PAGE)
Isoelectroenfoque

2. Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

PAGE-NATIVA
La PAGE-nativa se utiliza para separar protenas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en funcin de la carga
intrnseca de las mismas.

PAGE-DESNATURALIZANTE
En la electroforesis desnaturalizante, como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes de protenas,
como pueden ser: detergentes (p.ej. SDS, sodio dodecil sulfato), catropos (p.ej. urea) y agentes reductores (2mercaptoetanol, DTT). Para la visualizacin de las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin, siendo el ms
habitual el azul de Coomassie. En la SDS-PAGE, la separacin es funcin del tamao (masa molecular), lo que permite
determinar el peso molecular de las protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica (Rf) de la protena de
peso molecular desconocido con el de protenas de referencia de peso molecular conocido. La SDS-PAGE es muy til
para calcular el peso molecular de una protena concreta ya que separa las protenas segn su tamao.

ISOLECTROENFOQUE

Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de
pH. Las molculas anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de
potencial y un gradiente de pH. La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un
gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango. Las sustancias
que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y
migraran hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico
tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con
su punto isolctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas amfotricas se sitan en
estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH.

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla segn sus dos propiedades moleculares,
una en cada dimensin. El procedimiento ms usado se basa en la separacin en una primera dimensin mediante
isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.

Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo comn y efectivo para la separacin de
molculas, el proceso de separacin puede durar varias horas, siendo difcil de cuantificar y automatizar. La
electroforesis capilar (CE) es una tcnica de separacin que se ha desarrollado gracias a los avances de la cromatografa
lquida de alta eficacia junto con los procedimientos ms tradicionales de electroforesis. Esta tcnica permite separar
bastante bien biomolculas, donde la cromatografa lquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequea masa
molecular, difciles de estudiar por los procedimientos clsicos de electromigracin en soporte.
La electroforesis capilar constituye una adaptacin particular de la
tcnica de electroforesis. Esta tcnica separativa se basa en la
migracin de las especies de la muestra en disolucin, portadoras de
una carga elctrica global, bajo el efecto de un campo elctrico y en
contacto con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado.
En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto
en sus extremos, fabricado con un dimetro pequeo (15 a 150m). El
capilar oscila entre 20 y 80cm, y est lleno de una solucin buffer. Un
detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar, cerca del
compartimiento catdico. La seal obtenida es la base de la obtencin
del electroferograma, que muestra el registro de la composicin de la
muestra. Solo las especies que se dirigen hacia el ctodo sern detectadas.

MTODOS DE DETECCIN
En la deteccin UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a travs del capilar en una pequea zona en la que se ha
eliminado el revestimiento opaco. La deteccin por fluorescencia resulta ms sensible si se emplea una fuente lser muy
intensa, asociada a menudo a un procedimiento de preformacin de derivados de los analitos portadores de un fluorforo.

TCNICAS ELECTROFORTICAS CAPILARES

Electroforesis capilar en zona o en disolucin libre (CZE)

Es el procedimiento de electroforesis ms habitual, en el cual el capilar es
recorrido por el electrolito a travs de un medio buffer que puede ser cido
(fosfato o citrato), bsico (borato), o anftero (carcter cido y bsico). El
flujo electroosmtico crece con el pH del medio electrofortico.

Electroforesis capilar electrocintica micelar (MEKC)

En esta variante del procedimiento anterior se aade a la fase mvil un compuesto catinico o aninico para formar
micelas cargadas. Estas pequesimas gotitas inmiscibles con la disolucin retienen a los compuestos neutros de un modo
ms o menos eficaz, por afinidad hidrfila-hidrfoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para molculas que
tienen tendencia a migrar sin separacin, como es el caso de algunos enantiomeros.

Electroforesis capilar en gel (CGE)

Esta es la transposicin de la electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar est relleno con un
electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtracin que ralentiza a las grandes molculas y que minimiza

los fenmenos de conveccin o de difusin. Los oligonucletidos, poco frgiles, se pueden separar de este modo.

Isoelectroenfoque capilar (CIEF)

Esta tcnica, tambin conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar
con pared tratada que contiene un anftero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto
isoelctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presin hidrosttica y manteniendo el
campo elctrico, se desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este
procedimiento permiten separar pptidos con pI que apenas difieren entre s 0.02 unidades de pH.

