METODE PENENTUAN KANDUNGAN ASAM-ASAM LEMAK PADA MINYAK BIJI

KENARI, RAMI, DAN OPIUM OLEH HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAFI / KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI) DISERTAI PROSES
ENZIMATIK LIPASE

OLEH
DERI FEBIOLA PUTRA
110520

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PADANG
2013

ABSTRAK
Makalah ini akan membahas prosedur analisis kuantitatif untuk menentukan kompisisi asam
lemak dalam minyak biji rami (linseed), kenari (walnut), opium (poppy). Prosedur ini
membutuhkan hidrolisis enzimatik minyak (triasilgliserol) oleh Candida rugosa lipase. Asam
lemak (FFA) yang dihasilkan berupa (linolenic, myristic, linoleic, palmitic, oleic, dan stearic)
diamana diekstraksi dengan n-heptana dan diturunkan dengan -bromoacetopherone. Pemisahan
asam lemak dan penentuannnya dilakukan oleh HPLC dengan menggunakan kolom C18 dan
metode elusi isokratik yang digabungkan dengan deteksi UV. Prosedur ini sensitif pada <0.5
mg/ml asam lemak untuk sampel 0.1 mg minyak. Prosedur ini juga dibandingkan dengan kolom
HPLC yang lain dan sesuai dengan sampel FFA.

DAFTAR ISI

ABSTRAK......................................................................................................................................................................I
DAFTAR ISI.................................................................................................................................................................II
DAFTAR TABEL.......................................................................................................................................................III
DAFTAR GAMBAR..................................................................................................................................................IV
BAB I. PENDAHULUAN.............................................................................................................................................1
A.
B.

LATAR BELAKANG.......................................................................................................................................1
BATASAN MASALAH...................................................................................................................................1

BAB II. TINJUAN PUSTAKA.....................................................................................................................................2

A.
B.
C.
D.
E.
F.

TUMBUHAN KENARI, RAMI, DAN OPIUM..............................................................................................2

LIPID DAN ASAM LEMAK...........................................................................................................................3
HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAFI/KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI)...........................................................................................................................................................6
FASA DIAM DAN GERAK KROMATOGRAFI PARTISI KINERJA TINGGI............................................9
PRINSIP DETEKTOR ULTRA VIOLET (UV).............................................................................................10
HIDROLISIS DAN TURUNAN ASAM LEMAK.........................................................................................11

BAB III. METODOLOGI PENELITAN..................................................................................................................13

A.
B.
C.
D.

INSTRUMEN DAN BAHAN........................................................................................................................13

KONDISI ANALISIS.....................................................................................................................................13
STANDARISASI DAN LARUTAN..............................................................................................................14
PREPARASI SAMPEL..................................................................................................................................14

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................................................................................15

A.
B.
C.
D.

KALIBRASI LARUTAN STANDAR ASAM LEMAK BEBAS..................................................................15

KONDISI HYDROLISIS...............................................................................................................................15
PENENTUAN KUANTITATIF.....................................................................................................................16
PEMILIHAN FASA KOLOM........................................................................................................................19

BAB V. PENUTUP......................................................................................................................................................21
KESIMPULAN........................................................................................................................................................21
DAFTAR PUSTAKA..................................................................................................................................................22

ii

DAFTAR TABEL
Tabel 1. Asam Lemak yang Banyak Ditemukan dalam Lipid..................................................5
Tabel 2. data kalibrasi larutan standar.....................................................................................15
Tabel 3. kandungan asam lemak dalam minyak setelah hidrolisis.........................................19

iii

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. tumbuhan opium........................................................................................................2
Gambar 2. tumbuhan rami...........................................................................................................3
Gambar 3. tumbuhan kenari........................................................................................................3
Gambar 4. kolom kromatografi...................................................................................................7
Gambar 5. Kurava jarak migrasi Vs konsentrasi......................................................................7
Gambar 6. kurva waktu Vs sinyal detektor................................................................................8
Gambar 7. komponen HPLC........................................................................................................8
Gambar 8. reaksi organologam fasa diam...................................................................................9
Gambar 9. prinsip analisis UV...................................................................................................11
Gambar 10. reaksi hidrolisis oleh enzim lipase.........................................................................12
Gambar 11. kurva hidrolisis minyak kenari oleh lipase (pembentukan asam linoleat dalam
%)...........................................................................................................................................16
Gambar 12. kromatogram campuran asam lemak standar....................................................16
Gambar 13. kromatogram asam lemak setelah hidrolsis enzimatik minyak biji rami.........17
Gambar 14. kromatogram asam lemak setelah hidrolisis enzimatik minyak kenari ...........18
Gambar 15. kromatogram asam lemak setelah hidrolisis enzimatik minyak biji opium.....18
Gambar 16. model molekul fasa alkil........................................................................................20
Gambar 17. model molekul fasa alkil termodifikasi................................................................20
Gambar 18. model molekul fasa fenil dan bifenil.....................................................................21

