PROTEINAS

separao, purificacao e caracterizacao das caadeias polipeptidicas

1 determinar a massa molecular. A partir ela podemos estimar o n de residuos
no polipeptideo a ser sequenciados.
2 Antes de iniciar com o sequenciamento da cadeia util saber a sua composicao
de a.a. esta e determinada pela sua hidrolise completa, seguida da analise quantitativa
dos a.a liberados. pod ser realizado tanto por meio quimico ou enzimatico.
3o conteudo de a.a do hidrolisado de um polipeptideo pode ser determinado
quantitativamente com a separacao dos a.a. por cromatografia de troca ionica ou fase
reversa ( diferenca de carga e polaridade). o integral da area debaixo do pico e a
concentracao. sabendo a [] e a massa molecular, sabemos a quantidade. os a.a sao
entao identificados de acordo com os seus volumes de ebulicao caracteristico.
Identificacao da extremidade aminoterminal
Degradacao de Edman
Clivagem do residuo aminoterminal sem hidrolisa as outras ligacoes peptidicas. Este
mtodo libera o aminoterminal mas deixa intacto o resto da cadeia polipeptidica.Pode
determinar a sequencia de a.a de uma cadeia poli a partir da sua porcao aminoterminal
ao se submeter o poli a ciclos repetidos da degradacao de edman.
Cadeias maiores -> clivagem especifica, as sequencias parciais dos fragmentos peptidicos de um subunidade, qdo ordenados
correctamete correspondem aquela subunidade intacta. depois de ter os fragmentos peptidicos devidamente sequenciados para ordenar
os a.a no polipeptideo original, compara-se as sequencias de a.a de um conjt de fragmentos peptidicos com aquelas de um cjt cujos
sitios de clivagem specifica sobrepoem ao 1 conjt.
Identificacao da extermidade carboxiterminal
carboxipeptidases: catalisa a hidrolise dos residuos carboxiterminais. qdo se pode utilizar esta enzimas -> hidrozinolise, o polipeptideo e
tratado com hidrazina. todas as ligacoes peptidicas so clivadas fornecendo hidrazidas aminocicladas de todos os residuos de a.a,
execpto da residuo c-terminal o q libertado como a.a livre ->identificado na cromatografia.