Desenvolvimento
QUINTA EDIÇÃO
Biologia do
Desenvolvimento
QUINTA EDIÇÃO
Scott F. Gilbert
Swarthmore College
Tradução e Revisão
Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase Identificando moléculas de adesão celular e seu
em cadeia 66 papel no desenvolvimento 92
Determinando a função do gene: células e organismos Caderinas 92
transgênicos 69 CAMs da superfamília de imunoglobulinas 95
Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula 69 Moléculas da junção celular: proteínas da junção em
Camundongos quiméricos 70 fenda 97
Experimentos com genes com endereçamento A base molecular da afinidade célula-substrato 99
(Gene targeting ou Knockout) 70 Afinidade diferencial a substrato 99
Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense 73 A matriz extracelular 99
Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos 73 Receptores celulares para moléculas da matriz
Uma conclusão e um alerta 75 extracelular 104
Adesão diferencial resultante de sistemas de
Base celular da morfogênese: adesão múltipla 106
Q
Indução Vulvar no Nematóide Caenorhabditis
elegans 690
Informações adicionais & Especulações
desenvolvimento 733 19
Interações Célula-Célula e Possibilidade na Metamorfose: o direcionamento hormonal do
Determinação de Tipos Celulares 692 desenvolvimento 733
Metamorfose anfíbia 734
Controle hormonal da metamorfose de anfíbios 735
Desenvolvimento do membro
de tetrápode 701 18 Q
Respostas Moleculares aos Hormônios da Tireóide
Durante a Metamorfose 740
Informações adicionais & Especulações
Padronização no membro 701 Heterocronia 743
Formação do broto do membro 702 Metamorfose em insetos 746
O campo do membro 702 Eversão e Diferenciação dos Discos Imaginais 746
Especificação dos campos do membro: Genes Q Informações adicionais & Especulações
Hox e ácido retinóico 703 A determinação dos discos imaginais da perna
Crescimento do broto de membro precoce: fatores e da asa 750
Remodelação do sistema nervoso 753
xiv Tabela dos Conteúdos
da Quinta Edição inicia com uma visão geral das famílias do fator de cres-
cimento fibroblástico, TGF-β, Wnt e Hedgehog dos fatores de crescimento
e diferenciação.
Quarto, este livro está conectado a um website onde estudantes e pro-
fessores podem encontrar mais material em muitos tópicos selecionados.
Tal material inclui (1) detalhes de experimentos que são extremamente
especializados para serem colocados no texto, (2) informação histórica so-
bre áreas particulares da biologia do desenvolvimento e personalidades
envolvidas, (3) implicações médicas de fenômenos particulares do desen-
volvimento, (4) debates ou comentários em questões relevantes para o cam-
po, e (5) atualizações do material do texto nessa área da biologia de cresci-
mento cada vez mais rápido. Filmes e entrevistas gravadas estão incluídas
e esses artigos de destaque poderão ser expandidos à medida que a tecnologia
os tornar mais fáceis para serem usados. Esse website está conectado tam-
bém a outros websites e podem ser usados para enriquecer a perspectiva de
alguém sobre o que está acontecendo no desenvolvimento animal. A presen-
ça de um website nos permite manter o direcionamento deste livro às pesso-
as para as quais isso foi originalmente pretendido: estudantes dos últimos
anos da graduação e do início da pós-graduação. Ele também me ajudou a
não deixar o livro tornar-se um substituto para peso de papel.
A visão de Roux foi que a biologia do desenvolvimento “algum dia cons-
tituiria a base de todas as outras disciplinas biológicas e, em continuada
simbiose com essas disciplinas, desempenharia uma parte proeminente nas
soluções dos problemas da vida.” Essas foram palavras audaciosas, até mes-
mo arrogantes há cem anos atrás; hoje, elas expressam uma aceitação ampla-
mente sustentada. O desenvolvimento integra todas as áreas da biologia e
desempenha um papel crucial em relacionar o genótipo ao fenótipo. O desen-
volvimento pode ser estudado usando qualquer organismo e em qualquer
nível de organização, de moléculas a filos.
À medida que o campo continuar a se expandir e se aprofundar , uma
palavra de advertência é requerida: a biologia do desenvolvimento não pode
ser aprendida ou ensinada em um único semestre. Este texto é uma tentati-
va para prover cada pessoa com material suficiente para seu curso, mas um
instrutor não necessita se sentir culpado por não determinar todos os capí-
tulos, e os estudantes não necessitam se sentir privados se eles não lerem
todos os capítulos. Isto é o começo do caminho, não sua conclusão.
http://zygote.swarthmore.edu/intro2.html
Agradecimentos
Esta edição, como suas precursoras, deve muito às sugestões e críticas dos
estudantes em minhas classes de biologia do desenvolvimento e genética
do desenvolvimento. O grupo de funcionários e docentes extremamente
corporativo da Universidade Swarthmore também desempenharam pa-
péis importantes na produção deste livro, e os bibliotecários da área de
ciência E. Horikawa e M. Spencer merecem agradecimentos especiais por
terem segurado volumes recentes na biblioteca enquanto eu estava escre-
vendo o livro. Os cientistas que revisaram estes capítulos forneceram enor-
me ajuda tanto na precisão técnica dos capítulos quanto nas sugestões
para trabalho futuro. Esses investigadores incluem: S. Carroll, J. Cebra-
Thomas, E. M. De Robertis, S. DiNardo, E. Eicher, C. Emerson, G. Grunwald,
D. J. Grunwald, M. Hollyday, L. A. Jaffe, W. Katz, R. Keller, K. Kemphues, D.
Kirk, G. Martin, H. F. Nijhout, D. Page, R. Raff, R. Schultz, C. Stern, S.
Tilghman, R. Tuan e M. Wickens. Eu também quero agradecer aos muitos
cientistas que desviaram do seu caminho para ajudar a tornar esta edição
melhor lendo porções específicas dos capítulos. Eles incluem: M. Bronner-
Fraser, J. Fallon, N. M. Le Douarin, E. McCloud, J. Opitz, K. Sainio, H. Sariola,
I. Thesleff e T. Valente. Se eu deixei alguém fora, por favor me desculpem. É
desnecessário dizer que os julgamentos editoriais finais foram de minha
responsabilidade. Meus agradecimentos especiais a Judy Cebra-Thomas
que não somente me aconselhou em certos capítulos mas quem deu exce-
lente ajuda durante meu período sabático permitindo-me terminar este
livro. Agradecimentos também aos cientistas e filósofos, especialmente: C.
van der Weele, R. Amundson, L. Nyhart, R. Burian, H. F. Nijhout, A. F.
Sterling, K. Smith e A. I. Tauber, que participaram nos workshops de biolo-
gia do desenvolvimento da Sociedade Internacional para a História, Filo-
sofia e Estudos Sociais da Biologia. Algumas das melhores críticas cons-
trutivas deste livro-texto vieram dessas pessoas.
Andy Sinauer uma vez mais conseguiu reunir as mesmas e extraor-
dinárias pessoas neste projeto, e foi um privilégio trabalhar com eles. Meus
agradecimentos a ele e aos editores Nan Sinauer e Carol Wigg, coordenador
de produção Chris Small, artistas John Woolsey e Gary Welch, designer
Susan Schmidler, editor de texto Janet Greenblatt, e artista de layout Janice
Holabird. As habilidades editoriais de Tinsley Davis são extremamente re-
conhecidas. Devido ao fato de que os prazos finais devem ser cumpridos e
outro trabalho posto de lado, eu tenho que agradecer minha família por
mais uma vez me permitir prosseguir com isso. Em particular, este livro
nunca poderia ter sido completado se não fosse pelo encorajamento de mi-
nha esposa, Anne Raunio, que, como uma obstetra, gosta do lado mais prá-
tico da biologia do desenvolvimento. Meus agradecimentos a todos vocês.
SCOTT F. GILBERT
1 DE MARÇO DE 1997
Introdução à Biologia
do Desenvolvimento
1 Introdução ao desenvolvimento animal 1
2 Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 35
3 Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 79
I
CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 1
1
2 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
níveis molecular e químico (p. ex., Como os genes globina são transcritos, e como os
fatores que ativam sua transcrição interagem uns com os outros e com o DNA?), a níveis
celular e tissular (p. ex., Quais são as células capazes de produzir globina, e como o
mRNA da globina deixa o núcleo?), a nível de órgãos ou sistema de órgãos (p. ex., Como
vasos capilares são formados em cada tecido, e como são instruídos a se conectarem e
ramificarem?) e, até mesmo, a níveis ecológicos e evolucionários (p. ex., Como diferenças
na ativação do gene globina permitem o fluxo de oxigênio da mãe para o feto, e como
fatores ambientais acionam a diferenciação de mais hemácias?). Biologistas do desen-
volvimento podem estudar qualquer organismo e todo tipo de célula.
Biologia do desenvolvimento é um dos campos que mais tem crescido e também
um dos mais emocionantes da biologia. Parte dessa emoção vem dos assuntos estu-
dados, porque estamos apenas começando a entender o mecanismo molecular do
desenvolvimento animal. Outra parte da emoção vem do papel unificador que a biolo-
gia do desenvolvimento assume nas ciências biológicas. A biologia do desenvolvi-
mento está criando uma estrutura que integra a biologia molecular, fisiologia, biologia
celular, anatomia, pesquisa do câncer, neurobiologia, imunologia, ecologia, e biologia
evolucionária. O estudo do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreensão
de qualquer área da biologia.
Esperma-
tozóide
Mórula
Blástula
Oócito Local das células
embrionárias
Célula germinativa
(“Germ plasm”)
Esperma- Blastocele
tozóide
(gameta Oócito
masculino) (gameta
feminino)
GAMETOGÊNESE
Adulto
sexualmente maduro
Blastóporo
Ectoderma
Gônada
Mesoderma
Estágios
Endoderma
larvais
imaturos
INCUBAÇÃO (NASCIMENTO)
Figura 1.1
Histórico do desenvolvimento de um repre-
sentante animal, um sapo. Estágios que vão
da fertilização até o nascimento são coletiva-
mente conhecidos como embriogênese. As
regiões responsáveis por produzir células em-
brionárias são mostradas em cores. Gameto-
gênese, que é completa no adulto sexualmen-
te maduro, começa em épocas diferentes, de-
pendendo da espécie. revestimento do tubo digestivo e órgãos associados (pâncreas, fígado, pul-
mões, etc.); e o mesoderma, camada do meio, dá origem a diversos órgãos
(coração, rins, gônadas), tecidos conjuntivos (ossos, músculos, tendões, va-
sos sangüíneos) e células sangüíneas.
3. Uma vez que as três camadas embrionárias estão estabelecidas, as células
interagem umas com as outras e se reorganizam para produzir tecidos e órgãos.
Esse processo é chamado organogênese. (Nos vertebrados, a organogênese é
iniciada quando uma série de interações celulares induzem as células ectodér-
micas da porção mediana do dorso a formar o tubo neural. Esse tubo originará
o cérebro e a coluna vertebral). Muitos órgãos contêm células de mais de uma
camada embrionária, e não é incomum o exterior de um órgão ser derivado de
uma determinada camada e o interior de outra. Também durante a organogênese,
CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 5
algumas células sofrem longas migrações do seu lugar de origem até sua loca-
lização final. Essas células migrantes incluem os precursores das células san-
güíneas, células linfáticas, células pigmentadas e gametas. A maior parte dos
ossos de nossa face são provenientes de células que migraram ventralmente
da região dorsal da nossa cabeça.
4. Como observado na Figura 1.1, em muitas espécies, uma parte especializada
do citoplasma do ovo dá origem às células que são precursoras dos gametas.
Essas células são chamadas de células germinativas, sendo destinadas à
função reprodutiva. Todas as outras células do corpo são chamadas células
somáticas. Essa separação entre células somáticas (que dão origem a um
corpo individual) e células germinativas (que contribuem para a formação de
uma nova geração) é freqüentemente uma das primeiras diferenciações que
ocorrem durante o desenvolvimento animal. As células germinativas final-
mente migram para as gônadas, onde se diferenciam em gametas. O desen-
volvimento de gametas, chamado de gametogênese, normalmente não é com-
pletado até que o organismo tenha se tornado fisicamente maduro. Na matu-
ridade, os gametas podem ser liberados e participar de uma fertilização dando
início a um novo embrião. O organismo adulto finalmente sofre envelheci-
mento e morre.
Processamento de RNA
mRNA mRNA
Tradução
Citoplasma Tradução
mRNA mRNA
Proteína Proteína
Prófase:
O envoltório nuclear
quebra e um fuso se forma
entre dois centríolos.
Prometáfase:
Interfase: DNA é duplicado em Os cromossomos se
preparação para a divisão celular. ligam às fibras dos fusos.
Cromatídeos do
cromossomo
Núcleo Cromatina Nucléolo
Região do centrômero
Fuso em
desenvolvimento
Centríolos
Áster
Envoltório Envoltório
nuclear nuclear
Nucléolo rompe
Cromossomos filhos
Metáfase:
Os cromossomos se
alinham no equador da célula.
Telófase:
Os cromossomos atingem
os pólos mitóticos e a célula
começa a invaginar.
Figura 1.3
Diagrama de mitose em células animais. Du-
Anáfase:
Os cromossomos duplicados
rante a interfase o DNA é duplicado em pre-
(chamados cromatídeos) são paração para a divisão celular. Durante a
separados. prófase, o envoltório nuclear quebra e for-
ma-se um fuso entre os dois centríolos. Na
nucleados e anucleados (revisão por Wilson, 1986). Quando vários protistas foram metáfase, os cromosssomos se alinham no
equador da célula e se inicia a anáfase, os
fragmentados, quase todas as partes morreram. No entanto, os fragmentos que conti-
cromossomos duplicados (cada duplicata de
nham núcleo foram capazes de sobreviver, regenerando todo a complexa estrutura cromossomo é um cromatídeo) são separa-
celular (Figura 1.5) dos. Na telófase os cromossomos atingem
O controle nuclear da morfogênese celular e a interação do núcleo e citoplasma os pólos mitóticos e a célula começa a
estão muito bem demonstrados nos estudos da Acetabulária. Essa enorme célula invaginar. Cada pólo contém o mesmo núme-
individual (2 a 4 cm de comprimento) consiste de três partes: o disco reprodutivo, o ro e tipos de cromossomos que continha a
pedúnculo e o rizóide (Figura 1.6A). O rizóide está localizado na base da célula onde célula antes da divisão.
essa é presa ao substrato. O núcleo individual da célula se localiza dentro do rizóide. O
tamanho da Acetabulária e a localização do seu núcleo permitiram que pesquisadores
8 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Figura 1.4
Transcrição e tradução simultânea em procariotos. Uma porção de DNA de Escherichia coli se
estende horizontalmente por essa microfotografia eletrônica. Transcrições de RNA mensageiro
podem ser vistas dos dois lados. Ribossomos se juntaram ao mRNA e estão sintetizando
proteínas (que não podem ser vistas). O mRNA pode ser visto aumentando de tamanho, da
esquerda para a direita, indicando a direção da transcrição. (Cortesia de O. L. Miller, Jr.)
removessem o núcleo de uma célula e o substituísse por outro, de outra célula. Nos
anos 30, J. Hämmerling tirou proveito dessa singular característica e trocou núcleos
entre duas espécies morfologicamente distintas, A. mediterranea e A. crenulata. Como
é mostrado na fotografia, essas duas espécies têm discos reprodutivos muito diferen-
tes. Hämmerling descobriu que quando um núcleo de uma determinada espécie era
transplantado para o pedúnculo de outra, o novo disco em formação finalmente assu-
mia a forma associada com o núcleo do doador (Figura 1.6B). Assim, foi considerado
que o núcleo era o controlador do desenvolvimento da Acetabulária.
A formação de um disco reprodutivo é um evento morfogênico complexo, envol-
vendo a síntese de um grande número de proteínas, que devem ser acumuladas em
certa porção da célula e então organizadas em estruturas complexas específicas da
espécie. O núcleo transplantado da célula realmente direciona a síntese de seu disco
reprodutivo espécie-específico, mas é uma tarefa que pode levar semanas para ser
realizada. Além disso, se o núcleo for removido da célula de Acetabulária em estágio
inicial do desenvolvimento, antes de formar o disco reprodutivo, um disco normal se
formará semanas depois, ainda que o organismo irá morrer. Esses estudos sugerem
que (1) o núcleo contém informação específica sobre o tipo de disco reprodutivo
produzido (isto é, contém informação genética que especifica as proteínas necessári-
as para a produção de um certo tipo de disco reprodutivo), e (2) o material contendo
essa informação entra no citoplasma muito antes dessa produção ocorrer. A informa-
ção no citoplasma não será usada por várias semanas.
Fragmento
anucleado morre
Corte
Fragmento
Núcleo nucleado
se regenera
Corte
Figura 1.5
Regeneração do fragmento nucleado do protista unicelular
Stylonychia. Os fragmentos anucleados sobrevivem por al- Fragmento
gum tempo, mas finalmente morrem. anucleado morre
CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 9
(B)
Disco
reprodutivo
(A)
Disco
reprodutivo
Pedúnculo
A. crenulata A. mediterranea
Pedúnculo Núcleos transplantados
Núcleo Núcleo
Rizóide
Rizóide Rizóide
1 cm 1 cm A estrutura do disco
reprodutivo é a do
núcleo doador
Figura 1.6
(A) Acetabulária mediterranea (esquerda) e A.
crenulata (direita). Cada unidade é uma célula singu-
lar. O rizóide contém o núcleo. (B) Efeitos da troca de
núcleos entre duas espécies de Acetabulária. Núcleos
foram transplantados para fragmentos de rizóides
anucleados. Estruturas de A. crenulata estão sombre-
adas; estruturas de A. mediterranea não estão som-
breadas. (Fotografias cortesia de H. Harris.)
Uma hipótese atual, proposta para explicar essas observações, é que o núcleo sintetiza
um mRNA estável, posicionado em estado dormente no citoplasma até a formação do
disco reprodutivo. Essa hipótese é amparada por uma observação publicada por Hämmerling
em 1934. Hämmerling fracionou uma Acetabulária jovem em diversas partes (Figura 1.7). A
porção com o núcleo finalmente formou um novo disco, conforme esperado; da mesma
forma o fez a extremidade apical do pedúnculo. No entanto, a parte intermediária do pedún-
culo não formou o disco reprodutivo. Por isso, Hämmerling postulou (aproximadamente 30
anos antes de sabermos da existência do mRNA), que as instruções para a formação do
disco reprodutivo se originavam no núcleo, sendo de alguma forma guardadas dormen-
tes próximo à extremidade do pedúnculo. Muitos anos mais tarde, Kloppstech e
Schweiger (1975) estabeleceram que o mRNA derivado do núcleo se acumula nessa
região. Ribonuclease, uma enzima que cliva RNA, inibe completamente a formação do
disco reprodutivo quando adicionada à água marinha na qual cresce a Acetabulária. Em
células anucleadas, esse efeito é permanente; uma vez que o RNA é destruído, não pode
mais haver a formação do disco reprodutivo. Em células nucleadas, no entanto, um novo
disco pode ser formado após a eliminação da ribonuclease, presumivelmente porque um
novo mRNA é então produzido pelo núcleo. Garcia e Dazy (1986) também demonstraram
que a síntese da proteína é especialmente ativa no ápice da Acetabulária.
Fica claro pela discussão anterior, que a transcrição nuclear tem um papel impor-
tante na formação do disco reprodutivo da Acetabulária. Mas deve ser notado que o
10 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Disco reprodutivo e
pedúnculo regenerados
Extremidade
apical do
pedúnculo
Porção central
do pedúnculo Sem regeneração
Rizóide
e núcleo
Regeneração total
Figura 1.7
Habilidade regenerativa de diferentes fragmentos da A. mediterranea
citoplasma também cumpre uma parte essencial na formação desse disco. O mRNA
não é traduzido durante semanas, mesmo estando no citoplasma. Algo no citoplasma
controla quando as mensagens devem ou não ser utilizadas. Portanto, a expressão do
disco reprodutivo é controlada não somente pela transcrição nuclear como também
pelo controle de tradução do RNA citoplasmático. Nesse organismo unicelular, o
“desenvolvimento” é controlado em ambos estágios de transcrição e de tradução.
Figura 1.8
Transformação de Naegleria gruberi da forma
em seu estágio de ameba. É produzida de novo (“desde o começo”), começando com amebóide ao estado flagelado. Linha superior
uma nova transcrição no núcleo. Para mostrar isso, os pesquisadores manipularam corada com Iodo/Lugol; linha inferior corada
com um anticorpo fluorescente à proteína tu-
transcrições em vários estágios com actinomicina D, uma droga antibiótica que seleti-
bulina dos microtúbulos. A transformação é
vamente inibe a síntese do RNA. Quando adicionada anteriormente à diluição do iniciada pela eliminação do alimento (bactéri-
alimento, esse antibiótico previne a síntese da tubulina. No entanto, se a actinomicina as) da colônia de Naegleria. (A) 0 minutos;
D é adicionada 20 minutos após a diluição, a tubulina ainda é produzida em tempo (B) 25 minutos, mostrando síntese de nova
normal (aproximadamente 30 minutos mais tarde). Portanto, parece que o mRNA para tubulina; (C) 70 minutos, emergência de
a tubulina foi produzido durante os primeiros vinte minutos após a diluição e usado flagelos visíveis (D) 120 minutos, mostrando
logo em seguida. Essa interpretação foi confirmada quando foi demonstrado que o flagelos maduros e forma aerodinâmica do cor-
mRNA extraído da ameba não continha mensagem alguma, detectável para tubulina po (de Walsh, 1984, cortesia de C. Walsh.)
flagelar, ao passo que mRNA extraído de células diferenciadas continha muitas mensa-
gens desse tipo (Walsh, 1984).
Então, temos aqui um excelente exemplo de controle transcricional de um proces-
so de desenvolvimento: O núcleo da Naegleria responde a mudanças ambientais
sintetizando o mRNA para tubulina flagelar. Notamos também um outro processo que
permanece extremamente importante no desenvolvimento de todos os outros animais
e plantas, que é o agrupamento de moléculas de tubulina para a produção do flagelo.
Esse arranjo, pelo qual a tubulina é polimerizada em microtúbulos, e esses por sua vez
agrupados de forma ordenada, é visto em toda a natureza. Em mamíferos, está evidente
no flagelo do espermatozóide e nos cílios da medula espinhal e do trato respiratório.
Mais ainda, não é somente a tubulina que produz o flagelo. Existem em torno de 300
outras proteínas em cada flagelo, e o movimento flagelar depende da orientação ade-
quada dessas proteínas uma em relação a outra. Até mesmo processos celulares têm a
sua própria “morfogênese” baseada em interações moleculares entre os fragmentos
de proteína. Tal controle pós-tradução, onde uma proteína não é funcional até que
esteja ligada a outras moléculas, será discutido melhor mais tarde. Vimos então, que o
desenvolvimento em eucariotos unicelulares pode ser controlado nos estágios de
transcrição, tradução e pós-tradução.
12 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Figura 1.9 os
Diferenciação do fenótipo flagelado em rp
co m
Naegleria. Amebas que vinham crescendo a de po ça
in o or lar an
em um meio enriquecido com bactéria são ul t
en las
c c
b
tu e ç a ei
s
de ag
e al n t o
lavadas afim de se eliminar as bactérias no da o m p am élu dam s ív o a fl l os m e
u c n v i ã e i
e c
es r gr s, o aç rm ag r
tempo 0. Aos 80 minutos, praticamente toda
í nt e l a A asai rred e lo
s
rm fo Fl o m p l
o
a população desenvolveu flagelo. (Segundo S ag b a ag F m c ta
fl se Fl co to
Fulton, 1977.)
100
40
20
0
0 20 40 60 80 100
Tempo após suspensão (minutos)
Micronúcleo Fuso
meiótico
Macronúcleo
Ponte
citoplasmática
Dois paramécios Micronúcleos passam Todos menos um
formam por meiose, formando 8 dos micronúcleos de
ponte citoplasmática núcleos haplóides por célula; cada parceiro degeneram
macronúcleos degeneram
Micronúcleo
estacionário
Micronúcleo
migratório
Figura 1.11
União de paramécios através da ponte citoplasmática, onde dois paramécios podem trocar
material genético, deixando cada um com genes que diferem daqueles com os quais iniciaram o
processo. (Strickberger, 1985.)
Acasalamento
Fusão citoplasmática
Zigoto (diplóide)
Maturação (meiose)
Germinação
Figura 1.13
Sumário da meiose. O DNA e as proteínas associadas replicam durante a interfase. Durante a
prófase, o envoltório nuclear se rompe e os cromossomos homólogos (cada cromossomo é
duplicado, com os cromatídeos juntos no centrômero) se alinham em pares. Reagrupamentos
cromossômicos podem ocorrer entre quatro cromatídeos homólogos nesse estágio. Após a
primeira metáfase, os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células dife-
rentes. Durante a segunda divisão, o centrômero se divide, deixando cada nova célula com uma
cópia de cada cromossomo.
MEIOSE I
Esse tubo conecta e se funde com um local específico no indivíduo menos. É interes-
sante que o mecanismo usado para estender esse tubo - polimerização da proteína
actina - também é usado para estender processos do espermatozóide e óvulo do
ouriço-do-mar. No Capítulo 4, veremos que o reconhecimento e fusão de espermato-
zóide e óvulo ocorrem de uma maneira espantosamente semelhante a desses protistas.
Eucariotos unicelulares parecem ter os elementos básicos do processo de desen-
volvimento que caracterizam os organismos mais complexos: a síntese celular é con-
trolada pela regulação transcricional, por tradução e pós-tradução; existe um mecanis-
mo para processar o RNA através da membrana nuclear; as estruturas de genes indi-
viduais e cromossomos são como serão através da evolução eucariótica; mitose e
meiose são aperfeiçoadas; e a reprodução sexual existe, envolvendo a cooperação
entre células individuais.Tal cooperação intercelular se torna ainda mais importante
com a evolução de organismos multicelulares.
MEIOSE II
As Volvocaceanas
Os organismos mais simples entre as volvocaceanas são reuniões ordenadas de nu-
merosas células, cada uma parecida ao protista unicelular Chlamydomonas. Um único
organismo de volvocacea do gênero Gonium (Figura 1.15), por exemplo, consiste de
uma placa plana contendo de 4 a 16 células, cada uma com seu próprio flagelo. Em um
gênero relacionado, Pandorina, 16 células formam uma esfera; e no Eudorina, a esfe-
ra contém 32 ou 64 células organizadas em um padrão regular. Nesses organismos, um
princípio muito importante tem-se desenvolvido: a divisão ordenada de uma célula
para gerar um número de células que são organizadas de uma maneira previsível.
Como ocorre na maioria dos embriões animais, as divisões celulares pelo qual uma
única célula de volvocacea produz um organismo de 4 a 64 células ocorrem em uma
seqüência muito rápida e com ausência de crescimento celular.
Os dois próximos gêneros da série volvocacea exibem um outro princípio impor-
tante do desenvolvimento: a diferenciação de tipos celulares em organismo indivi-
dual. As células reprodutivas se diferenciam das células somáticas. Em todos os
gêneros já mencionados, toda a célula pode, e normalmente o faz, produzir um organis-
mo novo completo por mitose (Figura 1.16 A,B). Nos gêneros Pleodorina e Volvox,
porém, relativamente poucas células podem se reproduzir. Na Pleodorina californica,
as células da região anterior são restritas à uma função somática; somente aquelas
Figura 1.15
Representante da ordem dos Volvocales. (A)
o protista unicelular Chlamydomonas rei-
nhardtii. (B) Gonium pectorale com oito cé-
lulas Chlamydomonas-símiles em um disco
convexo. (C) Pandorina morum. (D) Eudo-
rina elegans. (E) Pleodorina californica. Aqui
todas as 64 células são originalmente simila-
res, mas as posteriores desdiferenciam e redi- (A) (B) (C)
ferenciam como células assexuadas reprodu-
tivas chamadas gonídios, enquanto as células
anteriores permanecem pequenas e biflagela-
das, como o Chlamydomonas. (F) Volvox
carteri. Aqui, células destinadas a se torna-
rem gonídios são separadas no começo do
desenvolvimento e nunca desenvolvem carac-
terísticas somáticas. As células menores,
somáticas, lembram Chlamydomonas. Todas,
menos o Chlamydomonas, são membros da
família das Volvocaceas. A complexidade au-
menta do Chlamydomonas unicelular ao
Volvox pluricelular. Barra em A é de 5µm; B-
D, 25µm; E, F, 50µm (Cortesia de D. Kirk.) (D) (E) (F)
CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 17
Figura 1.16
Reprodução assexuada nas volvocaceanas. (A)
Colônia madura de Eudorina elegans. (B) Cada
uma das células de E. elegans se divide e pro-
duz uma nova colônia. (C) Volvox carteri ma-
duro. A maioria das células são incapazes de se
reproduzir. Células germinativas (gonídia) co-
meçaram a se dividir em novos organismos. (A
e B segundo Hartmann,1921; C de Kirk et al.,
(A) (B) (C)
1982, cortesia de D. Kirk.)
Informações adicionais
& Especulações
Adulto com
juvenis
Adulto com
gonídios maduros
Maturação
dos gonídios Expansão continuada
da matriz extracelular
(E) (J)
Indutor
sexual
Espermatozóide
Indutor
Zigotos
sexual
Óvulo
sexual indutiva de 30-kDa. Essa proteína tando placas com V. carteri à temperaturas de aparecer, multiplicar-se, realizando uma
é tão poderosa que concentrações meno- que poderiam ser encontradas em um reser- orgia sexual reprodutiva em poças de água
res que 6x10-17 fazem com que os gonídios vatório raso durante o fim do verão. Quan- da chuva de apenas duas semanas”
sofram um padrão modificado de desen- do isso era feito, as células somáticas dos (Powers, 1908). Ainda que reservatórios tem-
volvimento embrionário que resulta na volvox assexuados produziam a proteína porários formados pela água das chuvas se-
produção de óvulos ou espermatozóides, sexual indutora. Sendo a quantidade da pro- quem sob o calor do verão, Volvox encon-
dependendo do sexo genético do indiví- teína secretada por um indivíduo suficiente trou um meio de sobrevivência: usa o calor
duo (Sumper et al.,1993). Os espermato- para iniciar o desenvolvimento sexual em para induzir a formação de indivíduos sexu-
zóides são liberados para nadar para a fê- mais de 500 milhões de volvox assexuados, ados cujo acasalamento produz zigotos ca-
mea onde fertilizam os óvulos para pro- um único volvox indutor pode converter um pazes de sobreviver sob condições que ma-
duzir zigotos dormentes (Figura 1.21). reservatório inteiro para a sexualidade. Essa tam o organismo adulto. Observamos, tam-
Qual é a fonte dessa proteína indutora descoberta explica uma observação feita há bém, que o desenvolvimento está critica-
sexual? Kirk e Kirk (1986), descobriram que quase 90 anos, de que “na intensa radiação mente ligado ao ecossistema ao qual o or-
o ciclo sexual poderia ser iniciado esquen- solar do verão de Nebraska, Volvox é capaz ganismo se adaptou para sobreviver.