iv

BAB I. PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Minyak telah banyak digunakan selama bertahun-tahun di berbagai bidang seperti bahan
dasar parfum, medis, kosmetik, dimana minyak khususnya digunakan sebagai medium pigment
pada cat. Minyak terdiri dari campuran triasilgliserol, dimana ester terbentuk dari satu molekul
gliserol dengan tiga molekul asam lemak. Asam lemak yang ditemukan umumnya mono-tak
jenuh (monounsaturated) atau mempunyai satu ikatan rangkap, seperti asam oleic (18:1), dan
polyunsaturated, seperti asam linoleic (18:2) dan linolenic (18:3), dan juga mengandung asam
lemak jenuh seperti asam palmitat dan stearat (Mills, 1966).
High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai kelebihan diantaranya:
kesensitifannya

sehingga

mudah

digunakan

untuk

turunan

asam

lemak,

seperti

nitrofenilhidrasida dan 4-bromometil-7-metoksikumarin dan mempunyai variasi kolom yang

sesuai dengan kebutuhan. Selain itu mempunyai kelebihan dalam pemisahan turunan asam
lemak tidak hanya berdasarkan panjang rantai tetapi juga derajat ketakjenuhan dan posisi ikatan
rangkap dua terminal (Chen & Chuang, 2002).
Enzim lipase, dimana telah digunakan sebagai katalis yang sangat bagus dan murah untuk
mendegradasi lipid (Houde, Kademi, & Leblanc, 2004). Lipase sangat sesuai karena mengkatalis
hampir semua hidrolisis lemak/minyak menjadi asam lemak dan gliserol pada temperatur
dibawah 40oC (Tarola, Girelli, & Lorusso, 2012).
B. BATASAN MASALAH
Batasan masalah pada makalah ini adalah menjelaskan metode analisis yang relatif
sederhana dan tersedia untuk mempelajari asam lemak yang terkandung dalam minyak kenari,
rami dan opium. Asam lemak diperoleh secara enzimatik. Asam lemak yang terbentuk lalu
diturunkan dengan bromoasetofenon dan pemisahan kromatografi menggunakan sistem HPLC
fasa balik dan detektor ultraviolet (UV) untuk analisis kuantitatif. Metode HPLC ini
menggunakan kolom C18 yang juga akan dibandingkan dengan jenis kolom yang lain secara
teoritis. Candida Rugosa telah dipilih sebagai mikroba penghasil lipase dari fermentasi karena
dapat menghidrolisis semua minyak menjadi asam lemak tanpa syarat tertentu.
1

BAB II. TINJUAN PUSTAKA

A. TUMBUHAN KENARI, RAMI, DAN OPIUM
Minyak telah banyak digunakan selama bertahun-tahun di berbagai bidang seperti bahan
dasar parfum, medis, kosmetik, dimana minyak kacang khususnya digunakan sebagai medium
pigment pada cat. Minyak terdiri dari campuran triasilgliserol, dimana ester terbentuk dari satu
molekul gliserol dengan tiga molekul asam lemak tak jenuh dengan panjang yang bervariasi.
Adapun pada makalah ini akan dibahas tiga macam minyak yang masing berasal dari biji kenari
(Juglans nigra L.), rami (Linum usitatissimum L.) dan opium (Papaver somniferum).

1. Tumbuhan opium
Gambar tumbuhan opium dapat dilihat di bawah ini.

Gambar 1. tumbuhan opium

Papaver somniferum atau yang biasa disebut opium poppy mempunyai bunga berbentuk
panjang, permukaan halus, menghasilkan tepung, mempunyai lima mahkota dengan warna
putih, violet dan ungu. Tumbuhan opium mempunyai kelopak berbentuk globular dengan
warna hijau dengan bagian atas mirip bukit-bukit dan berisi biji. Kelopak yang belum matang
menhasilkan latex yang mengandung opium (Papaver somniferum, 2004).
2. Tumbuhan rami
Tumbuhan rami Linum usitatissimum L. (linseed dalam bahasa inggris) merupakan keluarga
linacae diamana tumbuhan ini mempunyai biji yang berwarna coklat atau kuning. Biji ini
mengandung 35-45% minyak dan 18-26% protein, morfologi tumbuhan rami dapat dilihat
pada gambar dibawah ini (Agriculture, Fisheries, & Forestry, 2012).

Gambar 2. tumbuhan rami

3. Tumbuhan kenari
Tumbuhan kenari Juglans nigra L. Meruapakan keluarga dari Juglandaceae. Tumbuhan ini
mempunyai habitat berupa tanah yang lembab dengan biji berwarna gelap. Gambar
tumbuhan da biji kenari dapat dilihat pada gambar dibawah ini (Juglans nigra, n.d.)

