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PRUEBAS

BIOQUMICAS
DOCENTE: Q.F. PEDRO JACINTO HERVIAS

PRUEBAS BIOQUMICAS
La identificacin
definitiva de una
especie requiere
de pruebas
bioqumicas.
Permiten conocer
las actividades
metablicas y
enzimticas de
los
microorganismos.

PRUEBAS BIOQUMICAS

Identificar los productos finales de los procesos metablicos

Se debe conocer:
1.- Cambios que se producen
2.- Reacciones qumicas que ocurren
3.- Enzimas que intervienen
4.- Productos intermedios
5.- Secuencias de las reacciones bioqumicas

PRUEBAS BIOQUMICAS

Los microorganismos se cultivan en medios S/D

SS + SD

PB

Las pruebas bioqumicas disponibles para la identificacin de


microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son:
1.- Pruebas IMVIC
2.- Prueba de TSI
3.- Prueba de Ureasa
4.- Movilidad

PRUEBAS IMVIC

Incluyen

un

diferenciar

grupo
los

de

cuatro

pruebas

microorganismos

Enterobacteriaceae)

Las pruebas son:

INDOL
ROJO DE METILO

VOGES PROSKAUER
CITRATO.

usadas

entricos

para

(Familia

Fermentacin de hidratos de carbono:

Accin
sobre
los
hidrat
os de
carbo
no

Primer da
Inocula cada tubo de caldo lactosado con E.coli,
S.aureus, P.vulgaris.
Toma un cuarto tubo sin sembrar como control.
Rotula los tubos e incuba todos los tubos a 37C por
24 horas.
Segundo da
Despus del perodo de incubacin, compara cada uno
de los tubos inoculados, con el tubo control.
Cuando la bacteria ha degradado el hidrato de
carbono (lactosa), se detecta por la inclusin del
indicador de Andrade.
Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar
un subproducto metablico a CO2 e H+ se observar
la presencia de gas, en forma de burbujas.

Hidrlisis del almidn:

1.

Accin
sobre
los
hidratos
de
carbono

Primer da
Con ayuda del lpiz de cera, divida por
fuera la base de la placa Petri en 3 partes.
En la seccin 1, siembra B. Subtilis, en la
seccin 2 siembra E. Coli y en la seccin 3
siembra Ps. aeruginosa
Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
Agrega a toda la superficie del medio la
solucin de lugol.
Observa la reaccin alrededor del
crecimiento microbiano

Los polisacaridos, como el almidn


son demasiados largos para ser
transportados al interior de la
clula. Los microorganismos
excretan amilasas que hidrolizan
esos polmeros hasta oligo o
monosacridos que pueden usarse
como sustratos para crecer.
La hidrlisis de almidn es analizada
en medios conteniendo almidn en
placa. Despus de incubar se
inundan las placas con lugol que al
unirse con el almidn intacto forma
un complejo prpura.

PRUEBA DE ROJO DE METILO


Y VOGES PROSKAUER
GLUCOSA
ACIDO MIXTA

BUTILENGLICOLICA

ACIDOS MIXTOS pH por debajo de 4,4

ACETIL-METILCARBINOL
(ACETONA)

INDICADOR ROJO DE
METILO

REACTIVO DE BARRET

COLOR ROJO MR +

COLOR ROSADO VP +

Produccin de cidos y acetil-metil-carbinol (acetona):

Accin
sobre
los
hidrat
os de
carbo
no

Prueba de Voges Proskauer (VP)


Primer da
Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.
Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y
Enterobacter) en su tubo correspondiente.
Incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
A cada tubo agrega 10 a 12 gotas de la solucin de alfa-naftol
y 4 gotas de la solucin de KOH creatina.
Agita despus de agregar las soluciones por 1 minuto.
Deja en reposo durante 15 minutos.
La reaccin es positiva, si aparece una coloracin rosada
localizada en la mitad superior o en todo el tubo dentro de los
primeros 15 minutos, lo que nos indica la presencia de acetilmetil-carbinol.
Si la lectura se realiza despus de 1 hora, los cultivos pueden
presentar una coloracin cobriza, siendo esta una respuesta
falsa positiva.
La reaccin es negativa, si el color inicial del medio de cultivo
no cambia.

