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Escola Secundária Dr.

Solano de Abreu
Ano Lectivo: 2008/2009

Disciplina: Biologia e Geologia

Joana Braga Gomes Tavares, nº7 do 12ºA


DNA Fingerprint

Existem várias técnicas de obtenção das impressões digitais genéticas, entre as quais
a de RFLP (Restriction Lenght Polymorphism), a mais utilizada, e ainda a de PCR (Polymerase
Chain Reaction), que graças à alta sensibilidade e espeficidade é possível analisar um fio de
cabelo com bulbo ou caspas eliminadas do couro cabeludo.

A técnica de Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição baseia-se no


princípio que a sequência nucleotídica da molécula de DNA é exclusiva de cada indivíduo,
excepto no caso dos gémeos verdadeiros, esta técnica permite estabelecer relações de
parentesco entre diferentes indivíduos. A RFLP foi desenvolvida por Alec Jeffreys na Inglaterra,
no inicio dos anos 80, apesar de apresentar as suas desvantagens, os marcadores requerem
grandes quantidades de DNA relativamente puro, sondas específicas de DNA e marcação por
radioatividade no sistema de detecção, actualmente a RFLP tem sido vista como um meio para
chegar as identidades de criminosos, apurar a paternidade de crianças e muito mais.

O Processo da técnica de
RFLP
Materias que podem ser colectados:

Origem animal:

Origem vegetal:
 Sangue;

 Secreções, como esperma;  Folhas;

 Saliva;  Caule;

 Urina;  Raiz;

 Tecidos moles;  Semente;

 Pêlos com folículos;  Pólen;

 Caspa;  Pétalas e outros;

 Dentes;

 Ossos e outros.

O material mais utilizado é o sangue. O DNA é retirado dos glóbulos brancos, devido
aos glóbulos vermelhos humanos não possuírem núcleo.

1ºPasso – Extracção e purificação do DNA

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DNA Fingerprint

Torna-se difícil obter o DNA de uma amostra caso esta seja escassa, esteja degradada
ou ainda contaminada. O DNA é purificado através da utilização de métodos químicos (ex:
fenol, chelex, etc.)

2ºPasso (facultativo) - Processo de PCR

No caso de a amostra de DNA ser inferior ao necessário para realizar a sua análise, a
reacção de polimerização em cadeia permite obter cópias de uma parte do material genético
em quantidade suficiente.

3ºPasso – DNA é submetido a enzimas de restrição específicas

Esta passo baseia-se na existência de padrões repetitivos no DNA denominados de


DNA minissatélites ou ainda de VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats). Os VNTRs
exibem uma enorme variabilidade e sendo constituídos de até centenas de pares de bases
repetidos sequencialmente. Por locus, cada sonda hibridiza com dois segmentos de DNA,
correspondentes aos alelos materno e paterno de cada indivíduo.

Os cientistas seleccionam determinadas enzimas de restrição, que dividem o DNA


nestes segmentos de restrição cujas dimensões, composição em nucleótidos e localização
variam muito de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.

4ºPasso – Electroforese

Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos


a electroforese. Esta técnica, também denominada separação electroforética, baseia-se na
migração de moléculas carregadas por aplicação de um campo eléctrico.

Este processo é frequentemente usado para separar e algumas vezes purificar


macromoléculas, especialmente proteínas e ácidos nucleicos, com base no seu tamanho, peso
molecular, carga eléctrica ou conformação.

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DNA Fingerprint

A electroforece de DNA é realizada em gel de agarose.

Prepara-se o gel de agarose que é imerso numa tina de electroforese com uma
solução-tampão que estabelece a condução eléctrica com a fonte de alimentação. Uma vez
aplicadas as amostras de DNA e o padrão de pesos moleculares nos poços, inicia-se a
electroforese. A aplicação do campo eléctrico é efectuada através de 2 eléctrodos situados
paralelamente à fileira de poços.

Quando sujeitos a este campo eléctrico, os ácidos nucleicos migram em direcção ao


pólo positivo, uma vez que apresentam carga negativa. A agarose funciona como uma rede
cujos poros deixam passar mais facilmente as moléculas de menor tamanho, que vão, portanto,
migrar mais do que as de maiores dimensões. A migração de um fragmento de DNA na forma
circular, como um plasmídeo não digerido, é diferente da migração do mesmo plasmídeo sob a
forma linear (após digestão com uma enzima de restrição). Por outro lado, moléculas com uma
configuração mais compacta migram mais rapidamente do que moléculas com uma
conformação molecular mais distendida.
A electroforese em gel é frequentemente utilizada para estimar o tamanho de fragmentos de
ácidos nucleicos.

Através da comparação da distância percorrida pelos fragmentos com a percorrida por


fragmentos de peso molecular conhecido (padrões de peso molecular) é possível inferir sobre o
peso molecular de cada fragmento da amostra a analisar.

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DNA Fingerprint

5º Passo – método de Southern blot

Desnaturação

Terminada a separação electroforética, o gel deve ser tratado com uma solução
alcalina (geralmente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla fita
do DNA, separando-a em simples fitas.