Gambar 3. tumbuhan kenari

B. LIPID DAN ASAM LEMAK

Lipid adalah zat yang termasuk senyawa heterogen yang terdapat dalam jaringan tanaman
dan hewan, mempunyai sifat tidak larut dalam air dan larut dalam pelarut organik seperti
ether, kloroform dan benzena. Salah satu kelompok yang berperan penting dalam nutrisi
adalah lemak dan minyak. Lemak tersimpan dalam tubuh hewan, sedangkan minyak tersimpan
dalam jaringan tanaman sebagai cadangan energi.
3

Dalam analisis proksimat Weende, yang disebut lipida atau dalam kepentingan
nutrisi disebut lemak kasar (ether extract) adalah semua bahan (baik makanan ataupun
jaringan) yang dapat diekstraksi dengan eter.
lemak,

sekarang

Ekstrak eter yang selanjutnya disebut

lazim disebut trigliserida atau ester

Perbedaan lemak dan minyak adalah minyak dalam

sedangkan lemak berbentuk semi padat.
kebanyakan merupakan lemak netral.

lemak murni dari gliserol.

suhu k a m a r berbentuk cair

Lemak nabati (biji-bijian) dan lemak hewan

Meskipun demikian bahan-bahan nabati selain biji-

bijian umumnya mengandung banyak sekali lipida kompleks dan pigmen-pigmen yang
dapat diekstraksi dengan eter, tetapi tidak menghasilkan energi (Llyod, L.E., B.E. Mc. Donald,
1978).
Lemak dan minyak didefinisikan sebagai esterisasi dari campuran trihidroksialkohol
(gliserol) dan tiga molekul (R1, R2 dan R3 ) asam lemak (trigliserida).

Asam lemak adalah penyusun sebagaian besar lipid. Walaupun lebih dari 100 asam
lemak diketahui terdapat di alam, namun yang berperan dalam nutrisi terutama dalam
bentuk lemak (fat).
Asam-asam lemak terdiri dari sebuah gugusan tunggal COOH dan sebuah rantai
karbon lurus tidak bercabang dengan formula umum CH3(CH2)nCOOH , misalnya :
n = 0 adalah asam asetat
n = 1 adalah asam propionat
n = 2 adalah asam butirat dan seterusnya sampai n = 24
Asam lemak dapat digolongkan menjadi dua, yaitu :
1. Asam lemak saturated (jenuh) yaitu asam lemak ikatan tunggal atau tidak ada ikatan
rangkap.

Penamaannya

memakai

sufiks-anoic

atau-anoat.

Formula

dapat

disederhanakan menjadi : CnH2nO2

4

2. Asam lemak unsaturated (tak jenuh) yang mengandung ikatan rangkap, terdiri dari
a. Ikatan rangkap tunggal yang disebut dengan asam lemak mono unsaturated.
Penamaannya memakai sufiks -dienoic atau - dienoat.
b. Lebih dari satu ikatan rangkap yang yang disebut asam lemak polyunsaturated
(PUFA). Penamaannya memakai sufiks -trienoic (3 ikatan rangkap) atau -trienoat,
dsb.
Tingkat kejenuhan berpengaruh terhadap sifat-sifat fisik dan susunan lemak, biasanya
asam lemak unsaturated adalah lebih reaktif dan mempunyai titik cair lebih rendah
dibandingkan asam lemak saturated.
Lokasi

ikatan

rangkap

pada

rantai karbon

dari

asam

lemak unsaturated

menyebabkan perbedaan besar bagaimana asam lemak tersebut dimetabolisme. Pada dasarnya
kelompok asam lemak polyunsaturated (PUFA) dapat dibagi kedalam 3 kelompok besar
yaitu seri oleic (0-9), seri linoleic (0-6) dan seri linolenic (0-3), ketiga jenis asam lemak
tersebut merupakan anggota kelompok dengan rantai terpendek, sedangkan jenis asam
lemak yang lain diturunkan dari ketiga kelompok tersebut. 0-9 artinya ikatan rangkapnya
terletak pada C ke-9 dan kelipatannya.

Untuk lebih jelasnya contoh dari asam lemak

saturated dan unsaturated serta penulisannya disajikan dalam Tabel 1.

Tabel 1. Asam Lemak yang Banyak Ditemukan dalam Lipid
Asam lemak

Formula

Simbol

Titik cair

Saturated
Butirat (butanoic)

C4H8O2

C4:0

-4,3

Caproic

C6H12O2

C6:0

-2

(hexanoic)

C8H16O2

C8:0

16,5

Caprilat (octanoic)

C10H20O2

C10:0

31,4

Caprat (decanoic)

C12H24O2

C12:0

44

Laurat(dodecanoic

C14H28O2

C14:0

58

C16H32O2

C16:0

63

C18H36O2

C18:0

71,5

Myristat(tetradecanoic
)

Unsaturated

C16H30O2

Palmitoleat(hexadecenoic

C18H34O2

C16:1

1,5

) Oleat (octadecenoic)

C18H34O2

C 18 : 1w9

16,3

Linoleat (octadecacenoic)