Lesma
(Pseudoplasmódio; grex)
15 h
16 h
14 h
17 h
CULMINAÇÃO 20 h
MIGRAÇÃO
12 h
Esporos
23 h
10 h
AGREGAÇÃO
Mixamebas Fluxos
9 h celulares
Corpo de frutificação maduro
6 h
24h
Figura 1.22
Ciclo vital de Dictyostelium discoideum. Esporos haplóides originam mixamebas, que podem
reproduzir-se assexualmente para formar mais mixamebas haplóides. A medida que diminui o
suprimento alimentar, ocorre agregação em pontos centrais, e forma-se um agregado de
pseudoplasmódio. Finalmente, esse pára de se movimentar e forma um corpo de frutificação
que libera mais esporos. Os números referem-se às horas decorridas desde que a diluição
nutricional iniciou a seqüência desenvolvimental.
(C)
(D)
Figura 1.23
Quimiotaxia de amebas de Dictyostelium de-
vida à ondas espirais de cAMP. (A) estrutura
resultado é uma onda giratória em espiral de cAMP, que se propaga através da química do cAMP. (B) Visualização de várias
população de células (Figura 1.23B-D). À medida que chega cada onda, as células dão “ondas” de cAMP no meio. Células centrais
secretam cAMP em intervalos regulares, e
mais um passo para o centro.*
cada secreção difunde para fora como um onda
A diferenciação de amebas individuais em células pedunculares (somáticas) ou concêntrica. As ondas são mapeadas saturan-
esporos (reprodutivas) é uma questão complexa. Raper (1940) e Bonner (1957) de- do-se papel de filtro com cAMP radioativo e
monstraram que as células anteriores normalmente formam pedúnculo, enquanto as colocando-o sobre uma colônia em agregação.
células remanescentes, posteriores, em geral estão destinadas a formar esporos. No O cAMP das células secretoras dilui o cAMP
entanto, a remoção cirúrgica da parte anterior da lesma não elimina a capacidade do radiativo. Quando a radioatividade no papel
grex formar um pedúnculo. Em vez disso, as células que agora se encontram no final é registada (colocando-o sobre filme de raios-
anterior após a cirurgia (e que originalmente estavam destinadas a formar esporos), X), as regiões de alta concentração de cAMP
agora formam o pedúnculo (Raper, 1940). De alguma maneira, é tomada uma decisão de na cultura aparecem mais claras que aquelas
de baixa concentração de cAMP. (C,D) On-
modo tal, que células anteriores virem células pedunculares e células posteriores
das espirais de amebas movendo-se em dire-
virem esporos. Essa habilidade de células mudarem seus destinos desenvolvimentais, ção à fonte inicial de cAMP. (C) Essa
microfotografia em campo escuro processa-
da digitalmente mostra cerca de 107 células.
* A bioquímica dessa reação envolve um receptor que liga o cAMP. Quando essa ligação Como células móveis e imóveis dispersam a
ocorre, realiza-se transcrição específica de genes, é iniciada movimentação em direção à fonte de luz diferentemente, a fotografia reflete movi-
cAMP, e enzimas adenilciclases (que sintetizam cAMP a partir de ATP) são ativadas. O cAMP mento celular. As bandas claras são compos-
recém-formado ativa seus receptores próprios, assim como aqueles de seus vizinhos. As células tas de células migratórias alongadas; as ban-
na área permanecem insensíveis às novas ondas de cAMP até que o cAMP ligado seja removido das escuras são células que pararam de se
dos receptores por outra enzima da superfície celular, a fosfodiesterase (Johnson et al., 1989). mover e se arredondaram. (D) As células for-
A matemática de tais reações de oscilação prevê que a difusão de cAMP seria inicialmente mam correntes, a espiral de movimento ainda
circular. Porém, à medida que o cAMP interage com as células que recebem e propagam o sinal, pode ser vista movendo-se em direção ao cen-
as células que recebem a parte frontal da onda começam a migrar com uma velocidade diferente
daquela das células atrás delas. O resultado é a espiral rotatória de cAMP e a migração vistas na tro. (B de Tomchick e Devreotes, 1981, cor-
Figura 1.23. É interessante que as mesmas fórmulas matemáticas predizem o comportamento de tesia de P. Devreotes; C e D de Siegert e Weijer,
certas reações químicas e a formação de novas estrelas em galáxias espirais rotatórias (Tyson e 1989, cortesia de F. Siegert.)
Murray, 1989).
24 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Figura 1.24
Células de Dictyostelium sintetizam um adesivo, glicoproteína 24-kDa, pouco após a inanição
nutricional. Células de Dictyostelium foram coradas com um anticorpo fluorescente que se liga
à glicoproteína 24-kDa e foram em seguida observada sob luz ultravioleta. Essa proteína não foi
vista em amebas que tinham apenas parado de se dividir. No entanto, como mostrado aqui – 10
horas após o fim da divisão celular – amebas individuais são vistas apresentando essa proteína
em suas membranas celulares e são capazes de aderir umas às outras.
de acordo com sua localização dentro do organismo inteiro, e assim compensar por
partes faltantes, é chamada regulação. Veremos esse fenômeno em muitos embriões,
inclusive naqueles dos mamiferos.
Informações adicionais
& Especulações
Evidência e Anticorpos
A Biologia, tal como qualquer outra Como então ir para além da mera cor- teínas de membrana em geral). Nesse
ciência, não trata de fatos; antes, relação? No estudo da adesão celular em caso, bloquear a glicoproteína também
trata de evidências. Vários tipos Dictyostelium, o próximo passo foi usar causaria a inibição da agregação celu-
de evidência serão apresentados neste li- aqueles mesmos anticorpos para bloque- lar. Assim, a evidência perda-de–função
vro; não são todos de equivalente vigor. ar a adesão de mixamebas. Usando uma precisa ser amparada por muitos con-
Como exemplo, vamos usar a análise da técnica introduzida pelo laboratório de troles demonstrando que agentes cau-
adesão celular em Dictyostelium. O primei- Gerisch (Beug et al., 1970), Knecht e cola- sadores de perda de função derrubam
ro e mais fraco tipo de evidência é a evi- boradores (1987) tomaram os anticorpos especificamente aquela função em par-
dência correlativa. Aqui, são feitas corre- que ligam essa glicoproteína 24-kDa e iso- ticular, e nada mais.
lações entre dois ou mais eventos, e infe- laram seus sítios ligantes de antígeno (as O tipo mais forte de evidência é evi-
re-se que um evento estimule o outro. partes da molécula do anticorpo que re- dência-de-ganho-de-função. Aqui, o iní-
Como vimos, anticorpos marcados com flu- conhecem o antígeno). Isso foi necessá- cio do primeiro evento estimula um segun-
orescência para uma certa glicoproteína de rio porque o todo da molécula de anticor- do e mesmo em situações onde nenhum
24 kDa, não marcam células vegetativas em po contém dois sítios ligantes de antígeno desses eventos ocorre usualmente. Recen-
divisão; porém, esses mesmos anticorpos que iriam ligar-se artificialmente de manei- temente, da Silva e Klein (1990) e Faix e
acham a proteína em membranas celulares ra cruzada e aglutinar as mixamebas. Quan- colaboradores (1990) obtiveram tal evidên-
de mixameba logo que as células param de do esses fragmentos ligantes de antígeno cia para mostrar que a glicoproteína 80-kDa
se dividir e tornam-se competentes para (chamados Fragmentos Fab) foram adici- é uma molécula adesiva. Isolaram o gene
agregar (veja Figura 1.24). Assim, existe uma onados às células competentes para agre- para essa proteína e o modificaram de uma
correlação entre a presença dessa glico- gação, as células não puderam se agre- maneira a motivá-lo ser expresso continu-
proteína da membrana celular e a capaci- gar. Os fragmentos de anticorpo impedi- amente. Em seguida, recolocaram-no em
dade de agregação. ram as células de aderir entre si, presu– mixameba bem-alimentada, crescendo ve-
Evidência correlativa dá um ponto de mivelmente por ligar–se a glicoproteína getativamente, que usualmente não expres-
partida para investigações, mas não se 24-kDa, bloqueando sua função. Esse tipo sa essa proteína e não tem capacidade de
pode afirmar com certeza que um evento de evidência é chamado evidência-de- adesão. A presença dessa proteína na mem-
estimula outro somente baseado em cor- perda-de-função. Se bem que mais forte brana celular dessas células em divisão foi
relações. Embora se possa inferir que a que a evidência correlativa, ela ainda não confirmada por marcação com anticorpos.
síntese dessa proteína causa a adesão das exclui outras inferências. Por exemplo, é Tais células agora aderiram umas às outras
células, é também possível que adesão ce- possível que os anticorpos tenham mata- mesmo nos estados vegetativos, o que nor-
lular leve as células a sintetizar essa nova do a célula (o que poderia acontecer se a malmente não fazem. Assim, elas tinham
glicoproteína, ou que a adesão celular e a glicoproteína 24-kDa for um crítico canal ganho uma função adesiva somente por
síntese da glicoproteína 24-kDa sejam de transporte). Isso também impediria a expressar essa glicoproteína em particular
eventos separados, iniciados pela mesma adesão celular. Ou talvez, a glicoproteína nas suas superfícies celulares. Essa evi-
causa subjacente. A ocorrência simultâ- 24-kDa nada tinha a ver com a adesão pro- dência de ganho-de-função é mais convin-
nea dos dois eventos pode mesmo ser co- priamente, mas é necessária para o funci- cente que outros tipos de análise. Experi-
incidência e os eventos não terem relação onamento da verdadeira molécula adesi- mentos semelhantes foram recentemente
um com o outro.* va (como através da estabilização de pro- realizados em células de mamíferos (veja
capítulo 3), para demonstrar a presença de
* Em uma carta irônica, caçoando de tais inferências correlativas, Sies (1988) demonstrou uma determinadas moléculas adesivas celula-
notável boa correlação entre o número de cegonhas vistas na Alemanha Ocidental de 1965 até 1980 res no embrião em desenvolvimento.
e o número de bebês nascidos durante esses mesmos anos.
26 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
(A)
(B)
Figura 1.25
Substâncias químicas que controlam a diferenciação em Dictyostelium. (A) e (C)
(B) mostram os efeitos de se colocar lesmas Dictyostelium em um meio
contendo enzimas que destroem cAMP extracelular. (A) Grex (pseudoplas-
módio) corado para presença de uma proteína pré-esporo específica (regiões
claras). (B) Grex semelhante corado após tratamento com enzimas que de-
gradam cAMP. Não é visto produto pré-esporo específico. (C) Amplifica-
ção maior de uma lesma tratada com DIF (na ausência de amônia). O corante
usado liga-se à parede de celulose das células pedunculares. Todas as células
do grex tornaram-se células pedunculares. (A e B de Wang et al., 1988a; C de
Wang e Schaap, 1989; cortesia dos autores.)
CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 27
Informações adicionais
& Especulações
Pré-pedúnculo B Pré-pedúnculo B
grex migram para as bordas da região pré- (Gross et al., 1983; Wang et al., 1990). passa a fosforilar um repressor que esta-
esporo e diferenciam-se no invólucro dos Bonner e colaboradores (1985), sugeriram va inibindo a expressão dos genes de di-
esporos e disco basal (Williams e Jermyn, que como a luz causa difusão mais rápida ferenciação do pedúnculo. No estado fos-
1991; Harwood et al., 1992). Finalmente, da amônia, remove o inibidor permitindo forilado, o inibidor é inativo. Portanto, uma
os esporos são levantados 2 mm acima assim, o progresso da culminação. vez que os níveis de cAMP se elevam (pela
do solo, de onde podem ser dispersos A amônia parece inibir a produção do remoção da amônia), a PKA pode inativar
pelo vento ou um animal que passa. pedúnculo pelos menos de duas manei- o inibidor dos genes formadores do pe-
O gatilho para a culminação parece ser ras. Inibe a ação de DIF (Wang e Schaap, dúnculo (Figura 1.27). [intro.4html]
a luz solar ou a baixa umidade. Experimen- 1989), e inibe a produção de cAMP nas
tos recentes sugerem que esses dois fa- células pré-pedúnculo (Schindler e Sus- Figura 1.27
tores causam a difusão de amônia da les- sman, 1977; Harwood et al., 1992). Esse Uma hipótese para a iniciação coordenada da
ma. A amônia é produzida copiosamente cAMP é necessário para ativar a proteína culminação e diferenciação de células
por lesmas migratórias e reprime a culmi- quinase cAMP-dependente (PKA). Célu- pedunculares em Dictyostelium. A luz solar
dissipa a amônia na parte anterior do grex,
nação. Sempre que a amônia estiver exau- las pré-pedúnculo contendo PKA não- permitindo maior produção de cAMP nas cé-
rida (quer naturalmente ou experimental- funcional, não fosforilam certas proteínas. lulas pré-pedúnculo. A concentração mais alta
mente), a culminação começa (Schindler e Essas células não migram para a região de cAMP ativa a PKA, que fosforila um
Sussman, 1977; Newell e Ross, 1982; central anterior, nem se diferenciam em inibidor da expressão gênica do pedúnculo. O
Bonner et al., 1985). A amônia inibe a con- células do pedúnculo (Firtel e Chapman, inibidor fosforilado não pode mais inibir os
versão de células pstA em pstB e proíbe a 1990; Harwood et al., 1992). Os dados genes pedúnculo-específicos. A seqüência pela
qual a formação de esporos é inibida, não está
continuação da formação do pedúnculo sugerem que quando PKA é ativada, clara. (Baseado em modelos de Bonner et al.,
1985, e Harwood et al., 1992)
cAMP
Amônia
Repressor ativo da
diferenciação e de Migração
genes de migração continuada
peduncular do grex
PKA
ativa
Transcrição
do gene da proteína B
da matriz extracelular;
Repressor inativo
migração de células
(fosforilado)
pré-pedúnculo;
diferenciação e
culminação peduncular
DEUTEROSTOMATAS PROTOSTOMATAS
Segmentados Não-segmentados
Larva
trocófora
Clivagem em
a
ad
espiral gastrulação
m
lo
protostosomal da
ce
ma
do
lo
eu
ce
Larva dipleura
ps
a
izo
ad
em
(tornária)
m
qu
elo
ag
es
ac
nh
em
Li
em
ag
ag
nh
Clivagem radial
nh
Li
gastrulação Li
deuterostomal
L
DIA
RA
SIMETRIA Platelmintos primitivos RIA
ET
BILATERAL (acelomados) SIM
Larvas planulóides
Protozoários coloniais
primitivos
Protistas flagelados
Figura 1.28
Principiais divergências evolucionárias em animais existentes. (Outros modelos são possíveis,
porém, os esquemas em geral são todos semelhantes ao mostrado aqui.)
Os Poríferos
Considera-se que os protistas coloniais deram origem, ao menos, a dois grupos de
metazoários, ambos passando por estágios embrionários. Um desses grupos é o Porífero
(esponjas). Esses animais desenvolvem-se de um modo tão diferente daquele de qual-
quer outro grupo de animais, que alguns taxonomistas sequer consideram-nos
metazoários (chamando-os, “parazoários”). Uma esponja tem três tipos principais de
células somáticas, mas um deles, o arqueócito, pode se diferenciar em todos os outros
30 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
tipos. As células de uma esponja quando passadas por uma peneira, podem regenerar
novas esponjas a partir de células individuais. Ainda mais, em alguns casos, tal re-
agregação é espécie-específica: se células individuais de esponja de duas espécies
diferentes forem misturadas, cada uma que se re-forma contém somente células de
uma espécie (Wilson, 1907). Nesses casos, admite-se que os arqueócitos móveis cole-
cionam células de sua espécie, mas não das outras (Turner, 1978). Esponjas não con-
tém mesoderma, não havendo portanto verdadeiros sistemas de órgãos em Porífero;
esses seres não têm tubo digestivo, sistema circulatório, nervos ou músculos. Assim,
apesar de passarem por estágios embrionários e larvais, esponjas são muito pouco
parecidos com a maioria dos metazoários (veja Fell, 1997).
Protostomatas e Deuterostomatas
O outro grupo de metazoários emergindo dos protistas coloniais é caracterizado pela
presença de três camadas germinativas durante o desenvolvimento. Alguns membros
do grupo constituem os Radiatas, assim chamados porque têm simetria radial tal como
um tubo ou uma roda. Os Radiatas incluem os cnidários (medusas, corais e hidras) e
ctenóforos (medusas de crista). Nesses animais, o mesoderma é rudimentar, consistin-
do de células escassamente disseminadas em uma matriz gelatinosa. Porém, a maioria
dos metazoários tem simetria bilateral, constituindo assim, os Bilaterias. Esses filos
bilaterais são classificados como platelmintos, protostomatas ou deuterostomatas.
Pensa-se que todos os Bilateria descendam de um tipo primitivo de platelminto. Esses
platelmintos foram os primeiros a ter mesoderma verdadeiro (embora não tivessem
ficado ocos para formar uma cavidade corpórea), e foram considerados parecidos com
as larvas de certos celenterados contemporâneos. Enquanto os platelmintos são des-
providos de celoma (cavidade corpórea), os nematelmintos (e rotiferas) têm uma cavi-
dade corpórea diferente daquela de todos os outros animais, por ser desprovida de
revestimento mesodérmico. A maioria dos filos são celomados, isto é, possuem uma
cavidade corporal revestida por mesoderma.
As diferenças entre as duas divisões de Bilateria estão ilustradas na Figura 1.29.
Protostomatas (do Grego, “boca primeiro”), incluem os filos dos moluscos, artrópodos
e vermes; são assim chamados porque a boca é formada em primeiro lugar, junto ou
próximo da abertura intestinal, produzida durante a gastrulação. O ânus se forma mais
tarde em outro local.
A cavidade corpórea desses animais se forma a partir de uma previamente sólida
corda de células mesodérmicas, tornadas ocas. A outra grande divisão dos Bilateria é
a linhagem dos deuterostomatas. Os filos nessa divisão incluem os chordatas e os
equinodermos. Embora possa parecer estranho classificar seres humanos e cavalos
no mesmo grupo que estrelas-do-mar e ouriços-do-mar, alguns traços embriológicos
acentuam esse parentesco. Em primeiro lugar, nos deuterostomatas (do Grego signifi-
cando “boca depois”), a abertura bucal é formada depois da abertura anal. Também,
enquanto prostostomatas em geral formam suas cavidades corpóreas tornando oco
um bloco sólido de mesoderma (formação esquizelóide), a maioria dos deuterostomatas
formam suas cavidades corpóreas a partir de bolsas mesodérmicas estendendo-se do
intestino (formação enterocélica). Porém, deve-se mencionar que há muitas exceções
a essas generalizações.
Protostomatas e deuterostomatas diferem na maneira pela qual são clivados. Na
maioria dos deuterostomatas, os blastômeros são perpendiculares ou paralelos uns aos
outros. Isso é chamado clivagem radial. Protostomatas ao contrário, têm uma extensa
variedade de tipos de clivagem. Muitas espécies formam blástulas compostas por célu-
las que estão em ângulos agudos relativamente ao eixo polar do embrião. São por isso
considerados sofrer clivagem espiral. Além disso, os blastômeros em estágio de clivagem,
na maioria dos deuterostomatas, têm maior capacidade de regular seu desenvolvimento
do que os prostostomatas. Se um único blastômero é removido de um embrião
quadricelular de ouriço-do-mar ou camundongo, tal blastômero irá desenvolver-se em
um organismo inteiro, e os três-quartos restantes do embrião também irão se desenvolver
CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 31
Celoma Celoma
Bolsa
Blastocele Blastocele
Intestinal
Mesoderma Bolsas se
se divide destacam
Mesoderma Mesoderma
Figura 1.29
Tendências principais dos prostostomatas e
normalmente. Porém, se a mesma operação fosse realizada em um embrião de lesma ou de deuterostomatas. Exceções à todas essas ten-
verme, tanto o blastômero isolado como os restantes se desenvolveriam em embriões dências gerais evoluíram secundariamente em
certos membros de cada grupo. (A maioria dos
parciais – cada um carente daquilo que foi formado a partir dos outros.
vertebrados por exemplo, não tem uma forma-
A evolução dos organismos depende de alterações herdadas em seu desenvolvi- ção estritamente enterocélica da cavidade cor-
mento. Um dos maiores avanços evolucionários – o ovo amniótico – ocorreu entre os poral; e os embriões de certos deuterostomatas,
deuterostomatas. Esse tipo de ovo, exemplificado pelo da galinha (Figura 1.30), é como os tunicados, não sofrem regulação se os
considerado ter-se originado dos ancestrais anfíbios dos répteis, há cerca de 255 blastômeros são deles removidos.)
milhões de anos. O ovo amniótico permitiu aos vertebrados vagar pela terra longe de
suprimentos de água existentes. Ao passo que a maioria dos anfíbios é obrigada a
voltar para a água para procriar e permitir o desenvolvimento de seus ovos, o ovo
amniótico carrega seu próprio suprimento de água e nutrientes. O ovo é fertilizado
internamente e contém a gema para nutrir o embrião em desenvolvimento. Ainda,
contém quatro bolsas: o saco vitelínico, que armazena proteínas nutrientes, o âmnio,
que contém fluido banhando o embrião, a alantóide, na qual restos do metabolismo
embrionário são coletados, e o cório, que interage com o ambiente externo, seletiva-
mente permitindo materiais chegar ao embrião. O todo dessa estrutura está contido em
uma casca que permite a difusão de oxigênio, ao mesmo tempo sendo suficientemente
dura para proteger o embrião de agressões ambientais. Desenvolvimento semelhante
de proteções do ovo permitiram aos artrópodes serem os primeiros invertebrados
sobre a terra. Assim, a travessia final dos limites entre água e terra ocorreu com a
modificação do estágio mais precoce do desenvolvimento – o ovo.
32 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
LITERATURA CITADA
Bergman, K., Goodenough, U. W., Coodenough, Bonner, J., Hay, A. and John, D. 1985. pH Firtel, R. A. and Chapman, A. L. 1990. A role
D. A., Jawitz, J. and Martin, H. 1975. Gametic affects fruiting and slug orientation in Dictyos- for cAMP-dependent protein kinase A in early
differentiation in ChIamydomonas reinhardtii. telium discoideum. J. Embryol. Exp. Morphol. Dictyostelium development. Genes Dev. 4:18-28.
II. Flagellar membranes and the agglutination 87: 207-213.
Fulton, C. 1977. Cell differentiation in Naegleria
reaction. J. Cell Biol. 67: 606-622.
da Silva, A. M. and Klein, C. 1990. Cell adhesion gruberi. Annu. Rev. Microbiol. 31: 597-629.
Beug, H., Gerisch, G., Kempff, S., Riedel, V. and transformed D. discoideum cells: Expression of
Fulton, C. and Walsh, C. 1980. Cell differentia-
Cremer, G. 1970. Specific inhibition of cell gp80 and its biochemical characterization. Dev.
tion and flagellar elongation in Naegleria
contact formation in Dictyostelium by univalent Biol. 140: 139-148.
gruberi: Dependence on transcription and
antibodies. Exp. Cell Res. 63: 147-158.
Early, A., Abe, T. and Williams, J. 1995. Evidence translation. J. Cell Biol. 85: 346-360.
Bonner, J. T. 1947. Evidence for the formation for positional differentiation of prestalk celIs
Garcia, E. and Dazy, A.-C. 1986. Spatial
of cell aggregates by chemotaxis in the develop- and for a morphogenetic gradient in Dictyoste-
distribution of poly(A) + RNA and protein
ment of the slime mold Dictyostelium discoi- lium. Cell 83: 91-99.
synthesis in Acetabularia mediterranea. Biol.
deum. J. Exp. Zool. 106: 1-26.
Faix, J., Gerisch, G. and Noegel, A. A. 1990. Cell 58: 23-29.
Bonner, J. T. 1957. A theory of the control of Constitutive overexpression of the contact A
Gilbert, S. F. aned Raunio, A. M. 1997. Embryo-
differentiation in the cellular slime molds. Q. glycoprotein enables growth-phase celIs of Dic-
logy: Constructing the Organism. Sinauer
Rev. Biol. 32: 232-246. tyostelium discoideum to aggregate. EMBO J. 9:
Associates, Sunderland, MA.
2709-2716.
Bonner, J. T., Berkley, D. S., Hall, E. M., Konijn,
Goodenough, U. W. and Weiss, R. L. 1975,
T. M., Mason, J. W., O’Keefe, G. and Fell, P. 1997. Porifera, the sponges. In S. F.
Gametic differentiation in ChIamydomonas rei-
Gilbert and A. M. Raunio (eds.), Embryology:
Wolfe, P. B. 1969. Acrasin, acrasinase and the nhardtii. III. Cell wall lysis and microfilament
Constructing the Organism. Sinauer Associates,
sensitivity to acrasin in Dictyostelium discoi- associated mating structure activation in wild-type
Sunderland, MA.
deum. Dev. Biol. 20: 72-87. and mutant strains. I. Cell Biol. 67: 623-637.
CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 33
Cross, J., Bradbury, J, Kay, R. and Peacey, M. Krutch, J. W. 1956. The Great Chain of Life. Shaffer, B. M. 1975. Secretion of cyclic AMP
1983. Intracellular pH and the control of cell Houghton Mifflin, Boston. [pp. 28-29] induced by cyclic AMP in the cellular slime mold
differentiation in Dictyostelium discoideum. Dictyostelium discoideum. Nature 255: 549-552.
Loormis, W. F. 1988. Cell-cell adhesion in Dic-
Nature 303: 244-245.
tyostelium discoideum. Dev. Genet. 9: 549-559. Shaulsky, G. and Loomis, W. F. 1995. Mitochon-
Hämmerling, J. 1934. Über formbildended drial DNA replication but no nuclear DNA
Matsukuma, S. and Durston, A. J. 1979. replication during development. Proc. Natl.
Substanzen bei Acetabularia mediterranea, ihre
Chemotactic cell sorting in Dictyostelium dis- Acad. Sci. USA 92: 5660-5663.
rãumliche und zeitfiche Verteilung und ihre
coideum. J. Embryo1. Exp. Morphol, 5O:
Herkunft. Wílhelm Roux Arch. Entwicklungs- Siegert, F. and Weijer, C. J. 1989. Digital image
243-251.
mech. Org. 131: 1-81. processing of optical density wave propagation
McDonald, S. A. and Durston, A. J. 1984. The in Dictyostelium discoideum and analysis of the
Hartmann, M. 1921. Die dauernd agame Zucht
cell cycle and sorting out behaviour in Dictyos- effects of caffeine and ammonia. J. Cell Sci. 93:
von Eudorina elegans, experimentelle Beiträge
telium discoideum. J. Cell Sci. 66: 196-204. 325-335.
zum Be–fruchtungs-und Todproblem. Arch.
Protistk. 43: 223-286. Mee, J. D., Tortolo, D. M. and CoukelI, M. B. Siegert, F. and Weijer, C. J. 1991. Analysis of
1986. Chemotaxis -associated properties of optical density wave propagation anel cell
Harwood, A. J., Hopper, N. A., Simon, M.-N.,
separated prestalk and prespore celIs of Dic- movement in the cellular slime mould Disctyos-
Driscoll, D. M., Veron, M. and Williams, J. G.
tyostelium discoideum. Biochem. Cell Biol. telium discoideum. Physica D 49: 224-232.
1992. Culmination in Dictyostelium is regulated
64:722-732.
by the cAMP-dependent protein kinase. Cell Sies, H. 1988. A new parameter for sex education.
69: 615-624. Morris, H. R., Taylor, G. W., Masento, M. S., Nature 332: 495.
Jermyn, K. A. and Kay, R. R. 1987. Chemical Singer, S. 1997. Plant development. In S. F.
Jermyn, K. A. and Williams, J. 1991. An analysis
structure of the morphogen differentiation-in- Gilbert and A. M. Raunio (eds.), Embryology:
of culmination in Dictyostelium using prestalk
ducing factor from Dictyostelium discoideum. Constructing the Organism. Sinauer Associates,
and stalk-specific cell autonomous markers. De-
Nature 328: 811-814. Sunderland, MA.
velopment 111: 779-787.
Müllier, K. and Gerisch, G. 1978. A specific gly- Strickberger, M. W. 1985. Genetics, 3rd Ed.
Johnson, R. L., Gundersen, R., Lilly, P., Pitt, G.
coprotein as the target of adhesion blocking Fab Macmillan, New York.
S., Pupillo, M., Sun, T. J, Vaughan, R. A. and
in aggregating Dictyostelium cells. Nature 274:
Devreotes, P. N. 1989. G-protein-linked signal Sumper, M., Berg, E., WenzI, S. and Gocil, K.
445-447.
transduction systems control development in 1993. How a sex pheromone might act at a
Dictyostelium. Development [Supp1.1: 75-80. NewelI, P. and Ross, F 1982. Genetic analysis of concentration below 10-16 M. EMBO J. 12:
the slug stage of Dictyostelium discoideurn. J. 831-836.
Kay, R. R. and Jermyn, K. A. 1983. A possible
Genet. Microbiol. 128: 1639-1652.
morphogen controlling differentiation in Dic- Takeuchi, 1. 1991. Cell sorting and pattern for-
tyostelium. Nature 303: 242-244. Ohmori, T. and Maeda, Y. 1987. The develop- mation in Dictyostelium discoideum. In J.
mental fate of Dictyostelium discoideum cells Gerhart (ed.), Ce11-Cell Interactions in Early
Kay, R. R., Berks, M. and Traynor, D. 1989.
depends greatly on the cell-cycle position at the Development. Wiley-Liss, New York, pp.
Morphogen hunting in Dictyostelium. Develop-
onset of starvation. Cell Differ. 22:11-18. 249-259.
ment [Supp1.1: 81-90.
Pommerville, J. and Kochert, G. 1982. Effects Tomchick, K. J. and Devreotes, P. N. 1981.
Keller, E. F. and Segal, L. A. 1970. Initiation of Adenosine 3',5' monophosphate waves in Dictyos-
of senescence on somatic cell physiology in the
slime mold aggregation viewed as an instability. telium discoideum: A demonstration by isotope
green alga Volvox carteri. Exp. Cell Res. 14:
J. Theoret. Biol. 26: 399-415. dilution -fluorography. Science 212: 443-446.
39-45.
Kirk, D. L. 1988. The ontogeny and phylogeny Turner, R. S. Jr. 1978. Sponge cell adhesions. In
Powers, J. H. 1908. Further studies on Volvox,
of cellular differentiation in Volvox. Trends D. R. Garrod (ed.), Specificity of Embryological
with description of three new species. Trans.
Genet. 4: 32-36. Interactions. Chapman and HalI, London, pp.
Am. Micros. Soc. 28: 141-175.
Kirk, D. L. and Kirk, M. M. 1986. Heat shock 199-232.
elicits production of sexual inducer in Volvox. Raper, K. B. 1940. Pseudoplasmodium formati-
Tyson, J. J. and Murray, J. D. 1989. Cyclic AMP
Science 231: 51-54. on and organization in Dietyostelium discoi-
waves during aggregation of Dictyostelium
deum. J. Elisha Mitchell Sci. Soc. 56: 241-282.
Kirk, D. L., Viamontes, G. I., Green, K. J. and amoebae. Development 106: 421-426.
Bryant, J. L. Jr. 1982. Integrated morphogene- Robertson, A., Drage, D. J. and Cohen, M. H. 1972. Walsh, C. 1984. Synthesis and assembly of the
tic behavior of cell sheets: Volvox as a model. In Control of aggregation in Dictyostelium discoi- cytoskeleton of Naegleria gruberi flagellates.
