Bilogo Paulo Francisco Naoum

MTODOS DE AVALIAO LABORATORIAL

I) Cromatografia
Cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Fundamenta-se na
migrao diferencial dos componentes de uma mistura. formada por duas fases
imiscveis: uma fase mvel e uma fase estacionria. De acordo com o tipo de fase
mvel e estacionria utilizados as cromatografias podem classificadas em
Cromatografia Gasosa, Cromatografia de Troca Inica e HPLC (sigla de High
Pressure Liquid Chromathography).

Sentido da
migrao

Coluna
Cromatogrfica

Fase
Mvel

Fase
Estacionria

Mistura a ser
separada

a) Cromatografia Gasosa
A cromatografia gasosa consiste na vaporizao (sem que haja decomposio)
da substncia em um gs chamado gs de arraste, e posterior migrao de uma
atravs da coluna de cromatografia; isto , a amostra tem que se dissolver ao
menos em parte, em um gs que participar da composio da fase mvel. Esse
gs deve, obrigatoriamente, ser inerte em relao fase estacionria. Gases
como hidrognio, nitrognio, argnio e hlio so os mais utilizados. As substncias
saem ento da coluna e passam por um detector que gera um sinal proporcional
quantidade de substncia eluda no gs em funo do tempo (anlise
quantitativa). Por exemplo, em uma mistura, cada componente ter sua presso

de vapor caracterstica (volatilidade), assim substncias que forem mais volteis,

ficaro dissolvidas no gs de arraste e passaro mais rapidamente pela coluna
cromatogrfica. Trata-se de uma tcnica muito utilizada pois capaz de separar
substncias com concentraes de nanogramas e at picogramas.
A cromatografia gasosa usada no fracionamento de protenas, enzimas,
peptdeos e aminocidos.

6
2

5
3
1 Reservatrio do gs de arraste (N2 ou H2 ou He ou Ar)
2 Local onde a amostra ser injetada (vaporizao da amostra)
3 Coluna Cromatogrfica
4 Detector
5 Amplificador de sinal
6 Formao do Cromatograma (grfico concentrao de amostra x tempo)

b) Cromatografia Inica
Tambm conhecida como cromatografia de troca inica. Tcnica cromatogrfica
onde a fase estacionria representada por uma resina trocadora de ons. Essa
resina possui em sua composio ons que iro interagir quimicamente com os
ons presentes na soluo da fase mvel.

Coluna
Cromatogrfica

ons da Resina (-)

ons da Soluo (+)

ons da Soluo (-)

Aps a interao dos ons da amostra com a resina, uma soluo chamada
eluente passada pela coluna de cromatografia liberando assim os ons que
estavam interagindo com a resina. O tempo de reteno/separao das diferentes
espcies que determinar a concentrao dos diferentes ons na amostra. Antes
de passar pelo detector, as amostras passam por uma segunda coluna
cromatogrfica, a coluna supressora de eluente, que ir bloquear a deteco de
ons que por ventura possam fazer parte da constituio do eluente e que
poderiam interferir na concentrao inica real da amostra; ou seja, somente os
ons da amostra so encaminhados para anlise. Desvantagens: tcnica de custo
extremamente elevado e que requer mo de obra altamente especializada na
operao do sistema e anlise de dados. usada para fracionar peptdeos,
aminocidos, hemoglobinas e hemoglobina glicada.

c) Cromatografia Lquida de Alta Presso (HPLC)

HPLC: sigla do ingls que significa High Pressure (or Performace) Liquid
Chromatography. Atualmente chamada de Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (CLAE). Possui como caractersticas: a elevada sensibilidade, a alta
velocidade de reao e o grande desempenho com confiabilidade e rapidez na
liberao de resultados. Trata-se de um tipo de cromatografia que utiliza um
lquido como fase mvel, que injetado na coluna cromatogrfica a altas presses
e diferentes tipos de fase estacionria, variando de acordo com aquilo que se quer
analisar. Os constituintes da fase estacionria, em geral se encontram altamente
particionados, o que gera uma separao mais eficiente. Constitui-se de
reservatrios para os reagentes, bombas que propulsionam a fase mvel a altas
presses, injetor de amostra, coluna cromatogrfica e um detector acoplado a um
computador. A tcnica de CLAE (HPLC) a base para o entendimento e
realizao de outras tcnicas como a cromatografia gasosa e de troca inica. A
utilizao de partculas ainda mais finas (0,1 nm) e presses ainda mais elevadas
(15.000 psi) tem gerado o que se chama de CLUE (Cromatografia de Ultra
Eficincia). usada principalmente para fracionar hemoglobinas e hemoglobina
glicada. Pode ser usada para protenas, peptdeos e aminocidos.

