Você está na página 1de 10

METODE ANALISIS KUALITATIF & KUANTITATIF TERHADAP ASAM NUKLEAT

(Elisabeth, 1306371035, HG-9 Fruktosa)


Abstrak
Sel memiliki bagian inti yang terdiri dari asam nukleat. Asam nukleat dapat dianalisis secara
kualitatif maupun kuantitatif. Analisis dilakukan guna pendeteksian asam nukleat di dalam sel.
Analisis secara kualitatif, berhubungan dengan keberadaan, panjang rantai, urutan serta jumlah
kodon DNA. Metode yang dapat digunakan untuk analisis ini, antara lain Nucleic Acid
Hybridization, Polymerase Chain Reaction, serta Nucleic Acid Sequencing. Sedangkan, analisis
kuantitatif pada asam nukleat dilakukan dengan melihat jumlah gen yang terdapat pada sampel.
Analisis ini dapat dilakukan menggunakan metode spektroskopi UV-Vis.
Sub Bahasan 1 : Nucleic Acid Hybridization

Hibridisasi DNA merupakan teknik yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA dari
patogen dan juga untuk meletakan gen spesifik dalam sel.
Hibridisasi DNA menggunakan prinsip kemampuan asam nukleat untuk membentuk double
strands yang stabil pada kondisi tertentu.
Pada pengujian hibridisasi DNA, DNA dari suatu viris atau sel didenaturasi menggunakan
alkali untuk memisahkan strands. Double strands menjadi single strand. Single strand ini akan
dilekatkan dengan nitrocelluloseatau nylon membran.
Untuk mengidentifikasi DNA target, sebuah probe yang telah dilabeli dengan radioaktif
(reporter group) ditambahkan.
Probe akan bereaksi dengan DNA target. Probe yang tidak bereaksi akan dihilangkan dalam
larutan buffer. Probe dan DNA target akan membentuk hibridisasi yang stabil.
Jika tidak ada reporter group yang terdeteksi, maka diasumsikan bahwa molekul target tidak
memiliki urutan DNA yang cocok dengan probe, dengan demikian maka segmen DNA yang
dicari tidak ada dalam sample.
Dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk melihat keberadaan asam nukleat dalam
molekul target.

Sub Bahasan 2 : Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi polimerasi rantai adalah suatu metode yang memanfaatkan enzim polimerase dalam
mensintesis DNA yang ingin digandakan.
Alat yang digunakan adalah Thermal cycler yang berfungsi untuk mengatur perubahan suhu
selama proses PCR berlangsung.
Bahan yang dibutuhkan dalam proses ini adalah sampel DNA yang mau dilipatgandakan,
enzim DNA polimerase, deoksinukleosida (dNTP) dan oligonukleotida (disebut juga primer).
Enzim yang digunakan adalah enzim Taq polymerase yang berasal dari bakteri yang tahan
terhadap suhu tinggi (termofil). Hal ini dilakukan supaya enzim bisa terus melakukan replikasi
pada berbagai macam ukuran suhu.
Oligonukleotida yang digunakan harus dipertimbangkan dari beberapa aspek yaitu :
1. Panjang
Panjang primer menunjukkan tingkat kompleksitas dari DNA cetakan. Semakin panjang
primernya, maka semakin rumit DNA yang harus direplikasi
2. Tingkat ketidakcocokan
Tingkat ketidakcocokan menunjukkan bahwa belum tentu seluruh rantai hasil replikasi
akan komplemen terhadap sampel DNA. Akan tetapi, asam nukleat pada ujung 5 dari
primer harus sesuai dengan ujung 3 pada sampel DNA.
3. Titik leleh
Kesamaan titik leleh antara DNA sampel dengan kedua primer yang digunakan akan
menunjukkan kesesuaian dari komposisi asam nukleat
4. Struktur internal sekunder
Struktur ini harus dihindari supaya tidak terjadi annealing dengan diri sendiri pada primer
yang digunakan. Akibatnya primer tersebut akan berlipat dan tidak bisa berikatan dengan
sampel.
5. Annealing antara sesama primer
Annealing antara kedua primer yang digunakan juga harus dihindari karena akan
mengakibatkan terbentuknya primer yang dimer.
PCR terjadi sekitar 30-50 siklus dimana 1 siklus menunjukkan replikasi oleh 3 tahap
(denaturasi, annealing dan elongasi).
Tahapan dalam melakukan PCR adalah :
1. Denaturasi
Denaturasi terjadi ketika ikatan DNA yang double-helix terputus sehingga membentuk 2
rantai panjang yang saling komplemen. Proses ini terjadi pada suhu tinggi (94C) dengan
bantuan enzim polimerase.
2. Annealing