S. Subtelny and P. B. Green (eds.), Developmen- deum by an external periodic pulse of cyclic J. Cell Biol. 98: 449-456.
tal Order: Its Origin and Regulation. Alan R. adenosine monophosphate. Science 175: 333-335.
Liss, New York, pp. 247-274. Wang, M. and Schaap, P. 1989. Ammonia
Schaap, P. and van Driel, R. 1985. The induction depletion and DIF trigger stalk cell differentia-
Kloppstech, K. and Schweiger, H. G. 1975. of post-aggregative differentiation in Dictyos- tion in intact Dictyostelium discoideum slugs.
Polyadenylated RNA from Acetabularia. Diffe- teiíum discoideum by cAMP. Evidence for in- Development 105: 569-574
rentiation 4:115-123. volvement of the cell surface cAMP receptor.
Exp. Cell Res. 159: 388-398. Wang, M., van Driel, R. and Schaap, P. 1988a.
Knecht, D. A., Fuller, D. and Loomis, W. F. Cyclic AMP-phosphodiesterase induces dediffe-
1987. Surface glycoprotein gp24 involved in Schindier, J. and Sussman, M. 1977. Ammonia rentiation of prespore celIs in Dictyostelium
early adhesion of Dictyostelium discoideum. Dev. determines the choice of morphogenetic discoideum slugs: Evidence that cyclic AMP is
Biol. 121: 277-283. pathways in Dictyostelium discoideum. J. Mol. the morphogenetic signal for prespore differen-
Biol. 116:161-169. tiation. Development 103: 611-618.
Konijn, T. M., van der Meene, J. G. C., Bonner,
J. T. and Barkley, D. S. 1967. The acrasin activity Shaffer, B. M. 1953. Aggregation in cellular
Wang, M., Aerts, R. J., Spek, W. and Schaap,
of adenosine -3´,5'-cyclic phosphate. Proc. Natl. slime molds: In vitro isolation of acrasin.
P. 1988b. Cell cycle phase in. Dictyostelium
Acad. Sei. USA 58: 1152-1154. Nature 171: 975.
34 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
discoideum is correlated with the expression of Williams, J. G. and Jermyn, K. A. 1991. Cell Williams, J. G., Duffy, K. T., Lane, D. P.,
cyclic AMP production, detection and degrada- sorting and positional differentiation during Dic- McRobbie, S. J., Harwood, A. J., Traynor, D.,
tion. Involvement of cAMP signalling in cell tyostelium morphogenesis. In J. Gerhart (ed.), Kay, R. R. and Jermyn, K. A. 1989. Origins of
sorting. Dev. Biol. 125:410-416. Ce11-Cell Interactions in Early Development. the prestalk-prespore pattern in Dictyostelium
Wiley-Liss, New York, pp. 261-272. development. Cell 59: 1157-1163.
Wang, M., Roelfsema, J. H., Williams, J. G. and
Schaap, P. 1990. Cytoplasmic acidification Williams, J. C., Ceccarelli, A., McRobbie, S., Wilson, E. B. 1896. The Cell in Development
facilitates but does not mediate DIF-induced Mahbubani, H., Kay, R. R., Early, A., Berks, M. and Inheritance. Macmillian, New York.
prestalk gene expression in Dictyostelium dis- and Jermyn, K. A. 1987. Direct induction of
Wilson, H. V. 1907. On some phenomena of
coideum. Dev. Biol. 140: 182-188. Dictyostelium pre-staIk gene expression. of DIF
coalescence and regeneration. in sponges. J. Exp.
provides evidence that DIF is a morphogen. Cell
Weijer, C. J., DuschI, G. and David, C. N. 1984. Zool. 5: 245-258.
49: 185-192.
Dependence of cell-type proportioning and
sorting on cell cycle phase in Dictyostelium dis-
coideum. Exp. Cell Res. 70: 133-145.
Genes e desenvolvimento:
Introdução e técnicas 2
O que gostaríamos de saber é se a estrutura
é determinada diretamente pela informação
codificada no DNA, gravada no ovo... na
extensão em que estrutura pode ser ex-
pressa por informação. JONATHAN
“E NTRE OS CARACTERES que fornecem os dados para a teoria, e os
genes postulados, aos quais os caracteres se referem, está todo o cam-
po do desenvolvimento embrionário”. Aqui Thomas Hunt Morgan (1926)
estava verificando que o único caminho de genótipo para fenótipo, passava através
de processos desenvolvimentais. No começo do século vinte, embriologia e genética
BARD (1990) não eram consideradas ciências separadas. Divergiram na década de 1920, quando
Morgan redefiniu a genética como a ciência que estuda a transmissão dos traços em
Os segredos que me enlaçam e cativam são oposição à embriologia, a ciência que estuda a expressão desses traços. Durante a
em geral segredos da hereditariedade: como última década, porém, as técnicas da biologia molecular realizaram uma reaproximação
uma semente de pêra vira uma pereira em entre embriologia e genética. Na realidade, os dois campos se ligaram novamente a tal
vez de um urso polar. CYNTHIA
ponto que se torna necessário uma discussão prévia da genética molecular neste
OZICK (1989)
texto. Questões do desenvolvimento animal que não poderiam ser consideradas há
uma década, estão sendo agora resolvidas por um conjunto de técnicas envolvendo
síntese de ácidos nucléico e hibridização. Este capítulo procura situar essas novas
técnicas dentro do contexto do diálogo, ora em curso, entre genética e embriologia.
35
36 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
(B)
Figura 2.1
(A) E. B. Wilson (1856-1939; mostrado aqui em
aproximadamente 1899), um embriologista cujo
trabalho, na fase precoce da embriologia e da de-
terminação sexual, muito avançou as hipóteses
cromossômicas do desenvolvimento. (Wilson era
também reconhecido como um dos melhores vio-
loncelistas amadores do país.) (B) Thomas Hunt
Morgan (1866-1945), que desenvolveu a teoria
dos genes a partir da embriologia. Essa fotografia
- tomada em 1915, quando os elementos básicos
da teoria dos genes estavam se encontrando –
mostra Morgan usando uma lente manual para
identificar moscas. (A) cortesia de W. N. Timmins;
(B) cortesia de G. Allen.)
(A)
Quando Morgan e Wilson entraram nesse debate, a disputa já estava bem ativa.
Uma escola associada a Oskar Hertwig, Wilhelm Roux e Theodor Boveri, propunha
que os cromossomos do núcleo continham os elementos construtores de formas.
Esse grupo era desafiado por Eduard Pflüger, T. L. W. Bischoff, Wilhelm His e seus
colegas, que acreditavam que estruturas pré-formadas não poderiam causar tão enor-
mes mudanças durante o desenvolvimento; ao contrário, eles acreditavam que os
padrões herdados de desenvolvimento eram causados pela criação de novas molécu-
las do gameta interativo, citoplasmas. Morgan aliou-se a esse último grupo e obteve
dados que interpretou com sendo consistentes com o modelo citoplasmático da he-
rança. Em seu experimento mais crucial, ele removeu citoplasma do récem-fertilizado
ovo ctenóforo (geléia de crista). Em 1897 Morgan relatou:
Esse fato presume que o núcleo é, se não o local da formação de energia, ao menos,
o fator controlador dessa energia e, por isso, o fator controlador da herança. Essa
conjectura transforma-se em certeza quando nos voltamos para os fatos da matu-
ração (meiose), fertilização e divisão celular. Todos convergem em direção da
conclusão de que a cromatina é o elemento essencial para o desenvolvimento.
Wilson pensou que o material formador de órgãos que Morgan havia removido do
citoplasma de ovos de ctenóforo, já havia sido para ali secretado pelos cromossomos
nucleares (Wilson, 1894, 1904). Para Wilson (1905) “Os materiais citoplasmáticos pare-
cem ser apenas o meio imediato ou a causa eficiente da diferenciação, e ainda procu-
ramos sua determinação primária nas causas que residem mais profundamente.”
Parte do maior apoio para a hipótese cromossômica da herança estava vindo dos
estudos embriológicos de Theodor Boveri (Figura 2.2 A), um pesquisador na Estação
Biológica de Nápoles. Boveri fertilizou óvulos de ouriço-do-mar com altas concentra-
ções de seu espermatozóide e obteve ovos que haviam sido fertilizados por dois
espermatozóides. Na primeira clivagem, esses ovos formaram quatro pólos mitóticos e
dividiram o ovo em quatro, em vez de duas células (veja capítulo 4). Boveri então
separou os blastômeros e demonstrou que cada célula se desenvolvia anormalmente
e de maneiras diferentes por ter cada célula diferentes tipos de cromossomos. Assim,
Boveri declarou que cada cromossomo tinha uma natureza individual e o controle de (B)
diferentes processos vitais.
Figura 2.2
O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento O caráter singular do cromossomo foi mostra-
do por Boveri e Stevens. (A) Theodor Boveri
Em adição à evidência de Boveri, E. B. Wilson (1905) e Nettie Stevens (1905a,b) de- (1862-1915) cujo trabalho Wilson (1918) co-
monstraram uma correlação crítica entre cromossomos nucleares e o desenvolvimento mentou: “conseguiu a verdadeira fusão de
organizacional. Stevens (Figura 2.2B), uma ex- estudante de Morgan, mostrou que em citologia, embriologia e genética – um feito bi-
92 espécies de insetos (e um cordato primitivo), as fêmeas tinham dois cromossomos ológico que... não fica atrás de qualquer outro
sexo-específicos em cada núcleo (XX), enquanto machos tinham somente um cromos- de nosso tempo.” Fotografia tirada em 1908,
somo X (XY ou XO). Parecia que uma estrutura nuclear, o cromossomo X, estava quando os estudos cromossômicos e embrio-
controlando o desenvolvimento sexual** . Morgan discordou da interpretação de que lógicos de Boveri estavam no seu apogeu. (B)
Nettie M. Stevens (1861-1912), que treinou
tanto com Boveri como com Morgan, vista
*Note-se que Wilson está escrevendo sobre unidades construtoras de forma na cromatina aqui em 1904 quando era estudante de pós-
em 1896 – antes da redescoberta do trabalhos de Mendel ou do estabelecimento da teoria dos doutorado, realizando a pesquisa que correla-
genes. Para uma análise mais detalhada das interações entre Morgan e Wilson que levaram à cionou o número de cromossomos X com o
teoria dos genes, veja Gilbert (1978, 1987) e Allen (1986). desenvolvimento sexual. [(A) cortesia de
**
Baltzer, 1967; (B) cortesia do Instituto
Wilson era um dos amigos mais íntimos de Morgan, que considerava Stevens sua melhor
estudante de pós-graduação. Ambos estavam contra Morgan nessa questão. Mesmo assim,
Carnegie de Washington.]
Morgan apoiou inteiramente o pedido de Stevens para fundos de pesquisa, confirmando suas
qualidades como as melhores possíveis. Wilson escreveu uma elogiosa carta de recomendação,
apesar de saber que ela seria uma rival na pesquisa (veja Brush, 1978).
38 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
(A) (B)
Ao mesmo tempo, Waddington (1939) isolava diversos genes que causavam mal-
formações alares na mosca das frutas, Drosophila. Também analisava como esses
genes podiam afetar os primórdios que dão origem a essas estruturas. A asa da Droso-
phila, conforme proclamou corretamente, “parecia favorável para pesquisas sobre a
ação desenvolvimental dos genes”. Assim, uma das principais objeções ao modelo
genético do desenvolvimento levantadas pelos embriologistas - que os genes atuam
somente sobre a modelagem final do embrião e não sobre seus principais esquemas de
construção – foi contrariada. [gene3.html]
Metaplasia
A primeira evidência para equivalência genômica veio após a 2a Guerra Mundial, por
parte de embriologistas que estavam estudando a regeneração de tecidos excisados.
O estudo da regeneração do olho da salamandra demonstrou que mesmo células
adultas diferenciadas podem reter o seu potencial de produzir outros tipos celulares.
Portanto, os genes para os produtos desses outros tipos de células devem ainda estar
presentes, embora normalmente não expressos. Na salamandra, a remoção da retina
neural promove sua regeneração a partir da retina pigmentada, e uma nova lente pode
ser formada a partir das células da íris dorsal. A regeneração do tecido lenticular da íris
(a assim chamada regeneração Wolffiana a partir da pessoa que primeiro a observou
em 1894) foi intensamente estudada. Yamada e seus colegas (Yamada, 1966, Dumont e
Yamada, 1972) acharam que após a remoção de uma lente, uma série de acontecimentos
leva à produção de uma nova lente a partir da íris (Figura 2.4). Os núcleos do lado
dorsal da íris começam a sintetizar quantidades enormes de ribossomos, seu DNA se
replica, e divisões mitóticas se sucedem. As células da íris pigmentada começam, em
seguida, a se desdiferenciar expelindo seus melanossomos (os grânulos pigmentados
que dão ao olho a sua cor; esses melanossomos são ingeridos por macrófagos que
entram no local da ferida). A íris dorsal continua a se dividir, formando um globo de
tecido desdiferenciado na região da lente removida. Essas células começam então a
sintetizar os produtos diferenciados de células lenticulares, as proteínas do cristali-
no. Essas proteínas são fabricadas na mesma ordem que no desenvolvimento normal
da lente. Uma vez formada uma nova lente, as células do lado dorsal da íris cessam sua
atividade mitótica.
Esses eventos não são a via normal pela qual a lente dos vertebrados é formada.
Como será visto em detalhe mais tarde, a lente normalmente se desenvolve a partir de
uma camada de células epiteliais da cabeça, induzida pelas células retinais precursoras
subjacentes. A formação da lente por células diferenciadas da íris representa metaplasia
(ou transdiferenciação), a transformação de um tipo celular diferenciado em outro
(Okada, 1991). A íris da salamandra, portanto, não havia perdido gene algum daqueles
usados na diferenciação das células da lente.
Retina Retina
pigmentada neural
Íris dorsal
Figura 2.4
Lente Regeneração Wolffiana da lente da salamandra
a partir da margem dorsal da íris. (A) Olho
normal, não-operado no estágio larval da sala-
Íris mandra Notophtalmus viridiscens. (B-G) Re-
ventral generação da lente, vista respectivamente nos
dias 5, 7, 9, 16, 18 e 30. A nova lente estará
completa no dia 30. (de Reyer, 1954, cortesia
de R. W. Reyer.)
(A) (B) (C)
Fuso Grânulos Remoção dos cromossomos Ovo ativado Extração e lise da Núcleo doador
meiótico pigmentados e do fuso da célula enucleado célula doadora inserido na célula
enucleada
Figura 2.5
Procedimento para o transplante de núcleos da Membrana
blástula para ovos ativados enucleados de Rana cicatriza
pipiens. As dimensões relativas do fuso meiótico
foram exageradas para demonstrar a técnica. A
bela R. pipiens na fotografia foi derivada dessa
maneira. (Segundo King, 1966; fotografia corte-
sia de M. DiBerardino e N. Hoffner.)
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 43
r di ec r di m co o c
pr
Porcentagem de embriões de transplantes
Horas a 18oC
RESULTADOS
Girino Girino
(morre)
Embrião
anormal
Rã adulta
(Cepa 1 – nu)
de gerar girinos natatórios (Orr et al., 1986; DiBerardino, 1989). Embora DiBerardino
(1987) tenha observado que “até o presente, núcleo algum de uma célula
documentadamente especializada, nem de uma célula adulta tenha mostrado ser
totipotente”, tal núcleo pode no entanto instruir a formação de todos os órgãos do
girino natatório.
Algumas das diferenças entre os resultados dos laboratórios de Briggs e de Gurdon,
podem envolver diferenças na fisiologia do desenvolvimento das rãs Rana e Xenopus.
Quando se transfere um núcleo de uma célula diferenciada para o citoplasma do oócito,
se está pedindo ao núcleo para reverter para condições fisiológicas às quais ele não
está acostumado. Os núcleos da clivagem das rãs dividem-se rapidamente, enquanto
alguns núcleos de células diferenciadas dividem-se raramente, se tanto. Falhas em
replicar DNA rapidamente podem levar a quebras cromossômicas: tais anormalidades
foram vistas em muitas células de girinos clonados. Sally Hennen (1970) mostrou que
o sucesso desenvolvimental de núcleos doadores pode ser ampliado tratando-se
esses núcleos com espermina e resfriando os ovos para dar tempo ao núcleo de se
adaptar ao citoplasma do ovo. Acredita-se que a espermina remova histonas da
cromatina podendo “re-acertar” a atividade dos núcleos. Quando núcleos do endoderma
de girinos de Rana pipiens, no estágio de broto caudal, foram tratados dessa maneira,
62 porcento daqueles núcleos que iniciaram desenvolvimento normal, prosseguiram
até a geração de girinos normais. Em animais controle, nenhum dos núcleos conse-
guiu gerar tais girinos. Assim, os genes para o desenvolvimento do girino completo
não pareceram ter sido perdidos pelas células do endoderma.
Podemos olhar para esses experimentos de clonagem de anfíbios de duas manei-
ras. Primeiro, reconhecer uma restrição geral de potência concomitante ao desenvolvi-
mento. Segundo, facilmente ver que o genoma da célula diferenciada é notavelmente
potente em sua habilidade de produzir todos os tipos celulares do girino anfíbio. Em
outras palavras, mesmo existindo um debate sobre a totipotência de tais núcleos,
existe pouca dúvida de que eles são extremamente pluripotentes. Certamente, muitos
genes não usados na pele ou em células sangüíneas, podem ser reativados para
produzir os nervos, o estômago, ou o coração de um girino natatório. Assim, cada
núcleo no corpo contém a maioria (se não todos) dos mesmos genes.
Informações adicionais
& Especulações
Figura 2.9
Experimento de Steward demonstrando a
totipotência de células do floema da cenoura.
Corte Planta
Planta de Proliferação de
transversal jovem
cenoura massa celular
da raiz
madura (calo) em meio Planta embrionária
de cultura de transferida para meio Planta de cenoura
leite de coco de cultura de agar madura no agar
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 47
desorganizada chamada calo. A continu- de cenoura completa e fértil (Steward et são destacadas como uma linhagem dis-
ação da rotação leva ao desbastamento al., 1964; Steward, 1970). tinta de células no início do desenvol-
de células individuais do calo para o meio Porém, plantas e animais se desen- vimento), as plantas normalmente deri-
de suspensão. Essas células dão origem volvem de maneira diferente; a propa- vam seus gametas de células somáticas.
a nódulos celulares semelhantes a raízes gação vegetativa de plantas por corte Portanto, não é tão surpreendente que
que continuam a crescer enquanto per- (i.e, porções de plantas que quando nu- uma única célula de uma planta possa
manecem em suspensão. A partir desses tridas, regeneram as partes faltantes) é se diferenciar em outros tipos de célu-
nódulos, colocados em um meio solidifi- uma prática agrícola comum. Além dis- las e formar um clone geneticamente
cado com agar, o resto da planta é capaz so, em contraste com anfíbios e mamífe- idêntico (clone, do grego klon, signifi-
de se desenvolver, formando uma planta ros (nos quais as células germinativas cando “ramo”).
a maior lacuna, ainda para ser preenchida, entre dois campos da pesquisa em
biologia é provavelmente aquela entre a genética e a embriologia. É o problema
repetidas vezes declarado, porém, até agora não resolvido, de como células com
genomas idênticos podem se tornar diferenciadas, adquirir a propriedade de
confeccionar moléculas com novos, ou no mínimo, diferentes padrões ou confi-
gurações específicos.
*A grande exceção a essa regra da constância dos genes – os genes das imunoglobulinas – é
discutida no Capítulo 10. Cada célula tem todas as subunidades gênicas das imunoglobulinas, mas em
linfócitos, algumas dessas subunidades estão rearranjadas ou mesmo suprimidas do genoma. O
terceiro desafio - a explicação de como o ambiente pode direcionar o desenvolvimento – foi
prontamente compreendida, uma vez que a explicação geral para a expressão diferencial da expres-
são gênica foi estabelecida. Conforme veremos, o modelo do operon demonstrou como uma
substância do ambiente podia efetuar a expresão gênica diferenciada.
48 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Monod não foi o único cientista a achar que micróbios unicelulares poderiam
explicar a diferenciação multicelular. O microbiologista Sol Spiegelman (1947) declarou
que a embriologia estava sendo prejudicada por sua própria terminologia. O problema
da diferenciação não podia mais ser visto como uma propriedade estrutural dos teci-
dos, mas passar a ser considerado uma propriedade bioquímica de células individuais.
A diferenciação deveria ser vista não em termos anatômicos, mas como “produção
controlada de padrões enzimáticos únicos”. Essa redefinição focaliza a atenção para a
relação entre os genes do núcleo e as propriedades do citoplasma. Além disso, a
síntese de uma enzima adaptativa em presença do seu substrato deveria ser discutida
como uma “indução”. Esse é o termo técnico usado em embriologia para descrever a
habilidade de uma célula produzir uma substância capaz de influenciar a diferenciação
de outra. O agente molecular responsável deveria ser chamado “o indutor”. Spiegelman
via uma semelhança fundamental entre a indução de novos tipos celulares no embrião
e a indução de novas enzimas em microorganismos. [gene5.html]
No fim da década de 1950, um grupo de pesquisadores acreditava que micróbios
eram um excelente (e facilmente estudado) modelo para diferenciação embrionária.
Muitos geneticistas microbianos explicitamente ligaram enzimas indutivas a concei-
tos embriológicos. Julgavam ser válida a extrapolação, e apelaram para a unidade da
natureza e, em última análise, as regras simples que esperavam encontrar. Como suge-
rido por Monod (veja Judson, 1979), se alguém entender a bactéria, entenderá o ele-
fante. Muitos embriologistas, porém, permaneceram cépticos a respeito da extrapolação
de bactérias a embriões, enfatizando a complexidade do desenvolvimento e a diversi-
dade da performance embriológica.
Em 1961, Jacob e Monod sintetizaram dados sobre a indução da β-galactosidase
levando à construção do modelo do operon. Esse modelo postula que a pequena
molécula do indutor causava a transcrição de diferentes genes em E. coli (Figura 2.10).
Em sistemas indutivos, uma proteína repressora codificada por genes liga-se ao sítio
operador adjacente aos genes estruturais, impedindo a ligação da RNA polimerase ao
sítio promotor que inciaria a transcrição. Estando presente, o indutor liga-se à proteína
repressora alterando sua conformação de forma a impedir a ligação ao operador. Com
isso, o gene torna-se capaz de transcrever mRNA, que pode ser traduzido formando
proteína. Dessa maneira, o mesmo genoma pode sintetizar diferentes enzimas, depen-
dendo da presença ou não do respectivo indutor. Em um importante trabalho de 1961,
Jacob e Monod enfatizaram que o mecanismo de controle do operon-símile pode ser
parte da regulação gênica universal. Eles conectaram seus resultados ao “problema
fundamental da embriologia química que é a compreensão do porquê células dos
tecidos não expressam constantemente todos os potenciais contidos em seu genoma”.
O modelo do operon foi imediatamente introduzido nos textos de embriologia por
cientistas que procuravam a síntese da genética com a embriologia. O livro de
Waddington (1962), Novos Padrões na Genética e no Desenvolvimento, começa com
um capítulo relacionando o modelo do operon de Jacob e Monod com o controle da
expressão gênica no desenvovimento dos anfíbios. Waddington aprovou especial-
mente esse modelo porque significava que os genes não são apenas ativos, mas
reativos, respondendo às mudanças no citoplasma. Waddington considerou genes e
citoplasma como mutuamente interativos. Essa perspectiva foi também salientada em
Hereditariedade e Desenvolvimento (1963), síntese de embriologia com genética por
John Moore, que conclui:
Lactose
RNA
mRNA polimerase
β-galactosidase
mRNA é transcrito
Lactose combinando
com o repressor,
previne ligação a o
Genes estruturais
Genes estruturais
Figura 2.11
Cromossomos politênicos. (A) Cromossomos politênicos de células da glândula salivar de
Drosophila melanogaster. Os quatro cromossomos estão conectados em seus centrômeros,
formando um denso cromocentro. Os genes estruturais para a álcool desidrogenase (ADH),
aldeído oxidase (Aldox) e octanol desidrogenase (ODH) foram mapeados nas posições designa-
das nesses cromossomos. (B) Fotografia ao microscópio eletrônico de uma pequena região de
um cromossomo politênico de Drosophila. As bandas escuras estão altamente condensadas
comparadas com as regiões interbandas. (A de Ursprung et al., 1968, cortesia de H. Ursprung;
B de Burkholder, 1976, cortesia de G. D. Burkholder.)
Aldox
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 51
estimulados ou inibidos por certas mudanças fisiológicas causadas pelo calor ou por
hormônios (Clever, 1966; Ashburner, 1972; Ashburner e Berondes, 1978).
Beermann (1961) apresentou evidências que esses tufos representam um afrouxa-
mento localizado de cromossomos politênicos (Figura 2.14) e que são sítios de síntese
ativa de RNA. Duas espécies intercruzadas diferentes de Chiromonus foram encon-
tradas: uma produzindo grande quantidade de proteína salivar e a outra não (Figura
2.15). Os produtores tinham uma tufo grande (anel de Balbiani) em determinada banda;
esse tufo não existia nos não-produtores. O cruzamento de produtor com não-produ-
tor resultou em larvas produzindo quantias intermediárias de proteína salivar. Cruzan-
do duas moscas híbridas, a capacidade de produzir proteína salivar segregou-se de
forma Mendeliana: 1 alto produtor: 2 intermediários:1 não-produtor. Altos produtores
tinham dois tufos (um em cada cromossomo homólogo), produtores intermediários
tinham apenas um, e não-produtores nenhum tufo. Beermann concluiu que a informa-
ção genética necessária para a síntese dessa proteína salivar está presente nessa
banda distal do cromossomo e que sua produção dependia de transformação em uma
região estufada.
(A)
(B)
Figura 2.12
Identidade genômica em cromossomos politênicos. (A) Uma região do
conjunto cromossômico da mosca Chiromonus tentans. Notar a constân-
cia do número de bandas nos diferentes tecidos. (B) Hibridização do RNA
de uma proteína da gema com um cromossomo da glândula salivar larval
de Drosophila. Os grãos escuros (flexa) mostram onde a mensagem da
proteína radioativa da gema se ligou aos cromossomos. Notar que o gene
para a proteína está presente no cromossomo da glândula salivar, apesar
da proteína não ser aí sintetizada. (A) Segundo Beermann, 1952; (B) De
Barnett et al., 1980; fotografia cortesia de P. C. Wensink.
52 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Figura 2.13
Seqüência de estufamentos de uma porção do cro-
mossomo 3 da glândula salivar de Drosophila mela-
nogaster. (A,B) larva de 110 horas; (C) larva de 115
horas; (D,E) estágio pré-pupa (após 4 horas). Notar
o estufamento e a regressão das bandas 74EF e 75B.
Outras bandas (71DE, 78D) estufam mais tarde, po-
rém, a maioria não estufa de modo algum durante o
período. (Cortesia de M. Ashburner.)
(A)
(B)
Figura 2.14
Terminação proximal do cromossomo 4 da glândula sali-
var de Chiromonus pallidivitatus, mostrando o enorme
tufo BR2. (A) Fotomicrografia em contraste de fase, de
preparações coradas, mostrando o extenso tufo no cro-
mossomo politênico. (B) Diagrama da região passando
por estufamento. (A de Grossbach, 1973, cortesia de U.
Grossbach; B segundo Beermann, 1963)
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 53
BR4(SZ)
Alto Não-produtor
produtor
BR2
Todos produtos
intermediários
BR1
BR3
Figura 2.15
Correlação de padrões de estufamento com fun-
ções especializadas nas células das glândulas
salivares de Chironomus pallidivitatus. (A)
radioativos. O RNA radioativo pôde, em seguida, ser extraído da porção BR2 do Cromossomo de uma célula produzindo uma
cromossomo dissecado (Lambert, 1972). Esse RNA era excepcionalmente grande – secreção granular e mostrando um anel de
cerca de 50.000 bases. O grande segmento de RNA radioativo, especificamente Balbiani adicional [BR4(SZ)]. (B) Cromosso-
hibridizado para a região BR2 do cromossomo, mostrou que o DNA estufado (Puff mo 4 de uma célula salivar, mostrando somen-
de DNA) - e nenhum outro local - tinha-o transcrito ativamente (Figura 2.16C). Esse te anéis de Balbiani 1, 2 e 3 (BR1, BR2, BR3).
mesmo RNA pôde ser isolado de polissomos sintetizadores de proteínas, indicando (C) Evidência genética que a síntese de uma
importante proteína salivar depende da for-
que é ativo na síntese protéica (Wieslander e Daneholt, 1977). Assim, um RNA
mação de tufos BR4(SZ). Larvas com altos
transcrito de uma banda específica de DNA, que estufa na glândula salivar larval, níveis de secreções granulares têm células sali-
pode posteriormente ser visto produzindo proteínas em ribossomos citoplasmáticos. vares glandulares com tufos BR4(SZ) em am-
bos cromossomos 4 (coloridos), enquanto lar-
vas sem essas secreções não têm tais tufos.
Produtores intermediários têm somente um
cromossomo 4 com uma região estufada
BR4(SZ) em cada célula salivar realizando a
secreção. (A e B segundo Beermann, 1961, cor-
tesia de W. Beermann.)
(A)
(A)
Condições de Condições de
desnaturação re-anelamento
(calor, álcali)
Figura 2.17
Hibridização de ácidos nucléicos. (A) Se a hé- RNA
(B)
lice de DNA for separada em duas fitas, essas
devem se re-anelar sob condições adequadas
de força iônica e tempo. De maneira semelhan-
te, se o DNA for separado em suas duas fitas,
o RNA deve ficar capacitado a se ligar a genes
que o codificam. Se presente em quantidades Desnaturar; adicionar RNA hibridiza
RNA (em grande com uma
suficientemente grandes em comparação com
quantidade em fita de DNA
o DNA, o RNA irá substituir uma das fitas de comparação com DNA)
DNA nessa região.
