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BIO10-329 Biofsica de Protenas

Regente: Clia R. Carlini

Hemoglobinas normais e patolgicas


Os assuntos abordados nessa aula so:
Relaes estrutura X funo: comparao com a mioglobina

Aspectos ontogenticos e filogenticos


Hemoglobinopatias

Ateno ! Use o modo apresentao de slides para ativar as animaes

As globinas constituem um bom exemplo para se compreender as relaes


entre a estrutura e a funo das protenas.

A Hemoglobina um hetero-tetrmero formada por 2 tipos de globinas: a e b.


Max Perutz e John Kendrew resolveram a estrutura 3D da hemoglobina em 1959

Estrutura 3D do esqueleto covalente da mioglobina.


A mioglobina da baleia cachalote uma protena monomrica de 153 aminocidos
composta por 7 segmentos de a-hlice, denominados de A a H. As pores da cadeia
polipeptdica entre segmentos de a-hlice so chamados cotovelos. As globinas
apresentam um bolso (fenda) hidrofbico no qual se aloja o grupo prosttico heme.

O ambiente hidrofbico em torno do heme fundamental para a atividade


biolgica das globinas, que depende de uma interao reversvel com oxignio.
Fe++

Fe++.O2

Comparao das seqncias de aminocidos da mioglobina (Mb, 153 aa) e das


globinas a (Hba, 141 aa) e b (Hbb, 146 aa) da hemoglobina de cavalo.

As seqncias comeam com o resduo N-terminal NA1 ( esquerda, em cima), antes da hlice A,
composta por 16 aminocidos. Segue a hlice B, tambm com 16 resduos, e assim at a hlice H.
Os aminocidos idnticos nas trs protenas esto marcados em cinza, e os que interagem com o heme
aparecem em rosa. Entre esses ltimos esto a His E57 e a His F8 que ocupam a mesma posio
espacial nas 3 molculas, apesar de terem posies diferentes nas seqncias correspondentes.
Observe que o grau de identidade da seqncia entre as trs globinas relativamente baixo, da
ordem de 20% (27 resduos).

Comparao das estruturas 3D das globinas a e b da hemoglobina e mioglobina

globina a

globina b

mioglobina

hemoglobina

Observe a semelhana estrutural das 3 globinas, formadas por


7 segmentos de a-hlice que delimitam uma fenda, na qual se localiza o heme.

Considerando:
1) que a seqencia de aminocidos o que determina a estrutura 3D de
uma protena,
2) e o baixo grau de identidade das 3 sequncias globnicas,
Como se explica o fato delas possurem estrutura 3D to semelhantes ?

Como visto na aula anterior, os radicais dos aminocidos


no participam das ligaes que estabilizam a a-hlice.
Assim, pode haver mudanas na seqncia primria de
uma protena sem afetar a estrutura secundria, no caso
dessas ocorrerem numa regio de a-hlice ou de folha b.
Como as globinas contm grande proporo de a-hlices,
ao longo da evoluo acumularam nmero significativo de
mutaes pontuais sem alterao de sua forma 3D. .

O heme das globinas responsvel pela ligao ao oxignio.


O heme, tambm presente nos citocromos, sintetizado nas clulas aerbicas
atravs de uma cadeia complexa de enzimas, a via das porfirinas. Na ltima etapa,
um tomo de ferro introduzido na protoporfirina IX, originando o heme.

+ Fe2+
Heme sintase

Outros derivados porfirnicos no hemnicos importantes so a cobalamina ou


vitamina B12, que contem Co2+ ao invs de ferro, e clorofilas, que contm Mg2+

Nas globinas, o Fe2+ hemnico faz 6 ligaes de coordenao: 4 ligaes planares


com os nitrognios dos anis pirrlicos da protoporfirina, e 2 perpendiculares ao plano
do heme. A 5. ligao permanentemente ocupada com um dos N imidazlico da
histidina F8 (proximal). A sexta coordenao pode ser ocupada pelo oxignio, ou pela
histidina E7 (distal) nas globinas desoxigenadas.

Fe

No desenho ao lado, a globina a. Observar os


resduos hidrofbicos (em preto) que forram o
bolso do heme nas globinas.

A estrutura tetramrica da hemoglobina confere molcula maior


controle da afinidade por oxignio

A Mioglobina, composta por uma cadeia polipeptdica,


uma protena armazenadora de oxignio presente
no tecido muscular de mamferos.
1 heme = 1 O2

apresenta alta afinidade por O2

A Hemoglobina, composta por quatro cadeias


polipeptdicas (dois dmeros ab), uma protena
transportadora de oxignio.
apresenta afinidade varivel por O2

A curva de saturao com O2 mostra diferenas importantes na afinidade


da hemoglobina e da mioglobina pelo oxignio.
A curva de saturao descreve a percentagem de molculas carregando O2 (eixo y) medida que se aumenta
a presso parcial do gs (pO2, eixo x).