El resultado de una electroforesis depende de numerosos factores y es necesario conocerlos para lograr la mxima
resolucin.

CAMPO ELCTRICO
Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez,
depende de diferentes parmetros:

Diferencia de potencial (V). Se mide en voltios y es lo que define el

campo elctrico. Cuanto mayor sea, mayor ser la velocidad de migracin.
Las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500
voltios (la mayora) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10.000 voltios.

Intensidad (I). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga elctrica.

Est relacionada con la diferencia de
potencial por la Ley de Ohm:

y para una diferencia de potencial dada, su valor

(normalmente entre 5-50mA) viene
resistencia del soporte, por lo que, en ltima
distancia recorrida por las molculas.

determinado por la
instancia, da cuenta de la

Resistencia (R). Se mide en ohmios y

cuanto mayor sea la resistencia
del soporte, menor ser la movilidad
electrofortica (ya que la
intensidad ha de ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del soporte, sus
dimensiones (anchura, longitud y seccin) y de la concentracin del tampn de electroforesis.

Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente elctrica produce calor, y este efecto ser tanto mayor
cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, puesto
que puede afectar a la muestra (desnaturalizndola), al soporte e incluso al equipo electrofortico. Todo esto
justifica, por s solo, la necesidad de un sistema de refrigeracin en las cubetas de electroforesis.

MUESTRA

La movilidad electrofortica de una molcula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga
y disminuye segn aumenta su tamao, ya que mayor es la friccin de la molcula con
el medio y menor es su carga por unidad de superficie. Por esta razn, las molculas
globulares se mueven con mayor facilidad que las elongadas, ya que la esfera presenta
la mnima superficie a igualdad de volumen. As, molculas del mismo tamao y carga,
pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electrofortica diferente y ser, por
tanto, separables mediante una electroforesis.
TAMPN
Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por accin del campo
elctrico, lo cual genera protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilo en el
ctodo. El tampn es, por esta razn, esencial durante la electroforesis para evitar que
el nodo se acidifique y el ctodo se haga ms bsico, pero no debe afectar a las
molculas a separar.
Adems, la fuerza inica condiciona la movilidad electrofortica de
las substancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatacin
y en la conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria
una fuerza inica suficiente para mantener el pH y la conductividad
durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegara a
interferir en el sistema.
Normalmente, se emplean tampones con fuerzas inicas moderadas
(0.05-0.10M), siendo el pH la caracterstica que debe ser ms
controlada, puesto que determina la carga de la muestra.
Conviene sealar tambin que atendiendo a la distribucin del
tampn, los sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un
nico tampn en el proceso, y discontinuos cuando se emplean, al
menos, dos tampones de pH y composicin diferentes.

SOPORTE
La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie de fenmenos de elevada
trascendencia para el
resultado del proceso:

Adsorcin. Es una
muestra sobre el
resolucin,

retencin inespecfica de las molculas de la

soporte, por lo que afecta negativamente a la
ensanchando las bandas de migracin.

Electroendsmosis
soportes (sobre
aparecen cargas
sulfato, al estar en

(EEO). Es un fenmeno que se da en algunos

todo en los no restrictivos de tipo I), en los que
negativas, debidas a grupos carboxilo o
contacto con una disolucin inica.

Al aplicar el campo elctrico, los iones y las molculas se desplazan

segn su carga, pero en su migracin se encuentran con un flujo de
cationes desplazndose sobre la superficie del soporte y otro de
aniones hacindolo por el centro de los poros. Este flujo orientado se
llama flujo electroendosmtico. El EEO va en contra de la resolucin
de una electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y
se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuir a una mejor
resolucin en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis

Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor

reticulado de los soportes; cuanto ms tupida sea la red de
fibras, menores sern los poros. El movimiento de las molculas a travs del soporte es ms o menos fcil en
funcin de su tamao respecto al de los poros; aquellas molculas cuyo tamao se aproxime al del poro, ver
impedido su avance respecto a aquellas cuyo tamao sea muy inferior. Por esta razn, el soporte acta como un
cedazo que separa o tamiza las molculas en funcin de su tamao.