Exerccios

Tcnicas Bio Mol 2

Voc foi contratado por uma empresa farmacutica para produzir insulina humana
recombinante. A empresa deseja produzir usando o sistema de expresso em leveduras e ainda
recebeu de outro laboratrio uma bactria contendo o plasmdeo pUC18 com o RNAm da
insulina humana, de 469 pares de base (REF NCBI Gene ID 3630, NM_000207), clonado no stio
de BamHI.

1. Como voc faz para ter certeza que a bactria que voc recebeu contm o plasmdeo
com a insulina humana clonada no stio de BamHI do pUC18 ?
2. O RNAm da insulina no possui stio para a enzima de restrio BamHI. Que tamanhos
de fragmentos vocs vai observar em eletroforese em gel de agarose se voc digerir o
pUC18 com o RNAm da insulina clonada com BamHI?
3. Quais as vantagens de produzir se produzir uma protena humana em levedura?
4. Descreva brevemente a funo, na produo de protena recombinante, dos segmentos
do vetor pPIC9K relacionados abaixo:

5AOX1 promoter fragment
fator alpha de secreo
Stio de clonagem
ORF HIS4
Gene resistncia a canamicina
Origem de replicao
Gene resistncia a ampicilina


5. Quais sero as etapas para construir o vetor pIC9K com o gene da insulina humana
clonado. Quais enzimas utilizaria, em que ordem, quando transforma bactria ou
levedura?

MCS

pBR322 origin: Origem de replicao em bactria

O Stio Mltiplo de Clonagem de pPIC9K possui um

stio para BamHI