A Mioglobina (Mb) tem a curva hiperblica,


e atinge 50% de saturao (p50) com uma pO2
de ~1 torr.
A Hemoglobina (Hb) tem a curva sigmide,
indicando alosteria ou cooperativadade entre
suas subunidades. Sua pO2 de ~ 26 torr e
sua afinidade pelo O2 varia com o grau de
saturao da molcula.

Observe os valores da pO2 venosa (nos


tecidos) e arterial (nos pulmes).
A diferena de afinidade por O2 faz com
que nos tecidos, a Mb fique 100% saturada,
enquanto que a saturao da Hb diminui a
~55%, liberando de 1 a 2 molculas de O2.
Essa diferena de comportamento
est de acordo com a funo de
armazenamento de O2 da Mb e de
transporte de O2 pela Hb.

Por que a afinidade da hemoglobina pelo oxignio 26 vezes menor do


que a da mioglobina, se as protenas possuem as estruturas 3D de suas
cadeias globnicas (ambiente onde est o complexo heme-Fe2+ ~ O2) to
semelhantes ?

Quais so os mecanismos que fazem a afinidade da hemoglobina variar


conforme o grau de saturao em O2 ? Por que isso no ocorre com a
miglobina ?

A hemoglobina passa por vrias alteraes conformacionais na transio do


estado desoxigenado para oxigenado.

O2

No estado oxigenado, a cavidade


central do tetrmero diminue.
Vrios loops se movem.

Alteraes conformacionais da hemoglobina A durante a transio do


estado oxigenado para desoxigenado
Observar os movimentos da cadeia b
em relao ao Heme. A histidina 92 a
F8 proximal.

Observar a expanso da cavidade


central do tetrmero e as mudanas
nos contactos entre as subunidades

Alteraes conformacionais da hemoglobina A durante a transio do


estado oxigenado para desoxigenado

O estado de oxigenao afeta propriedades fsicas da Hemoglobina como a interao


com a luz visvel.

A hemoglobina desoxigenada interage mais com a luz azul (absoro no comprimento de


onda de 600-650 nm), dando ao sangue venoso uma cor acastanhada (no sangue sujo !),
quando comparado ao sangue arterial.

As alteraes conformacionais que ocorrem nas cadeias globnicas da


hemoglobina na transio oxigenao-desoxigenao so transmitidas de
uma cadeia a outra, atravs de contactos nas interfaces das subunidades.
Esse fenmeno a base molecular da cooperatividade, uma forma de
alosteria caracterstica de protenas oligomricas. Por ser monomrica, a
mioglobina no tem essa propriedade.
A cooperatividade na hemoglobina positiva. Isso significa que quando
uma cadeia passa do estado oxigenado para o desoxigenado, as alteraes
conformacionais que essa molcula sofre so sentidas pelas cadeias
vizinhas. Essas, por sua vez, respondem com uma diminuio de sua
afinidade pelo oxignio, facilitando a desoxigenao da hemoglobina.
O mesmo tipo de fenmeno ocorre na oxigenao da molcula, que
tambm acontece de forma positivamente cooperativa.
A cooperatividade na transio oxigenao-desoxigenao da hemoglobina
a causa de sua curva de saturao ter aspecto sigmide, e uma das
razes da afinidade varivel da hemoglobina pelo oxignio.

Vrios mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxignio.


O efeito Bohr um dos mais importantes em termos fisiolgicos.

O efeito Bohr a modulao da


afinidade da Hb por O2 pelo pH
do meio, facilitando a desoxigenao da Hb a nvel tecidual.
O sangue venoso mais cido
do que o arterial, pela presena
de CO2 vindo dos tecidos. Esse
forma cido carbnico H2CO3,
que se dissocia liberando H+
para o meio.
A curva ao lado mostra como a
% de saturao da Hb, em uma
pO2 prxima aos valores nos
tecidos (20 torr), diminue em
funo do pH do meio.
Para a mesma pO2, a saturao da Hb diminue
de 45% em pH 7,6 para 22% em pH 7,2.

Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se do as trocas de gases na Hb, e
suas propriedades de tampo.