Annealing adalah proses yang diawali dengan penempelan primer sebagai awal dari suatu
rantai komplemen baru. Proses ini terjadi pada suhu sekitar 60C.
3. Elongasi
Pada tahap ini, enzim polimerase akan menyusun rantai komplemen yang tersusun dari
deoksinukleosida yang berada secara bebas dalam tabung reaksi. Proses ini terjadi pada
suhu 72C.

Jenis PCR yang telah dikembangkan :


1. Real-Time PCR
Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real
time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR.
Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah target
molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Pada analisa PCR konvensional, deteksi
keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan
dengan elektroforesis, namun analisa menggunakan Real-Time PCR memungkinkan untuk
dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung sehingga tidak perlu dilakukan
elektroforesis.
2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal sengan kinetic polymerase chain reaction.
RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR, dimana metode ini digunakan untuk
mengamplifikasi RNA, berbeda dengan PCR biasa yang mengamplifikasi DNA. Proses RTPCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase, karena hanya enzim jenis ini yang dapat
mensintesis DNA dengan cetakan RNA, sedangkan polimerase DNA hanya dapat
mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA. RT-PCR penting digunakan sebagai alat
diagnostik untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus, sebagai informasi untuk studi
epidemiologi.
3. Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan
bantuan enzim
DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah
diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh
primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik
dalam melakukan amplifikasi. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama
daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR, sedangkan
pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR.
4. Multiplex PCR
Multiplex PCR merupakan modifikasi dari PCR yang digunakan untuk mendeteksi adanya
delesi atau duplikasi secara cepat pada gen besar. Proses ini mengamplifikasi sampel DNA
genomik menggunakan banyak primer dan DNA polimerase pada thermal cycler.
5. Touchdown PCR
Sebuah modifikasi dari PCR yang mencegah amplifikasi sekuens nonspesifik dengan
mempermainkan suhu annealing.
Masih banyak jenis modifikasi dari PCR ini, seperti Allele-specific PCR, Assembly
PCR, Assymetric PCR, Dial-out PCR, Hot start PCR, dan lain-lain.

PCR banyak digunakan untuk :


1. DNA Sequencing
PCR mampu membuat terjadinya DNA sequencing hanya dengan suatu cetakan DNA
yang kecil, ketika berada bersama dengan ddNATP dalam proses terminasi.
2. Diagnosis
Dalam pendeteksian sel anemia bulan sabit, hal yang dideteksi adalah keberadaan bagian
restriksi dari gen beta globin. Ketika PCR tidak dapat mendeteksi bagian tersebut, dapat
diasumsikan bahwa sampel mengandung sel bulan sabit.
3. Forensik
Pada forensik, DNA yang digunakan adalah DNA polimorfik (berbeda untuk setiap
individu). Oleh karena itu dengan memanfaatkan PCR, bagian polimorfik dari DNA yang
sangat pendek akan digandakan. Kemudian akan disesuaikan dengan DNA dari orang tua
donor sampel.
4. Populasi genetis
Dalam hal ini, peneliti umumnya melihat tingkat frekuensi kesamaan allel antara beberapa
gen sampel untuk melihat tingkat kekeluargaan DNA nya. Umumnya proses yang
digunakan yaitu :
- Random Amplification of Polymorphic DNA analysis (RAPD)
Dalam teknik ini, digunakan suatu primer yang pendek tetapi dapat melakukan
annealing terhadap banyak bagian dari gen yang diteliti. Selain itu produk hasil
annealing juga beragam.
- Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
Dalam teknik ini, hanya fragmen-fragmen restriksi DNA yang digandakan sehingga
ukuran panjang dari masing-masing replikasi dapat dibandingkan.
5. Arkeologi dan evolusi
Dalam arkeologi, PCR digunakan untuk mengambil sampel DNA yang polimorfik kemudian
dibandingkan dengan sampel DNA dari hewan yang sekarang dapat diamati. Hal ini
ditujukan untuk mengetahui asal dari suatu populasi spesies tertentu.