C18H34O2

C 18 : 2w6

16,3

Linolenat(hexadecacenoic

C18H34O2

C 18 : 2w3

16,3

)Arakidonat(eicosatetraec

C18H34O2

C 20 : 4w6

16,3

enoic)
Ket : C4 : 0 : 4 atom C, tanpa ikatan rangkap
W : ikatan rangkap dihitung dari gugus metil terminal Posisi w yang sama, famili
sama, contoh C 20 : 4w6 dapat disintesis dari C 18 : 2w6
C. HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAFI/KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI)
High performance liquid chromatografi, HPLC adalah salah satu tipe kromatografi yang fasa
mobilnya berupa liquid dan fasa diamnya padatan yang sangat halus. Untuk memperoleh laju alir
yang baik , liquid/cairan harus diberi tekanan beberapa ratus atau lebih pound per inchi kuadrat
(Skoog, West, Holler, & Crouch, 2004).
1. Prinsip Pemisahan Kromatografi
Kromatografi adalah metode umum yang digunakan untuk memisahkan, identifikasi, dan
menentukan komponen kimia dalam campuran yang kompleks. Kromatografi adalah pemisahan
campuran komponen berdasarkan perbedaan laju dimana komponen tersebut dilewati melalui
fasa diam oleh fasa gerak cair atau gas. Fasa diam pada kromatografi adalah tempat yang tetap
yang berada dalam kolom atau permukaan bidang datar. Fasa mobil/gerak pada kromatografi
bergerak melalui fasa diam, membawa campuran analit. Fasa gerak bisa berupa gas, cairan atau
cairan superkritikal (Skoog et al., 2004).
a. Elusi pada kolom kromatografi
Elusi adalah proses dimana solut melalui fasa diam disebabkan oleh pergerakan fasa gerak.
Fasa mobil yang keluar dari kolom disebut eluate. Proses elusi dapat dilihat pada gambar 1
dibawah ini (Skoog et al., 2004).

Gambar 4. kolom kromatograf

Eluent adalah pelarut yang digunakan untuk membawa komponen campuran untuk melalui
fasa diam. Kromatogram adalah hubungan dari beberapa fungsi dari konsentrasi solut dengan
waktu elusi atau volume elusi, ini berguna untuk analisis kuantitatif dan kualitatif (Skoog et al.,
2004).
b. Laju migrasi dari solut
Efektifitas kolom kromatografi dalam memisahkan dua solut tergantung pada dimana laju
relatif dari dua spesies terelusi. Laju migrasi ini ditentukan oleh rasio konsentrasi solut dalam
masing-masing dua fasa. Contohnya pemisahan campuran A dan B dimana pada t 1 campuran
mulai terpisah sedangkan pada t2 campuran A dan B sudah terpisah sempurna. Hubungan antara
waktu dan rasio konsentrasi dapat dilihat pada gambar 2 (Skoog et al., 2004).

Gambar 5. Kurava jarak migrasi Vs konsentrasi

c. Waktu retensi

Waktu retensi tR adalah waktu yang berada diantara injeksi sampel dan timbulnya puncak dari
solute pada detektor dari sebuah kolom kromatografi. Waktu mati (dead time) tM adalah waktu
yang dibutuhkan bagi spesi yang tidak tertahan (unretained) untuk melalui kolom kromatografi.
Semua komponen menghabiskan semua waktunya pada fasa mobil. Pemisahan berdasarkan
perbedaan waktu tS dimana komponen berada fasa diam. Hubungan antara ketiga waktu ini dapat
dilihat pada gambar 3 (Skoog et al., 2004).

Gambar 6. kurva waktu Vs sinyal detektor

2. Instrumentasi
Komponen-komponen dan sistematika HPLC dapat dilihat pada gambar berikut ini (Skoog et
al., 2004).

Gambar 7. komponen HPLC

a. Sistem penanganan penampungan fasa gerak dan pelarut

Sparging adalah sebuah proses dimana gas dibuang pada pelarut oleh gelembung
gelembung yang berasal dari gas inert yank tak larut. Elusi Isokratik pada HPLC adalah
diamana komposisi pelarut dalam keadaan konstant. Elusi gradient adalah dimana
komposisi pelarut berubah-ubah secara kontiniu atau dalam bertahap-tahap.
b. Kolom untuk HPLC
Packing kolom yang paling umum untuk liquid kromatografi adalah dari partikel silika,
yang disentesis oleh submikron agglomerasi pertikel silika yang membuat partikel silika
8