TECIDOS

PLASMA

CO2

Nos tecidos, a pO2 de 25 a


40 torr e o pH ligeiramente
mais cido (7,2-7,3). O CO2
produzido difunde-se para o
plasma e para as hemcias.

2.

Nas hemcias, o CO2


convertido a H2CO3 pela
enzima anidrase carbnica.

3.

O H2CO3 se dissocia no on
bicarbonato HCO3- e um
prton H+. Parte do HCO3(~60%) difunde para o
plasma, onde constitue o
principal sistema tampo.

4.

Uma parte pequena (~8%)


do CO2 liga-se diretamente
ao resduo N-terminal de
cada globina, formando a
carbamino-Hb.

HEMCIAS

DIFUSO

CO2

(1)

(2) Anidrase

carbnica

O HCO3transportado no
plasma
representa 60%
do CO2 formado
nos tecidos

1.

HCO3-

Cl

(3)

+H2O

H2CO3

HCO3-

+ H+

Cl

(4)
NH3+

Hb
pO2 25 a 40 torr

NHCOO-

Hb

Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se do as trocas de gases na Hb, e
suas propriedades de tampo.

TECIDOS

PLASMA

CO2

CO2
Anidrase
carbnica

O2

6.

Ao receber o prton, a HbO2


sofre o efeito Bohr, que
resulta em uma diminuio
da afinidade pelo o O2,
facilitando a desoxigenao.

7.

Concordando com o efeito


Bohr, a Hb oxigenada mais
cida (pK ~7.4) do que a Hb
desoxigenada (pK ~7.6 ).

+H2O

H2CO3
HCO3-

Cl

DIFUSO

HCO3-

+ H+

Cl
FeO

(6)

(6)

H
C

Fe2+
H
C

(5)

NH
(5)

HC

C
NH3+

Hb
pO2 25 a 40 torr

O prton H+ gerado da
dissociao do H2CO3
tamponado por histidinas
que ligam o heme.

HEMCIAS

DIFUSO

O HCO3transportado no
plasma
representa 60%
do CO2 formado
nos tecidos

5.

N
HC
NHCOO-

Hb

N
NH2
C

Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se do as trocas de gases na Hb, e
suas propriedades de tampo.

ALVOLOS

PLASMA

CO2

CO2

HCO3-

(10)

HCO3-

Cl

+ H+

Cl
(9)

Fe2+
H
C

HC

NH2
NH

NHCOO-

Hb
(11)

10. Esses fatores fazem a anidrase


carbnica catalizar a reao
reversa, formando CO2 e H2O a
partir de H2CO3, resultante da
associao bicarbonato e H+.
11. O CO2 ligado
FeO2
Hb liberado.

H
C

pO2 100 torr

A Hb desoxigenada recebe O2 e
libera os prtons H+ recebidos no
tecido. O efeito Bohr agora resulta
em um aumento da afinidade pelo
o O2, facilitando a oxigenao.

(10)

H2CO3

DIFUSO

9.

+ H2O

Anidrase
carbnica

(12)

O2

No pulmo, a pO2 de 100 torr e


o pH mais alcalino (pH ~7.6).

HEMCIAS

DIFUSO

O HCO3transportado no
plasma
representa 60%
do CO2 formado
nos tecidos

8.

N
HC
NH3+

Hb

NH
N
C

12. O CO2 difunde


para o plasma
e da para os
alvolos.

Vrios mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxignio.


O 2,3-difosfoglicerato um regulador alostrico negativo da hemoglobina.
O 2,3-bifosfoglicerato (2,3 BPG) um
produto exclusivo do metabolismo das
hemcias, formado a partir de um dos
intermedirio da via glicoltica, por uma
enzima mutase especfica.

Glicose

1,3 bifosfoglicerato

2,3-BPG

Mutase
(s em hemcias)

piruvato

Via glicoltica nas hemcias

O 2,3 BPG liga-se na cavidade central do tetrmero


da hemoglobina, estabilizado por interaes
eletrostticas com resduos de carga positiva.

A ligao de uma molcula de 2,3 BPG


hemoglobina reduz a sua afinidade por O2,
facilitando a desoxigenao.

Na oxihemoglobina, a cavidade central menor, expulsando o 2,3-DPG e


aumentando a afinidade da molcula por O2.
A mudana conformacional que ocorre na primeira desoxigenao torna essa
cavidade maior na desoxi-hemoglobina, possibilitando a ligao do 2,3-DPG.