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 55
dos precursores radiativos. Além disso, o DNA pode hibridizar tanto com o gene que
produziu o RNA (embora a outra fita) e com o próprio RNA, tornando-o extremamente
mRNA
útil para a detecção de pequenas quantidades de RNAs específicos.[other.html#gene6]
Anelar iniciador
Clonagem de DNA genômico
mRNA
Já em 1904 Theodor Boveri desesperava-se, considerando que as técnicas de sua
época nunca seriam suficientes para permitir-lhe estudar como os genes criam embri- Transcriptase
ões. Havia necessidade de uma técnica especial de amplificação gênica: reversa
Porque não é somente o núcleo, nem mesmo cromossomos individuais, mas cer- mRNA
tas partes de certos cromossomos de certas células que precisam ser isolados e
coletados em quantidades enormes para análise; essa seria uma pré-condição cDNA
para colocar o químico em uma posição a qual lhe permitiria analisar (o mate- Álcali
rial hereditário) com mais minúcias que o morfologista.
cDNA
Entretanto, desde a década de 1970 a hibridização de ácido nucléico permitiu aos
biologistas do desenvolvimento realizar o que Boveri aspirava: isolar e amplificar Figura 2.18
regiões específicas do cromossomo. A técnica principal para isolar e amplificar genes Método para preparar DNA complementar
individuais é chamada clonagem de genes. A primeira fase desse processo consiste no (cDNA). A maioria dos mRNA possui uma
corte de DNA nuclear em pedaços distintos, por incubação de DNA com uma longa cadeia de resíduos de adenosina (AAAn)
endonuclease de restrição (geralmente chamada de enzima de restrição). De modo no terminal 3’ da mensagem (a ser discutida no
geral, essas endonucleases são enzimas bacterianas que reconhecem seqüências es- Capítulo 12); por isso, o pesquisador anela
pecíficas do DNA e o clivam nesses sítios (Tabela 2.1; Nathans e Smith, 1975). Por um iniciador consistindo de 15 resíduos de de-
soxitimidina (dT15) ao final 3' da mensagem.
exemplo, quando DNA humano é incubado com a enzima BamHI (de Bacillus
Transcriptase reversa em seguida, transcreve
amyloliquifaciens, cepa H), o DNA é clivado em cada sítio onde aparece a seqüência uma fita de DNA complementar, começando
GGATCC. Os produtos são fragmentos de DNA de vários tamanhos, todos terminan- no iniciador dT15. O cDNA pode ser separado
do com G em um dos lados e GATCC no outro (Figura 2.19). Esses pedaços são aumentando o pH da solução, dessa maneira,
freqüentemente chamados de fragmentos de restrição. desnaturando o híbrido de dupla fita e clivan-
do o RNA.
*O corante é 5-bromo-4-cloroindol, e é azul a não ser quando está complexado com uma
molécula como galactose. A ß-galactosidase codificada pelo gene do plasmídeo cliva a galactose do
corante permitindo que adquira a conformação azul.
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 57
Plasmídeo cortado
no gene lacZ
Quebra
endonucleolítica
por BamHI
Fragmentos
de gene Plasmídeo
humano recombinante
incubados e com gene lacZ
ligados em um interrompido
plasmídeo
DNA humano
Figura 2.19
Um protocolo geral para clonar DNA, usando como exemplo a inserção de uma se-
“Colônias
qüência de DNA humano em um plasmídeo com um sítio sensível à BamHI.
incolores”
quer clonar. Em alguns casos, a seqüência do mRNA ou gene não é conhecida, Meio contendo
ampicilina
devendo-se então estimar a seqüência a partir da seqüência de aminoácidos da
proteína). Se o plasmídeo contém aquele gene, seu DNA deve estar no filtro, e
“Colônias azuis”
somente aquele DNA deverá ser capaz de ligar o RNA radioativo ou a sonda de
cDNA. Portanto, somente aquelas áreas serão radioativas. A radioatividade nessas
regiões é determinada por auto-radiografia. Filme sensível a raios-X é colocado Aplicação das colônias
“incolores” nos círculos do
sobre o papel tratado. Os elétrons de alta energia, emitidos pelo RNA radioativo, papel de filtro; lisar para
sensibilizam os grãos de prata no filme, tornando-os escuros quando o filme é reve- expor o DNA
lado. Finalmente, uma mancha escura é produzida sobre cada colônia contendo o
plasmídeo recombinante que carrega o gene específico (veja Figura 2.19). Essa colô-
nia é então isolada e cultivada, produzindo bilhões de bactérias, cada uma contendo
centenas de plasmídeos recombinantes idênticos.
Os plasmídeos recombinantes podem ser separados do cromossomo da E. coli por
centrifugação, e incubando o DNA do plasmídeo com BamHI libera-se o fragmento de
DNA extranho que contém o gene. Esse fragmento pode ser separado do DNA
plasmídico, permitindo ao pesquisador possuir microgramas de seqüências de DNA mRNA
radioativo
purificado contendo o gene específico. Apesar desse procedimento parecer muito
lógico e fácil, freqüentemente o número de colônias a serem selecionadas é astronômi- Papel de filtro incubado com mRNA
co. O número de fragmentos aleatórios que devem ser clonados para a obtenção do radioativo do gene a ser clonado
gene desejado, aumenta com a crescente complexidade do genoma do organismo*.
Para detectar um gene específico de um genoma de mamífero, milhões de clones indi-
viduais devem ser selecionados.
Contatos de
Desnaturar fragmentos de papel de filtro
DNA à fitas simples em álcali
Suporte
Cuba com
Gel
Digestão com restrição solução tampão Colocar filtro de nitrocelulose
e eletroforese Colocar gel no papel de filtro ou membrana de nylon sobre gel:
em gel de agarose úmido entre 2 espaçadores colocar papel-toalha e peso
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 59
Seqüenciamento de DNA
Dados de seqüência podem dar informações sobre a estrutura da proteína codifi-
cada e podem identificar seqüências regulatórias de DNA que certos genes têm em
comum. A simplicidade da técnica de seqüenciamento “didesoxi” de Sanger (Sanger
et al.,1977) tornou-a um procedimento padrão em muitos laboratórios de biologia
molecular. No início, usa-se um vetor contendo o gene clonado e se isola uma fita
única do DNA circular (Figura 2.22). Funde-se (anela-se) então um iniciador (primer)
radioativo de DNA (aproximadamente 20 pares de bases) complementar ao DNA
do vetor imediatamente 3' ao gene clonado. (Porque essas seqüências dos vetores
são conhecidas, iniciadores oligonucleotídicos podem ser facilmente sintetizados
ou adquiridos comercialmente). O iniciador tem uma ponta 3' livre à qual mais
nucleotídeos podem ser adicionados. Coloca-se o DNA alvo e o iniciador junta-
mente com todos os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos em quatro tubos
de ensaio. Cada um dos tubos contém a subunidade polimerizante da DNA polime-
rase e um diferente didesoxinucleosídeo trifosfato: um tubo contém didesoxi-G,
outro didesoxi-A e assim por diante. As estruturas dos desoxinucleotídeos e dos
didesoxinucleotídeos estão representadas na Figura 2.23. Enquanto o
desoxirribonucleotídeo não tem um grupo hidroxila (OH) no carbono 2' do seu
açúcar, o didesoxirribonucleotídeo não tem grupos hidroxila em ambos os carbo-
nos, 2' e 3'. Assim, mesmo que um didesoxirribonucleotídeo possa ser ligado a uma
crescente cadeia de DNA pela DNA polimerase, ele interrompe o crescimento da
cadeia por não ter um grupamento 3' ao qual se ligaria um novo nucleotídeo.
Assim, quando a DNA polimerase está sintetizando DNA do iniciador, o novo
DNA será complementar ao gene clonado. No tubo com didesoxi-A, entretanto,
sempre que a polimerase coloca um A na cadeia crescente, existe a possibilidade
de que um didesoxi-A seja colocado em lugar do desoxi-A. Se isso acontecer, a
cadeia pára. Similarmente, no tubo com didesoxi-G, a cadeia tem o potencial de
parar toda vez que um G é inserido. (O processo foi comparado à uma dança
folclórica grega na qual uma pequena porcentagem dos dançarinos em potencial
tem um braço em uma tipóia).
60 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Iniciador
Seqüência da fita
do iniciador
Seqüência
complementar
Fragmentos
maiores
Fragmentos
menores
Figura 2.22
O método didesoxi de seqüenciar DNA. A fotografia contém a região da auto-radiografia que
mostra essa seqüência (Cortesia de G. Guild).
Base 1
Adenina Adenina
Base 2
Adenina Desoxiadenosina Didesoxiadenosina
trifosfato (açúcar desoxirribose) trifosfato (açúcar
(A) didesoxirribose) (B)
Figura 2.23
Comparação entre desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos. (A) Estruturas dos dois tipos de
nucleotídeos. A diferença é evidenciada em cores. (B) O terminal 3' de uma cadeia que terminou
pela incorporação de um didesoxinucleotídeo não tem um grupo hidroxila 3' terminal para
continuar a polimerização do DNA.
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 61
Em cada tubo estão sendo feitas milhões de cadeias e por essa razão eles conterão
uma população de cadeias, algumas interrompidas no primeiro sítio possível, outras
no último e algumas em sítios intermediários. O tubo com didesoxi-A, por exemplo,
conterá cadeias com diferentes e distintos comprimentos, cada uma terminando com o
resíduo A. Os fragmentos de DNA radioativo resultantes serão separados por eletro-
forese. O resultado é uma “escada” de fragmentos onde cada “degrau” é uma seqüên-
cia de nucleotídeos de comprimento diferente. Lendo escada acima, obtem-se a se-
qüência do DNA complementar àquela do gene clonado.
(A)Preparação de cDNA (B) Inserção de cDNA de dupla fita no vetor viral (bacteriófago λ)
clonável
Região codificadora
mRNA DNA de fago λ
BamHI
Região codificadora
mRNA
cDNA
Não é necessário para
mRNA a replicação do fago
Região codificadora
cDNA
S1 nuclease
Região codificadora
Fita cDNA do
dupla mRNA, agora
cDNA clonado em
vetores virais
Adicionar finais Bam HI
(C) Preparação da biblioteca de clones do fago (D) Seleção da biblioteca de fagos clonados
Transferir alguns
Fago fagos para filtros
híbrido de nitrocelulose
Adicionar à camada de
células de E. coli Filtros de nitrocelulose
Transferências Northern
Podemos também determinar a expressão temporal e espacial de RNAs executando
uma transferência de RNA (freqüentemente chamada transferência Northern). En-
quanto transferências Southern transferem fragmentos de DNA do gel para o papel,
transferências Northern (nome não se relaciona com o inventor) transferem RNA
entre os mesmos suportes e da mesma maneira. O pesquisador pode extrair RNAs
mensageiros do embrião em vários estágios de desenvolvimento e submetê-los à
eletroforese lado a lado, em um gel. Após transferência dos RNAs separados para o
papel de nitrocelulose ou membrana de nylon, o conjunto é incubado em uma solu-
ção contendo um fragmento radioativo, mono-fita, de DNA de um determinado gene.
Esse DNA adere somente às regiões onde está localizado o RNA complementar.
Assim, se o mRNA para aquele gene está presente em um determinado estágio
embrionário, o DNA radioativo se liga a ele e pode ser detectado por auto-radiogra-
fia. Autoradiogramas desse tipo, onde vários estágios são comparados simultanea-
mente, são denominados transferências Northern de desenvolvimento. A Figura
2.26A mostra uma transferência Northern de desenvolvimento para a expressão de
um gene endoderma-específico durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar. Po-
demos ver que o mRNA para essa proteína endodérmica é inicialmente sintetizado
durante o estágio de blástula mesenquimatosa e continuamente durante todo o
resto do desenvolvimento. A transferência Northern na Figura 2.26B mostra que a
acumulação desse mRNA no estágio de prisma é restrita ao endoderma (Wessel et
al.,1989). Hibridização in situ e transferências Northern fornecem as melhores evi-
dências em favor da transcrição diferencial de RNA, no espaço e no tempo. A trans-
crição de certos genes pode ser específica para tecidos ou tempo.
A distribuição temporal na transcrição de vários genes pode ser visualizada por
transferência de mancha. Por exemplo, Sargent e Dawid (1983) isolaram da gástrula de
Xenopus um mRNA que não estava presente no ovo. Para isso eles extraíram o mRNA
da gástrula e fizeram cópias cDNA dessas mensagens. Os cDNAs da gástrula foram
misturados com grandes quantidades de mRNA de oócitos. Se houvesse hibridização
entre o mRNA dos oócitos e o cDNA da gástrula, significaria que o cDNA era derivado
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 65
(B)
(A)
(C)
Figura 2.25
Hibridação in situ. (A,B) Fotomicrografias,
em fundo escuro, de hibridação in situ, mos-
trando a localização de mRNA endoderma-
específico em embrião de ouriço-do-mar. O
cDNA radioativo usado como sonda foi pre-
parado do gene clonado, feito a partir de
mRNA endoderma-específico (veja Figura
2.24). Esse cDNA radioativo se liga ao mRNA
do endoderma da gástrula precoce do ouriço-
do-mar (A) e ao endoderma do intestino mé-
dio e posterior da gástrula tardia do ouriço-
do-mar (B). (C) Hibridização in situ, em mon-
tagem integral, de um embrião de camundon-
go de 9.5-10.5 dias corado para mRNA de
Brachyury. Essa mensagem é transcrita em
células formando novo mesoderma, e nesse
estágio é encontrada na porção posterior do
embrião. Embriões fixados foram incubados
Enzima em uma sonda para mRNA de Brachyury (a
fosfatase Corante fita antisense complementar ao mRNA) que
alcalina (precipitado azul escuro) foi sintetizada usando uridina biotinilada.
Núcleo Após eliminar a parte da sonda que não se
Corante ligou ao mRNA de Brachyury (e inativar qual-
Anticorpo (incolor) quer atividade endógena de fosfatase alcalina
para biotina do embrião), o embrião foi tratado com anti-
Sonda complementar a mRNA de Brachyury corpos para biotina. Esses anticorpos foram
Biotina ligados às enzimas do tipo fosfatase alcalina.
tendo resíduos de biotina em suas uridinas
Colorir para a presença de fosfatase alcalina
permite que se determine a localização de um
mRNA específico. Fotografias coloridas da
mRNA de Brachyury hibridização in situ, em montagem integral,
estão nas Pranchas 22, 23 e 25. (A e B de
Wessel et al.,1989, cortesia de G. Wessel; C
do laboratório do autor.)
66 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
(A) Ovo de um mRNA presente em ambos os estágios, oócito e gástrula. Essas moléculas
Clivagem híbridas com dupla fita foram removidas por filtração, deixando uma população de
cDNAs gástrula-específico. Os cDNAs foram transformados na forma de dupla fita
Blástula
(pela DNA polimerase) e inseridos em veículos de clonagem. Essa técnica é denomina-
Blástula da de clonagem de subtração. Como a seleção dupla de bibliotecas de cDNA, a
Mesenquimatosa clonagem de subtração gera um conjunto de clones estágio-específicos cujo mRNA é
Blástula precoce
encontrado em alguns estágios, mas não em outros, ou em alguns tecidos mas não em
Blástula tardia outros (Figura 2.27).
Sargent e Dawid usaram embriões, dos estágios de zigoto a broto caudal do
Prisma
girino e, separadamente, isolaram seus RNAs. Os RNAs foram aplicados direta-
Plúteo mente (sem prévia eletroforese em gel) a filtros de nitrocelulose de modo que cada
filtro tinha RNAs de todos os estágios. Após a fixação (calor) dos RNAs no filtro,
(B) Ectoderma / mesoderma
DNA de fita única derivado de um específico clone “gastrular”, foi marcado radi-
oativamente e incubado com os filtros. Se um gene estava sendo transcrito em um
Endoderma determinado estágio, o cDNA radioativo daquele gene encontraria seu comple-
mento nos mRNAs daquele estágio, no filtro. Após eliminacão do cDNA não liga-
Figura 2.26 do, a ligação do cDNA radioativo foi observado por auto-radiografia. A transfe-
Transferência Northern para um gene especí- rência de manchas na Figura 2.28 mostra o esquema temporal de expressão para 17
fico no endoderma do ouriço-do-mar, Lytechi-
genes que são ativos em vários estágios da gastrulação. Nenhum deles é expresso
nus variegatus. (A) Transferência Northern
de desenvolvimento, mostrando acumulação antes da transição da blástula mediana em 7 horas. Alguns genes (DG64, DG39)
de mRNA de acordo com o estágio específico são expressos imediatamente depois, enquanto outros (DG72, DG81) começam a
desse gene. mRNA total (10 µg por estágio) ser transcritos na gástrula mediana, após aproximadamente 7 horas. Alguns genes
foi submetido à eletroforese em gel de agarose. (DG76, DG81) são mantidos após a ativação, enquanto a atividade de outros (DG56,
O gel foi transferido para papel tratado e os DG21) é muito mais transitória.
mRNAs aderidos ao papel, que foi em seguida
incubado com cDNA radioativo de um clone
endoderma-específico. Mostrou-se que esse
Encontrando mensagens raras pela
mRNA é sintetizado durante o estágio de blás-
reação da polimerase em cadeia
tula do mesênquima e aumentado ao longo do
desenvolvimento. (B) Transferência Northern A reação da polimerase em cadeia (PCR) é um método de clonagem in vitro que pode
no estágio de prisma, mostrando que o mRNA produzir enormes quantidades de um fragmento específico de DNA a partir de uma
está presente no endoderma (com algum me- pequena quantidade de material de partida (Saiki et al.,1985). Esse método pode ser
soderma aderido) mas não no ectoderma. RNA usado para clonar um gene específico ou para determinar se um gene específico está
total do endoderma foi eletroforisado (pista 2) ativamente transcrevendo RNA em um determinado órgão ou tipo de célula. O método
próximo ao mRNA do resto do ouriço-do-mar padrão de clonagem usa microorganismos vivos para amplificar o DNA recombinante.
(pista1). Ligação com cDNA radioativo detec-
PCR, no entanto, pode amplificar uma única molécula de DNA por um fator de vários
tou mRNA somente no endoderma. (de Wessel
et al., 1989, cortesia de G. Wessel.) milhões em poucas horas e o faz em um tubo de ensaio. Essa técnica tem sido extrema-
mente útil em casos onde a quantidade de ácido nucléico para estudo é muito peque-
na. Embriões de camundongos, por exemplo, na fase de pré-implantação têm muito
pouco mRNA e não se pode obter milhões desses embriões para estudo. Se fosse
necessário saber se o embrião de camundongo na fase de pré-implantação contém o
mRNA para uma proteína determinada, seria muito difícil descobrir usando os méto-
dos padrão de clonagem. Entretanto, a técnica do PCR permite encontrar essa mensa-
gem com poucos embriões, por amplificar especificamente somente aquela mensagem,
um milhão de vezes (Rappolee et al., 1988).
O uso de PCR para encontrar mRNAs raros está ilustrado na Figura 2.29. Os
mRNAs de um grupo de células são purificados e convertidos a cDNA por transcriptase
reversa. Usando DNA polimerase e S1 nuclease, a população de DNAs de fita única é
transformada em uma população de fita dupla. Em seguida, escolhe-se um DNA para
ser amplificado. Para isso, separam-se as duplas hélices do DNA, às quais são adici-
onados dois pequenos oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a
uma porção da mensagem procurada. Se os oligonucleotídeos reconhecem seqüên-
cias no DNA, então o mRNA estava presente originalmente. Os oligonucleotídeos
foram preparados de forma a permitir uma hibridização com fitas opostas e lados
opostos da seqüência alvo. (Se a tentativa é isolar o gene ou mRNA para uma proteína
específica de seqüência conhecida, essas regiões laterais podem ser preparadas,
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 67
Estágio
Clone
RNA
1 cópia iniciador 1 DNA alvo
Aquecer a 95oC para
desnaturar DNA.
Esfriar a 37oC para RNA
permitir hibridização iniciador 2
dos iniciadores a DNA
Primeiro ciclo
Desnatura DNA
Hibridiza
Segundo ciclo
iniciadores
Estende novas
fitas de DNA
Segundo ciclo de
sínteses resulta em
4 cópias quatro cópias da
seqüência alvo de DNA
Figura 2.29
Protocolo para a reação de polimerase em cadeia (PCR). Para determinar se um tipo particular
de mRNA está presente, todo mRNA é convertido a DNA de dupla fita pela transcriptase
reversa e DNA polimerase. Esse DNA é desnaturado e dois conjuntos de iniciadores são
adicionados. Se a seqüência específica estiver presente, os iniciadores se hibridizarão aos seus
terminais opostos. (Iniciadores específicos são produzidos com base na seqüência que se pro-
cura. Se é conhecida apenas a seqüência da proteína codificada pela mensagem, prepara-se um
conjunto de diferentes iniciadores, cada um possivelmente complementar ao DNA.) Usando
DNA polimerase termoestável de T. aquaticus, cada fita de DNA sintetiza seu complemento.
Essas fitas são, por sua vez, desnaturadas e os iniciadores são hibridizados a elas, iniciando o
ciclo novamente. Dessa maneira, o número de fitas novas com a sequência entre os dois
iniciadores aumenta exponencialmente.
Adulto
em fontes de água quente (como aquelas do Yellowstone National Park) ou nos respi- Ovário de camundongo
radouros térmicos de submarinos, onde a temperatura atinge valores próximos de
900C. Essas DNA polimerases podem suportar temperaturas próximas à ebulição e o Rim de camundongo
PCR se utiliza dessa adaptação evolucionária. Uma vez sintetizada a segunda fita, ela
Rim de camundongo
Embrião de 14 dias
é separada de seu complemento por desnaturação em alta temperatura. O segundo
iniciador é adicionado e agora ambas as fitas podem sintetizar novo DNA. Sucessivos Salivares de camundongo
ciclos de desnaturação e síntese amplificarão essa região do DNA de forma geométri-
ca. Após vinte turnos, aquela região específica estará amplificada 220 vezes (um pouco Pâncreas de camundongo
mais de um milhão). Quando submetido à eletroforese esse fragmento amplificado é Pulmão de camundongo
facilmente detectado. Isso mostra que o mRNA original com essa seqüência estava
presente na amostra. (A confirmação poderia ser feita por transferência Southern,
como na Figura 2.30). Além disso, pode-se usar essas cópias amplificadas para clona- Sem adição de DNA
gem, colocando-as em vetores de clonagem.
Figura 2.30
Determinando a função do gene: Evidência fornecida por PCR, para a síntese
de um fator de crescimento, activina, de ór-
células e organismos transgênicos gãos embrionários de camundongo. O mRNA
desses órgãos foi convertido em DNA e am-
Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula plificado através de 20 ciclos de replicação.
Apesar de ser importante conhecer a seqüência de um gene e seu esquema temporo- O DNA foi submetido sucessivamente à ele-
espacial de expressão, o que é realmente crucial é conhecer a função daquele gene troforese e transferência Southern usando uma
no desenvolvimento. Técnicas recentes permitem estudar a função do gene, tirando sonda radioativa para uma parte do gene de
e repondo certos genes de células embrionárias. Pedaços de DNA clonados podem activina. mRNA de activina foi encontrado
ser modificados (se desejado), e colocados em células por vários meios. Uma técni- no ovário do camundongo adulto (como es-
ca muito direta é a microinjeção, na qual uma solução contendo o gene clonado é perado) e também em vários órgãos embrio-
nários. A possível função de activina nesses
cuidadosamente injetada no núcleo da célula (Capecchi, 1980). Essa é uma técnica
orgãos será discutida no Capítulo 17. (Corte-
especialmente útil para injetar genes em ovos recentemente fertilizados, pois os sia de O. Ritvos.)
núcleo haplóides do espermatozóide e do óvulo são relativamente grandes (Figura
2.31). Em transfecção, o DNA é incorporado diretamente na célula por incubação em
uma solução determinada onde a célula o incorpora. A probabilidade de incorpora-
ção de tal fragmento de DNA no cromossomo é relativamente pequena, sendo ne-
cessário misturar o DNA com outro gene que permite a sobrevivência das raras
células que o incorporaram, em condições de cultura onde as outras células são
destruídas (Perucho et al.,1980; Robins et al.,1981).
Outra técnica é a eletroporação, onde pulsos de alta voltagem “empurram” o DNA
para dentro da célula. Um método mais “natural” para introduzir genes na célula é
colocar o gene clonado em um elemento transponível ou vetor retroviral. Esses são
regiões móveis de DNA, de ocorrência natural, que podem ser integrados no genoma.
Retrovírus são vírus contendo RNA. Dentro da célula hospedeira eles produzem uma
cópia de seu DNA (usando sua própria transcriptase reversa); a cópia se transforma
em dupla fita e se integra em um cromossomo do hospedeiro. A integração é consuma-
da devido às duas seqüências idênticas (longas repetições terminais) nos terminais
do DNA retroviral. Vetores retrovirais são produzidos removendo os genes do
empacotamento viral (necessários para a saída dos vírus da célula) do centro de um
retrovírus de camundongo. Essa extração cria um sítio vazio onde outros genes po-
dem ser colocados. Usando enzimas de restrição apropriadas, o pesquisador pode
remover genes de um fago ou plasmídeo clonado e reinserir o gene em vetores retrovirais.
Retrovetores virais infectam células de camundongo com eficiência próxima de 100%.
Em Drosophila, novos genes podem ser introduzidos na mosca, via elementos P.
Essas seqüências de DNA, são elementos transponíveis de ocorrência natural que
podem ser integrados como vírus em qualquer região do genoma da Drosophila.
Ainda mais, eles podem ser isolados, e genes clonados inseridos no centro do elemen-
to P. Quando o elemento P recombinado é injetado em um oócito de Drosophila, ele
pode se integrar ao DNA e prover o embrião de um novo gene (Spradling e Rubin, 1982).
70 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Camundongos quiméricos
As técnicas descritas têm sido usadas recentemente para transferir genes para to-
das as células do embrião de camundongo (Figura 2.32). Durante o desenvolvimen-
to do camundongo existe um estágio onde somente estão presentes dois tipos de
células: as células externas, que formarão a porção fetal da placenta, e as células
internas, que darão origem ao próprio embrião. Essas células internas são chamadas
células embrionárias precursoras (células tronco), porque cada uma delas pode,
se isolada, gerar todas as células do embrião (Gardner, 1968; Moustafa e Brinster,
1972). Essas células podem ser isoladas do embrião de um camundongo e cultiva-
das. Uma vez em cultura, elas podem ser tratadas como descrito, de modo a incorpo-
rar novo DNA. A nova célula embrionária precursora (não somente o DNA, mas a
célula inteira) pode ser injetada em outro embrião de camundongo em fase precoce.
Assim, a célula precursora tratada estará integrada no embrião do hospedeiro. O
resultado é um camundongo quimérico*. Algumas de suas células são derivadas
das células embrionárias precursoras do hospedeiro, mas outra porção de células é
derivada também das células precursoras tratadas. Se as células tratadas se torna-
ram parte da linha germinal do camundongo, alguns dos seus gametas serão deriva-
dos da célula doadora. Quando cruzado com um camundongo do tipo selvagem,
alguns de seus descendentes levarão, portanto, uma cópia do gene inserido. Os
descendentes heterozigotos, no acasalamento produzirão 25% de embriões carre-
Figura 2.31 gando duas cópias do gene inserido em cada célula de seu corpo (Gossler et al.,1986).
Injeção de DNA (de genes clonados) em um
Assim, em três gerações — o camundongo quimérico, o camundongo heterozigoto
núcleo (neste caso, um pronúcleo de um ovo
de camundongo). (de Wagner et al.,1981, cor- e o camundongo homozigoto — um gene que foi clonado de um outro indivíduo,
tesia de T. E. Wagner.) está agora presente em ambas as cópias dos cromossomos dentro do genoma do
camundongo. Camundongos com genes estáveis de outros indivíduos são chama-
dos camundongos transgênicos. Essas linhagens têm sido particularmente úteis na
determinação das funções de regiões reguladoras que ladeiam os genes.
* É crítico notar a diferença entre uma quimera e um híbrido. Um híbrido resulta da união de dois
genomas diferentes dentro da mesma célula: o descendente de um genitor de genótipo AA e outro de
genótipo aa é um híbrido Aa. Uma quimera resulta quando células de constituição genética diferente
aparecem no mesmo organismo. O termo é apto: refere-se a um monstro mitológico com cabeça de
leão, corpo de bode e cauda de serpente.
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 71
Células embrionárias
precursoras
Gene clonado
no vetor
Cultura de células
Trofoblasto embrionárias precursoras
Mistura de células Seleção de células
embrionárias precursoras embrionárias precursoras
com o gene clonado que incorporaram o transgene
Figura 2.32
Produção de camundongos transgênicos. Cé-
lulas embrionárias precursoras de um camun-
dongo são cultivadas e o genoma alterado pela
adição de um gene clonado. As células
transgênicas são selecionadas e injetadas em
um embrião hospedeiro de camundongo na sua
fase precoce. Aqui, as células embrionárias
Camundongos precursoras transgênicas se integram às celulas
transgênicos precursoras do hospedeiro. Esse embrião é
homozigotos colocado no útero de um camundongo fêmea
Camundongos
grávida e se desenvolve em um camundongo
transgênicos
heterozigotos quimérico. Se as células precursoras doadoras
contribuíram para a linha germinativa, e o ca-
mundongo quimérico é cruzado com um do
tipo selvagem, parte dos descendentes serão
Uma vez dentro do núcleo dessas células, o gene Hoxa-3 mutado substituiu um heterozigotos ao alelo adicionado. Cruzando
alelo normal desse gene por um processo chamado recombinação homóloga. Aqui, heterozigotos, pode ser gerada uma linhagem
de camundongos que é homozigota ao alelo
as enzimas envolvidas no reparo de DNA e replicação incorporam o gene mutante
adicionado. Essa seria uma linhagem transgê-
em lugar da cópia normal. Esse é um evento raro, mas tais células podem ser nica. O gene adicionado (o transgene) pode
selecionadas cultivando as células precursoras em neomicina. A maioria das células ser de qualquer fonte eucariótica.
morre com a droga, mas aquelas que adquiriram resistência pelo gene incorporado
sobrevivem. As células resultantes têm um gene Hoxa-3 normal e um Hoxa-3 mutado.
As células precursoras heterozigotas são microinjetadas em um blastócito de ca-
mundongo e se integram nas células do embrião. O camundongo resultante é uma
quimera composta de células do tipo selvagem do embrião hospedeiro e de células
heterozigotas Hoxa-3, das células precursoras. As quimeras são acasaladas com
camundongos do tipo selvagem e se algumas das células doadoras se integraram à
linhagem das células germinativas, alguns dos descendentes serão heterozigotos
72 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
(A)
Massa
celular neo r
interna
Cultura de células
Blastócito embrionárias
precursoras (ES) Recombinação
Eletroporação homóloga
(B) Célula
gene Hoxa-3 precursora
embrionária
Hoxa-3
Endonucleases gene Hoxa-3 mutado
de restrição com o gene neor inserido
gene neor
Figura 2.33
Seleção de células ES
Técnica de endereçamento de genes (gene targeting). Nesse caso o gene alvo é o heterozigotas por sua
Hoxa-3. (A) Células embrionárias precursoras (ES) são cultivadas a partir de uma resistência à neomicína
massa celular interna. (B) Os genes Hoxa-3 clonados são cortados com uma enzima
de restrição, e um gene neomicina-resistente é inserido na região que codifica o sítio
de ligação da proteína ao DNA. Esses genes Hoxa-3 mutantes são eletroporados em
células ES, onde recombinação homóloga troca o gene do tipo selvagem pela cópia Injeção de células ES
mutada. As células são selecionadas pela sua resistência à neomicina. (C) As células heterozigotas no
(C)
blastócito
ES heterozigotas selecionadas são inseridas na massa interna de células de um em-
brião do tipo selvagem, e o blastócito é retornado ao útero. O camundongo resultante
é uma quimera composta de tecidos Hoxa-3 heterozigotos e tecidos Hoxa-3 do tipo
selvagem. Cruzando os animais quiméricos com camundongos do tipo selvagem
produz-se descendentes Hoxa-3 heterozigotos se as células ES contribuíram na
linhagem germinativa. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e Injeção dos
aproximadamente 25% de sua cria deve ser de homozigotos mutantes de Hoxa-3. blastócitos no útero
Produção de
camundongos quiméricos
Cruzamento de
quiméricos com
tipo selvagem
Cruzamento de
camundongos
heterozigotos
Hoxa-3¯/ Hoxa-3+
Heterozigotos Heterozigotos
Hoxa-3¯/ Hoxa-3¯
Homozigoto
para o gene Hoxa-3. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e apro-
ximadamente 25% de seus descendentes devem levar duas cópias do gene mutado
Hoxa-3. Esses camundongos mutantes homozigotos não possuem as glândulas
tireóide, paratireóide e timo! Dessa maneira, endereçando genes pode-se analisar as
funções de determinados genes durante o desenvolvimento de mamíferos.
