Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Hibridisasi DNA merupakan teknik yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA dari
patogen dan juga untuk meletakan gen spesifik dalam sel.
Hibridisasi DNA menggunakan prinsip kemampuan asam nukleat untuk membentuk double
strands yang stabil pada kondisi tertentu.
Pada pengujian hibridisasi DNA, DNA dari suatu viris atau sel didenaturasi menggunakan
alkali untuk memisahkan strands. Double strands menjadi single strand. Single strand ini akan
dilekatkan dengan nitrocelluloseatau nylon membran.
Untuk mengidentifikasi DNA target, sebuah probe yang telah dilabeli dengan radioaktif
(reporter group) ditambahkan.
Probe akan bereaksi dengan DNA target. Probe yang tidak bereaksi akan dihilangkan dalam
larutan buffer. Probe dan DNA target akan membentuk hibridisasi yang stabil.
Jika tidak ada reporter group yang terdeteksi, maka diasumsikan bahwa molekul target tidak
memiliki urutan DNA yang cocok dengan probe, dengan demikian maka segmen DNA yang
dicari tidak ada dalam sample.
Dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk melihat keberadaan asam nukleat dalam
molekul target.
Reaksi polimerasi rantai adalah suatu metode yang memanfaatkan enzim polimerase dalam
mensintesis DNA yang ingin digandakan.
Alat yang digunakan adalah Thermal cycler yang berfungsi untuk mengatur perubahan suhu
selama proses PCR berlangsung.
Bahan yang dibutuhkan dalam proses ini adalah sampel DNA yang mau dilipatgandakan,
enzim DNA polimerase, deoksinukleosida (dNTP) dan oligonukleotida (disebut juga primer).
Enzim yang digunakan adalah enzim Taq polymerase yang berasal dari bakteri yang tahan
terhadap suhu tinggi (termofil). Hal ini dilakukan supaya enzim bisa terus melakukan replikasi
pada berbagai macam ukuran suhu.
Oligonukleotida yang digunakan harus dipertimbangkan dari beberapa aspek yaitu :
1. Panjang
Panjang primer menunjukkan tingkat kompleksitas dari DNA cetakan. Semakin panjang
primernya, maka semakin rumit DNA yang harus direplikasi
2. Tingkat ketidakcocokan
Tingkat ketidakcocokan menunjukkan bahwa belum tentu seluruh rantai hasil replikasi
akan komplemen terhadap sampel DNA. Akan tetapi, asam nukleat pada ujung 5 dari
primer harus sesuai dengan ujung 3 pada sampel DNA.
3. Titik leleh
Kesamaan titik leleh antara DNA sampel dengan kedua primer yang digunakan akan
menunjukkan kesesuaian dari komposisi asam nukleat
4. Struktur internal sekunder
Struktur ini harus dihindari supaya tidak terjadi annealing dengan diri sendiri pada primer
yang digunakan. Akibatnya primer tersebut akan berlipat dan tidak bisa berikatan dengan
sampel.
5. Annealing antara sesama primer
Annealing antara kedua primer yang digunakan juga harus dihindari karena akan
mengakibatkan terbentuknya primer yang dimer.
PCR terjadi sekitar 30-50 siklus dimana 1 siklus menunjukkan replikasi oleh 3 tahap
(denaturasi, annealing dan elongasi).
Tahapan dalam melakukan PCR adalah :
1. Denaturasi
Denaturasi terjadi ketika ikatan DNA yang double-helix terputus sehingga membentuk 2
rantai panjang yang saling komplemen. Proses ini terjadi pada suhu tinggi (94C) dengan
bantuan enzim polimerase.
2. Annealing
Annealing adalah proses yang diawali dengan penempelan primer sebagai awal dari suatu
rantai komplemen baru. Proses ini terjadi pada suhu sekitar 60C.
3. Elongasi
Pada tahap ini, enzim polimerase akan menyusun rantai komplemen yang tersusun dari
deoksinukleosida yang berada secara bebas dalam tabung reaksi. Proses ini terjadi pada
suhu 72C.
Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal sengan kinetic polymerase chain reaction.
RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR, dimana metode ini digunakan untuk
mengamplifikasi RNA, berbeda dengan PCR biasa yang mengamplifikasi DNA. Proses RTPCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase, karena hanya enzim jenis ini yang dapat
mensintesis DNA dengan cetakan RNA, sedangkan polimerase DNA hanya dapat
mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA. RT-PCR penting digunakan sebagai alat
diagnostik untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus, sebagai informasi untuk studi
epidemiologi.
3. Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan
bantuan enzim
DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah
diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh
primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik
dalam melakukan amplifikasi. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama
daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR, sedangkan
pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR.