A concentrao plasmtica de 2,3-DPG


constante, ~5 mM.
Populaes que habitam regies de
elevada altitude, onde a atmosfera
rarefeita, apresentam como mecanismo
compensatrio um aumento nos nveis da
enzima mutase que forma o 2,3 BPG.
Com concentraes plasmticas mais
elevadas de 2,3-BPG, e uma consequente
diminuio da afinidade da Hb por O2, no
h prejuizo da oxigenao dos tecidos,
apesar da pO2 atmosfrica mais baixa
eventualmente no ser suficiente para
saturar 100% a Hb.

A regulao da afinidade da hemoglobina pelo O2 um somatrio do


efeito Bohr e do 2,3 bifosfoglicerato, alm da cooperatividade positiva.

A figura ilustra a somatria de efeitos


moduladores negativos do 2,3 BPG e
do CO2 (efeito Bohr) sobre a afinidade
da hemoglobina para o oxignio.

50%

Observe como a P50 (presso parcial


de O2 que satura 50% das molculas)
aumenta progressivamente a medida
que os moduladores so adicionados
ao meio.
O efeito Bohr (presena de CO2) e o
2,3-BPG, juntos, diminuem em cerca de
2,6 vezes a afinidade da Hb pelo O2.

Stripped Hb Hb sem nenhum


modulador

Whole blood Hb em sangue total,


com todos seus moduladores

Evoluo das globinas

heme

mioglobina

hemoglobina

Na evoluo das globinas, houve um evento de duplicao gnica, e depois,


divergncia de cada um dos genes atravs de mutaes pontuais, que acabaram
originando as duas cadeias globnicas da atual hemoglobina.

Ontogenia das hemoglobinas humanas

A hemoglobina A (HbA), composta


das cadeias a e b, corresponde a
96-98 % da hemoglobina total de um
adulto.
Um variante normal da hemoglobina
A, correspondente a 2-3% da
hemoglobina total em adultos, a
HbA2, formada por cadeias a e d
(delta), ou seja, a2d2.
No adulto, a Hemoglobina A resulta
da expresso co-dominante de 2
genes que codificam a cadeia b e de
4 genes que codificam a cadeia a.

Existem 17 genes para globinas no


genoma humano.

Durante a vida embrionria e fetal,


diferentes genes para as globinas
so expressos sucessivamente.

Ontogenia das hemoglobinas humanas: 17 genes codificando cadeias globnicas

Hb embrionrias

Hb Portland

z2e2
a2e2
z2g2

Hb Fetal

a2g2

Hb adulto

a2b2
a2d2

Hb Gower 1
Hb Gower 2

idade gestacional
(semanas)

idade ps-natal
(semanas)

O grfico e a tabela mostram a sucesso de diferentes hemoglobinas e a sua composio em


cadeias globnicas presentes no embrio, feto (aps a 12a. semana) e no adulto.
Aps o nascimento, com a represso da sntese da cadeia g e aumento da sntese da cadeia b,
ocorre a troca da HbF pela HbA, que se completa entre o 3o e 4o ms de vida. Nessa fase so
muito importantes os banhos de luz dados na criana, pois estes auxiliam na degradao de
derivados txicos do heme, formados na destruio das hemcias fetais.

A Hemoglobina Fetal (HbF)


A HbF possue cadeias g (gama)
equivalentes cadeia b da HbA, com
10 aminocidos diferentes nas
sequncias primrias dessas globinas.
Uma das substituies importantes
na HbF a posio 82 da cadeia g, que
possui um resduo de serina (polar sem
carga), diferentemente da cadeia b, que
tem lisina (Lys82; com carga positiva)
nessa posio.

Essa substituo resulta numa


ligao mais fraca do 2,3-DPG, que
interage com as globinas por interaes
eletrostticas, HbF.

Como resultado, a HbF apresenta


maior afinidade por O2 do que a HbA
materna, possibilitando a captao de
O2 a nvel da barreira placentria.

Ligao do 2,3-BPG com a hemoglobina A

Hemoglobinopatias

Hemoglobinopatias podem resultar de


mutaes nos genes estruturais das globinas,
ou ainda nos genes reguladores da sntese das
diferentes globinas, que o caso das
talassemias.

42
92 93

145

63

143

23

73
76
79

121

Mutaes pontuais nos genes das globinas


a e b so relativamente frequentes. Em outubro
de 2003 j eram conhecidos mais de 900 tipos
de hemoglobinas anmalas contendo a troca de
1 aminocido na cadeia a ou na cadeia b.
Mutaes duplas, inseres e delees so
casos mais raros.

Como existem 4 alelos de cadeia a e 2 de


cadeia b expressos co-dominantemente, so
conhecidos mais mutantes de cadeia b
(produzem 50 % de Hb anmala) do que de
cadeia a (produo de 25 % de Hb anmala).