[gene7.html]
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 73
promotor
T7
mRNA
antisense Embrião normal
Krüppel
T3 RNA
T3 polimerase polimerase
promotor T7 RNA Embrião normal
infectado com RNA
“antisense” Krüppel
74 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
o sítio onde se liga a RNA polimerase. Localizada em algum lugar dentro do gene (a
jusante ou a montante, ou ainda em um íntron dentro do gene), está uma segunda
região chamada intensificadora. Fatores protéicos que se ligam ao intensificador per-
mitem sua interação com o promotor e, conseqüentemente, com a transcrição do gene
pela RNA polimerase. Alguns promotores (como aqueles usados por produtos relaci-
onados ao metabolismo geral da célula) não precisam ser ativados por intensificado-
res, mas a maioria dos genes ligados ao desenvolvimento são ativados em tempos e
células específicos. Esses genes precisam ser ativados por fatores que se ligam ao
intensificador e ao promotor. Como veremos no Capítulo 10, a ligação de diferentes
fatores de transcrição aos promotores e intensificadores de genes específicos é um
dos mecanismos que controlam a produção de proteínas diferentes a partir de genomas
idênticos. Um exemplo é a ativação do gene para ZP3.
Como detalharemos no Capítulo 4, ZP3 é a principal proteína ligante de espermato-
zóide na superfície do óvulo de camundongo. É uma glicoproteína sintetisada pelo
oócito durante sua maturação em óvulo (Roller et al.,1989). Uma transferência Northern
mostra que o mRNA para essa proteína é sintetizado somente em oócitos em cresci-
mento e não pode ser detectado em nenhum outro tipo de célula (Figura 2.36). O que
permite a esse gene ser ativado somente nos oócitos? Lira e colaboradores (1990)
isolaram o gene para ZP3, determinaram sua seqüência e encontraram um sítio promo-
tor, 28 pares de bases a montante do sítio onde a transcrição do gene é iniciada. Como
hipótese, consideraram que seqüências responsáveis por ativação oócito-específica
podem existir até mais longe, a montante do gene. Eles usaram enzimas de restrição
para isolar o DNA da região 5', a montante, (com 150 pares de bases) e o fundiram ao
gene para a luciferinase de vaga-lume. (Não é necessário dizer que essa enzima produ-
tora de luz não é encontrada em camundongos. Está sendo usada aqui como um “gene
repórter” para monitorar onde o DNA a montante pode causar sua expressão.) O gene
recém-construído, contendo a região a montante do gene ZP3 ligada ao gene estrutu-
ral para luciferinase, foi injetado em zigotos de camundongo para criar animais
transgênicos, levando em cada núcleo o gene luciferinase com a região regulatória
ZP3. Em camundongos transgênicos fêmeas, a hibridização in situ localizou mRNA de
luciferinase em um único tipo de célula, o oócito (Figura 2.37). Assim, a seqüência de
DNA com 150 pares de bases foi necessária e suficiente para ativar o gene (qualquer
gene!) no oócito. Dentro dessa região de 150 pares de bases (de 99 a 86 pares de bases
a montante do gene estrutural ZP3) existe a seqüência 5’-GATAA-3' que liga uma
proteína chamada OSP-1. OSP-1 é encontrada somente em oócitos em maturação; ela
ativa o gene ZP3 ligando-se a essa sequência de DNA no promotor. Parece, então, que
ZP3 é sintetizado em oócitos porque eles têm a proteína OSP-1 que se liga a certas
seqüências de DNA que são parte de seu promotor (Schickler et al.,1992). No momen-
to, está sendo investigado como é regulado o gene codificador de OSP-1.
Figura 2.35
Estrutura básica de um gene regulado pelo de-
senvolvimento. O promotor da maioria dos
genes codificadores de proteínas é encontrado
no terminal 5' (a montante) do gene. O intensi-
ficador freqüentemente está mais acima, a mon-
tante, mas pode ser encontrado dentro de um Intensificador
íntron ou no terminal 3'. Proteínas que se li- Promotor Éxon Íntron Éxon Íntron Éxon
gam ao promotor e aos intensificadores
interagem para regular a transcrição do gene.
(No exemplo ZP3, o sítio OSP-1, GATAA,
está localizado no promotor, aproximadamen-
te 95 pares de bases a montante do sítio de Intensificador Intensificador
início da transcrição. Um sítio intensificador
sensível a estrogênios é encontrado no primei- “a montante “a jusante”
ro íntron do gene ZP3.) do gene” do gene
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 75
Depois de quase um século, estamos começando a entender como as células regulam Músculo
a expressão diferenciada de seus genes, permitindo que genes diferentes possam se Testículos
tornar ativos em diferentes células. Esse conhecimento está ajudando a explicar como Útero
a informação herdada é utilizada para construir os planos básicos do corpo e os tipos
específicos de células do organismo em desenvolvimento.
Entretanto, uma palavra de alerta. Caso o tom celebratório deste capítulo deixou a
impressão de que desenvolvimento é somente uma função da atividade gênica é
necessário relembrar do Capítulo 1, que a distinção entre talo e esporo (Dictyoste-
lium), estado amebóide e flagelado (Naegleria) e gonídios sexual e assexual (Volvox)
é determinada pelo ambiente. Em capítulos posteriores (especialmente Capítulo 21),
veremos outros exemplos do controle ambiental do desenvolvimento: determinação
de sexo temperatura-dependente em répteis, desenvolvimento em insetos dependente
da dieta, e a diferenciação, dependente de experiência, dos neurônios e linfócitos em
mamíferos. Nesses casos o organismo herda a habilidade para responder aos sinais
do ambiente, mas não é possível predizer o fenótipo a partir do genótipo.
(A) (B)
Figura 2.37
Hibridização in situ da expressão do gene repórter luciferinase, quando luciferinase foi
ligado ao promotor do gene ZP3. A sonda radioativa era dirigida à mensagem luciferinase,
a qual apareceu onde foi expressa sob a direção do promotor de ZP3. (A) Visão do
ovário inteiro (60x). (B) Magnificação (160x) de dois folículos ovarianos contendo
oócitos em maturação. (de Lira et al., 1990, cortesia de P. Wassarman.)
76 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
LITERATURA CITADA
Allen, G. E. 1978. Thomas Hunt Morgan: The Brush, S. 1978. Nettie Stevens and the discovery Gilbert, S. F. 1991. Induction and the origins
Man and His Science. Princeton University of sex determination. Isis 69: 132-172. of developmental genetics. In S. Gilbert
Press, Princeton, NJ. (ed.), A Conceptual History of Modern
Burian, R., Gayon, J. and Zallen, D. T. 1991.
E m b r y o l o g y. P l e n u m , N e w Yo r k , p p .
Allen, G. E. 1986. T. H. Morgan and the split Boris Ephrussi and the synthesis of genetics and
181-206.
between embryology and genetics, 1910-1935. embryology. In S. Gilbert (ed.), A Conceptual
In T. J. Horder, J. A. Witkowski and C. C. Wylie History of Modern Embryology. Plenum, New Gilbert, S.F. 1996. Enzyme adaptation and the
(eds.), A History of Embryology. Cambridge York, pp. 207-227. entrance of molecular biology into embryology.
University Press, New York, pp. 113-146. In S. Sarkar (ed.), The Molecular Philosophy
Burkholder, G. D. 1976. Whole mount electron
and History of Molecular Biology: New
Ashburner, M. 1972. Patterns of puffing activity microscopy of polytene chromosome from Dro-
Perspectives, Kluwer Academic Publishers,
in the salivary glands of Drosophila. VI. sophila melanogaster. Can. J. Genet. Cytol. 18:
Dordrecht, pp. 101-123.
Induction by ecdysone in salivary glands of D. 67-77.
melanogaster cultured in vitro. Chromosoma Gluecksohn-Schoenheimer, S. 1938. The deve-
Capecchi, M. R. 1980. High efficiency trans-
38: 255-281. lopment of two tailless mutants in the house
formation by direct microinjection of DNA into
mouse. Genetics 23: 573-584.
Ashburner, M. and Berondes, H. D. 1978. Puffing cultured mammalian cells. Cell 22: 479-488.
of polytene chromosomes. In The Genetics and Gluecksohn-Schoenheimer, S. 1940. The effect
Chisaka, 0. and Capecchi, M. R. 1991. Regionally
Biology of Drosophila, Vol. 2B. Academic Press, of an early lethal (to) in the house mouse. Gene-
restricted developmental defects resulting from
New York, pp. 316-395. tics 25: 391-400.
targeted disruption of the homeobox gene box
Baltzer, F. 1967. Theodor Boveri: Life and Work 1.5. Nature 350: 473-479. Goldschmidt, R. B. 1938. Physiological Gene-
of a Great Biologist. (Trans. D. Rudnick.) tics. McGraw-Hill, New York. [p. 1]
Clever, U. 1966. Induction and repression of
University of California Press, Berkeley.
a puff in Chironomus tentans. Dev. Biol. Gossler, A., Doetschman, T., Korn, R., Serfling,
Barnett, T., Pachl, C., Gergen, J. P. and Wensink, 14:421-438. E. and Kemler, R. 1986. Transgenesis by means
P. C. 1980. The isolation and characterization of blastocyst -derived stem cell lines. Proc. NatI.
Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., Boyer, H. W. and
of Drosophila yolk protein genes. Cell 21: Acad. Sci. USA 83: 9065-9069.
Helling, R. B. 1973. Construction of biologically
729-738.
functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Grossbach, U. 1973. Chromosome puffs and gene
Becker, H. J. 1959. Die Puffs der Speicheldrü- Acad. Sci. USA 70: 3240-3244. expressions in polytene cells. Cold Spring
senchromosomen von Drosophila melanogas- Harbor Symp. Quant. Biol. 38: 619-627.
DiBerardino, M. A. 1987. Genomic potential of
ter. I. Beobachtungen zum Verhalten des Puff-
differentiated cells analyzed by nuclear trans- Gurdon, J. B. 1962. The developmental capacity
musters im Normalstamm und bei zwei
plantation. Am. Zool. 27: 623-644. of nuclei taken from intestinal epithelial cells
Mutanten, giant- und lethal-giant Larvae. Chro-
of feeding tadpoles. J. Embryol. Exp. Morphol.
mosoma 10: 654-678. DiBerardino, M. A. 1989. Genomic activation
10: 622-640.
in differentiated somatic cells. In M. A.
Beermann, W. 1952. Chromomerenkonstanz
DiBerardino and L. D. Etkin (eds.), Develop- Gurdon, J. B. 1968. Transplanted nuclei and cell
und spezifische Modifikationen der Chromo-
mental Biology: A Comprehensive Synthesis. differentiation. Sci. Am. 219(6): 24-35.
somenstruktur in der Entwicklung und Organ-
Plenum, New York, pp. 175-198.
differenzierung von Chironomus tentans. Chro- Gurdon, J. B. 1977. Egg cytoplasm and gene
mosoma 5: 139-198. DiBerardino, M. A. and King, T. J. 1967. Deve- control in development. Proc. R. Soc. Lond.
lopment and cellular differentiation of neural [B] 198: 211-247.
Beermann, W. 1961. Ein Balbiani -ring als
nuclear transplants of known karyotypes. Dev.
Locus einer Speicheldrüsen -Mutation. Chro- Gurdon, J. B. and Uehlinger, V. 1966. “Fertile”
Biol. 15:102-128.
mosoma 12: 1-25. intestinal nuclei. Nature 210: 1240-1241.
Dumont, J. N. and Yamada, T. 1972. Dediffe-
Beermann, W. 1963. Cytological aspects of Gurdon, J. B., Laskey, R. A. and Reeves, 0. R.
rentiation of iris epithelial cells. Dev. Biol.
information transfer in cellular differentiation. 1975. The developmental capacity of nuclei
29:385-401.
Am. Zool. 3: 23-28. transplanted from keratinized cells of adult frogs.
Gardner, R. L. 1968. Mouse chimeras obtained J. Embryol. Exp. Morphol. 34: 93-112.
Blattner, F. R. and eight others. 1978. Cloning
by the injection of cells into the blastocyst.
human fetal g-globin and mouse a-type globin Harrison, R. G. 1937. Embryology and its
Nature 220: 596-597.
DNA: Preparation and screening of shotgun relations. Science 85: 369-374.
collections. Science 202:1279-1283. Gilbert, S. F. 1978. The embryological origins
Harwood, J. 1993. Styles of Scientific Thought:
of the gene theory. J. Hist. Biol. 11: 307-351.
Boveri, T. 1904. Ergebmisse über die Konstitu- The German Genetics Community 1900-1933.
tion der chromatischen Substanz des Zelkerns. Gilbert, S. F. 1987. In friendly disagreement: The University of Chicago Press, Chicago.
Gustav Fisher, Jena. [p. 123] Wilson, Morgan, and the embryological origins
Hennen, S. 1970. Influence of spermine and reduced
of the gene theory. Am. Zool. 27: 797-806.
Briggs, R. 1979. Genetics of cell type deter- temperature on the ability of transplanted nuclei to
mination. Int. Rev. Cytol. [Suppl.] 9: Gilbert, S. E 1988. Cellular politics: Ernest Everett promote normal development in eggs of Rana
107-127. just, Richard B. Goldschmidt, and the attempts to pipiens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66: 630-637.
reconcile embryology and genetics. In R. Rainger,
Briggs, R. and King, T. J. 1952. Transplan- Holland, P. W. H. and Hogan, B. L. M. 1986.
K. R. Benson and J. Maienschein (eds.), The
tation of living nuclei from blastula cells Phylogenetic distribution of Antennapedia-like
American Development of Biology. University of
into enucleated frogs’ eggs. Proc. Natl. Acad. homeoboxes. Nature 321: 251-253.
Pennsylvania Press, Philadelphia, pp. 311-346.
Sci. USA 38:455-463.
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 77
Jacob, F. and Monod, J. 1961. Genetic regulatory Morange, M. 1996. Construction of the develo- Roller, R. J., Kinloch, R. A., Hiraoka, B. Y.,
mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. pmental gene concept. The crucial years: Li, S. S.-L. and Wassarman, P. M. 1989. Gene
Biol. 3: 318-356. 1960-1980. Biol. Zent. bl. 115:132-138. expression during mammalian oogenesis and
early embryogenesis: Quantification of three
Jamrich, J., Sargent, T. D. and Dawid, I. 1985. Morgan, I H. 1897. The Frog’s Egg. Macmi- messenger RNAs abundant in fully grown
Altered morphogenesis and its effects on gene llan, New York. [p. 135]. mouse oocytes. Development 106:251-261.
activity in Xenopus laevis embryos. Cold Spring
Morgan, T. H. 1926. The Theory of the Gene. Rosenberg, U. B., Preiss, A., Seifert, E., Jäckle,
Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 31-35.
Yale University Press, New Haven. H. and Knüpple, D. C. 1985. Production of
Judson, H. F. 1979. The Eighth Day of Creation. phenocopies by Kriippel antisense RNA
Moustafa, L. A. and Brinster, R. L. 1972. Induced
Simon & Schuster, New York. injection into Drosophila embryos. Nature 313:
chimaerism by transplanting embryonic cells into
Just, E. E. 1939. The Biology of the Cell Surface. mouse blastocysts. J. Exp. Zool. 181: 193-202. 703-706.
Blakiston, Philadelphia. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.
Nathans, D. and Smith, H. 0. 1975. Restriction
Keller, E. F. 1995. Refiguring Life: Metaphors endonucleases in the analysis and restructuring B., Horn, G. T., Erlich, H. A. and Arnheim, N.
of Twentieth-Century Biology. Colorado of DNA molecules. Annu. Rev. Biochem. 44: 1985. Enzymatic amplification of β-globin
University Press. 273-293. genomic sequences and restriction site analysis
for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:
King, T. J. 1966. Nuclear transplantation in Okada, T. S. 1991. Transdifferentiation. Oxford 1350-1354.
amphibia. Methods Cell Physiol. 2: 1-36. University Press, New York.
Sander, K. 1986. The role of genes in ontogene-
King, T. J. and Briggs, R. 1956. Serial transplan- Oppenheimer, J. M. 1981. Walter Landauer and sisevolving concepts from 1883 to 1983 as
tation of embryonic nuclei. Cold Spring Harbor developmental genetics. In S. Subtelny and U. perceived by an insect embryologist. In T. J.
Symp. Quant. Biol. 21: 271-289. K. Abbott (eds.), Levels of Genetic Control in Horder, J. A. Witkowski and C. C. Wylie (eds.),
Development. Alan R. Liss, New York, pp. 1-13. A History of Embryology. Cambridge University
Lambert, B. 1972. Repeated DNA sequences in
Press, New York, pp. 363-395.
a Balbiani ring. J. Mol. Biol. 72: 65-75. Orr, N. H., DiBerardino, M. A. and McKinnell,
R. G. 1986. The genome of frog erythrocytes Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R.
Lambert, B. and Daneholt, B. 1975. Microa-
displays centuplicate replications. Proc. Natl. 1977. DNA sequencing with chain-termina-
nalysis of RNA from defined cellular compo-
Acad. Sci. USA 83: 1369-1373. ting inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
nents. Methods Cell Biol. 10: 17-47.
74:5463-5467.
Pardue, M. L. and Gall, J. G. 1970. Chromoso-
Lederman, M. 1989. Research note: Genes on
mal localization of mouse satellite DNA. Science Sapp, J. 1987. Beyond the Gene: Cytoplasm
chromosomes: The conversion of Thomas Hunt
168: 1356-1358. Inheritance and the Struggle for Authority in
Morgan. J. Hist. Biol. 22: 163-176.
Genetics. Oxford Universtiy Press.
Paul, D. B. and Kimmelman, B. A. 1988. Mendel
Lillie, F. R. 1927. The gene and the ontogenetic
in America: Theory and practice, 1900-1919. Sargent, T. D. and Dawid, I. 1983. Differential
process. Science 64: 361-368.
In R. Rainger, K. R. Benson and J. Maienschein gene expression in the gastrula of Xenopus laevis.
Lira, A. A., Kinloch, R. A., Mortillo, S. and Was- (eds.), The American Development of Biology. Science 222: 135-139.
sarman, P. A. 1990. An upstream region of the University of Pennsylvania Press, Philadelphia,
pp. 281-310. Schickler, M., Lira, S., Kinloch, R. A. and
mouse ZP3 gene directs expression of firefly
Wassarman, P. A. 1992. A mouse oocytes-
luciferinase specifically to growing oocytes in
Perucho, M., Hanahan, D. and Wigler, M. 1980. pecific protein that binds to a region of
transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
Genetic and physical linkage of exogenous mZP3 promoter responsible for oocyte
7215-7219.
sequences in transformed cells. Cell 22: 309-317. -specific mZP3 gene expression. Mol. Cell
McGinnis, W., Garber, R. L., Wirz, J. Kurioiwa, Biol. 122:120-127.
Prather, R. S. 1991. Nuclear transplantation and
A. and Gehring, W. J. 1984. A homologous
embryo cloning in mammals. Int. Lab. Animal Smith, L. D. 1956. Transplantation of the nuclei
protein-coding sequence in Drosophila homeotic
Res. News 33: 62-68. of primordial germ cells into enucleated eggs of
genes and its conservation in other metazoans.
Rana pipiens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54:
Cell 37: 403-408. Prather, R. S., Barnes, F. L., Sims, M. M., Robl,
101-107.
J. M., Eyestone, W. H. and First, N L. 1987.
McGrath, J. and Solter, D. 1983. Nuclear trans-
Nuclear transplantation in the bovine embryo: Southern, E. M. 1975. Detection of specific
plantation in the mouse embryo by microsur-
Assessment of donor nuclei and recipient oocyte. sequences among DNA fragments separated by
gery and cell fusion. Science 220: 1300-1302.
Biol. Reprod. 37: 859-866. gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.
McGrath, J. and Solter, D. 1984. Inability of
Prather, R. S., Sims, M. M. and First, N. L. 1989. Spemann, H. 1938. Embryonic Development
mouse blastomere nuclei transferred to enuclea-
Nuclear transplantation in early porcine and Induction. Yale University Press, New
ted zygotes to support development in vitro.
embryos. Biol. Reprod. 41: 414-418. Haven.
Science 226: 1317-1319.
Rappolee, D. A., Brenner, C. A., Schultz, R., Spiegelman, S. 1947. Differentiation as the
McKinnell, R. G. 1978. Cloning: Nuclear Trans-
Mark, D. and Werb, Z. 1988. Developmental controlled production of unique enzymatic
plantation in Amphibia. University of Minne-
expression of PDGF, TGF- α and TGF- β genes patterns. In J. F. Danielli and R. Brown
sota Press, Minneapolis.
in preimplantation mouse embryos. Science 241: (eds.), Growth in Relation to Differentiati-
Monod, J. 1947. The phenomenon of enzymatic 1823-1825. on and Morphogenesis. Cambridge Univer-
adaptation and its bearing on problems of genetics sity Press, Cambridge, p. 287.
Reyer, R. W. 1954. Regeneration in the lens in
and cellular differentiation. Growth Symp. 11:
the amphibian eye. Q. Rev. Biol. 29: 1-46. Spradling, A. C. and Rubin, G. M. 1982.
223-289.
Transposition of cloned P elements into
Robins, D. M., Ripley, S., Henderson, A. S. and
Moore, J. A. 1963. Heredity and Development. Drosophila germ line chromosomes. Science
Axel, R. 1981. Transforming DNA integrates
Oxford University Press, Oxford. [p. 236] 218:341-347.
into the host chromosome. Cell 23: 29-39.
78 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Stevens N. M. 1905a. A study of the germ cells Waddington, C. H. 1939. Preliminary notes on Willadsen, S. M. 1986. Nuclear transplantation
of Aphis rosae and Aphis oenotherae. J. Exp. the development of wings in normal and mutant in sheep embryos. Nature 320: 63-65.
Zool. 2: 371-405; 507-545. strains of Drosophila. Proc. NatI. Acad. Sci.
Willadsen, S. M. 1989. Cloning of sheep and
USA 25:299-307.
Stevens, N. M. 1905b. Studies in Spermato- cow embryos. Genome 31: 956-962.
genesis with Especial Reference to the Waddington, C. H. 1962. New Patterns in Gene-
“Accessory Chromosome.” Carnegie Institute Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind,
tics and Development. Columbia University
of Washington, Washington, D.C. A. J. and Campbell, K. H. S. 1997. Viable
Press, New York, pp. 14-36.
offspring from fetal and adult mammalian cells.
Steward,F. C. 1970. From cultured cells to whole Wagner, T. E., Hoppe, P., Jollick, J. D., Scholl, Nature 385: 810-813.
plants: The induction and control of their growth D. R., Hodinka, R. L. and Gault, J. B. 1981.
Wilson, E. B. 1894. The mosaic theory of de-
and morphogenesis. Proc. R. Soc. Lond. [B] Microinjection of rabbit β-globin gene into
175:1-30. velopment. Biol. Lect. Marine Biol. Lab. Woods
zygotes and its subsequent expression in adult
Hole 2:1-14.
mice and offspring. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Steward, F. C., Mapes, M. 0. and Smith, J. 1958.
78: 6376-6380. Wilson, E. B. 1895. An Atlas of the Fertilization
Growth and organized development of cultured
cells. I. Growth and division of freely suspended and Karyogenesis of the Ovum. Macmillan, New
Wieslander, L. and Daneholt, B. 1977. Demons-
cells. Am. J. Bot. 45: 693-703. York. [p. 4]
tration of Balbiani ring RNA sequence in
polysomes. J. Cell Biol. 73: 260-264. Wilson, E. B. 1896. The Cell in Development
Steward, F. C., Mapes, M. 0., Kent, A. E. and
Holsten, R. D. 1964. Growth and development and Inheritance. Macmillan, New York. [p. 262]
Wessel, G. M., Goldberg, L., Lennarz, W. J.
of cultured plant cells. Science 143: 20-27. and Klein, W. H. 1989. Gastrulation in the sea Wilson, E. B. 1904. Experimental studies on
urchin is accompanied by the accumulation of germinal localization. I. The germ regions in
Stice, S. J. and Robl, J. M. 1988. Nuclear re-
an endoderm-specific mRNA. Dev. Biol. 136: the egg of Dentalium. J. Exp. Zool. 1: 1-72.
programming in nuclear transplant rabbit
526-538.
embryos. Biol. Reprod. 39: 657-664. Wilson, E. B. 1905. The chromosomes in re-
Wetmur, J. G. and Davidson, N. 1968 . Kinetics lation to the determination of sex in insects.
Ursprung, H., Smith, K. D., Sofer, W. H. and
of renaturation of DNA. J. Mol. Biol. 31:349-370. Science 22: 500-502.
Sullivan, D. T 1968. Assay systems for the study
of gene function. Science 160: 1075-1081. Wilkinson, D. G., Bhatt, S. and Herrmann, B. Yamada, T. 1966. Control of tissue specificity:
G. 1990. Expression pattern of the mouse T The pattern of cellular synthetic activities in
Vierra, J. and Messing, J. 1982. The pUC
gene and its role in mesoderm formation. tissue transformation. Am. Zool. 6:21-31.
plasmids, an M13mp7-derived system for
Nature 343: 657-659.
insertion mutagenesis and sequencing with
synthetic universal primers. Gene 19: 259-268.
A base celular da morfogênese:
Afinidade celular diferencial
3
Mas a natureza não é atomizada. Sua pa-
dronização é inerente e primária, e a ordem
subjacente à beleza é nela demonstrada; mais
ainda, a natureza só pode ser percebida pela
mente humana, porque ela mesmo é parte
U m corpo não é meramente uma coleção de tipos de células distribuídas ao
acaso. Desenvolvimento envolve não só a diferenciação celular, mas tam-
bém sua morfogênese em arranjos multicelulares tais como tecidos e órgãos.
Quando observamos a anatomia detalhada de um tecido como a retina neural, vemos
um arranjo preciso e intrincado de muitos tipos diferentes de células. Neste Capítulo,
integrante e majoritária daquela ordem. introduziremos as vias de mudança pelas quais as células do embrião em desenvolvi-
Paul Weiss (1960) mento criam órgãos funcionais do corpo. Existem quatro questões majoritárias partici-
pando do arcabouço de discussões sobre morfogênese:
Eu fui criado terrivelmente e maravilhosa-
• Como se formam tecidos a partir de células? De que modo células da retina
mente. Salmo 139 (ca. 500 a.c).
neural aderem a outras células da retina neural e não se associam às celulas da
retina pigmentada ou da íris que estão próximas a elas? De que modo, os vários
tipos de células presentes na retina neural (as três camadas distintas de fotore-
ceptores, neurônios bipolares e células ganglionares) estão organizados para
permitir que a retina seja funcional?
• Como são os órgãos construídos a partir de tecidos? As células retinais do
olho estão situadas atrás da córnea e da lente a uma distância exata. A retina
seria inútil se estivesse situada atrás de um osso ou outro lugar qualquer, onde
a lente não pudesse nela focalizar os raios de luz. Além disso, os neurônios da
retina devem penetrar no cérebro para inervar as regiões do córtex cerebral que
analisam a informação visual. Todas essas conexões devem estar precisamente
ordenadas.
• Como células migrantes atingem seu destino, e como se formam órgãos em
determinados locais? Olhos se desenvolvem na cabeça, mas em nenhum ou-
tro lugar. O que impede a formação de um olho em outras partes do corpo, se
todas as células têm o mesmo potencial genético? Em alguns casos, como o de
precursores de nossas células pigmentadas, células germinativas e glândula
supra-renal, as células devem percorrer longas distâncias para alcançar seu
destino final. Como as células são instruídas para percorrer certas rotas e parar
quando atingem uma região específica do corpo?
• Como crescem órgãos e suas células, e como é esse crescimento coordenado
ao longo do desenvolvimento? As células do olho devem crescer juntas, e as
células da retina raramente dividem-se após o nascimento. Nosso intestino,
entretanto, está constantemente descartando células e regenerando outras, e
79
80 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Figura 3.1 ➧
Sumário dos principais processos morfogenéticos em células mesenquimatosas e epiteliais
PROCESSO AÇÃO MORFOLOGIA EXEMPLO
CÉLULAS MESENQUIMATOSAS
CÉLULAS EPITELIAIS
Células epidérmicas
presuntivas
Segregação de
tipos de células
Reagregação
espontânea
Dissociação
de células
Figura 3.2
Reagregação de células da nêurula de anfíbi-
os. Células epidérmicas presuntivas de em- Os resultados de seus experimentos foram surpreendentes. Em primeiro lugar,
briões pigmentados e células da placa neural verificaram que células reagregadas se tornavam espacialmente segregadas. Ou seja,
de embriões não pigmentados são dissociadas em lugar de permanecerem misturadas, cada tipo de célula se posicionava em sua
e misturadas entre si. As células reagrupam- própria região. Assim, quando células epidérmicas (ectodérmicas) e mesodérmicas
se de tal forma que um tipo (aqui, a epiderme foram ajuntadas para formar um agregado misto, as células epidérmicas foram encon-
presuntiva) cobre o outro. (Modificado de tradas na periferia do agregado e as células mesodérmicas no seu interior. Em nenhum
Townes e Holtfreter, 1955.) caso as células permaneceram misturadas ao acaso, e na maioria dos casos, um tipo de
tecido envolvia o outro completamente.
Em segundo lugar, os pesquisadores observaram que as posições finais das célu-
las reagregadas refletiam suas posições embriônicas. O mesoderma migra centralmen-
te à epiderme, aderindo à sua superfície interna (Figura 3.3A). O mesoderma também
migra centralmente em relação ao intestino ou endoderma (Figura 3.3B). Entretanto,
quando as três camadas germinativas são misturadas entre si, o endoderma se separa
do ectoderma e mesoderma e é então envolvido por eles (Figura 3.3C). Na sua configu-
ração final, o ectoderma está na periferia, o endoderma é interno e o mesoderma se
situa na região entre eles. Holtfreter interpretou esse fato em termos de afinidade
seletiva. A superfície interna do ectoderma tem uma afinidade positiva pelas células
mesodérmicas e uma afinidade negativa para o endoderma, enquanto o mesoderma
tem afinidades positivas para ambas as células, ectodérmicas e endodérmicas. A
mimetização da estrutura embrionária normal por agregados celulares também pode
ser vista na recombinação de células da epiderme e da placa neural (Figura 3.3D). As
células epidérmicas presuntivas migram para a periferia, como antes; as células da
placa neural migram para o centro, formando uma estrutura reminescente do tubo
neural. Quando células axiais mesodérmicas (notocorda) são adicionadas à suspen-
são de células presuntivas, epidérmicas e neurais, a segregação celular resulta em uma
camada epidérmica externa, um tecido neural localizado centralmente, e uma camada
de tecido mesodérmico entre eles (Figura 3.3E). De alguma maneira, as células têm a
capacidade de distribuirem-se em suas próprias posições embriológicas.