Esquema geral de um cromatgrafo.

II) Quimioluminescncia
Tipo de reao qumica, que ao se processar gera energia luminosa. Durante uma
reao qumica, os reagentes se transformam em estados intermedirios
eletronicamente excitados, e ao passarem para um estado de menos excitado,
liberam a energia absorvida na forma de luz. O composto qumico Luminol, um
dos representantes mais conhecidos da quimioluminescncia. Quando em contato
com o sangue, por exemplo, utiliza o ferro da hemoglobina como catalisador para
a reao de liberao de luz. Esse composto muito usado em percia criminal,
quando se quer investigar a presena de vestgios de sangue em uma cena de
crime. Mesmo que o local tenha sido limpo, o luminol evidencia a presena do
sangue.
Laboratorialmente, hormnios, drogas e microorganismos podem ser identificados
por testes colorimtricos. Tais mtodos utilizam-se de anticorpos ligados a um
marcador luminescente (cromgeno) que pode ser o prprio luminol ou mais
modernamente derivados de acridina, sistema avidina-biotina, entre outros.

III) Colorimetria
Mtodo de anlise quantitativa que se baseia na comparao da cor produzida por
uma reao qumica com uma cor padro. De acordo com a intensidade da cor
produzida, infere-se a concentrao do determinado analito (substncia que se
quer analisar). O mtodo mais seguro de se verificar a colorao de uma reao
atravs do uso do espectrofotmetro, que compara a intensidade de cor com uma
cor padro, chamada de branco (soluo padro em que o espectrofotmetro
zerado). o mtodo mais usado em anlises laboratoriais de bioqumica clnica.
IV) Cintico
Geralmente utilizado em reaes em que o analito uma enzima. A atividade da
enzima analisada por meio da reao dela com um composto qumico
denominado substrato. Essa reao gera um produto. Em geral, a reao
acoplada a uma reao colorimtrica: medida que a converso enzimtica se
processa e o produto gerado, h mudana de cor que deve ser observada em
espectrofotmetro. Leituras sucessivas em intervalos de tempos iguais devem ser
feitas. Aos valores obtidos na leitura espectrofotomtrica deve-se aplicar fatores
de correo que variam de acordo com o exame a ser realizado.

Substrato

analito (enzima)

Produto (reao colorimtrica)

V) Cintico Enzimtico:
Muito semelhante ao mtodo cintico, porm o analito no uma enzima e sim o
substrato que ser utilizado por uma enzima especfica. O produto dessa primeira
reao enzimtica pode ento ser captado por outra(s) enzima(s) que est
acoplada a uma reao colorimtrica, de liberao de gs ou formao de
precipitado.

enzima 1

Analito (substrato)
Produto 1

enzima

Produto 1
Produto Final

reao colorimtrica;
liberao de gs ou
formao de ppt

Obs.: podem haver outras enzimas entre o produto 1 e o produto final.

VI) Radioimunoensaio (RIA Radio Imuno Assay)
Baseia-se na competio de um antgeno presente na amostra em anlise com
um antgeno marcado com istopo radioativo pelo mesmo anticorpo. A
concentrao do antgeno em anlise ser inversamente proporcional radiao
emitida. Trata-se de uma tcnica com alta especificidade e sensibilidade, porm
com elevado custo e grande risco operacional por manipular material radioativo.