Sub Bahasan 3 : Nucleic Acid Sequencing

Metode ini memanfaatkan pemisahan secara denaturasi oleh gel poliakrilamide.


Metode ini membutuhkan alat berupa film x-Ray serta komputer untuk menginterpretasikan
hasil corak pada film.
Alat yang dibutuhkan adalah DNA sampel serta gel poliakrilamide. Denaturasi oleh gel
tersebut bersifat khusus karena mampu membedakan panjang dari potongan-potongan DNA
yang dihasilkan berdasarkan jenis basanya.
Secara umum, proses sequencing ini terjadi dalam beberapa tahap yaitu :
1. Elektroforesis
Elektroforesis adalah tahap pemisahan kedua rantai DNA dengan memanfaatkan
perbedaan muatan listrik dari setiap makromolekul dalam DNA. Dalam sequencing,
elektroforesis dilakukan dengan memanfaatkan kemampuan denaturasi oleh gel
poliakrilamida. Gel ini mengandung urea yang memicu terjadinya proses pemisahan rantai
DNA.
2. Labelling
Proses pemberian label dilakukan dengan menempelkan beberapa radioisotop yaitu 32P,
33
P, dan 35S. Setelah diberikan radioisotop tersebut, gel yang berisi potongan DNA akan
dikeringkan dan diletakkan di dekat film X-Ray.
3. Visualisasi gambar
Gel kering tersebut akan memancarkan sinar akibat terjadinya emisi partikel. Sinar
tersebut akan di tangkap oleh film x-Ray dan akan ditampilkan dalam suatu bentuk corak
tertentu pada film. Film bercorak tersebut disebut juga autoradiograph dan akan
menggambarkan kopian dari letak basa pada DNA sampel.
Metode ini dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger
a. Metode Maxam-Gilbert
Metode ini memanfaatkan 2 jenis senyawa kimia yaitu piperdin, dimetil sulfat dan hidrazin.
Kedua senyawa tersebut berperan dalam pemutusan ikatan glikosida antara basa dan
gula ribosanya. Pemutusan rantai menjadi beberapa potongan dengan panjang yang
berbeda, dapat terjadi melalui proses :
1. Pemutusan ikatan glikosida
Pemutusan ikatan glikosida dilakukan oleh 2 senyawa kimia. Dimetil sulfat akan
memutus ikatan pada basa purin sedangkan hidrazin pada basa pirimidin. Akibatnya
terjadi pemisahan membentuk basa dan gula ribosa
2. Pemutusan ikatan fosfodiester
Pada tahap ini, piperdin akan muncul dan menguraikan ikatan fosfodiester yang dimiliki
oleh gula ribosa tersebut. Akibatnya, gula akan lepas dari rantai panjang DNA sampel
dan menghasilkan 2 potong rantai DNA yang memiliki panjang yang berbeda-beda.

b. Metode Sanger
Metode ini memanfaatkan enzim DNA polimerase untuk membentuk rantai yang
komplemen terhadap cetakan DNA sampel. Dalam metode ini, proses elektroforesis akan
dilanjutkan dengan proses replikasi oleh suatu primer, DNA polimerase, deoksinukleotida
(deoksiNTP) dan 4 jenis dideoksinukleotida (ddA,ddG,ddC,dan ddT) yang diletakkan
dalam 4 tabung yang berbeda-beda. Dideoksinukleotida merupakan suatu basa yang tidak
memiliki gugus OH pada ujung 3, melainkan gugus H. Dideoksinukleotida akan
menghentikan proses polimerisasi oleh DNA polimerase ketika ia juga ikut terikat.
Perbedaan panjang rantai pada metode ini terjadi dalam beberapa proses yaitu :
1. Inisiasi oleh primer
Proses replikasi DNA dari cetakan dimulai dengan pengikatan primer dengan ujung 3
pada cetakan.
2. Elongasi oleh deoksiNTP
Kemudian DNA polimerase akan melanjutkan replikasi dengan cara menyusun
deoksiNTP yang tersebar bebas dalam tabung sesuai dengan urutan pada sampel.
3. Terminasi oleh dideoksinukleotida
Pada akhirnya, akan ada saat dimana dideoksinukleotida ikut menempel pada rantai
hasil replikasi. Akibatnya, proses polimerisasi akan terhenti.