Tais afinidades preferenciais foram também observadas por Boucaut (1974),
que injetou células individuais de específicas camadas germinativas de volta na
cavidade gastrular de anfíbio. Ele verificou que essas células migram para sua
camada germinativa apropriada. Células endodérmicas encontram posições no
endoderma do hospedeiro, enquanto que células ectodérmicas se localizam em seu
CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 83
Figura 3.3
ectoderma. Assim, afinidade seletiva parece ser importante para fornecer informação Distribuição e reorganização de relacionamen-
posicional às células embrionárias. tos embrionários espaciais em agregados de
A terceira conclusão de Holtfreter e seus colegas foi que afinidades seletivas células embrionárias de anfíbios. (Modificado
mudam durante o desenvolvimento. Isso deveria ser esperado, pois células embrioná- de Townes e Holtfreter, 1955.)
rias não mantêm uma única relação estável com outras células. Para que ocorra o
desenvolvimento, células precisam interagir de forma diferente com outras popula-
ções celulares em tempos específicos. Essas mudanças na afinidade celular foram
dramaticamente confirmadas por Trinkaus (1963), que mostrou uma clara correlação
entre mudanças de adesão in vitro e o comportamento da célula embrionária. Mais
recentemente, os experimentos de Fink e McClay (1985) demonstraram esse comporta-
mento no ouriço-do-mar, durante seu desenvolvimento. Na blástula, todas as células
parecem ter a mesma afinidade umas pelas outras. Cada célula tem também uma alta
afinidade para a matriz extracelular (camada hialina) que cobre o embrião, e uma baixa
afinidade para as proteínas dentro da cavidade embrionária (blastocele). Entretanto,
ao iniciar-se a gastrulação, um grupo específico de células, no pólo vegetal da blástu-
la, perde sua afinidade pelas células vizinhas e pela matriz extracelular externa, en-
quanto adquire simultaneamente afinidade pelas fibrilas protéicas que forram a blasto-
cele (Figura 3.4). Essas mudanças de afinidade causam a perda de contato das células
84 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Fibrilas
da
blastocele
com suas vizinhas e a migração para dentro da blastocele, onde elas formarão o
esqueleto da larva. Quando elas começam a formar esse esqueleto, suas proprieda-
des adesivas terão que mudar novamente. Essas células, que tinham sido “anti-
sociais” entre si desde seu ingresso na blastocele, devem agora aderir para formar
os rudimentos do anel esquelético. Essas mudanças na adesão são específicas
temporalmente e também específicas para as células precursoras esqueléticas
(McClay e Ettensohn, 1987). Tais mudanças na afinidade celular são extremamente
importantes nos processos da morfogênese.
A reconstrução de agregados de embriões tardios de aves e mamíferos foi
obtida pelo uso da protease tripsina para dissociar as células entre si (Moscona,
1952). Quando as células isoladas resultantes foram misturadas em um frasco e
agitadas de modo que a força de cisalhamento destruísse adesões não específi-
cas, as células se distribuíram de acordo com seu tipo celular. Dessa maneira, elas
reconstruíram a organização do tecido original (Moscona, 1961; Giudice, 1962). A
Figura 3.5 mostra a “reconstrução” do tecido da pele de um embrião de camundon-
go de 15 dias. As células da pele são separadas por enzimas proteolíticas e depois
agregadas em uma cultura rotatória. As células epidérmicas migram para a perife-
ria, e as dérmicas migram para o centro. Em 72 horas, a epiderme foi reconstituída,
formou-se uma camada de queratina e folículos de pêlo são vistos na região dermal.
Essa reconstrução de tecidos complexos a partir de células únicas é chamada de
agregação histotípica.
(D) Derme
Figura 3.6
Agregados formados pela mistura de células da retina neural (não pigmentada) de um embrião de (E)
galinha de 7 dias com células pigmentadas da retina (escuras). (A) Cinco horas após a mistura Folículos de pêlo
das suspensões de células isoladas, são vistos agregados de células distribuídas ao acaso. (B) Em
19 horas, as células pigmentadas da retina não são mais vistas na periferia. (C) Após dois dias,
a maioria das células pigmentadas da retina estão localizadas em uma massa central interna
rodeadas pelas células da retina neural. (As células pigmentadas espalhadas são provavelmente
células mortas). (de Armstrong, 1989, cortesia de P. B. Armstrong.)
86 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Figura 3.7
Espalhamento de um tipo de célula sobre outro tipo. A posição final de agregados compostos de
dois tipos de tecidos é independente de sua posição inicial. Uma condição final idêntica é
Tecido Tecido obtida, se os tecidos são transformados em suspensões de células isoladas e, então, reagregadas
A B ou os tecidos são mantidos intactos e colocados em contato. (De acordo com Armstrong, 1989.)
Células A localizadas
centralmente às células B
(A) DISTRIBUIÇÃO
(B) AO ACASO
(C) SEPARAÇÃO
Figura 3.8
Distribuição como um processo tendendo à estabilidade termodinâmica máxima. (A) Distribui-
ção ocorre quando a força adesiva média entre diferentes tipos de células (ωab) é menor que a
força adesiva média homotípica (A-A ou B-B) (ωaa, ω bb). As células mais adesivas se localizam
centralmente. (B) Se a força das adesões A-B é maior ou igual à média das adesões homotípicas,
não vai haver distribuição, porque o sistema já atingiu o equilíbrio termodinâmico, e a mistura
dos tipos de células será ao acaso. (C) Se as ligações A-B são muito mais fracas que a média das
adesões homotípicas, haverá uma completa separação, como é característico para óleo e água.
CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 87
Informações adicionais
& Especulações
Figura 3.9
Distribuição quando blastemas de níveis iguais
ou diferentes, de membros anteriores, são co-
locados juntos em cultura. (Um membro de
cada par foi marcado com tritio para distinguí-
lo do outro). Depois de três dias em cultura,
os agregados foram fixados e secionados.
Antebraço
Permitir crescimento
externo dos enxertos
Informações adicionais
& Especulações
TCC ATG T T C GAT CGC GAG ATG GAG GAG ACG CAT TAC CCG CCC TGC ACC TAC AAC GTG ATG TGC
Ser Met Phe Asp Arg Glu Met Glu Glu T h r His Ty r P r o P r o Cys T h r Ty r Asn Val Met Cys
Seqüência esperada
Caderinas
Íons de cálcio são freqüentemente necessários para a adesão celular. Os íons esta-
bilizam as conformações adesivas de certas proteínas da superfície celular chama-
das caderinas. Caderinas têm um papel crítico no estabelecimento e manutenção de
conexões intercelulares, e parecem ser cruciais para a segregação espacial de célu-
las e para a organização da forma animal (Takeichi, 1987). Caderinas interagem com
outras caderinas de células adjacentes e são ancoradas na célula por complexos de
proteínas chamados cateninas (Figura 3.16). O complexo caderina-catenina forma a
clássica junção aderente que liga as células epiteliais entre si. Mais ainda, como as
cateninas se ligam ao citoesqueleto de actina, elas integram as células epiteliais em
uma unidade mecânica. Em embriões de vertebrados, quatro classes principais de
caderinas foram identificadas:
Tipo de agregado Cartilagem Fígado Músculo peitoral Rotação por seis horas
Cartilagem 100 6 48
Fígado 10 100 0
Músculo peitoral 38 49 100 Contar células
radioativas que
* Porcentagem do número médio de células coletadas pelos agregados isotípicos. aderiram ao agregado
CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 93
Tabela 3.1 Classificação geral das principais moléculas de adesão celular (CAMs)
Caderina
Ligação
caderina-caderina
Caderina
94 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
(A)
(B)
Figura 3.18
Importância de caderinas em manter a coesão entre células em desenvolvimento. (A) Quando
oócitos são injetados com oligonucleotídeos antisense contra uma mensagem de caderina herda-
da maternalmente, as células centrais dispersam quando o hemisfério animal é removido. Em
embriões controle (direita), as células internas permanecem juntas. (B) No estágio de quatro
células, os blastômeros que formam o lado esquerdo do sapo são injetados com um mRNA para
N-caderina que não tem a região extracelular da caderina. Durante a neurulação as células com a
proteína mutante não formam uma camada coerente. (de Heasman et al., 1994; B de acordo com
Kintner et al, 1992; fotografias cortesia de J. Heasman e C. Kintner.)
et al., 1990; Fujimori et al., 1990). Assim, as caderinas estão, provavelmente, tendo um
papel principal na organização das células em tecidos. [cell2.html]
N N N
N N
Domínios semelhantes
à imunoglobulina
Domínios semelhantes N
à fibronectina
Extracelular
ou ou
Citoplasma CC
C C C
IgM N-CAM ou fasciclina II L1 ou neurogliana Interações de N-CAM célula-célula
Figura 3.21
Distribuição de diferentes CAMs em bordas tissulares. Enquanto as células mesodérmicas se
reúnem para induzir o broto das penas no ectoderma, as células mesenquimatosas recém-
agregadas expressam N-CAM (A) e as células ectodérmicas expressam E-caderinas (B) nas
suas respectivas membranas celulares. (de Chuong e Edelman, 1985a, cortesia de G. Edelman).
(B) (D)
Figura 3.22
Proteínas das junções em fenda. (A) Micro-
grafia eletrônica de uma fileira de junções em
Espaço intracelular
(15-40 nm) fenda ligando duas células justapostas. (B) Mi-
crografia fluorescente de junções em fenda em
túbulo renal de embrião de camundongo de 17
dias. (C) Compartimento formado por prote-
Canais de ínas da junção de fenda entre células que se
comunicação comunicam umas com as outras. Esse com-
partimento na gástrula de camundongo pode
ser visto injetando o corante Lucifer Yellow
em um célula e observando sua transferência a
um pequeno grupo de células. (D) Estrutura
da subunidade da junção em fenda. (A de
Membranas Peracchia e Dulhunty, 1976, cortesia de C.
celulares
Peracchia; B de Sainio et al., 1992, cortesia de
Conexões K. Sainio; C de Kalimi e Lo, 1988, cortesia de
(A) (D) C. Lo; D conforme Darnell et al., 1986.)
98 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
dos blastômeros precoces estão ligados por junções em fenda, dessa forma permi-
tindo que íons e pequenas moléculas solúveis passem livremente entre eles. A habi-
lidade de células em formar junções em fenda com algumas células, e não com
outras, cria “compartimentos” fisiológicos dentro do embrião em desenvolvimento
(Figura 3.22 C).
A importância de junções em fenda no desenvolvimento foi demonstrada em
embriões de anfíbios e mamíferos (Warner et al., 1984). Quando anticorpos contra
proteínas da junção em fenda foram microinjetados em uma célula específica de uma
blástula de Xenopus de oito células, a progênie daquela célula que usualmente está
ligada por junções de fenda, agora não podia permitir a passagem de íons ou molé-
culas pequenas de uma célula à outra. Ainda mais, os girinos que resultaram das
blástulas tratadas mostraram defeitos especificamente relacionados ao destino de-
senvolvimental da célula injetada (Figura 3.23). A progênie de tal célula não morreu,
mas foi incapaz de se desenvolver de maneira normal (Warner et al., 1984). No em-
brião de camundongo, os oito primeiros blastômeros são conectados entre si por
junções em fenda. Apesar de frouxamente associadas entre si, essas oito células se
movem juntas para formar um embrião compacto. Se a compactação for inibida por
anticorpos contra proteínas da junção em fenda, o desenvolvimento posterior ces-
sa. Os blastômeros tratados continuam a dividir-se, mas a compactação não ocorre
(Lo e Gilula, 1979; Lee et al., 1987). Se RNA antisense contra as mensagens da junção
em fenda é injetado em um dos blastômeros de um embrião normal de camundongo,
aquela célula não formará junções em fenda e não será incluída no embrião (Bevilacqua
et al., 1989).
Os canais da junção em fenda são feitos de proteínas chamadas conexinas. Em
cada célula, seis conexinas idênticas da membrana se agrupam para formar um canal
transmembrana contendo um poro central. O complexo de junção em fenda de uma
célula se conecta ao complexo de junção em fenda de outra célula, permitindo que se
juntem os citoplasmas de ambas as células (Figura 3.22D). Existem aproximadamente
doze tipos de conexinas, e algumas podem ser reguladas por caderinas. Jongen e
colaboradores (1991) observaram que em células acopladas por E-caderina, a comu-
nicação entre células, mediada por junções em fenda, depende da função de caderinas.
Evidências sugerem que caderinas permitem não só o contato entre as células como
também modificam as proteínas tipo conexina. Os diferentes tipos de proteína
conexina têm papéis separados, mas parcialmente sobrepostos, no desenvolvimen-
to normal. Por exemplo, a proteína de junção em fenda conexina-43 é encontrada em
quase todos os tecidos do embrião do camundongo em desenvolvimento. Entretan-
to, se os genes da conexina-43 forem derrubados por endereçamento de genes, o
embrião ainda se desenvolverá. Parece que a função da proteína conexina-43 pode
ser assumida por outras conexinas. Mas, logo após o nascimento, esses camundon-
gos têm respiração convulsiva, se tornam cianóticos e morrem. Autópsia desses
animais mostra que o ventrículo direito – a câmara que bombeia sangue aos pulmões
através da artéria pulmonar – está cheio de tecido que fecha a câmara e impede o
fluxo de sangue (Reaume et al.,1995). Mesmo que a perda da proteína conexina-43
(A) possa ser compensada em muitos tecidos, parece que ela é crítica para o desenvol-
vimento normal do coração. [cell4.html]
A membrana celular tem, então, vários mecanismos pelos quais pode fazer liga-
ções com membranas de outras células. Podem ser usadas CAMs da superfamília de
Figura 3.23
Efeitos da junção em fenda no desenvolvimento. Seção de um girino de Xenopus no qual um dos
blastômeros, no estágio de oito células, foi injetado com (A) um anticorpo controle ou (B) um
anticorpo contra a proteína da junção em fenda. O lado formado pelo blastômero injetado não tem
(B) o olho e tem uma morfologia cerebral anormal. (de Warner et al., 1984, cortesia de A. E. Warner.)
CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 99
A matriz extracelular
A matriz extracelular consiste de macromoléculas secretadas pelas células no seu
ambiente imediato. Essas moléculas interagem de modo a formar uma estrutura insolú-
vel que pode ter várias funções no desenvolvimento. Em algumas situações, ela pode
separar dois grupos adjacentes de células e prevenir qualquer interação. Em outros
casos, a matriz extracelular pode servir como o substrato no qual as células migram, ou
pode até induzir diferenciação em certos tipos celulares. Um tipo de matriz é mostrado
na Figura 3.24. Aqui, uma lâmina de células epiteliais está adjacente a uma camada de
tecido mesenquimatoso frouxo. As células epiteliais formaram uma apertada camada
extracelular chamada lâmina basal; as células mesenquimatosas secretam uma frouxa
lâmina reticular. Juntas, essas camadas constituem a membrana basal da lâmina de
células epiteliais. Existem três componentes principais na maioria de matrizes
extracelulares: colágeno, proteoglicanos e glicoproteínas grandes que são chamadas
moléculas de adesão a substrato (Tabela 3.2).
COLÁGENOS COLÁGENO IV
Moléculas longas e delgadas (Tipo I é o mais comum; Tipos II, Os componentes estruturais majoritários da lâmina basal. Ao contrá-
III, e V-XIII são também encontradas) que se organizam para rio de outros colágenos, suas fibrilas são como um fino “arame de
formar fibrilas, usualmente com 60-70 nm de diâmetro. galinheiro” e se organizam em um substrato semelhante a feltro.
Colágenos proporcionam força e estabilidade aos tecidos.
PROTEOGLICANOS DA MATRIZ
PROTEOGLICANOS DA MATRIZ
Ácido hialurônico e proteoglicanos sulfatados são freqüentes na lâmi-
Compostos de proteínas e dissacarídeos repetitivos (glicosaminogli- na basal. Sua presença pode facilitar a passagem de produtos
canos). Glicosaminoglicanos incluem ácido hialurônico, uma enorme secretados pela lâmina.
molécula (108 Da) que liga grandes quantidades de água. Proteoglica-
nos sulfatados compreendem uma proteína linear interna à qual estão MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO
ligadas cadeias de um ou mais glicosaminoglicanos sulfatados
(condroitina, heparan, queratan e dermatan sulfato). Laminina, o componente funcional majoritário da lâmina basal. Um
Proteoglicanos estimulam e modulam movimentos celulares; sua trímero de glicoproteína com sítios de adesão para a membrana celu-
disponibilidade sugere que podem ter outras propriedades não lar, colágeno IV e glicosaminoglicanos.
conhecidas. Lâmina basal pode conter fibronectina, tenascina, nidogen e outras
glicoproteínas adesivas.
MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO
Monômeros de proteoglicanos
Pequenos glicosaminoglicanos
(tal como condroitina sulfato)
Proteína
esqueleto
Ácido
hialurônico
Ácido hialurônico
a
Essas são unidades repetitivas típicas desses glicosaminoglicanos. Entretanto, algumas regiões de cada GAG podem ter
sacarídeos ligeiramente modificados.
102 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
(A)
(B)
(D)
(C)
Proteoglicanos também são importantes como mediadores de conexões entre
Figura 3.26 tecidos adjacentes em um órgão. No órgão, eles reúnem células soltas para formar
Capa de proteoglicanos envolvendo células mó-
uma lâmina epitelial* (San Antonio et al.,1987; Thesleff et al., 1989; Vainio et al.,
veis. (A) Capa de hialuronidato envolve
mioblastos de galinha. Mioblastos em cultura
1989; Bernfield e Sanderson, 1990). Em alguns casos, proteoglicanos secretados por
excluem pequenas partículas (nesse caso, um tipo de célula são essenciais para o crescimento de células vizinhas. Axônios
hemácias fixadas) em distância significante da dos gânglios da raiz dorsal têm proteoglicanos de heparan sulfato entre suas prote-
borda celular. (B) quando os mioblastos são ínas da superfície celular; a remoção desses proteoglicanos impede a proliferação
tratados com hialuronidase (a qual dissolve áci- ao seu redor, das células de Schwann associadas (Ratner et al.,1985). Uma maneira
do hialurônico), essa capa extracelular desapa- pela qual cadeias de glicosaminoglicanos, de proteoglicanos, podem funcionar é
rece. (C) A capa também desaparece quando reter e apresentar fatores de crescimento para receptores celulares. Fatores de cres-
os mioblastos cessam a divisão e se juntam cimento são proteínas semelhantes a hormônios que regulam mitose ou diferencia-
enquanto se diferenciam. (D) Micrografia ele-
ção quando se ligam a determinadas células. Entretanto, o receptor celular para o
trônica de hialuronidato em solução aquosa
mostra uma rede fibrilar ramificada. (A-C de
fator de crescimento freqüentemente não liga o fator com grande afinidade. Na
Orkin et al., 1985, cortesia de B. Toole; D de verdade, o fator é inicialmente ligado pelos carboidratos do proteoglicano, e isso
Hadler et al., 1982, cortesia de N. M. Hadler.) concentra o fator de crescimento localmente, de modo a ser possível a ligação com
o receptor (Massagué, 1991; Yayon et al.,1991).
(A) RGD
Fibronectina
Sítios de
ligação
Sítio de ligação de RGD de cálcio
Subunidade ß
Subunidade ß Subunidade
de integrina
de integrina α de
integrina
Extracelular
Citoplasma
α Actinina Vinculina
Talina
Glicosil transferase
(A) NDP-açúcar + aceptor NDP + açúcar-aceptor
Doador de açúcar
(B) ativado (NDP-açúcar)
(C)
Enzima
glicosil- Aceptor
transferase insolúvel
Procolagenase Colagenase
Plasminogênio
Ativação Colagenase
Uroquinase Plasmina Ativa
transcricional muito ativa
Prostromelisina Estromelisina
Figura 3.31
Cascata de ativação de metaloproteinases de membrana. Uroquinase é um ativador de
plasminogênio, que cliva o plasminogênio dando plasmina. Plasmina ativa as formas precurso-
ras de estromelisinas e colagenases produzindo uma mistura de enzimas muito ativa capaz de
digerir matrizes extracelulares. (Conforme Matrisian, 1992.)
JAK--ST
A via JAK STAAT
No Capítulo 2 discutimos um conjunto de fatores de transcrição inativos até que
um sinal de outra célula produz sua fosforilação. Esses fatores de transcrição são
as proteínas STAT (transdutores de sinais e ativadores de transcrição) (Ihle,1995,
1996). As STATs são fosforiladas pela forma ativa da uma família de quinases, a
JAK. A via JAK-STAT é muito importante na diferenciação de células sangüíneas
e na ativação do gene de caseína na produção de leite (Briscoe et al., 1994; Groner
e Gouilleux, 1995). Nesses casos, um certo fator de diferenciação se liga a seus
receptores membrana-abrangente, fazendo com que esse se dimerize (que forme
dímeros) (Figura 3.32). Proteínas JAK estão ligadas a cada um dos receptores (em
suas respectivas regiões citoplasmáticas), e agora ao serem aproximadas fosforilam
o receptor em vários sítios. Os receptores ativados têm agora sua própria ativida-
de quinásica e podem fosforilar certos STATs inativos, induzindo sua dimerização.
Os dímeros são a forma ativa dos STAT que são translocados para o núcleo onde
se ligam às regiões específicas do DNA.
108 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
A via RTK
RTK-R-R as
-Ras
A via de transdução de sinais RTK-Ras foi uma das primeiras vias a unir as várias áreas
da biologia do desenvolvimento. Pesquisadores estudando olhos de Drosophila,
vulvas de nematódeos e cânceres humanos chegaram à conclusão que estudavam o
mesmo gene. A via RTK-Ras começa na superfície celular, onde o receptor tirosina
quinase liga seu ligante específico. Ligantes que se ligam a RTKs incluem fatores de
crescimento fibroblásticos, fatores de crescimento epidérmico e fatores de crescimen-
to derivados de plaquetas. O receptor tirosina quinase abrange a membrana e, quando
conectado com seu ligante, sofre uma mudança conformacional que permite sua
dimerização. Esses dímeros têm uma atividade quinásica latente, ativada por mudança
conformacional fazendo com que os receptores se fosforilem um ao outro em resíduos
particulares de tirosina. Assim, a introdução de um ligante no receptor causa uma
autofosforilação no domínio citoplasmático do receptor.
A tirosina fosforilada no receptor é reconhecida por uma proteína adaptiva (Figura
3.33)—especificamente, as tirosinas fosforiladas são reconhecidas por uma porção da
proteína adaptativa chamada domínio SH2. As proteínas adptativas servem como uma
ponte que liga a quinase fosforilada do receptor a um poderoso sistema intracelular de
sinalização. Enquanto ligada ao receptor fosforilado pelo seu domínio SH2, a proteína
adaptativa usa seu domínio SH3 para regular o ativador de uma proteína Ras G. Normal-
mente, a proteína de tipo selvagem Ras está na sua forma inativa e ligante de GDP.
Quando ativada pelo receptor ligante-acoplado, ela troca um fosfato de outro GTP
para transformar o GDP ligado em GTP. Essa catálise é ajudada pelo fator de troca
guanina nucleotídeo. A Ras ligada a GTP é a forma ativa da proteína que transmite o
sinal. Após a transmissão, o GTP é hidrolizado a GDP. Essa catálise é muito estimulada
CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 109
Núcleo Modulação da
transcrição
* Nomes podem ser perigosamente ilusivos. Muitos compostos têm mais de uma função na
célula, e o que fazem depende do contexto da célula. Certos “fatores de crescimento” podem inibir
o crescimento, e alguns “fatores de transcrição” podem ser utilizados para inibir a transcrição.
Realmente, alguns fatores de transcrição podem ser usados para regular a tradução. Aqui vemos que
moléculas de adesão celular podem ser usadas para transdução de sinais. Proteínas celulares não
respeitam nossas fronteiras disciplinares.
Informações adicionais
& Especulações
FGF
FGFR normal:
FGF se liga causando dimerização
do receptor de FGF
(B) FGFR dominante negativo
FGFR FGFR
tações dominantes negativas de recep- Receptor de FGF normal mutante
tores. Esse tipo de experimento será bem
sucedido se a dimerização for crítica para
a função do receptor. Os receptores FGF
ativos, em um caso, são dímeros de duas
moléculas idênticas embebidas na mem-
brana celular. O mutante dominante ne-
gativo não formará um dímero ativo, mes-
mo com um parceiro do tipo selvagem.
Portanto, quando presente em concen- Receptores
trações suficientemente altas, o receptor sem domínios Excesso do receptor
Domínio
intracelulares mutante pode
mutante compete com receptores FGF da tirosina Sinal
são inativos seqüestrar o receptor
normais impedindo que suas proteínas quinase
normal do fator de
sejam ativadas. Isso pode ocorrer em Sem sinal
crescimento. Esse
mutações naturais ou provocadas. heterodímero é inativo.
Amaya e colaboradores (1991) injetaram
Sem sinal
mRNA de uma forma mutante de um re-
Figura 3.34
ceptor FGF em embriões de duas células
Ensaio para receptor dominante negativo para a importância de um determinado receptor. O
de Xenopus. Essas blástulas não conse-
receptor de FGF (FGFR) é uma RTK transmembrana. (A) Quando dímeros de FGF se ligam à
guem responder ao FGF (Figura 3.34).
porção extracelular desses receptores, esses se dimerizam e seus dois domínios de proteína
Nesse experimento, embriões que não ti- quinase se fosforilam mutuamente. Quando fosforilados, acionam um sinal através do citoplas-
nham receptores FGF funcionais tinham ma. (B) O receptor dominante negativo não tem o domínio da proteína quinase. Quando liga
mesoderma posterior e lateral dramatica- FGF, produz um dímero inativo, mesmo se o outro parceiro é do tipo selvagem. Assim, o efeito
mente reduzido (Prancha 3). de FGF não é transmitido à célula.
CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 111
Figura 3.35
A via do inositol fosfato. (A) A reação de
(A) fosfolipase C, transformando PIP2 em DAG e
IP3. (B) Essa reação pode ser iniciada em dois
Extracelular pontos principais na membrana celular. Pri-
meiro, a via é iniciada quando o receptor trans-
Fosfolipase C membrana ligado à proteína G é ativado pela
introdução do ligante. Essa ativação resulta na
ligação de GTP à proteína heteromérica G e
Citoplasma sua dissociação em subunidades ativas. Essas
subunidades ativam enzimas fosfolipase C
(PLC) que podem catalizar a formação de DAG
e IP3. Em segundo lugar, a via pode ser ativada
pela via RTK. IP3 pode se ligar a um receptor
para liberar íons cálcio do retículo endoplas-
mático. Neste ínterim, DAG (em presença dos
íons cálcio liberados) ativa a proteína quinase
C. A proteína quinase estimula o transporta-
dor sódio/hidrogênio a trocar íons hidrogênio
celulares por íons sódio extracelulares, assim
levando a um aumento do pH.
(B)
RECEPTORES LIGADOS À PROTEÍNA G RECEPTORES LIGADOS À TIROSINA QUINASE (PDGF, EGF, etc).
Ligante
Ligante
Extracelular
Citoplasma
Proteína G
Via IP 3 PATHWAY
PKC MAP quinase
Atividade
Receptor celular e
IP 3 mitogênese
Retículo
endoplasmático
112 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
A via pode ter dois pontos iniciais (Figura 3.35; Berridge, 1993; Shilling et al.,
1994). Um ponto de iniciação é o receptor tirosina quinase, mencionado anterior-
mente. Além de ativar a proteína Ras G, as tirosina quinases ativadas podem
interagir com um tipo de enzima, fosfolipase C (PLC1-y1, que também tem um
domínio SH2 que reconhece as tirosinas autofosforiladas). Fosfolipase C pode
catalisar a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos
mensageiros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). IP3 é capaz de
abrir canais de cálcio do retículo endoplasmático, liberando uma grande quantida-
de de íons cálcio no citoplasma. DAG ativa a proteína quinase C, que por sua vez
ativa a bomba de proteína que troca íons sódio por íons hidrogênio (Swann e
Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986). O resultado é a elevação de íons intracelulares
de cálcio e um aumento no pH intracelular.
Um segundo ponto de iniciação é outra classe de receptores, algumas vezes cha-
mado de receptores serpentina, porque têm sete domínios transmembrana e “serpen-
teiam” através da membrana. Esses receptores estão relacionados com outro tipo de
proteína G, a proteína G heteromérica. Quando o ligante liga-se ao seu receptor, esse
ativa a proteína G. Essa ativação dissocia a proteína G em suas subunidades, as quais
ativam outro conjunto de fosfolipase C, ou seja, PLC-β1 e PLC-β2. Esses dois tipos de
fosfolipase C podem clivar PIP2 em inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol. Como vere-
mos em capítulos posteriores, as mudanças nos íons hidrogênio e cálcio, efetuadas
por essa via, alteram não somente a transcrição de genes, mas também a tradução de
mRNA e a replicação de DNA.
SINAL 1 SINAL 2
Citoplasma
MHC II
Antígeno Receptor B7
da célula T CD28
Extracelular
Citoplasma
RAF
T-LINFÓCITO
ELK-1 ativa
transcrição de c-fos
Núcleo
Transcrição de IL-2
Figura 3.36
Dois sinais são necessários para efetuar a diferenciação de linfócitos T. O primeiro sinal vem de
receptores que ligam o antígeno apresentado na superfície das células B ou macrófagos. O
segundo sinal vem da ligação da proteína CD28 à proteína B7 que está na superfície da célula
apresentante do antígeno. O primeiro sinal dirige a síntese de uma subunidade do fator de
transcrição AP-1. A outra subunidade é sintetizada sob direção do segundo sinal. As duas
subunidades, c-fos e c-jun, formam o fator de transcrição AP-1 que pode ativar intensificadores
específicos para a célula T como os que regulam a produção de interleucina 2.
pode estimular a via RTK-Ras, como também pode estimular a interação da célula
com o L1, N-CAM e caderinas de uma célula vizinha (Bixby et al., 1994; Williams et
al., 1994a; Clark e Brugge, 1995). Caderinas (mesmo as solúveis) podem dimerizar
receptores FGF exatamente como os ligantes normais de FGF, causando a liberação
de íons cálcio, ativação transcricional e fenômenos de desenvolvimento caracterís-
ticos das respostas do FGF celular (Figura 3.37; Williams et al., 1994b; Doherty et al.,
1995). Comunicação cruzada é quase certa acontecer quando as moléculas de ade-
são celular são também transdutores de sinais.
Citoplasma
Molécula de
adesão celular Receptor FGF
Extracelular
Citoplasma
Sinal
Figura 3.37
Possíveis interações de moléculas de adesão celular com receptores de FGF. Os receptores FGF
podem ser “seqüestrados” pelas moléculas de adesão e colocados juntos. Isso pode ser feito
pela interação de moléculas de adesão opostas, ou “ligações cruzadas” de receptores de FGF das
membranas celulares opostas podem ativar seus domínios quinase.