Esquema mostrando como funciona o Radioimunoensaio

VII) Imunodifuso Radial

Trata-se de uma tcnica de difuso de antgeno e anticorpo seguida de
precipitao. Ao se adicionar um antgeno solvel com um anticorpo tambm
solvel forma-se um agregado antgeno-anticorpo que insolvel e sofre
precipitao.
a) Imunodifuso Dupla de Ouchterlony:
Utiliza como meio de difuso o gel de agarose. Antgeno e anticorpo se difundem
em todas as direes. Ao se encontrarem forma-se uma linha de precipitao.
de grande utilidade na identificao de microrganismos patognicos e auto
anticorpos em doenas auto-imunes. Porm somente pode ser utilizada em
reaes antgeno-anticorpo que formem precipitado, e requer grande tempo para
que ocorra a difuso e precipitao (at 24 horas).

b) Imunodifuso Radial de Mancini:

Mtodo realizado em gel de agarose com anti-soros especficos j incorporados
ao gel. As amostras so aplicados em poos circulares j feitos no gel. medida
que a difuso ocorre, a reao antgeno-anticorpo forma anis de precipitao e a
concentrao de antgeno proporcional ao raio do anel de precipitao. Ao medir
o dimetro do crculo de precipitado, utiliza-se com uma tabela contendo os
valores de dimetro relacionados com a concentrao de antgeno.

X mg/dL

Y mg/dL

Z mg/dL

Esquema mostrando os anis de precipitao (reao antgeno-anticorpo) pelo

mtodo de Imunodifuso Radial de Mancini. No caso, as concentraes so
X < Y < Z.

VIII) Hemaglutinao (HA)

Reao que gera agregao de eritrcitos devido presena de anticorpos (ou
vrus ou lecitinas). Hemcias sensibilizadas por antgenos especficos para um
patgeno so usadas para testar o soro do paciente. Quando na ausncia de
agente hemaglutinante (anticorpo), as hemceas sedimentam na forma de boto e
quando h aglutinao as hemceas sedimentam na forma de tapete (difusa).
IX) Fluorescncia e Imunoflorescncia (IF)
Fluorescncia um processo onde um elemento chamado fluorocromo absorve
energia na forma de espectro luminoso, tornando-se eletricamente excitado; ao
liberar essa energia emitem luz num comprimento de onda especfico. A
imunofluorescncia uma tcnica baseada na ligao de anticorpos com
fluorocromos. A imunofluorescncia pode ser direta ou indireta. Na IF direta
detecta-se o antgeno pesquisado propriamente dito: coloca-se a amostra a ser
analisada numa placa especifica para fluorescncia, a seguir, adiciona-se o
conjugado (anticorpo especfico marcado com fluorocromo). Na IF indireta a placa
de fluorescncia j vem com antgenos especficos, testa-se o soro do paciente e
depois adiciona-se um anti-anticorpo marcado com fluorocromo.

Ex.:
IFD

Amostra a ser pesquisada

(bipsia de tumor por exemplo)

adio do anticorpo marcado

Revelao

IFI
adio do soro contendo
anticorpos do paciente

Placa contendo antgenos especficos

Adio do
anti-anticorpo
Revelao

X) Nefelometria e Imunoturbidimetria
A Nefelometria uma tcnica para medir as concentraes de Ig A, Ig M e Ig G e
outras protenas plasmticas de uma amostra. Um aparelho especfico que mede
a turbidez utilizado e mede a difrao (desvio) da luz ao passar por uma soluo
contendo complexos imunolgicos.
J a Imunoturbidimetria mede a diminuio da luz ao passar por um complexo
antgeno-anticorpo, em outras palavras, a turbidimetria mede o quanto a soluo
antgeno-anticorpo absorve da luz e o quanto ela deixa passar. Essa tcnica,
assim como a nefelometria, usada para medir a concentrao plasmtica de
diversas protenas.

A principal diferena entre nefelometria e turbidimetria que na nefelometria a luz

difundida ou seja aquela que atravessa a soluo medida, enquanto que na
turbidimetria a luz no difundida (a absorvida) medida.