menjadi lebih besar dengan ukuran diameter yang sangat seragam. Partikel yang
dihasilkan biasanya dilapisi dengan lapisan tipis organik, dimana secara kimia atau fisika
terikat pada permukaan. Material packing lainnya termasuk partikel alumina, partikel
polimer yang berpori dan resin ion exchange. Kolom yang digunakan pada metode ini
adalah kolom C18.
c. Detektor
Detektor yang paling biasa digunakan untuk liquid kromatografi adalah berdasarkan
absorpsi ultra violet atau radiasi visible/tampak.
D. FASA DIAM DAN GERAK KROMATOGRAFI PARTISI KINERJA TINGGI
Pada kromatografi partisi liquid-liquid, fasa diamnya adalah pelarut yang tertahan oleh
adsorpsi pada permukaan partikel packing di dalam kolom. Penentuan komposisi asam lemak
pada minyak menggunakan fasa balik. Penjelasan tentang packing kolom kromatografi partisi,
yaitu (Skoog et al., 2004):
Dalam kromatografi partisi fasa terikat liquid, fasa diam adalah spesi organik yang
terpasang pada permukaan partikel packing yang disebabkan oleh ikatan kimia. Ikatan ini disebut
ikatan organologam dimana atom logam terikat langsung dengan atom karbon. Reaksi
pembentukan fasa ini adalah sebagai berikut.

Gambar 8. reaksi organologam fasa diam

Packing fasa normal dan fasa balik

kromatografi partisi dapat dibedakan berdasarkan kepolaran relatif dari fasa mobil dan
diam. Liquid kromatografi yang berdasarkan fasa diam yang bersifat polar sangat tinggi seperti
trietilen glikol atau air, mempunyai pelarut yang relatif nonpolar seperti hexane atau 1-propil eter
yang selanjutnya menjadi fasa mobil. Tipe kromatografi ini sekarang disebut kromatogarfi fasa
normal.
Pada kromatografi fasa balik, fasa diam adalah nonpolar, biasanya hidrokarbon dan
fasa geraknya adalah pelarut yang relative polar seperti air, metanol, acetonitril, atau
tetrahidrofuran.
9

Pada kromatografi fasa normal komponen yang kurang polar akan terelusi terlebih
dahulu. Bertambahnya kepolaran dari fasa mobil akan menurunkan waktu elusi. Kontras dengan
itu, kromatografi fasa balik, komponen yang paling polar akan terelusi terlebih dahulu, dan
naiknya kepolaran fasa mobil akan bertambahnya waktu elusi. Hal ini telah diperkirakan bahwa
lebih dari tiga perempat dari pemisahan oleh HPLC adalah berdsarkan fasa balik, contohnya
ikatan oktil- atau oktildekil-siloxane (kolom C18). Rantai panjang dari gugus hidrokarbon
terletak paralel dengan yang lain dan tegak lurus dengan permukaan partikel, seperti bentuk
sikat, sehingga bersifat polar. Fasa mobil pada packing ini umumnya larutan berair yang
mengandung konsentrasi yang berbeda-beda seperti metanol, acetonitril atau tetrahydrofuran.
Fasa mobil
Partisi yang sukses dari kromatografi membutuhkan keseimbangan gaya intermolekular
yang sesuai dari 3 partisipan pada proses pemisahan yaitu, analit, fasa mobil dan fasa diam.
Gaya-gaya intermolekular ini dideskripsikan secara kualitatif dalam istilah kepolaran relatif pada
setiap tiga komponen tersebut. Umumnya kepolaran dari gugus-gugus fungsional organik yang
biasa dijumpai meningkat pada urutan berikut; alifatik hydrokarbon <olefin <aromatik
hydrokarbon <halida <sulfida <eter <senyawa nitro <ester aldehid keton <alkohol amina
<sulfona <sulfoxida <amida <karboksilat <air (Skoog et al., 2004).
sebagian besar pemisahan kromatografi dicapai dengan mencocokkan kepolaran analit
dengan fasa diamnya; fasa gerak yang digunakan dipertimbangkan dengan kepolaran yang
berbeda. Prosedur ini umumnya lebih sukses dari pada mencocokkan kepolaran analit dengan
fasa mobil. Jika kepolaran analit jauh berbeda dengan fasa diam, sehingga waktu retensi sangat
singkat dan situasi yang lebih ekstrim jika kepolaran fasa diam dan analit hampir sama, maka
waktu retensi akan menjadi sangat lama (Skoog et al., 2004).
E. PRINSIP DETEKTOR ULTRA VIOLET (UV)
Absorpsi radiasi
Hukum absorsi, yang juga dikenal dengan beer-lambert law (beers law), menjelaskan
jumlah pelemahan energi radiasi (cahaya) oleh konsentrasi molekul penyerap dan panjang daerah
dimana absorpsi terjadi. Semakin panjang medium yang dilalui oleh cahaya maka semakin

10

banyak penyerapan dan semakin besar pelemahannya, juga apabila semakin tinggi konsentrasi
penyerap maka semakin kuat pelemahan energi.

Gambar 9. prinsip analisis UV

Transmitan T adalah fraksi energi radiasi yang dilewatkan/diteruskan oleh larutan.

Absorban A berhubungan dengan bentuk logaritma dari T (Skoog et al., 2004).