Receptor
Patched
Proteína
Hedgehog
LITERATURA CITADA
Ayama, E., Musci. T. J. and Kirschner, M. W. contact formation in Dictyostelium by univalent Bronner-Fraser, M. 1988. Distribution of
1991. Expression of a dominant negative mutant antibodies. Exp. Cell Res. 63: 147-158. tenascin during cranial neural crest development
of the FGF receptor disrupts mesoderm forma- in the chick. J. Neurosci. Res. 21: 135-147.
tion in Xenopus embryos. Cell 66: 257-270. Bevilacqua, A., Loch-Caruso, R. and Erick-
son, R. P. 1989. Abnormal development and Brooks, P. C. Montgomery, A. M. P., Rosenfeld,
Armstrong, P. B. 1989. Cell sorting out: The dye coupling produced by antisense RNA to M., Reisfeld, R. A., Hu, T., Klier, G. and Cheresh,
self-assembly of tissues in vitro. CRC Crit. Rev. gap junction protein in mouse preimplanta- D. A. 1994. Integrin α v β 3 antagonists promote
Biochem. Mol. Biol. 24: 119-149. tion embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA tumor regression by inducing apoptosis of
86: 5444-5448. angiogenic blood vessels. Cell 79: 1157-1164.
Bastiani, M. J., Harrelson, A. L., Snow, P. M.
and Goodman, C. S. 1987. Expression of fasciclin Bissell, M. J., Hall, H. G. and Parry, G. 1982. Brower, D. L. and Jaffe, S. M. 1989. Require-
I and II glycoproteins on subsets of axon How does the extracellular matrix direct gene ment for integrins during Drosophila wing de-
pathways during neuronal development in the expression? J. Theoret. Biol. 99: 31-68. velopment. Nature 342: 285-287.
grasshopper. Cell 48: 745-755.
Bixby, J. L., Grunwald, G. B. and Bookman, R. J. Cales, C., Hancock, J. F., Marshall, C. J. and
Beckerle, M. C., Burridge, K., DeMartino, 1994. Ca++ influx and neurite growthin response Hall, A. 1988. The cytoplasmic protein GAP is
G. N. and Croall, D. E. 1987. Colocalization to purified N-cadherin and laminin. J. Cell Biol. implicated as a target for regulation by the ras
of calcium-dependent protease II and one 127: 1461-1475. gene product. Nature 332: 548-551.
of its substrates and sites of adhesion. Cell
Boucaut, J. C. 1974. Étude autoradiographique Carson, D. D., Tang, J.-P. and Gay, S. 1988.
51: 569-577.
de la distribution de cellules embryonnaires Collagens support embryo attachment and
Behrendsten, 0., Alexander, C. M. and Werb, isolées, transplantées dans le blastocèle chez Pleu- outgrowth in vitro: Effects of the Arg-GlyAsp
Z. 1992. Metalloproteinases mediate extra- rodeles waltii Michah (Amphibien, Urodele). sequence. Dev. Biol. 127: 368-375.
cellular matrix degradation by cells from Ann. Embryol. Morphol. 7: 7-50.
Carson, D. D., Tang, J.-P. and Julian, J. 1993.
mouse blastocyst outgrowths. Development
Boyse, E. A. and Old, L. J. 1969. Some aspects Heparan sulfate proteoglycan (perlecan) expres-
114: 447-456.
of normal and abnormal cell surface genetics. sion by mouse embryos during acquisition of at-
Bernfield, M. and Sanderson, D. 1990. Syndecan, Annu. Rev. Genet. 3: 269-289. tachment competence. Dev. Biol. 155: 97-106.
a morphogenetically regulated cell surface pro-
Brackenbury, R., Thiery, J.-P., Rutishauser, U. Carthew, R.W. and Rubin, G.M. 1990. Seven
teoglycan that binds extracellular matrix and
and Edelman, G. M. 1977. Adhesion among -in-absentia, a gene required for the speci-
growth factors. Philos. Trans. R. Soc. Lond. [A]
neural cells of the chick embryo. I. Immunolo- fication of R7 cell fate in the Drosophila
327: 171-186.
gical assay for molecules involved in cell-cell eye. Cell 63: 561-577
Berridge, M. J. 1993. Inositol triphosphate and binding. J. Biol. Chem. 252: 6835-6840.
Chen, W. T., Hasegawa, E., Hasegawa, T.,
calcium signalling. Nature 361: 315-325.
Briscoe, J., Guschin, D., and Müller, M. 1994. Weinstock, C. and Yamada, K. M. 1985. Deve-
Beug, H., Gerisch, G., Kempff, S., Riedel, V. and Just another signalling pathway. Curr. Biol. 4: lopment of cell-surface linkage complexes in
Cremer, G. 1970. Specific inhibition of cell 1033-1035. cultured fibroblasts. J. Cell Biol. 100: 1103-1114.
116 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
C h e n e y, C . M . a n d L a s h , J . W. 1 9 8 1 . Edelman, G. M. and Thiery, J.-P. 1985. The Cell early morphogenetic events in chick develop-
Diversification within embryonic chick in Contact: Adhesions and Junctions as Mor- ment. Nature 320: 447-449.
somites: Differential response to notochord. phogenic Determinants. Wiley, New York.
Hatta, K. Takagi, S., Fujisawa, H. and Takeichi,
Dev. Biol. 81: 288-298.
Farach, M. C., Tang, J. P., Decker, G. L. and M. 1987. Spatial and temporal expression
Chuong, C.-M. and Edelman, G. M. 1985a. Ex- Carson, D. D. 1987. Heparin/heparan sulfate is pattern of N-cadherin cell adhesion molecules
pression of cell adhesion molecules in embryo- involved in attachment and spreading of mouse correlated with morphogenetic processes of
nic induction. I. Morphogenesis of nestling embryos in vitro. Dev. Biol. 123: 401-410, chicken embryos. Dev. Biol. 120: 215-227.
feathers. J. Cell Biol. 101: 1009-1026.
Fink, R. and McClay, D. R. 1985. Three cell Heasman, J., Hines, R. D., Swan, A. P., Thomas,
Chuong, C.-M. and Edelman, G. M. 1985b. Ex- recognition changes accompany the ingression V. and Wylie, C. C. 1981. Primordial germ cells
pression of cell adhesion molecules in embryo- of sea urchin primary mesenchyme cells. Dev. of Xenopus embryos: The role of fibronectin in
nic induction. II. Morphogenesis of adult Biol. 107: 66-74. their adhesion during migration. Cell 27: 437-447.
feathers. J. Cell Biol. 101: 1027-1043.
Fraser, S., E., Carhart, M. S., Murray, B. A., Heasman, J., Ginsberg, D., Goldstone, K., Pratt,
Clark, E. A. and Brugge, J. S. 1995. Integrin and Chuong, C.-M. and Edelman, G. E. 1988. T., Yoshidanaro, C., and Wylie, C. 1994. A
signal transduction pathways: The road taken. Alterations in the Xenopus retinotectal functional test for maternally inherited cadherin
Science 268: 233-239. projection by antibodies to Xenopus N-CAM. in Xenopus shows its importance in cell adhesion
Dev. Biol. 129: 217-230. at the blastula stage. Development 120: 49-57.
Covault, J. and Sanes, J. R. 1986. Distribution of
N-CAM in synaptic and extrasynaptic portions Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M. and Hemler, M. E. 1990. VLA proteins in the integrin
of developing and adult skeletal muscle. J. Cell Steinberg, M. S. 1994. Liquid properties of em- family: Structures, functions, and their role on
Biol. 102: 716-730. bryonic tissues: Measurements of interfacial leukocytes. Annu. Rev. Immunol. 8: 365-400.
tensions. Physic. Rev. Lett. 72: 2298-2301. Hemler, M. E., Huang, C. and Schwartz, L. 1987.
Crawford, K. and Stocum, D. L. 1988. Retinoic
acid coordinately proximalizes regenerate pattern Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G. and The VLA protein family. Characterization of
and blastema differential affinity in axolotl limbs. Steinberg, M. S. 1996. Surface tensions of em- five distinct cell surface heterodimers each with
Development 102: 687-698. bryonic tissues predict their mutual envelopment a common 130,000 molecular weight β subunit.
behavior. Development 122: 1611-1620. J. Biol. Chem. 262: 3300-3309.
Darnell, J., Lodish, H. and Baltimore, D. 1986.
Molecular Cell Biology. Scientific American Fujimori, T., Miyatani, S. and Takeichi, M. Horwitz, A., Duggan, K., Greggs, R., Decker,
Books, New York. 1990. Ectopic expression of N-cadherin perturbs C. and Buck, C. 1985. The cell substrate
histogenesis in Xenopus embryos. Development attachment (CSAT) antigen has properties
Deng, C., Wynshaw-Boris, A., Zhou, F., Kuo, A. of a receptor for laminin and fibronectin J.
110: 97-104.
and Leder, P. 1996. Fibroblast growth factor Cell Biol. 101: 2134-2144.
receptor-3 is a negative regulator of bone growth. Gibbs, J. B., Scaber, M. D., Allard, W.J., Sigal, I.
Cell 84: 911-921. S. and Scolnick, E. M. 1988. Purification of ras Horwitz, A., Duggan, K., Buck, C., Beckerle,
GTPase activating protein from bovine brain. M. C. and Burridge, K. 1986. Interaction of
Detrick, R. J., Dickey, D. and Kintner, C. R. plasma membrane fibronectin receptor with
Proc. Natt. Acad. Sci. USA 85: 5026-5030.
1990. The effects of N-cadherin misexpres- talin-a actinin transmembrane linkage. Nature
sion on morphogenesis in Xenopus embryos. Giudice, G. 1962. Restitution of whole larvae 320: 531-533.
Neuron 4: 493-506. from disaggregated cells of sea urchin embryos.
Dev. Biol. 5: 402-411. Ingham, P. W. 1994. Hedgehog points the way.
Dickson, B., Sprenger, F, Morrison, D. and Curr. Biol. 4:1-4.
Hafen, E. 1992. Ras1 functions downstream of Graf, J., Ogle, R. C., Robey, F A., Sasaki, M.,
Rasl in the Sevenless signal transduction pathway Martin, G. R., Yamada, Y. and Kleinman, H. K. Jongen, W, M. F. and seven others. 1991.
Nature 360: 600-603. 1987. A pentapeptide from the laminin B1 chain Regulation of connexin 43-mediated gap junction
mediates cell adhesion and binds to the 67000 intercellular communication by Ca2+ in mouse
Diderot, D. 1782. D’Alembert’s Dream. Reprin- epidermal cells is controlled by E-cadherin. J.
laminin receptor. Biochemistry 26: 6896-6900.
ted in J. Barzun and R. H. Bowen (eds.), Cell Biol. 114: 545-555.
Rameau’s Nephew and Other Works (1956). Groner, B. and Gouilleux, F. 1995. Prolactin-
Doubleday, Garden City, NY [p. 114] mediated gene activation in mammary epithelial lhle, J. N. 1995. Cytokine receptor signalling.
cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 587-594. Nature 377: 591-594.
Doherty, P., Williams, E. and Walsh, F. S. 1995.
lhle, J. N. 1996. STATs: Signal transducers and
A soluble chimeric form of the Ll glycoprotein Hadler, N. M., Dourmash, R. R., Nermut, M. V.
activators of transcription. Cell 84: 331-334.
stimulates neurite outgrowth. Neuron 14: 57-66. and Williams, L. D. 1982. Ultrastructure of a
hyaluronic acid matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. Just, E. E. 1939. The Biology of the Cell Surface.
Dufour, S., Duband, J.-L., Humphries, M. J.,
USA 79: 307-309. Blackiston, Philadelphia.
Obara, M., Yamada, K. M. and Thiery, J. P. 1988.
Attachment, spreading and locomotion of avian Hakomori, S., Fukuda, M., Sekiguchi, K. and Kadokawa, Y., Fuketa, I., Nose, A., Takeichi,
neural crest cells are mediated by multiple Carter, W. G. 1984. Fibronectin, laminin, and M. and Nakatsuji, N. 1989. Expression of E-
adhesion sites on fibronectin molecules. EMBO other extracellular glycoproteins. In K. A. Picz and P-cadherin in mouse embryos and uteri du-
J. 7: 2661-2671. and A. H. Reddi (eds.), Extracellular Matrix Bio- ring the periimplantation period. Dev. Growth
chemistry. Elsevier, New York, pp. 229-275. Diff. 31: 23-30.
Dutt, A., Tang, T.-P. and Carson, D. D. 1987. Lacto-
saminoglycans are involved in uterine epithelial cell Harrelson, A. L. and Goodman, C. S. 1988. Kalimi, G. H. and Lo, C. 1988. Communication
adhesion in vitro. Dev, Biol. 119: 27-37. Growth cone guidance in insects: FasciclinII is a compartments in the gastrulating mouse embryo.
member of the immunoglobulin superfamily. J. Cell Biol. 107: 241-255.
Eckstein, D. J. and Shur, B. D. 1989. Laminin
Science 242: 700-708.
induces the stable expression of surface glycosyl- Kintner, C. 1992. Regulation of embryonic cell
transferases on lamellipodia of migrating cells. Hatta, K. and Takeichi, M. 1986. Expression of adhesion by the cadherin cytoplasm domain. Cell
J. Cell Biol. 108: 2507-2517. N-cadherin adhesion molecules associated with 69: 225-236.
CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 117
Knudsen, K., Horwitz, A. F. and Buck, C. 1985. Liu, J-K., Di Persio, M. C., and Zaret, K. S. Nose, A., Nagafuchi, A. and Takeichi, M.
A monoclonal antibody identifies a glycopro- 1991. Extracellular signals that regulate liver 1988. Expressed recombinant cadherins
tein complex involved in cell-substratum transcription factors during hepatic differentia- mediate cell sorting in model systems. Cell
adhesion. Exp. Cell Res. 157: 218-226. tion in vitro. Mol. Cell Biol. 11: 773-784. 54: 993-1001.
Köhler, G. and Milstein, C. 1975. Continuous Lo, C. and Gilula, N. B. 1979. Gap junctional Notenboom, R. G. E., de Poer, P. A. J.,
cultures of fused cells secreting antibody of communication in the preimplantation mouse Moorman, A. F. M. and Lamers, W. H. 1996.
predefined specificity. Nature 256: 495-497. embryo. Cell 18: 399-409. The establishment of the hepatic architecture
is a prerequisite for the development of a
Lander, A. D. 1989. Understanding the Luna, E. J. and Hitt, A. L. 1992. Cytoskele-
lobular pattern of gene expression. Develop-
molecules of neural cell contacts: Emerging ton-plasma membrane interactions. Science
ment 122: 321-332.
patterns of structure and function. Trends 258: 955-964.
Neurosci. 12: 189-195. Orkin, R. W., Knudson, W. and Toole, P. T. 1985.
Martins-Green, M. and Bissell, M. J. 1995. Cell-
Loss of hyaluronidate-clependent coat during
Landmesser, L., Dahm, L., Schultz, K. and Ru- ECM interactions in development. Semin. Dev.
myoblast fusion. Dev. Biol. 107: 527-530.
tishauser, U. 1988. Distinct roles for adhesion Biol. 6: 149-159.
molecules during innervation of embryonic Peracchia, C. and Dulhunty, A. F. 1976. Low
chick muscle. Dev. Biol, 130: 645-670. Massagué, J. 1991. A helping hand from
resistance junctions in crayfish: Structural
proteoglycans. Curr. Biol. 1: 117-119.
changes with functional uncoupling. J. Cell Biol.
Lazarides, E. 1976. Actin, a actinin, and
Matrisian, L. M. 1992. The matrix-degrading 70: 419-439.
tropomyosin interaction in the structural
organization of actin filaments in nonmuscle metalloproteinases. BioEssays 14: 455-463.
Pierce, M., Turley, E. A. and Roth, S. 1980. Cell
cells. J. Cell Biol. 68: 202-219. McClay, D. R. and Ettensohn, C. A. 1987. Cell surface glycosyltransferase activities. Int. Rev.
recognition during sea urchin gastrulation. In W. Cytol. 65: 1-47.
Lee, C.-H. and Gumbiner, B. M. 1995. Disruption
of gastrulation movements in Xenopus by a F. Loomis (ed.), Genetic Regulation of Deve-
Ratner, N., Bunge, R. P. and Glaser, L. 1985. A
dominant-negative mutant for C-cadherin. Dev. lopment. Alan R. Liss, New York, pp. 111-128.
neuronal cell surface heparan sulfate proteogly-
Biol. 171: 363-373. McCormick, F. 1989. ras GTPase activating can is required for dorsal root ganglion neuron
Lee, S., Gilula, N. B. and Warner, A. E. 1987. protein: Signal transmitter and signal terminator. stimulation of Schwann cell proliferation. J. Cell
Gap junctional communication and compaction Cell 56: 5-8. Biol. 101: 744-754.
during preimplantation stages of mouse deve- Monroy, A. and Moscona, A. A. 1979. Intro- Reaurne, A. G. and eight others. 1995. Cardiac
lopment. Cell 51: 851-860. ductory Concepts in Developmental Biology. malformation in neonatal mice lacking connexin
Leevers, S. J., Paterson, H. F., and Marshall, C. University of Chicago Press, Chicago. 43. Science 267: 1831-1834.
J. 1994. Requirement for Ras in Raf activation Montgomery, A. M. P., Reisfeld, R. A., and Roth, S. 1968. Studies on intracellular adhesive
is overcome by targeting Raf to the plasma Cheresh, D. A. 1994. Integrin α v β 3 rescues selectivity. Dev. Biol. 18: 602-631.
membrane. Nature 369: 411-414. melanoma cells from apoptosis in a threedimen-
Roth, S., McGuire, E. J. and Roseman, S. 1971.
Lemmon, V., Farr, K. L., and Lagenauer, C. sional dermal collagen. Proc. NatI. Acad. Sci.
An assay for intercellular adhesive specificity. J.
1989). Ll-mediated axon growth occurs via USA 91: 8856-8860.
Cell Biol. 51: 525-535.
homophilic binding mechanism. Neuron 2: Moscona, A. A. 1952. Cell suspension from
1597-1603. Rousseau, F. and seven others. 1994. Muta-
organ rudiments of chick embryos. Exp. Cell
tions in the gene encoding fibroblast growth
Leonard, C. M., Bergman, M., Frenz, D. A., Res. 3: 535-539.
factor receptor-3 in achondroplasia. Nature
Macreery, L. A. and Newman, S. A. 1989. Moscona, A. A. 1961. Rotation-mediated 371: 252-254.
Abnormal ambient glucose levels inhibit pro- histogenetic aggregation of dissociated cells: A
teoglycan core protein gene expression and Ruoslahti, E. and Pierschbacher, M. D. 1987.
quantifiable approach to cell interaction in vitro.
reduce proteoglycan accumulation during chon- New perspectives in cell adhesion: RGD and
Exp. Cell Res. 22: 455-475.
drogenesis: Possible mechanism for teratogenic integrins. Science 238: 491-497.
effects of maternal diabetes. Proc. Natl. Acad. Nagafuchi, A., Shirayoshi, Y., Okazaki, K.,
Rutishauser, U., Acheson, A., Hall, A., Mann, D.
Sci. USA 86: 10113-10117. Yasuda, K. and Takeichi, M. 1987. Transforma-
M. and Sunshine, J. 1988. The neural cell
tion of cell adhesion properties of exogenously
Leptin, M., Bogaert, T., Lehmann, R. and Wilcox, adhesion molecule (N-CAM) as a regulator of
introduced E-cadherin cDNA. Nature 329: 341-343.
M. 1989. The function of PS integrins during cell-cell interactions. Science 240: 53-57.
Drosophila embryogenesis. Cell 56: 401-408. Nardi, J. B. and Stocum, D. L. 1983. Surface
Sainio, K., Gilbert, S. F., Lehtonen, E., Nishi,
properties of regenerating limb cells: Evidence
Li, W., Whaley, C. D., Mondino, A. and Mueller, M., Kumar, N. M., Gilula, N. B. and Saxén, L.
for gradation along the proximodistal axis. Dif-
D. L. 1996. Blocked signal transduction to the 1992. Differential expression of gap junction
ferentiation 25: 27-31.
ERK and JNK protein kinases in anergic CD4+ mRNAs and proteins in the developing murine
T cells. Science 271: 1272-1274. Nishizuka, Y. 1986. Studies and perspectives of kidney and in experimentally induced nephric
protein kinase C. Science 233: 305-312. mesenchymes. Development 115: 827-837.
Linask, K. L. and Lash, J. W. 1988a. A role for
fibronectin in the migration of avian precardiac Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R. and San Antonio, J. D., Winston, B. M. and Tuan, R.
cells. I. Dose-dependent effects of fibronectin Tickle, C. 1994. A positive feedback loop S. 1987. Regulation of chondrogenesis by
antibody. Dev. Biol. 129: 315-323. coordinates growth and patterning in the verte- heparan sulfate and structurally related glycosa-
brate limb. Nature 371, 609-612. minoglycans. Dev. Biol. 123: 17-24.
Linask, K. L. and Lash, J. W. 1988b. A role for
fibronectin in the migration of avian precardiac Nose, A. and Takeichi, M. 1986. A novel cadherin Sato H., Takino, T, Okada, Y., Cao, J., Shinagawa,
cells. II. Rotation of the heartforming region adhesion molecule: Its expression patterns A., Yamamoto, E. and Seiki, M. 1994. A matric
during different stages and its effects. Dev. Biol. associated with implantation and organogenesis metalloproteinase expressed on the surface of
129: 324-329. of mouse embryos. J. Cell Biol. 103: 2649-2658. invasive tuomour cells. Nature 370: 61-65.
118 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Shiang, R. and seven others. 1994. Mutations in nipulation of cell surface to affect cellular re- Warner, A. E., Guthrie, S. C. and Gilula, N. B.
the transmembrane domain of FGFR3 cause the cognition mechanisms. Dev. Biol. 70: 195-205. 1984. Antibodies to gap junctional protein selectively
most common genetic form of dwarfism, achon- disrupt junctional communication in the early
Tamkun, J. W., DeSimone, D. W., Fonda, D.,
droplasia. Cell 78: 335-342. amphibian embryo. Nature 311: 127-131.
Patel, R. S., Buck, C, Horwitz, A. F. and Hynes,
Shih, C. and Weinberg, R. A. 1982. Isolation of R. 0. 1986. Structure of integrin, a glycoprotein Webster, M. K. and Donoghue, D. J. 1996.
a transforming sequence from a human bladder involved in transmembrane linkage between fi- Constitutive activation of fibroblast growth
carcinoma cell line. Cell 29: 161-169. bronectin and actin. Cell 46: 271-282. factor receptor 3 by the transmembrane
domain point mutation found in achondro-
Shilling, F. M., Carroll, D. J., Muslin, A. J., Tan, S.-S., Crossin, K. L., Hoffman, S. and Edelman,
plasia. EMBO J. 15: 520-527.
Escobodo, J. A., Williams, L. T. and Jaffe, G. M. 1987. Asymmetric expression of somites of
L. A. 1994. Evidence for both tyrosine kinase cytotactin and its proteoglycan ligand is correlated Wehrle, B. and Chiquet, M. 1990. Tenascin is
and G-protein-coupled pathways leading to with neural crest cell migration. Proc. Natl. Acad. accumulated along developing peripheral nerves
starfish egg activation. Dev. Biol. 162: 590-599. Sci. USA 84: 7977-7981. and allows neurite outgrowth in vitro. Develop-
ment 110: 401-415.
Shur, B. D. 1977a. Cell surface glycosyl- Thesleff, I., Vainio, S. and Jalkanen, M. 1989.
transferases in gastrulating chick embryos. Cell-matrix interactions in tooth development. Weiss, P. 1945. Experiments on cell and
I. Temporally and spatially specific patterns Int. J. Dev. Biol. 33: 91-95. axon orientation in vitro: The role of
of four endogenous glycosyltransferase colloidal exudates in tissue organization. J.
Toole, B. P. 1976. Morphogenetic role of glycosa-
activities. Dev. Biol. 58: 23-29. Exp. Zool. 100: 353-386.
minoglycans (acid mucopolysaccharides) in brain and
Shur, B. D. 1977b. Cell surface glycosyltransfe- other tissues. In S. H. Barondes (ed.), Neuronal Re- Werb, Z., Tremble, P. and Damsky, C. H. 1990.
rases in gastrulating chick embryos. II. Bioche- cognition. Plenum, New York, pp. 276-329. Regulation of extracellular matrix degradation
mical evidence for a surface localization of by cell-extracellular matrix interaction. Cell
Tosney, K. W., Watanabe, M., Landmesser, L. and
endogenous glycosyltransferase activities. Dev. Differ. Dev. 32: 299-306.
Rutishauser, U. 1986. The distribution of N-CAM in
Biol. 58: 40-55.
the chick hindlimb during axon outgrowth and Wilcox, M., DiAntonio, A. and Leptin, M.
Spring, J., Beck, K. and Chiquet-Ehrismann, R. synaptogenesis. Dev. Biol. 114: 468-481. 1989. The functions of the PS integrins in
1989. Two contrary functions of tenascin: Drosophila wing morphogenesis. Develop-
Townes, P. L. and HoItfreter, J. 1955. Directed
Dissection of the active sites by recombinant ment 107: 891-897.
movements and selective adhesion of embryo-
tenascin fragments. Cell 59: 325-334.
nic amphibian cells. J. Exp. Zool. 128: 53-120. Wilder, E. L. and Perrimon, N. 1995. Dual
Steinberg, M. S. 1964. The problem of functions of wingless in the Drosophila leg
Trahey, M. and McCormick, F. 1987. A cyto-
adhesive selectivity in cellular interactions. imaginal disc. Development 121: 477-488.
plasmic protein stimulates normal N-ras p2l.
In M. Locke (ed.), Cellular Membranes in
GTPase, but does not affect oncogenic mutants. Williams, A. F. and Barclay, A. N. 1988. The
Development. Academic Press, New York,
Science 238: 542-544. immunoglobulin superfamily: Domains for
pp. 321-434.
cell surface recognition. Annu. Rev. Immu-
Trinkaus, J. P. 1963. The cellular basis of
Steinberg, M. S. 1970. Does differential adhesion nol. 6: 381-405.
Fundulus epiboly. Adhesivity of blastula and
govern self-assembly processes in histogenesis?
gastrula cells in culture. Dev. Biol. 7: 513-532. Williams, E. J., WaIsch, F. S. and Doherty, P.
Equilibrium configurations and the emergence
1994a. Tyrosine kinase inhibitors can differen-
of a hierarchy among populations of embryonic Turley, E. A. and Roth, S. 1979. Spontaneous
tially inhibit integrin-dependent and CAM-
cells. J. Exp. Zool. 173: 395-434. glycosylation of glycosaminoglycan substrates
dependent neurite outgrowth. J. Cell Biol. 124:
by adherent fibroblasts. Cell 17: 109-115.
Stokoe, D., Macdonald, S. G., Cadwallader, K., 1029-1037.
Symons, M. and Hancock, J. F. 1994. Activation Tyler, A. 1946. An auto-antibody concept of
Williams, E. J., Furness, J., Walsh, F. S. and
of raf as well as recruitment to the plasma cell structure, growth, and differentiation. Growth
Doherty, P. 1994b. Activation of the FGF
membrane. Science 264: 1463-1467. 10 (Symposium 6):7-19.
receptor underlies neuriote outgrowth stimu
Streuli, C. H., Bailey, N. and Bissell, M. J. 1991. Vainio, S., Jalkanen, M., Lehtonen, E. and lated by L1, N-CAM, and N-cadherin.
Control of mammary epithelial differentiation: Bernfield, M. 1989. Epithelial-mesenchymal in- Neuron 13: 583-594.
Basement membrane induces tissue specific gene teractions regulate stage-specific expression of
Yayon, A., Klagsbrun, M., Esko, J. D., Leder, P.
expression in the absence of cell-cell interacti- a cell surface proteoglycan, syndecan, in the
and Ornitz, D. M. 1991. Cell surface heparin-
ons and morphological polarity J. Cell Biol. 115: development kidney. Dev. Biol. 134: 382-391.
like molecules are required for binding of basic
1383-1395.
Venkatesh, T. R., Zipursky, S. L. and Benzer, S. fibroblast growth factor to its high affinity re-
Swann, K. and Whitaker, M. 1986. The part 1985. Molecular analysis of the development ceptor. Cell 64: 841-849.
played by inositol trisphosphate and calcium in of the compound eye in Drosophila. Trends
Yelton, D. E. and Scharff, M. D. 1980. Mono-
the propagation of the fertilization wave in sea Neurosci. 8: 251-257.
clonal antibodies. Am. Sci. 68: 510-516.
urchin eggs. J. Cell Biol. 103: 2333-2342.
Vits, L., Van Camp, G., Couke, P., Wilson, G.,
Yow H., Wong, J. M., Chen, H. S., Lee, C., Steei,
Takeichi, M. 1987. Cadherins: A molecular Schrander-Stumpel;C., Schwarz, C. and Willems,
G. D. Jr. and Chen, L. B. 1988. Increased mRNA
family essential for selective cell-cell P. J. 1994. MASA syndrome is due to mutations
expression of a lamininbinding protein in human
adhesion and animal morphogenesis. Trends in the LlCAM gene. Nature Genet. 7: 408-413.
colon carcinoma: Complete sequence of a full-
Genet. 3: 213-217.
Vuorio, E. 1986. Connective tissue diseases: length cDNA encoding the protein. Proc. Natl.
Takeichi, M. 1991. Cadherin cell adhesion Mutations of collagen genes. Ann. Clin. Res. Acad. Sci.. USA 85: 6394-6398.
receptors as a morphogenetic regulator. Science 18: 234-241.
Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B.
251: 1451-1455.
Wang, N., Butler, J. P. and Ingber, D. E. 1993. and Benzer, S. 1984. Neuronal development in
Takeichi, M., Ozaki, H. S., Tokunaga, K. Mechanotransduction across the cell surface and the Drosophila retina: Monoclonal antibodies
and Okada, T. S. 1979. Experimental ma- through the cytoskeleton. Science 260: 1124-1127. as molecular probes. Cell 36: 15-26.
Padrões de Desenvolvimento
4 Fertilização: Iniciando um novo organismo
167
Fertilização:
Iniciando um novo organismo
4
Desejo e desejo e desejo
Sempre o desejo procriativo do mundo.
Saindo da obscuridade iguais opostos
avançam,
Sempre substância e aumento, sempre sexo,
F ERTILIZAÇÃO (FECUNDAÇÃO) é o processo pelo qual duas células sexuais
(gametas) se fundem para criar um novo indivíduo com potenciais genéticos
derivados dos dois genitores. A fecundação, portanto, realiza duas atividades
separadas: sexo (a combinação de genes derivados dos dois pais) e a reprodução
(criação de novos organismos). Assim, a primeira função da fecundação é a de trans-
Sempre uma tessitura de identidade, sempre mitir genes dos pais para a prole, e a segunda é a de iniciar no citoplasma do ovo
distinção, aquelas reações que permitem o desenvolvimento.
Sempre uma criação de vida.
WALT WHITMAN (1855)
Embora os detalhes da fecundação variem de espécie para espécie, os eventos da
concepção consistem, em geral, de quatro atividades principais:
O objetivo final de todas as intrigas amoro- • Contato e reconhecimento entre espermatozóide e óvulo. Na maioria dos
sas, sejam elas cômicas ou trágicas, é na casos, isso assegura que o espermatozóide e o óvulo sejam da mesma espécie.
realidade mais importante que todas as ou- • Regulação da entrada do espermatozóide para o interior do óvulo. Somente
tras finalidades na vida humana. um espermatozóide pode, em última análise, fecundar um óvulo. Isso é geral-
Ele se volta para nada menos que a compo- mente conseguido com a permissão de somente um espermatozóide entrar no
sição da próxima geração. óvulo e a inibição da entrada de qualquer outro.