4. Multiplex PCR
Multiplex PCR merupakan modifikasi dari PCR yang digunakan untuk mendeteksi adanya
delesi atau duplikasi secara cepat pada gen besar. Proses ini mengamplifikasi sampel DNA
genomik menggunakan banyak primer dan DNA polimerase pada thermal cycler.
5. Touchdown PCR
Sebuah modifikasi dari PCR yang mencegah amplifikasi sekuens nonspesifik dengan
mempermainkan suhu annealing.
Masih banyak jenis modifikasi dari PCR ini, seperti Allele-specific PCR, Assembly
PCR, Assymetric PCR, Dial-out PCR, Hot start PCR, dan lain-lain.
b. Metode Sanger
Metode ini memanfaatkan enzim DNA polimerase untuk membentuk rantai yang
komplemen terhadap cetakan DNA sampel. Dalam metode ini, proses elektroforesis akan
dilanjutkan dengan proses replikasi oleh suatu primer, DNA polimerase, deoksinukleotida
(deoksiNTP) dan 4 jenis dideoksinukleotida (ddA,ddG,ddC,dan ddT) yang diletakkan
dalam 4 tabung yang berbeda-beda. Dideoksinukleotida merupakan suatu basa yang tidak
memiliki gugus OH pada ujung 3, melainkan gugus H. Dideoksinukleotida akan
menghentikan proses polimerisasi oleh DNA polimerase ketika ia juga ikut terikat.
Perbedaan panjang rantai pada metode ini terjadi dalam beberapa proses yaitu :
1. Inisiasi oleh primer
Proses replikasi DNA dari cetakan dimulai dengan pengikatan primer dengan ujung 3
pada cetakan.
2. Elongasi oleh deoksiNTP
Kemudian DNA polimerase akan melanjutkan replikasi dengan cara menyusun
deoksiNTP yang tersebar bebas dalam tabung sesuai dengan urutan pada sampel.
3. Terminasi oleh dideoksinukleotida
Pada akhirnya, akan ada saat dimana dideoksinukleotida ikut menempel pada rantai
hasil replikasi. Akibatnya, proses polimerisasi akan terhenti.
Spektrofotometer UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel yang berupa larutan,
gas, atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu diperhatikan pelarut yang dipakai
antara lain:
1. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada
struktur molekulnya dan tidak berwarna.
2. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis.
3. Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis.
Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visibel tergantung pada
struktur elektronik dari molekul. Serapan ultraviolet dan visibel dari senyawa-senyawa organik
berkaitan erat transisi-transisi diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Disebabkan
karena hal ini, maka serapan radiasi ultraviolet atau terlihat sering dikenal sebagai
spektroskopi elektronik. Transisi-transisi tersebut biasanya antara orbital ikatan antara orbital
ikatan atau orbital pasangan bebas dan orbital non ikatan tak jenuh atau orbital anti ikatan.
Panjang gelombang serapan merupakan ukuran dari pemisahan tingkatan-tingkatan tenaga
dari orbital yang bersangkutan. Spektrum ultraviolet adalah gambar antara panjang
gelombang atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan (transmitasi atau absorbansi).
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan
reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun
perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi. Prinsip
dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada
partikel koloid apalagi suspensi.
Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber
cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu
sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan
monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk
sample tak berwarna.
DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita
ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau
phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan
cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi
260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar
antara 1.8-2.0. Jika nilai melebihi 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan
dari protein membran/senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum
murni. Jika kurang dari 1.8 maka ddH 2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang
diambil terlalu sedikit.
Summary
Asam nukleat secara khusus asam deoksiribonukleat atau yang lebih dikenal dengan DNA
tergolong sebagai biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Keberadaannya
dapat dideteksi atau dianalisis secara kualitatif maupun kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan
dengan menggunakan metode Elektroforesis gel agarose, dan secara kuantitatif menggunakan
metode spektrofotometri.
Daftar Pustaka
Howe, C.(2007).Gene Cloning and Manipulation (2nd edition). New York:Cambridge University
Press
Karp,G.(2010).Cell and Molecular Biology:Concepts and Experiments (6 th edition). New Jersey :
John Wiley & Sons
Stansfield, W., Cano, R., dan Colome, J.(2003).Schaums Easy Outlines : Molecular and Cell
Biology. New York : McGraw-Hill.
Fitriani.(2014).
Spektrofotometri
Ultraviolet-Visibel
(UV-Vis).
http://digilib.ump.ac.id/files/disk1/14/jhptump-a-fitriyani-662-2-babii.pdf
The
Retrieved
Retrieved
from
from