A figura acima ilustra posies na sequncia primria de cadeias a ou b para as quais so


conhecidos mutantes pontuais de Hb com alteraes na estabilidade e/ou solubilidade da
protena ou na afinidade por oxignio, que resultam em patologias.
Observe que a grande maioria dessas posies esto em cotovelos da molcula, onde
as a-hlices no existem. Mutantes das histidinas proximal e distal (posies 92 e 63 na
cadeia b, respectivamente), podem resultar em incapacidade de ligar O2.

A tabela mostra exemplos de hemoglobinas anormais que so mutantes pontuais.


Hemoglobina*
Anormal

Resduo Normal
e Posio

Substituio

Cadeia Alfa (4 alelos)


Torino
MBoston
Chesapeake
GGeorgia
Tarrant
Suresnes

Fenilanina 43
Histidina 58
Arginina 92
Prolina 9
Aspartato 126
Arginina 141

Valina
Tirosina
Leucina
Leucina
Asparagina
Histidina

Cadeia Beta (2 alelos)


S
Riverdale -Bronx
Genova
Zurich
MMilwaukee
MHyde Park
Yoshizuka
Hiroshima

Glutamato 6
Glicina 24
Leucina
Histidina 63
Valina 67
Histidina 92
Asparagina 108
Histidina 146

Valina
Arginina
Prolina
Arginina
Glutamato
Tirosina
Aspartato
Aspartato

* Variantes da hemoglobina normalmente recebem o nome do local


geogrfico de origem

Hemoglobinas M apresentam
substituies nas histidinas
proximal ou distal, ou resduos
hidrofbicos do bolso do heme.
Como resultado, nas HbM
ocorre a oxidao do Fe2+a Fe3+,
tornando-as incapaz de ligar O2.
Metahemoglobina uma HbA
normal oxidada a Fe3+, situao
que pode ser causada por
fumaa de cigarro, cianetos, etc.
No confundir metahemoglobina
com HbM.

Hemoglobina S ou falciforme
apresenta uma troca de uma
resduo cido por um apolar,
causando alteraes na
solubilidade da protena, que
passa a ter tendncia de
polimerizar. No h alteraes
na afinidade pelo O2.

Algumas variantes de hemoglobina com importncia clnica

Hemoglobina

Origem
geogrfica

Substituio de
Aminocido

% presente
em
heterozigotos

* Existem outros variantes de HbG de cadeia a. A HbG Philadelphia um variante de


cadeia a que frequentemente traz deleo dos alelos no afetados. Quando no ocorre
deleo, existe ~20% de HbG, com deleo de 1 alelo, ~30% de HbG, e com deleo de 2
alelos, ~40% HbG.
*** HbD Punjab apresenta o mesmo tipo de mutao.
#

No uma mutao pontual e sim um porduto de crossover durante a meiose.

Anemia falciforme e hemoglobina S (HbS)


A HbS apresenta um resduo de valina na posio
6 da cadeia b, no lugar do cido glutmico
presente na HbA.

Hemcia falcmica

Essa troca resulta em alterao da solubilidade da


HbS, que apresenta tendncia de polimerizar
quando desoxigenada, formando fibras que se
depositam dentro da hemcia, deformando-a.
Deformadas, essas hemcias so retiradas de
circulao, causando o quadro anmico.
A figura ao lado uma micrografia de uma fibras
de HbS, que se organizam por polimerizao de
muitas molculas, conforme o esquema abaixo.

Fibra de HbS

Hemoglobina S: a valina na posio 6 da cadeia b da HbS faz interao hidrofbica com


resduos Phe 85 e Leu 88 da cadeia b de outra molcula de HbS, determinando
polimerizao da HbS desoxigenada.
A polimerizao reverte quando a HbS fica 100% saturada. No h alterao
da afinidade por O2, ou seja, o efeito Bohr, a ligao do 2,3-BPG e a cooperatividade
no so afetados.

A Hemoglobina Porto Alegre


Origem geogrfica: regio de So Leopoldo, RS, Brasil
mutao pontual com substituio de Ser por Cys na
posico 9 da cadeia b na regio helicoidal A6
por conter uma cistena a mais, a HbPorto Alegre
apresenta tendncia de polimerizar, fazendo tetrmeros
via pontes S-S a polimerizao baixa in vivo, mas intensa em
hemcias armazenadas (diminuio do poder redutor)

Tetrmero de HbPA

veja artigo e texto complementar para mais informaes.

Microscopia eletrnica de tetrmeros de HbPa