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER

FUNDAMENTO:
GLUCOSA

FERMENTACIN BUTILENGLICLICA

REACTIVO DE BARRETT
KOH 40%

NEGATIVO

POSITIVO

ACETIL-METIL-CARBINOL
(ACETONA)

2-3 BUTANODIOL, ETANOL, H2 y CO2

Prueba de rojo de metilo:

Accin
sobre
los
hidrat
os de
carbo
no

Primer da
Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.
Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E.
coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente.
Incuba a 37C por 48 a 72 horas.
Segundo da
Agrega 4 5 gotas del indicador rojo de metilo a
cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH 4.4
(rojo) y 6.0 (amarillo).
La prueba es negativa si da una coloracin amarillo
naranja.
La prueba es positiva si se mantiene un color rojo
estable.

PRUEBA DE ROJO DE METILO

FUNDAMENTO:
FERMENTACIN CIDO MIXTA

GLUCOSA

CIDOS LCTICO, ACTICO Y SUCCNICO

pH CIDO

+
CO2, H2 y ETANOL

5 GOTAS ROJO DE METILO

COLOR ROJO

NEGATIVO POSITIVO

PRUEBA DE ROJO DE METILO

PROTOCOLO: (caldo MRVP)


1.- Se Inocula el medio con
un cultivo puro joven.
2.- Se incuba a 35 37C
durante 48 horas.

3.- Luego de terminado el

INTERPRETACIN:

tiempo de incubacin se
aaden 5 gotas del reactivo
de

Rojo

agitar).

de

Metilo

(no

SIN INOCULAR NEGATIVO POSITIVO

Principios bioqumicos de las reacciones en TSI:

Accin
sobre
los
hidrat
os de
carbo
no

Primer da

Con el asa de siembra, inocula una porcin pequea de la colonia


en el centro del tubo y estra la superficie del pico de flauta.

Rotula e incuba a 37C por 24 horas.

Segundo da

Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de


incubacin indicada.

Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.

Fermentacin de la glucosa nicamente (rojo/amarillo): esto se


debe a que la glucosa (que se encuentra en baja concentracin
con respecto a los otros azucares) ha sido utilizada y la cantidad
de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos
alcalinos generados por la utilizacin de las peptonas. Estos
procesos que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio,
mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el
oxgeno, solo hay fermentacin y el medio permanece cido.

Fermentacin doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo):


la fermentacin de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos
azcares produce gran cantidad de cido, por lo que el tubo
permanece amarillo.

PRUEBA TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

1.

Medio S/D
Permite evidenciar:
Capacidad de produccin de cido y gas a partir de
glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio.

2.

Permite la identificacin de la produccin de SH2.

PRUEBA TSI

Esta prueba tiene como objetivo diferenciar entre:

Bacterias fermentadoras de la GLUCOSA


Bacterias fermentadoras de la LACTOSA
Bacterias fermentadoras de la
SACAROSA
Bacterias aerognicas
Bacterias productoras de SH2

PRUEBA TSI
FUNDAMENTO:

El extracto de carne y peptona aportan los nutrientes para


el desarrollo bacteriano.

La lactosa, sacarosa y glucosa son los HC fermentables.

El rojo de fenol es el indicador de pH.

Por la fermentacin de los azcares, se producen cidos


que se detectan por el indicador de pH.

PRUEBA TSI

PROTOCOLO:
1.- Se inocula los tubos de TSI
con punta.
2.-

Se

introduce

INOCULACION CON PUNTA

la

punta

hasta 3 a 5 mm del fondo del


tubo.
3.- Luego de retirar el asa del
fondo, se estra el pico con un
movimiento en zigzag, de un
lado al otro.
4.- Se incuba a 35 - 37C
durante 24 horas.