Sub Bahasan 4 : Spektroskopi UV-Vis

Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel (UV-Vis) Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu


teknik analisis spektroskopi yang memakai sumber radiasi eleltromagnetik ultraviolet dekat
(190-380) dan sinar tampak (380-780) dengan memakai instrumen spektrofotometer.
Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang
dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
ketimbang kualitatif.

Spektrofotometer terdiri atas spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan


sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang ditranmisikan atau yang diabsorpsi.

Spektrofotometer tersusun atas sumber spektrum yang kontinyu, monokromator, sel


pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat untuk mengukur pebedaan
absorpsi antara sampel dan blangko ataupun pembanding.

Spektrofotometer UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel yang berupa larutan,
gas, atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu diperhatikan pelarut yang dipakai
antara lain:

1. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada
struktur molekulnya dan tidak berwarna.
2. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis.
3. Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis.

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi:


1. Sumber tenaga radiasi yang stabil, sumber yang biasa digunakan adalah lampu
wolfram.
2. Monokromator untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis.
3. Sel absorpsi, pada pengukuran di daerah visibel menggunakan kuvet kaca atau kuvet
kaca corex, tetapi untuk pengukuran pada UV menggunakan sel kuarsa karena gelas
tidak tembus cahaya pada daerah ini.
4. Detektor radiasi yang dihubungkan dengan sistem meter atau pencatat. Peranan
detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai
panjang gelombang.

Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visibel tergantung pada
struktur elektronik dari molekul. Serapan ultraviolet dan visibel dari senyawa-senyawa organik
berkaitan erat transisi-transisi diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Disebabkan
karena hal ini, maka serapan radiasi ultraviolet atau terlihat sering dikenal sebagai
spektroskopi elektronik. Transisi-transisi tersebut biasanya antara orbital ikatan antara orbital
ikatan atau orbital pasangan bebas dan orbital non ikatan tak jenuh atau orbital anti ikatan.
Panjang gelombang serapan merupakan ukuran dari pemisahan tingkatan-tingkatan tenaga
dari orbital yang bersangkutan. Spektrum ultraviolet adalah gambar antara panjang
gelombang atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan (transmitasi atau absorbansi).

Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet-Visible) merupakan gabungan antara spektrofotometri UV


dan Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat
dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan
senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan
reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun
perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi. Prinsip
dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada
partikel koloid apalagi suspensi.

Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber
cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu
sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan
monokromator.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk
sample tak berwarna.

DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita
ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau
phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan

cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi
260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar
antara 1.8-2.0. Jika nilai melebihi 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan
dari protein membran/senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum
murni. Jika kurang dari 1.8 maka ddH 2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang
diambil terlalu sedikit.
Summary
Asam nukleat secara khusus asam deoksiribonukleat atau yang lebih dikenal dengan DNA
tergolong sebagai biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Keberadaannya
dapat dideteksi atau dianalisis secara kualitatif maupun kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan
dengan menggunakan metode Elektroforesis gel agarose, dan secara kuantitatif menggunakan
metode spektrofotometri.
Daftar Pustaka
Howe, C.(2007).Gene Cloning and Manipulation (2nd edition). New York:Cambridge University
Press
Karp,G.(2010).Cell and Molecular Biology:Concepts and Experiments (6 th edition). New Jersey :
John Wiley & Sons
Stansfield, W., Cano, R., dan Colome, J.(2003).Schaums Easy Outlines : Molecular and Cell
Biology. New York : McGraw-Hill.
Fitriani.(2014).
Spektrofotometri
Ultraviolet-Visibel
(UV-Vis).
http://digilib.ump.ac.id/files/disk1/14/jhptump-a-fitriyani-662-2-babii.pdf
The

Retrieved

University of Michigan.(2014). How do we Sequence DNA?.


http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/sequencing.html

Retrieved

from
from

Você também pode gostar