XI) ELISA (Enzime Linked Immuno Sorbent Assay)

Tambm chamado teste ou ensaio imunoenzimtico. Consiste num anticorpo
conjugado a uma enzima capaz de modificar um cromgeno, atravs da reao
com seu substrato especfico, gerando coloraes diferentes de acordo com o
cromgeno:

Substrato
da enzima
E

Substrato
modificado
Oxida o
cromgeno

Cromgeno incolor
Cromgeno colorido

enzima
Existem vrios tipos de ELISA: os para pesquisa de antgenos, onde as placas
contm anticorpos especficos; o ELISA para pesquisa de anticorpos, em que as
placas esto sensibilizadas por antgenos, a pesquisa feita atravs da amostra
contendo anticorpos e evidenciada pela adio de um anti-anticorpo marcado
(anticorpo 2rio); os testes por competio dentre outros.
XII) Eletroquimioluminescncia
Utiliza a emisso de luz atravs da aplicao de potenciais de oxidao ou
reduo a um eletrodo imerso em solues que emitem radiao (em geral
compostos de rutnio). Dentre os mtodos automatizados mais utilizados
encontra-se o Elecsys da Roche Diagnstica que utiliza micropartculas revestidas
de estreptavidina, anticorpo monoclonal especfico biotinilado e um anticorpo
monoclonal especfico para cada analito. Essa mistura fixada magneticamente
na superfcie do eletrodo e o que no se fixar removido. Por fim, h uma
aplicao de corrente eltrica no eletrodo que induz uma emisso
quimioluminescente, medida por um fotomultiplicador.

XIII) Imunofluorimetria
Tcnica basicamente automatizada que utiliza, em geral, anticorpo marcado com
fluorocromo (rodamina, fluorescena e eurpio so os mais utilizados). Caso a
reao seja positiva ocorre a associao do fluorocromo (aps lavagens
sucessivas) com uma soluo amplificadora de fluorescncia e conseqente
emisso de luz fluorescente, que intensa porm pouco duradoura, da a
necessidade de automao.

XIV) Espectrofotometria de Absoro Atmica

Tcnica analtica que se baseia na absoro de radiao eletromagntica por
tomos gasosos no estado fundamental. um mtodo de anlise usado para
determinar qualitativamente e quantitativamente a presena de metais.
O mtodo consiste em determinar a presena e quantidade de um determinado
metal em uma amostra qualquer, usando como princpio a absoro de radiao
ultravioleta por parte dos eltrons que, ao sofrerem um salto quntico depois de
devidamente excitados por uma chama de gs acetileno a 3000 graus celsius,
esses devolvem a energia recebida para o meio, voltando assim para a sua
camada orbital de origem. A energia devolvida na forma de um fton de luz, por
sua vez, absorve a radiao ultravioleta emitida pela fonte especfica (ctodo oco)
do elemento qumico em questo. Dessa forma, eltrons que esto contidos na
amostra, e que sofrem tambm um salto quntico e que no pertencem ao mesmo
elemento que constitui o ctodo oco que est sendo usado no momento, no
sero capazes de causar uma interferncia, isso porque eles absorvero apenas
radiao com comprimento de onda referente ao elemento qumico do qual fazem
parte.

XV) on Seletivo ou Potenciometria

Um eletrodo de on seletivo um sensor (ou um transdutor) capaz de converter a
atividade de um on presente numa soluo em um potencial eltrico que ento
captado por um voltmetro ou medidor de pH. So necessrios um eletrodo
especfico para o on que se quer testar (Ca, K, Na...) e um eletrodo de referncia;
ambos so imersos na soluo a ser analisada e a atividade do on diretamente
proporcional voltagem medida pelo voltmetro. A partir da atividade do on, por
meio de clculos matemticos, pode-se obter a concentrao do on na amostra.

XVI) Qumica Seca

Processo em que no existe despejo de resduos contaminados no meio
ambiente, pois no utiliza gua na execuo dos exames. Os reagentes ficam
dispostos em 6 camadas numa placa de vidro e medida que a amostra vai
passando por elas, as reaes qumicas vo se procedendo. Os dejetos
produzidos ficam contidos nas placas de vidro que podem ser autoclavados ps
uso. Requer pequena quantidade de amostra (cerca de 10 L), calibragem
reduzida (apenas 2 por ano), alta taxa de preciso e rapidez e cobre cerca de 95%
dos testes laboratoriais em bioqumica. A anlise se d por reflectncia (processo
luminoso): os reagentes so dispostos em multicamadas nas lminas de vidro e
medida que a amostra entra em contato com as lminas, ocorrem reaes em
multicamadas e a luz incidida transformada em voltagem que gera o resultado
solicitado. O Sistema Vitros da Johnson & Johnson Produtos Profissionais um
dos mais utilizados no processo.