ESTRIACION EN ZIGZAG

PRUEBA TSI
INTERPRETACIN:
Se debe considerar los
cambios de color en el
pico y el fondo del tubo y
la formacin de burbujas.
Cuando el medio es cido
(A) este se torna de color
amarillo y cuando es
alcalino (ALK)
permanece de color rojo.

PRUEBA TSI

El medio contiene 0.1% de glucosa y 1% de lactosa y sacarosa


respectivamente.

Si el microorganismo slo fermenta la glucosa, el cido producido en


el fondo acidifica el medio en esa zona y se torna de color amarillo.

Cuando el microorganismo fermenta la lactosa y la sacarosa, el cido


producido es suficiente como para virar el color del medio a amarillo.

El medio permanece rojo cuando no se produce fermentacin de


ninguno de los azcares.

PRUEBA TSI

Si hay formacin de gas


durante

el

proceso

de

fermentacin, en el fondo
del

medio

se

observan

burbujas o la ruptura del


agar.

Si

las

bacteria

son

productoras de SH2 este se


evidencia
precipitado

como
negro

un
en

el

Tubo

4A

Fermentacin de Glucosa

Produccin de gas

Fermentacin de Lactosa y
Sacarosa

Produccin de SH2

Hidrlisis de la gelatina:

Accin
sobre
las
proten
as

Primer da
Rotula cada tubo con el nombre de la
cepa correspondiente: E. Coli y B. Subtilis.
Inocula cada cepa en un tubo con
gelatina, haciendo uso de un asa en
punta, introduciendo de manera vertical
hasta el fondo del tubo.
Incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
Observa los resultados. Observa la
hidrlisis de la gelatina

La mayora de los polmeros son


demasiado grandes para ser
transportados dentro de las clulas.
Las bacterias excretan enzimas
extracelulares que hidrolizan esos
polmeros transportando al interior
de la clula en monmeros que les
sirven para crecer.
La produccin de proteasas es
evaluada por incorporacin de una
protena (gelatina o casena) en un
medio slido en placa. La placa se
inunda con cido que precipita la
proteina no hidrolizada.

Produccin de indol:

Accin
sobre
las
proten
as

Primer da
Rotula sus tubos con el nombre del microorganismo: E.
coli y B. subtilis.
Inocula cada cepa en su tubo correspondiente.
Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
Agrega 4 gotas del reactivo de Kovacs, dejando
resbalar por la pared interna de cada tubo que presenta
desarrollo bacteriano, luego agite suavemente.
La reaccin es positiva, si se forma un anillo de color rojo
fucsia brillante en la zona superior del tubo, pocos
segundos despus de haber agregado el reactivo.
Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio no
producen indol, permanecern sin cambio alguno
(reaccin negativa).

PRUEBA DE INDOL

FUNDAMENTO:
TRIPTOFANASA
H2O + TRIPTOFANO

INDOL + AC. PIRUVICO + NH3

PROTOCOLO: Se inocula en caldo triptosa e incuba a 35 37C durante 24 horas.

Luego de este perodo, se aaden 5 gotas del reactivo de


Kovacs.

INTERPRETACIN:
NEGATIVO
POSITIVO NEGATIVO

POSITIVO

Produccin de sulfuro de hidrgeno:

Accin
sobre
las
proten
as

Primer da
Por la tcnica de puntura y estra,
siembra separadamente en el medio
TSA las cepas de E. coli y P. vulgaris.
Coloca una tira de papel de filtro
impregnada con acetato de plomo.
Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
Observa el ennegrecimiento del papel
de filtro, por la produccin del sulfuro
de hidrgeno (reaccin positiva).

Muchas bacterias producen sulfuro


de hidrgeno a partir de
aminocidos azufrados (cistena o
metionina) o tiosulfato.
La fermentacin de sulfhdrico
puede ser detectada incluyendo
hierro reducido en el medio para
formar un precipitado negro de
FeS
Se inocula un medio de agar
nutritivo conteniendo tiosulfato
metionina y sulfato ferroso.