F. HIDROLISIS DAN TURUNAN ASAM LEMAK

Lipase merupakan enzim yang memiliki peran yang penting dalam bioteknologi modern.
Banyak industri yang telah mengaplikasikan penggunaan enzim sebagai biokatalis. Lipase
terkenal memiliki aktivitas yang tinggi dalam reaksi hidrolisis dan dalam kimia sintesis. Lipase
dapat berperan sebagai biokatalis untuk reaksi reaksi hidrolisis, esterifikasi, alkoholisis,
asidolisis and aminolisis. Candida yang merupakan organisme yang paling sering dipakai
sebagai sumber sintesis penghasil lipase (Hermansyah et al., n.d.).
Contoh Reaksi hidrolisis pada minyak zaitun

Skema reaksi ditunjukkan pada Gambar dibawah.

11

Gambar 10. reaksi hidrolisis oleh enzim lipase

12

BAB III. METODOLOGI PENELITAN

A. INSTRUMEN DAN BAHAN
Instrumen HPLC memiliki peralatan:
1. Pompa (model LC10AT dan FCV-10al)
2. Degasser DGU-14A (schimadzu, tokyo, japan)
3. Detektor UV-vis model L-4250 (merk Hitachi, LTD tokyo, japan)
4. Akuisisi data model Apex CSW 32 dengan PC (prague, republik ceko)
5. Kolom fasa balik supelcosil LC18 (15 cm x 4.6 mm, ukuran partikel ID 3 m)
Bahan dan reagen:
1. Linolenic acid (18:3) (9,12,15-octadecatrienoic)
2. Myristic acid (14:0) (tetradecanoic acid)
3. Linoleic acid (18:2) (9,12-octadecadienoic)
4. Palmitic acid (16:0) (hexadecanoic)
5. Oleic acid (18:1) (9-octadecenoic)
6. Stearic acid (18:0) (octadecanoic)
7. Acetonitril
8. bromofenasil bromida >99 %
9. trietilamin 99%
10. n-heptana >99 %
11. asam asetat
12. Na2HPO4
13. NaH2PO4
14. Ultra pure water
15. Enzim lipase
16. Minyak biji rami, kenari, opium
B. KONDISI ANALISIS
Absorbansi senyawa terlarut diukur pada panjang gelombang 242 nm. Fasa geraknya adalah
adalah acetonitril-air 85-15 (v/v) pada laju alir 1mL/min.

13

C. STANDARISASI DAN LARUTAN

Larutan standar asam lemak
1. Melarutkan jumlah tertentu dari masing-masing asam lemak murni dalam n-heptana
dengan konsentrasi 280mg/L
2. Disimpan pada suhu 4oC dan stabil selama 2 bulan
3. Mencampurkan larutan masing-masing asam lemak dengan jumlah tertentu dan
diencerkan dengan n-heptana untuk memperoleh konsentrasi 28mg/L
4. Larutan campuran digunakan untuk menentukan kurva kalibrasi.
Larutan lipase
1. Melarutkan 25 mg bubuk lipase dalam 25 ml buffer phospat (10 mmol/L) pada pH 7
2. Disimpan pada suhu 4oC.
D. PREPARASI SAMPEL
1. Jumlah kecil minyak (0.1-0.5 mg 0.001) ditempatkan di dalam tabing vial
2. Dihirolisis dengan larutan lipase sebanyak 500 L dalam buffer phospat 10mmol/L pada
pH7
3. Diinkubasi pada temperatur 30oC selama 30 menit.
4. Asam lemak yang dihasilkan diekstraksi dengan 500 L n-heptana
5. Kocok dengan kuat selama 5 menit
6. Ekstrak organik sebanyak 200L mengandung asam lemak ditempatkan dalam tabung
vial lalu dievaporasi oleh arus uap nitrogen dan dilanjutkan dengan proses penurunan
oleh phenasil bromida (dengan adanya larutan trietilamin dalam aseton)
7. Larutan lalu dikeringkan dengan arus uap nitrogen
8. Ditambahkan larutan fasa gerak (asetonitril-air, 85-15 v/v) 200 L.
9. Larutan disentrifugasi dan diinjeksikan kepada HPLC sebanyak 20 L pada temperatur
kolom 45oC1 dengan panjang gelombang 242 nm pada detektor.(senyawa turunan ini
stabil selama 3 hari pada temperatur ruang dan satu bulan pada 4oC).

14

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Kalibrasi larutan standar asam lemak bebas.
Data kalibrasi asam lemak bebas dapat dilihat pada tabel dibawah ini (Tarola et al.,
2012).