Transferência do DNA para uma membrana

Uma membrana de nitrocelulose ou nylon é posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada
uniformemente sobre o gel, ou recorrendo-se à sucção, ou pondo-se sobre a membrana uma
pilha de toalhas de papel com um peso em cima. Isto leva a que o DNA passe do gel para a
membrana, aonde ele adere-se.

A membrana é então aquecida, no caso de ser de nitrocelulose, ou é exposta a


radiação ultravioleta, no caso de a membrana ser de nylon, de modo a ligar o DNA
permanentemente à membrana.

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DNA Fingerprint

Tratamento com a sonda

A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora - que é uma molécula de
DNA isolada cuja sequência é conhecida e é idêntica, ou então complementar, aquela
sequência a qual se quer determinar a presença ou não na amostra (como as duas fitas da
dupla hélice do DNA são complementares uma a outra, tanto faz escolher uma sonda que seja
idêntica ou complementar à sequência procurada).

A sonda de DNA é marcada de tal forma que permita ser detectada a sua presença,
essa marcação é normalmente feita incorporando-se a ela átomos radioativos ou ligando-se a
ela corantes fluorescentes ou cromogênicos (substâncias incolores que produzem cor ao
interagirem com um determinado meio).

Essa sonda irá parear com qualquer sequência de DNA complementar a ela. Portanto
se a sequencia procurada não estiver presente na amostra não haverá o pareamento.

Então o excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não hibridizada será
removida. Depois disso, a presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela
está presente) é revelada por uma auto-radiografia em um filme de raio-x, ou pelo
aparecimento de uma cor caso a marcação cromogênica tenha sido usada.

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DNA Fingerprint

Aplicações do DNA
Fingerprint
Análise forense

A dactiloscopia genética é uma técnica utilizada na ciência forense


onde se analisam as diferenças entre os DNA minissatélites, já referidos,
provenientes de material biológico deixado num local (sangue, cabelo,
esperma, etc.). A hipótese de dois indivíduos sem qualquer relação de
parentesco possuírem exactamente os mesmos minissatélites é muito
remota, sendo assim a dactiloscopia do DNA constitui um teste viável.

Os padrões de bandas de DNA obtidos por indivíduos diferentes


podem ser comparados e as diferenças são facilmente detectadas e as
pessoas distinguidas.

Isto permite a identificação de cadáveres e a identificação de


criminosos, incluindo violadores. Contudo, na análise dos suspeitos de um
crime, por exemplo, é de ter em conta se estes têm irmãos gémeos
verdadeiros, uma vez que, através das impressões digitais genéticas, não
se podem distinguir dois gémeos monozigóticos, pois os padrões de
banda são os mesmos visto possuírem igual material genético.

Determinação de paternidade

Como cada indivíduo herda a disposição dos seus nucleótidos dos seus pais,
comparando os padrões de banda de um indivíduo com os dos alegados progenitores, podem-
se obter probabilidades de parentesco que nos levem a excluir a paternidade ou a confirmá-la
com um elevado grau de certeza. Se os dois padrões forem suficientemente semelhantes
(tendo em conta que só metade do DNA é herdado de cada progenitor), então a paternidade
confirma-se.

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DNA Fingerprint

Diagnóstico de doenças

Esta tecnologia pode ser usada para prever a nossa saúde futura.

Pode ser utilizada para localizar os genes de doenças hereditárias. Se um padrão


particular de DNA aparece repetidamente em diferentes doentes, os cientistas podem verificar
qual o gene ou genes, ou pelo menos qual pedaço de DNA ou quais os pedaços de DNA, que
poderão estar envolvidos. Como o conhecimento dos genes envolvidos na susceptibilidade a
uma doença dá pistas sobre fisiologia subjacente à doença, o DNA fingerprinting auxilia no
desenvolvimento de terapias.

Também pode ser usado no período pré-natal para detectar possíveis anomalias
hereditárias, como a distrofia muscular ou a doença de Huntington, de forma a que possa ser
disponibilizado aconselhamento médico e possam ser adoptadas as devidas precauções.

Diagnóstico molecular

É possível fazer o rastreamento de mutações não caracterizadas e ainda a análise da


eficiência de transplante de medula, afim de se verificar o quimerismo.

Também permite fazer o ensaio de mutações conhecidas como o caso de


acondrosplasia, a forma mais comum de displasia, responsável pelo fenótipo que caracteriza o
anão acondroplásico.

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DNA Fingerprint

http://www.ufv.br/dbg/trab2002/GMOL/GMOL006.htm

 http://www.portalmedico.org.br/revista/bio2v5/odnacomounica.htm

 http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel

 http://www.icb.ufmg.br/big/genmed/southblot.html

 http://www.biologia-ap.no.comunidades.net/index.php?pagina=1288163696

 DIAS DA SILVA, Amparo; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes;


BALDAIA; Ludovina; FÉLIX, José Mário. Terra, Universo de Vida – Biologia 12ºano
PORTO: Porto Editora. Páginas 138 - 141

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