Utilizacin del citrato:

Prueb
as
bioqu
micas
difere
nciale
s

Primer da
Siembra por la tcnica de estra en
cada tubo con las cepas de E.coli y
Enterobacter aerogenes.
Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
La prueba es positiva si observa
crecimiento bacteriano y un color azul
intenso del agar en 24 a 48 horas.
Es negativa si no hay crecimiento ni
cambio de color.

PRUEBA DE CITRATO
CITRATO

PIRUVATO

CO2 + Na + H2O

Agar Citratado de Simmons

PRUEBA

Na2CO3

Ph ALCALINO

AZUL DE
BROMOTIMOL

+
COLOR AZUL

PRUEBA DE CITRATO

PROTOCOLO
1.- Se inocula el agar de superficie inclinada con
una sola estra en la superficie.
2.- Se incuba a 35 - 37C durante 24 horas y se
realiza la lectura de la prueba.

PRUEBA DE CITRATO

INTERPRETACIN:
Es

positiva

cuando

se

observa crecimiento a lo
largo de la estra, y este se
acompaa
viraje

del

o no de un
indicador

de

verde a azul. El cambio de


color del medio a azul
indica
positiva.

una

reaccin

POSITIVO

NEGATIVO

Hidrlisis de la rea:

Prueba
s
bioqu
micas
diferen
ciales

Primer da
Por la tcnica de estra, siembra los
tubos con medio de urea con E.coli y
P.vulgaris. No inocular el fondo.
Rotula e incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
La prueba es positiva si el medio
presenta un color rosado en la
superficie o en todo el tubo.
La prueba es negativa, si el medio
permanece del color original.

PRUEBA DE LA UREASA

FUNDAMENTO:
UREASA

UREA

2 MOLCULAS DE NH4

pH ALCALINO

RESULTADOS

COLOR FUCSIA

ROJO DE FENOL

PRUEBA DE LA UREASA

PROTOCOLO:

1.- Se siembra el microorganismo en estudio en caldo urea o agar rea de


Cristensen.
2.- Se incuba a 35 - 37 C durante 24 horas.

INTERPRETACIN:

NEGATIVOPOSITIVO

NEGATIVO POSITIVO
Agar rea de Cristensen

Prueba de la catalasa:

Prueba
s
bioqu
micas
diferen
ciales

Con el asa de siembra en punta, picar


el crecimiento de uno de los tubos con
el cultivo de Staphylococcus aureus o
Streptococcus viridans, y transferir el
inculo a un portaobjetos limpio.
Aade de 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
Observa si se forman burbujas o no
inmediatamente despus que se
aade el reactivo.
Descarta la lmina en un recipiente
con desinfectante.

La catalasa es una enzima que proteje a las


clulas frente al perxido de hidrgeno
producido en el metabolismo del oxgeno.
Cataliza la formacin de agua y oxgeno a
partir del perxido de hidrgeno.
Es util para distinguir Streptococcus
(negativa) de Staphylococcus (positiva) y
Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva)
La actividad catalasa se detecta aadiendo
unas gotas de perxido de hidrgeno sobre
las colonias en placa que no sea de agar
sangre (dara falsos positivos). La
produccin de burbujas indica la presencia
del enzima.

Reaccin de la citocromo oxidasa:

Prueba
s
bioqu
micas
diferen
ciales

Con el asa de siembra en punta,


picar el crecimiento de uno de los
tubos con el cultivo de E.coli o Ps.
aeruginosa, y transferir el inculo
a una tira del reactivo de oxidasa.
Considera la prueba positiva
cuando los cultivos dan una
coloracin azul violceo intensa
en la tira, en un mximo de 5
segundos

La presencia de citocromo C
oxidasa en la cadena de
trasporte de e- puede
detectarse utilizando un
aceptor de e- artificial pfenilendiamina. Este test se
usa para diferenciar
pseudomonas (positivo) de
enterobacterias (negativo)
Se impregnan discos de papel
con parafenilandiamina y se
coloca en un cultivo creciendo
en placas de agar nutritivo.