Tabel 2. data kalibrasi larutan standar

Dari data ini kita dapat menentukan konsentrasi asam-asam lemak yang ditentukan
pada sampel berdasarkan kurva kalibrasinya atau persamaan regresi. asam-asam lemak tersebut
adalah linoleic, myristic, linoleic, palmitic, oleic, dan stearic.
Data ini diperoleh dari pengukuran spektrofotometri UV-vis yang terdapat pada alat
HPLC. Kurva kalibrasi menunjukan garis linear dengan range konsentrasi 1.2-380 mg/L dan
memiliki koefesien determinasi r2 0.96-0.99.
B. Kondisi hydrolisis
Kondisi eksperimen menunjukan reaksi hidrolisis pada pH 7, T=30oC dan waktu reaksi
didasarkan kepada minyak kenari dimana pada tabel dibawah dapat dilihat bahwa pembentukan
asam linoleic mencapai maksimum setelah 30 menit, sehingga waktu inilah yang optimum
selama inkubasi (Tarola et al., 2012).

15

Gambar 11. kurva hidrolisis minyak kenari oleh lipase (pembentukan asam linoleat dalam
%)

C. Penentuan kuantitatif
Linolenic, myristic, linoleic, palmitic, oleic, dan stearic dipisahkan oleh fasa balik
HPLC dibawah kondisi temperatur kolom 45oC. Kromatogram dari larutan standar asam lemak
dapat dilihat pada gambar (Tarola et al., 2012).

Gambar 12. kromatogram campuran asam lemak standar (A) 0.00-0.06 (B) 0.00-0.03 peak:
1-linolenat, 2-miristat, 3-linoleat, 4-palmitat, 5-oleat, 6-stearat. Elusi isokratik dengan
asetronitril-air (85-15) (v-v), temperatur kolom 45oC, =242 nm

16

Penggunaan kolom C18 dengan panjang 15 cm dan ukuran partikel 3 m,

menghasilkan keuntungan yang besar dalam efesiensi pemisahan analit. Reduksi dalam jumlah
fasa gerak akan mengurangi jumlah biaya yang dikeluarkan selain itu resolusi yang tinggi
diperoleh jika dibandingkan dengan metode lain, khususnya berkaitan dengan derajat
ketidakjenuhan.(Tarola et al., 2012)
Selain itu 0.1-0.5 mg sampel cukup untuk dapat dianalisis, sehingga metode ini dapat
bekerja pada jumlah sampel yang terbatas. Hasil kromatogram dari sampel minyak biji rami,
opium, kenari dapat dilihat pada gambar. Dan hasil penentuan kadar asam lemak dapat dilihat
pada tabel dimana hasil dalam persen total (Tarola et al., 2012).

Gambar 13. kromatogram asam lemak setelah hidrolsis enzimatik minyak biji rami. (A)
waktu: 0-15 min, respon: 0-5 mV, peak: 1-linolenat, 3-linoleat (B) waktu: 15-40 min, respon:
0.00-0.20 mV, peak: 4-palmitat, 5-oleat, 6-stearat. Elusi isokratik dengan asetonitril-air
(85-15) v-v, kolom temperatur 450C, =242 nm

17

Gambar 14. kromatogram asam lemak setelah hidrolisis enzimatik minyak kenari (A)
waktu: 0-40 min, respon: 0.00-0.30 mV, peak: 1-linolenat, 3-linoleat, 4-palmitat, 5-oleat, 6stearat (B) waktu:0-21 min, respon: 0.0-2.0 mV, peak: 3- linoleat, 4-palmitat, 5-oleat. Elusi
isokratik dengan asetoniitril-air (85-15) v-v, kolom temperatur 45 oC, =242 nm

Gambar 15. kromatogram asam lemak setelah hidrolisis enzimatik minyak biji opium (A)
0.00-0.30 (B) 0.0-3.0, peak: 1-linolenat, 2- linoleat, 4-palmitat, 5-oleat, 6-stearat. Elusi
isokratik dengan asetonitril-air (85-15) v-v, temperatur 45oC, =242 nm

18

Dari hasil tersebut dapat dilihat bahwa minyak apiun (poppy seed) mempunyai poliasam lemak tak jenuh (linolenic dan linoleic) paling sedikit dari yang lain (Tarola et al., 2012).

Tabel 3. kandungan asam lemak dalam minyak setelah hidrolisis

D. Pemilihan fasa kolom

Pemilihan kolom bergantung pada fasa diam, waktu retensi, ukuran partikel dan
dimensi kolom. Untuk menentukan fasa diam yang terbaik pada pemisahan adalah sebaiknya
berdasarkan kelarutan sampel dan perbedaan sifat-sifat kimia senyawa pada sampel tersebut
(Restek, n.d.).
Rantai lurus alkil sebagai fasa diam telah umum digunakan pada saat ini. Waktu retensi
dipengaruhi luas area dan % karbon di dalam material packing. Luas area proporsional dengan
ukuran rongga, semakin besar ukuran rongga semakin kecil retensi. Ukuran partikel
mempengaruhi efesiensi (plat/meter) versus tekanan kolom. Partikel dengan ukuran 3m 50%
lebih efesiensi dibandingkan dengan ukuran 5m (berdasarkan persamaan Van Deemter).
Diameter dalam termasuk dimensi kolom, dimana akan mempengaruhi laju alir fasa
gerak(Restek, n.d.).
Kolom fasa alkil, contohnya C18 sangat luas digunakan untuk berbagai senyawa
hidrophobik dari bersifat asam sampai sedikit basa. Kolom C18 juga sangat sesuai untuk
molekul dengan rasio karbon:heteroatom yang tinggi. Dalam hal ini maka kolom C18 dapat
digunakan pada asam-asam lemak yang bersifat hidrophobik dan kurang polar. Molekul fasa
padat ini dapat dilihat dibawah ini(Restek, n.d.).

19

Gambar 16. model molekul fasa

alkil

Kolom lain yang mungkin digunakan adalah kolom fasa alkil termodifikasi, contohnya
aqueous C18. Pada kolom ini fasa diam adalah alkil yang berikatan dengan gugus polar atau
rantai samping yang bersifat polar sehingga menghasilkan interaksi yang lebih baik terhadap
senyawa polar dibandingkan kolom fasa alkil biasa. Sehingga kolom ini ideal dengan senyawa
yang membutuhkan fasa gerak air yang banyak. Molekul fasa padat ini dapat dilihat dibawah
ini(Restek, n.d.).

Gambar 17. model molekul fasa alkil

termodifkasi

Pilihan kolom yang lebih baik dan memungkinkan untuk pemisahan asam-asam lemak
jenuh dan tak jenuh adalah kolom fasa fenil dan bifenil. Fasa diam fenil berinteraksi dengan
senyawa yang mengandung gugus aromatik atau ikatan rangkap melalui interaksi -. Interaksi
ini akan lebih besar jika konsentrasi cincin aromitik tinggi. Sehingga kolom ini sangat sesuai jika
kita menentukan senyawa asam-asam lemak jenuh dan tak jenuh dalam suatu minyak/lipid.
Molekul fasa padat ini dapat dilihat dibawah ini(Restek, n.d.).

20

Gambar 18. model molekul fasa fenil dan bifenil

BAB V. PENUTUP
KESIMPULAN
Makalah ini menggambarkan prosedur untuk menentukan komposisi asam lemak pada
minyak nabati seperti minyak biji rami, kenari dan opium. Asam lemak yang dihasilkan oleh
enzim lipase pada temperatur 30oC selama 30 menit, diekstraksi oleh n-heptana, direaksikan
dengan -bromoacetophenon den kuantitasnya ditentukan oleh HPLC yang dilengkapi diteksi
UV pada panjang gelombang 242 nm dan temperatur kolom 45oC. Keuntungan metode ini adalah
spesifik pada hydrolitic lipase pada jumlah sampel yang sedikit 0.1 mg. penggunaan jumlah
sampel yang sedikit sangat penting untuk menghindari kesalahan kerja.
Lebih lanjut penggunaan kolom C18 dengan panjang 15 cm dan ukuran partikel 3 m,
menghasilkan keuntungan dalam segi efesiensi pemisahan dan reduksi fasa gerak yang
digunakan. Tetapi kolom fasa fenil atau bifenil lebih efesien dari pada kolom C18 jika
menentukan asam-asam lemak jenuh dan tidak jenuh pada sampel minyak.

21

DAFTAR PUSTAKA
Agriculture, Fisheries, & Forestry. (2012). Production guidelines for flax. REPUBLIC OF
SOUTH AFRICA: Department: Agriculture, Forestry and Fisheries. Directorate: Plant
Production.
Chen, S., & Chuang, Y. (2002). Analysis of fatty acids by column liquid chromatography.
Analytica Chimica Acta, (465: 1451).
Hermansyah, H., Prabu, D., Rejoso, M. T., Wulan, P. P. D. K., Machsun, L., Wijanarko, A.,
Tel, D. (n.d.). Model Kinetika Sederhana Untuk Reaksi Hidrolisis Minyak Zaitun
Menggunakan Lipase, 18.
Houde, A., Kademi, A., & Leblanc, D. (2004). Lipases and their industrial applications. Applied
Biochemistry and Biotechnology, 118: 1551.
Juglans nigra. (n.d.).
Llyod, L.E., B.E. Mc. Donald, and E. W. C. (1978). Fundamental of NutritionNo Title. San
Fransisco: W.H. Freeman and Company.
Mills, J. (1966). The gas-chromatographic examination of paint media; Part I. Fatty acid
composition and identification of dried oil film. Studies in Conservation, (11), 92106.
Papaver somniferum. (2004).
Restek. (n.d.). HPLC Columns. Retrieved from www.restek.com
Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2004). Fundamentals of Analytical
Chemistry (EIGHTH.). Canada: Thomson LearningTM.
Tarola, A. M., Girelli, A. M., & Lorusso, S. (2012). High Performance Liquid Chromatography
Determination of Fatty Acids in Drying Oils Following Lipase Action, 294300.

22