A SCHOPENHAUER • Fusão do material genético do espermatozóide e do óvulo.
(CITADO POR C. DARWIN, 1871)
• Ativação do metabolismo do ovo para começar o desenvolvimento.
Espermatozóide
Foi somente no século XIX que o papel do espermatozóide na fertilização tornou-se
conhecido. Anton van Leeuwenhoek, o microbiologista holandês que co-descobriu o
espermatozóide em 1678, acreditou inicialmente que ele continha animais parasitas vi-
vendo em seu interior (daí o termo espermatozóides, significando “animais do esper-
ma”). Assumiu originalmente que esses nada tinham a haver com a reprodução do
organismo onde se encontravam, porém, posteriormente chegou a acreditar que cada
espermatozóide continha um embrião pré-formado. Leeuwenhoek (1685) escreveu que
121
122 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
ser considerado como uma vesícula secretória modificada. Essas enzimas armazena-
das são usadas para lisar os invólucros externos do óvulo. Em muitas espécies, tais
como os ouriços-do-mar, existe uma região de moléculas globulares de actina entre o
núcleo e a vesícula acrossômica. Essas proteínas são usadas para estender um pro-
cesso de forma semelhante a um dedo durante os estágios precoces da fertilização. Em
ouriços-do-mar e várias outras espécies, o reconhecimento mútuo entre espermatozói-
de e óvulo envolve moléculas desse processo acrossômico. Juntos, o acrossomo e o
núcleo constituem a cabeça do espermatozóide.
Os meios pelos quais o espermatozóide é impulsionado variam de acordo com o
modo pelo qual a espécie se adaptou às condições ambientais. Em algumas espécies
(como o nematelminto parasitário Ascaris), o espermatozóide viaja por movimentação
amebóide de extensões lamelipodiais da membrana celular. Na maioria das espécies,
porém, um espermatozóide é capaz de viajar por longas distâncias agitando o seu
flagelo. Os flagelos são estruturas complexas. A sua principal porção motora é chama-
da axonema. Um axonema é formado pelos microtúbulos que emanam do centríolo na
base do núcleo do espermatozóide (Figuras 4.2 e 4.3). O centro do axonema consiste
de dois túbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtúbulos.
Realmente, só um microtúbulo está completo, contendo 13 protofilamentos; o outro
tem forma de C e tem apenas 11 protofilamentos (Figura 4.3B). Um modelo tridimensi-
onal de um microtúbulo completo está apresentado na Figura 4.3C. Aqui vemos os 13
protofilamentos interligados; os quais consistem exclusivamente da proteína dimérica,
a tubulina.
Embora a tubulina seja a base da estrutura do flagelo, outras proteínas também
são críticas para a função do flagelo. A força para a propulsão do espermatozóide é
proporcionada pela dineína, uma proteína apensa aos microtúbulos (Figura 4.3B). A
dineína hidrolisa moléculas de ATP e pode converter a energia química liberada em
Golgi
remanescente
Centríolo
Flagelo
Microtúbulos
Centríolo
Flagelo
Vesícula Porção
acrossômica final
e grânulo
Núcleo
Aparelho Mitocôndrias
de Golgi Cauda
Mitocôndrias
Figura 4.2
Axonema A modificação de uma célula germinativa para formar um espermatozóide de ma-
Mitocôndrias mífero. O centríolo produz um longo flagelo na parte que virá a ser a extremidade
Porção mediana
Centríolo posterior do espermatozóide, e o aparelho de Golgi forma a vesícula acrossômica
Pescoço na futura extremidade anterior. As mitocôndrias (pontos abertos) agrupam-se ao
Núcleo Cabeça do redor do flagelo perto da base do núcleo haplóide e são incorporadas na parte
espermatozóide mediana do espermatozóide. O citoplasma remanescente é descartado e o núcleo
Membrana plasmática
se condensa. O tamanho do espermatozóide maduro foi aumentado em relação às
Vesícula acrossômica outras figuras. (Segundo Clermont e Leblond, 1955.)
124 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
O óvulo
Todo o material necessário para o começo do crescimento e desenvolvimento tem
que estar armazenado no óvulo maduro. Enquanto o espermatozóide eliminou a
maior parte do seu citoplasma, o óvulo em desenvolvimento (chamado de oócito
antes de tornar-se haplóide) não somente conserva seu material, mas continua a
acumulá-lo ativamente. Sintetiza ou absorve proteínas, como a gema, que atuam
como reservatórios de alimento para o embrião em desenvolvimento. Assim, game-
tas femininos das aves são enormes células singulares que se tornaram entumecidas
pela acumulação de gema. Mesmo óvulos com gema relativamente esparsa são com-
parativamente grandes. O volume do óvulo do ouriço-do-mar é de aproximadamente
2 x 10-4 µm3, mais de 10.000 vezes aquele do espermatozóide. A representação do
óvulo do ouriço-do-mar e do espermatozóide na Figura 4.4 mostra seus tamanhos
relativos, assim como os vários componentes do óvulo maduro. Assim, enquanto o
espermatozóide e o óvulo têm componentes nucleares haplóides iguais, o óvulo tem
ainda um notável reservatório citoplasmático acumulado durante seu amadureci-
mento. Esse armazém citoplasmático inclui proteínas, RNAs, substâncias químicas
protetoras e fatores morfogenéticos:*
• Proteínas. Será longo o período a transcorrer antes do embrião ser capaz de se
alimentar ou obter alimento de sua mãe. As células embrionárias precoces
precisam de um certo suprimento armazenável de energia e aminoácidos. Em
muitas espécies isso é conseguido pelo acúmulo de proteínas na gema do ovo.
Muitas proteínas da gema são sintetizadas em outros órgãos (fígado, corpo
gorduroso) e viajam através do sangue materno para o ovo.
• Ribossomos e tRNA. O embrião precoce precisa produzir muitas de suas própri-
as proteínas; em algumas espécies, ocorre um surto de síntese protéica pouco
após a fecundação. A síntese protéica é conseguida pelos ribossomos e tRNA,
preexistentes no óvulo. O óvulo em desenvolvimento tem mecanismos especi-
ais para sintetizar ribossomos, e certos oócitos de anfíbios produzem até 1012
ribossomos durante a prófase meiótica.
• RNA mensageiro. Na maioria dos organismos, as mensagens para proteínas
sintetizadas durante o desenvolvimento inicial já estão acondicionadas no
oócito. Estima-se que os óvulos do ouriço-do-mar contêm de 25.000 a 50.000
tipos diferentes de mRNA. Porém, esse mRNA permanece dormente até após a
fertilização (veja Capítulo 12).
• Fatores morfogenéticos. Essas moléculas dirigem a diferenciação celular
em certos tipos de células. Parecem estar localizadas em diferentes regiões
do óvulo e se segregam em células diferentes durante a clivagem (veja
Capítulo 13).
* Os conteúdos do óvulo variam muito de espécie para espécie. A síntese e a colocação desses
materiais será tratada no Capítulo 22, quando discutirmos a diferenciação das células germinativas.
126 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Grânulo cortical
Espermatozóide
Mitocôndria
Núcleo
*Em mamíferos, as coberturas extracelulares do óvulo estão divididas em duas regiões: A zona
pelúcida e o cumulus. O termo corona radiata refere-se àquelas células foliculares imediatamente
adjacentes à zona pelúcida; são as células mais internas do cumulus.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 127
Corpos
polares Pronúcleo
Vesícula
germinal feminino
Figura 4.5
para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos. Microfilamentos Estágios de maturação do óvulo no momento
são necessários para a divisão celular, e são também usados para estender a superfície da entrada do espermatozóide em diferentes
do óvulo para o interior das microvilosidades, que ajudam a entrada do espermatozói- animais. (Segundo Austin, 1965.)
de para dentro da célula (veja Figura 4.6; veja também a Figura 4.19). Ainda, dentro
desse córtex estão os grânulos corticais (veja Figuras 4.4 e 4.6). Essas estruturas
Cumulus
Óvulo
Zona
pelúcida
(A) (B)
Figura 4.7
Óvulos de hamster imediatamente antes da fecundação. (A) O ovo do hamster, ou óvulo, está
encaixado na zona pelúcida. Essa, por sua vez, está envolvida por células do cumulus. Uma célula
do corpo polar, produzida durante a meiose, também está dentro da zona pelúcida. (B) Em menor
aumento, um oócito de camundongo é mostrado em relação ao cumulus. Partículas de carbono
coloidal (tinta Nanquim) são excluídas pela matriz de hialuronidase. (Cortesia de R. Yanagimachi.)
Atração do Espermatozóide
A atração espécie-específica do espermatozóide (um tipo de quimiotaxia) foi docu-
mentada em numerosas espécies, incluindo cnidários, moluscos, equinodermos e
urocordados (Miller, 1985; Yoshida et al., 1993). Em 1978, Miller demonstrou que os
óvulos do cnidário Orthopyxis caliculata não somente secretam um fator quimiotáti-
co mas também regulam o período de sua liberação. Oócitos em desenvolvimento, em
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 129
Figura 4.8
vários estágios de amadurecimento, foram fixados sobre lâminas microscópicas, e Quimiotaxia do espermatozóide em Arbacia.
espermatozóides foram adicionados a uma certa distância dos óvulos. Miller encon- Um nanolitro de uma solução 10-nM de
trou que quando o espermatozóide era adicionado a oócitos que ainda não haviam resact é injetado em uma gota de 20ml de
suspensão de espermatozóide. A posição da
completado sua segunda divisão meiótica, não havia atração de espermatozóide pelos
micropipeta está indicada em (A). (A) Uma
óvulos. Porém, após o término da segunda divisão meiótica e os óvulos estarem fotografia de 1 segundo, mostrando esper-
prontos para ser fertilizados, o espermatozóide migrava em sua direção. Assim, esses matozóide nadando em círculos estreitos an-
oócitos não controlam somente o tipo de espermatozóide que atraem, mas também o tes da adição de resact. (B-D) Exposições
momento em que o atraem. semelhantes de 1 segundo mostrando a mi-
Os mecanismos de quimiotaxia são diferentes em outras espécies (veja Metz, 1978; gração do espermatozóide para o centro do
Ward e Kopf, 1993). Uma dessas moléculas quimiotáticas, um peptídio de 14 aminoácidos gradiente de resact 20, 40 e 90 segundos após
chamado resact foi isolado da geléia do óvulo do ouriço-do-mar Arbacia punctulata a injeção. (de Ward et al., 1985, cortesia de
(Ward et al., 1985). Resact difunde facilmente na água do mar e tem um profundo efeito V. D. Vacquier.)
quando adicionado a uma suspensão de espermatozóide de Arbacia, mesmo em con-
centração muito baixa (Figura 4.8). Quando uma gota de água do mar, contendo esper-
matozóide de Arbacia, é colocada em uma lâmina de microscópio, o espermatozóide
geralmente nada em círculos de aproximadamente 50 µm de diâmetro. Se uma quantida-
de mínima de resact for introduzida na gota, em segundos o esperma migra para a
região da injeção e ali se congrega. À medida que o resact continua a difundir-se, mais
espermatozóide é recrutado para dentro do crescente agrupamento. Resact é específi-
co para A. punctulata e não atrai espermatozóide de outras espécies. Espermatozóide
de A. punctulata liga resact a receptores na sua membrana celular (Ramarao e Garbers,
1985; Bentley et al., 1986) e pode nadar através de um gradiente crescente de concen-
tração desse composto até alcançar o óvulo.
Resact também age como um peptídio ativador de espermatozóide. Esses peptídios
(mais de 70 foram isolados de diferentes espécies de ouriços-do-mar) causam au-
mentos dramáticos e imediatos da motilidade espermática e do consumo de oxigênio
(Hardy et al., 1994). O receptor para resact é uma proteína transmembrana. Quando
ela liga o resact ao lado externo da célula, resact causa uma mudança conformacional
que ativa a atividade de guanidil ciclase no lado citoplasmático. Isso aumenta a
concentração de GMP cíclico do óvulo (Shimomura et al., 1986), que parece ativar a
ATPase da dineína estimulando a agitação da cauda no espermatozóide (Cook e
Babcock, 1993).
Membrana
acrossômica
Enzimas
acrossômicas
Bindina
Membrana do
espermatozóide
Actina
globular Microfilamentos
de actina
Núcleos
Figura 4.9
Reação acrossômica em espermatozóide de Em ouriços-do-mar, o contato com a geléia do óvulo causa a exocitose da vesícula
equinoderma. (A-C) A porção da membrana acrossômica e a liberação de enzimas digestoras de proteínas que podem digerir um
acrossômica diretamente abaixo da membra- caminho através da geléia de revestimento até a superfície do óvulo (Dan, 1967; Franklin,
na do espermatozóide funde-se com essa li- 1970; Levine et al., 1978). A seqüência desses eventos está esquematizada na Figura
berando o conteúdo da vesícula acrossômica. 4.9. A reação acrossômica é considerada ser iniciada por um oligossacarídeo ligado a
(D) Enquanto as moléculas de actina se agre-
uma proteína na geléia do óvulo que permite a entrada de cálcio na cabeça do esperma-
gam para produzir microfilamentos, o pro-
cesso acrossômico se estende para fora. Fo-
tozóide (SeGall e Lennarz, 1979; Schackmann e Shapiro, 1981; Keller e Vacquier, 1994
tografias reais da reação acrossômica no es- a,b). A exocitose da vesícula acrossômica é causada por uma fusão, mediada pelo
permatozóide do ouriço-do-mar são mostra- cálcio, da membrana acrossômica com a membrana plasmática adjacente do esperma-
das em seguida. (Segundo Summers e Hylan- tozóide (Figuras 4.9 e 4.10). Essa exocitose permite que a vesícula acrossômica libere
der, 1974; fotografias por cortesia de G. L. seu conteúdo na cabeça do espermatozóide*.
Decker e W. J. Lennarz.) A segunda parte da reação acrossômica envolve a extensão do processo
acrossômico (veja Figura 4.9). Essa protrusão se origina da polimerização de molécu-
las globulares de actina em filamentos de actina (Tilney et al., 1978). A exposição do
espermatozóide do ouriço-do-mar à geléia do óvulo também ocasiona a rápida utiliza-
ção de ATP e um aumento de 50% da respiração mitocondrial. A energia gerada é
usada primordialmente para motilidade flagelar (Tombes e Shapiro, 1985).
Os fatores da geléia do óvulo que iniciam a reação acrossômica em ouriços-do-mar
são muitas vezes muito específicos. Os espermatozóides dos ouriços-do-mar Arbacia
punctulata e Strongylocentrotus drobachiensis reagem somente com a geléia de
seus próprios óvulos. No entanto, o espermatozóide de S. purpuratus também pode
ser ativado pela geléia de Lytechinus variegatus (mas não de A. punctulata) (Summers
e Hylander, 1975). Portanto, a geléia do óvulo pode prover reconhecimento espécie-
específico em algumas espécies, mas não em outras.
* Tais reações exocitóticas podem ser vistas na liberação de insulina das células pancreáticas e
na liberação de neurotransmissores de terminais sinápticos. Em todos os casos, há uma fusão
mediada pelo cálcio entre a vesícula secretória e a membrana celular. Realmente, a semelhança entre
a exocitose da vesícula acrossômica e a exocitose da vesícula sináptica pode ser bastante profunda.
Estudos recentes de reações acrossômicas em ouriços-do-mar e mamíferos (Florman et al., 1992;
González-Martínez et al., 1992) sugerem que quando os receptores para os ligantes ativadores do
espermatozóide ligam essas moléculas, causam a despolarização da membrana que poderia abrir
canais de cálcio voltagem-dependentes de maneira reminescente à transmissão sináptica. As prote-
ínas que atracam os grânulos corticais à membrana celular também parecem ser homólogas àquelas
usadas na ponta do axônio (Bi et al., 1995).
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 131
Membrana celular do
espermatozóide
Fusão entre a
membrana celular
Membrana
do espermatozóide
acrossômica
e a membrana
acrossômica adjacente
Núcleo
Centríolo
Figura 4.10
Reação acrossômica em espermatozóide de hamster. (A) Micrografia de transmissão eletrônica
de um espermatozóide de hamster passando pela reação acrossômica. A membrana acrossômica
pode ser vista formando vesículas. (B) Diagrama interpretativo de micrografias eletrônicas
mostrando a fusão de membranas acrossômica e celular na cabeça do espermatozóide. (A de
Meizel, 1948, cortesia de S. Meizel; B, segundo Yanagimachi e Noda, 1970.)
Informações adicionais
& Especulações
pode se alterar, mudando sua composi- Hiperativação e Quimiotaxia possibilidade de que o efeito fosse devido
ção de lipídios. A concentração de As diferentes regiões do trato reproduti- a uma estimulação geral do movimento ou
colesterol no espermatozóide é diminuída vo feminino podem secretar fatores dife- do metabolismo do espermatozóide. No en-
durante a capacitação do espermatozóide rentes, regionalmente específicos. Esses tanto, essas investigações revelaram uma
em várias espécies (Davis, 1981), e duas fatores podem influenciar a motilidade correlação fascinante: o fluido de somente
proteínas encontradas tanto no soro como espermática assim como a capacitação. Por a metade dos folículos testados mostrou
no trato reprodutivo feminino (albumina exemplo, quando os espermatozóides de um efeito quimiotático, e em quase todos
e proteína 1 de transferência lipídica), fo- certos mamíferos (especialmente hams- os casos, o óvulo só era fertilizável se, e
ram verificadas remover colesterol do es- ters, cobaias e algumas variedades de ca- somente se, o fluido demonstrasse habili-
permatozóide humano (Langlais et al., mundongos) passam do útero para os dade quimiotática (P < 0,0001). É possível,
1988; Ravnik et al., 1992). Em segundo lu- ovidutos, ficam “hiperativados”, passan- portanto, que tal como certos óvulos de
gar, certas proteínas ou carboidratos na do a nadar com maior velocidade e geran- invertebrados, o óvulo humano secrete um
superfície do espermaozóide são perdidos do maior força. Suarez e colaboradores fator quimiotático somente quando estiver
durante a capacitação (Poirier e Jackson, (1991) mostraram que enquanto essas re- capacitado para a fertilização.
1981; Lopez et al., 1985; Wilson e Oliphant, ações não são conducentes a viagens em Deve-se notar que “o prêmio da corri-
1987). É possível que essas entidades per- fluidos de baixa viscosidade, parecem ser da não vai sempre para o mais rápido”. Em-
didas durante a capacitação estivessem muito adequadas para o movimento line- bora algum espermatozóide possa alcan-
bloqueando locais de reconhecimento ar do espermatozóide no fluido viscoso çar a região ampolar do oviduto (onde ocor-
para as proteínas que se ligam à zona que poderá encontrar no oviduto. re a fertilização) dentro de meia hora após a
pelúcida. Em terceiro lugar, certas proteí- Além de aumentar a atividade do es- relação sexual, aquele espermatozóide pode
nas são fosforiladas por um caminho permatozóide, fatores solúveis no oviduto ter poucas chances de fertilizar o óvulo.
cAMP-dependente. O AMP cíclico pode também podem prover o componente dire- Wilcox e colaboradores (1995) acharam que
induzir artificialmente a competência atra- cional do movimento do espermatozóide. quase todas os engravidamentos humanos
vés da proteína quinase cAMP-depen- Especulou-se que o óvulo (ou, mais pro- resultam de relacionamento sexual duran-
dente (PKA), que é necessária tanto para vavelmente, o folículo ovariano no qual o te um período de seis dias, terminando no
a aquisição de competência como para a óvulo se desenvolve) pode estar secretan- dia da ovulação. Isso significa que o es-
fosforilação de tirosino-quinases. É pos- do substâncias quimiotáticas que poderi- permatozóide fertilizador poderia demorar
sível que o trato reprodutivo feminino es- am atrair o espermatozóide em direção ao até seis dias para fazer a jornada. Eisenbach
timule a adenilciclase do espermatozóide óvulo durante os últimos estágios da mi- (1995) propôs a hipótese pela qual a
a produzir mais cAMP e que esse ative a gração (veja Hunter, 1989). Ralt e colabora- capacitação é um acontecimento transitó-
proteína quinase que inicia a cascata de dores (1991) testaram essa hipótese usan- rio, e que é dada ao espermatozóide uma
fosforilação, terminando na fosforilação do fluido de folículos humanos cujos óvu- janela de competência relativamente bre-
e ativação das proteínas envolvidas na los estavam sendo usados para fertiliza- ve, durante a qual pode ter sucesso na fer-
ligação do espermatozóide à zona pelúcida ção in vitro. Realizando um experimento tilização do óvulo. Quando os espermato-
e mediando a exocitose da vesícula acros- semelhante aquele descrito anteriormente zóides atingem a ampola, adquirem com-
sômica (Leyton e Saling, 1989a; Visconti com ouriços-do-mar, os autores microinje- petência, mas se aí ficam por um período
et al., 1995a,b). Em quarto lugar, o poten- taram uma gota do fluido folicular em uma demasiadamente longo, perdem-na. O es-
cial da membrana do espermatozóide é gota maior da suspensão de espermato- permatozóide pode também ter diferentes
dramaticamente reduzido (de cerca de – zóides. Feito isso, observaram que parte prazos de sobrevivência, dependendo da
30 para –50 mV; Zeng et al., 1995). Porém, do espermatozóide mudou sua direção de sua localização dentro do trato reproduti-
ainda é incerto se esses eventos são in- movimentação, passando a migrar ao en- vo; isso pode permitir que algum esperma-
dependentes um do outro e até que pon- contro da fonte de fluido folicular. A tozóide chegue mais tarde, porém com uma
to cada um deles produz capacitação do microinjeção de outras soluções não teve melhor probabilidade de sucesso do que
espermatozóide. esse efeito. Esses estudos não eliminam a aquele que chegou dias antes.
Figura 4.11
Contato do processo acrossômico do espermatozóide do ouriço-do-mar com uma Figura 4.12
microvilosidade do óvulo. (de Epel, 1977, cortesia de F. D. Collins e D. Epel.) Aglutinação espécie-específica por bindi-
na de óvulos desgeleificados . (A) aglutina-
ção promovida pela adição de 212 µg de
bindina em um recipiente plástico conten-
ligar a óvulos desgeleificados de S. purpuratus (Figura 4.12; Vacquier e Moy, 1977).
do 0.25 ml de suspensão a 2% (volume/
Ainda mais, sua interação com óvulos é relativamente espécie-específica (Glabe e volume) de óvulos. Após 2-5 min de agita-
Vacquier, 1977; Glabe e Lennarz, 1979); a bindina isolada dos acrossomos de S. ção branda, os recipientes foram fotografa-
Purpurata aglutina seus próprios óvulos desgeleificados, mas não aqueles de Arbacia dos. Cada bindina somente se ligou a seus
puctulata. Usando técnicas imunológicas, Moy e Vacquier (1979) demonstraram que próprios óvulos. (B) Fotomicrografia de
a bindina está especificamente localizada no processo acrossômico, exatamente onde fluorescência de óvulos de S. purpuratus
deve estar para o reconhecimento espermatozóide-óvulo (Figura 4.13). ligados entre si por partículas de bindina
Estudos bioquímicos mostraram que as bindinas de espécies proximamente relaci- de S. purpuratus marcadas por fluorescên-
onadas de ouriço-do-mar são mesmo diferentes. Esse achado implica na existência de cia. As partículas de bindina estavam inva-
riavelmente nos lugares onde dois óvulos
se encontravam. (A baseado em fotografias
de Glabe e Vacquier, 1977; B de Glabe e
(A) BINDINA DO ESPERMATOZÓIDE (B) Lennarz, 1979, cortesia dos autores.)
S. purpuratus S. fransciscanus
S. purpuratus
Partículas
de bindina
OVOS DESGELEIFICADOS
Bindina
Espermatozóide
Figura 4.13
Localização de bindina no processo acrossômico. (A) a técnica de localização
imunoquímica coloca um anticorpo de coelho nos lugares onde a bindina está exposta.
Os anticorpos do coelho foram produzidos contra a proteína bindina, e esses anticorpos
foram incubados com espermatozóide que tinha sofrido a reação acrossômica. Quando a
bindina estava presente, os anticorpos do coelho permaneciam ligados ao espermato-
zóide. Depois de todo anticorpo não-ligado ser removido por lavagem, o espermatozói-
de foi tratado com anticorpos de porco capazes de ligar-se a anticorpos de coelho.
Esses anticorpos de porco haviam sido ligados covalentemente à enzima peroxidase.
Dessa maneira, moléculas de peroxidase foram colocadas em todos os lugares onde havia
bindina. Peroxidase catalisa a formação de um precipitado escuro de diaminobenzidina
(DAB) e água oxigenada. O precipitado só se forma onde há bindina. (B) Localização de
bindina no processo acrossômico após a reação acrossômica (33.200x). (C) Localização
de bindina no processo acrossômico na junção do espermatozóide com o óvulo. (B e C de
Moy e Vacquier, 1979, cortesia de V. D. Vacquier.)
(A)
Figur
Figuraa 4.14
Receptores de bindina no óvulo. (A) Mi-
crografia eletrônica de varredura do esper-
matozóide do ouriço-do-mar ligado ao
envoltório vitelínico de um óvulo. (B) liga-
ção do espermatozóide de S. purpuratus a
partículas de polistireno que foram cober-
tas com a proteína purificada do receptor de
bindina. (A cortesia de C. Glabe, L. Perez e
W. J. Lennarz; B de Foltz et al., 1993.)
(B)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 135
ZP3 sem
carboidratos
ZP3
GALACTOSILTRANSFERASE SP 56 P95
(proteína
Ligação periférica da Ativação
cruzada ativa membrana) de
proteínas G tirosinoquinase Figura 4.16
Ligação de espermatozóide à zona pelúcida do
Ativação de síntese Regulação de camundongo: alguns possíveis participantes.
de IP3 na canais iônicos A proteína ZP3 da zona pelúcida liga esper-
membrana ou síntese matozóide. Há evidência da ligação de três pro-
acrossômica de IP3 teínas espermáticas – a galactosiltransferase
da superfície, sp56 e P95 – à ZP3. Essa liga-
Liberação de Ca++ ção induz a reação acrossômica através da ati-
vação do fluxo de cálcio. Os detalhes ainda
terão que ser elucidados. (Segundo Snell e
Reação acrossômica White, 1996.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 137
Figura 4.17
Sp56 purificada liga-se à zona pelúcida e ini-
be a ligação de espermatozóide a óvulos de
camundongo. (A) Ligação de sp56 à zona
pelúcida de ovos não-fertilizados. A pista 1 é
o resultado da lise de ovos não-fertilizados,
fazendo migrar as proteínas extraídas em um
gel, transferindo o gel, e sondando para a pre-
sença de sp56 com anticorpo marcado. Não
se vê sp56. A pista 2 mostra o resultado po-
sitivo obtido quando o ovo não-fertilizado é
pré-incubado com sp56, indicando que sp56
se liga aos óvulos. A pista 3 mostra os resul-
tados negativos obtidos quando sp56 foi adi-
cionada a embriões bicelulares. A pista 4 mos-
tra o controle quando sp56 purificada é feita
migrar no gel. (O anticorpo reconhece a for-
ma não-reduzida de sp56, que migra em 40
ZP3 à uma coluna de afinidade, passando em seguida, por essa coluna, as proteínas kDa). (B) Espermatozóide ligando-se normal-
isoladas da membrana de espermatozóides de camundongo (Bleil e Wassarman, mente a ovos não-fertilizados de camundon-
1990). A maioria das proteínas passou pela coluna; porém um peptídio de 56- go (aproximadamente 76 espermatozóides
kDa, ligou-se às partículas recobertas com ZP3, mas não se ligou a partículas por óvulo). Os embriões bicelulares (aqui
recobertas com ZP2 em experimento semelhante. Essa proteína foi encontrada marcados por asteriscos) são controles inter-
nos mostrando não ocorrer ligação. (C ) Na
exposta na membrana espermática; ligava-se a resíduos de galactose, sugerin-
presença de sp56, o espermatozóide foi im-
do fortemente ser um receptor de espermatozóide ligante à entidade terminal de pedido de se ligar à zona. (de Bookbinder et
galactose na glicoproteína ZP3. A proteína sp56 liga-se à zona pelúcida de al., 1995; cortesia de J.D. Bleil.)
ovos não-fertilizados (porém não dos fertilizados), bloqueando a ligação es-
permatozóide-óvulo (Figura 4.17; Bookbinder et al., 1995).
contraceptivo perdurou por vários meses, após os quais a fertilidade foi restabelecida.
Os animais foram temporariamente esterilizados por esses anticorpos. O análogo
humano da proteína PH-20 não é ainda conhecido, porém, certos antígenos do es-
permatozóide apresentam um padrão semelhante de localização no espermatozóide.
As proteínas da zona pelúcida humana e suas funções ainda não foram estabeleci-
das tão claramente como no camundongo. Ainda assim, esses experimentos mos-
tram que o princípio da contracepção imunológica está bem fundamentado.
(A) (B)
Figura 4.19
Varredura ao microscópio eletrônico da entrada
do espermatozóide em óvulo de ouriço-do-mar.
(A) Contato da cabeça do espermatozóide com
microvilosidades do óvulo através do processo
acrossômico. (B) Formação do cone de fertili-
zação. (C) Internalização do espermatozóide no
óvulo. (D) Micrografia de transmissão ao mi-
croscópio eletrônico da internalização do es-
permatozóide através do cone de fertilização.
(A-C de Schatten e Mazia, 1976, cortesia de G.
Schatten; D cortesia de F. J. Longo.)
(C) (D)
140 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Prevenção da Polispermia
Assim que um espermatozóide tiver penetrado o óvulo, a capacidade de fusão da
membrana do óvulo, que fora tão necessária para conseguir a penetração, torna-se
um risco. No ouriço-do-mar, como na maioria dos animais estudados, qualquer es-
permatozóide que penetra o óvulo, pode prover um núcleo haplóide e um centríolo
para o óvulo. Na monospermia normal, na qual somente um espermatozóide penetra
o óvulo, um núcleo haplóide do espermatozóide e um do óvulo se combinam para
formar o núcleo diplóide do ovo fertilizado (zigoto), restaurando o número de cro-
mossomos apropriado para a espécie. O centríolo, provindo do espermatozóide, se
dividirá para formar os dois pólos do fuso mitótico durante a clivagem.
A entrada de múltiplos espermatozóides – polispermia – conduz à conse-
qüências desastrosas na maioria dos organismos. No ouriço-do-mar, a fertiliza-
ção por dois espermatozóides resulta em um núcleo triplóide, no qual cada
cromossomo está representado não duas, mas três vezes. Pior ainda, como o
centríolo se divide para formar os dois pólos do aparelho mitótico, aqui, em
vez de um fuso mitótico bipolar separar os cromossomos em duas células, os
cromossomos triplóides se dividiriam em quatro células. Como não há meca-
nismos para assegurar que cada uma das quatro células receba o número e o
tipo apropriado de cromossomos, esses serão distribuídos de maneira desigual.
Algumas células receberiam cópias extra de certos cromossomos e outras cé-
lulas não os teriam. Theodor Boveri demonstrou em 1902 que tais células ou
morreriam ou se desenvolveriam anormalmente (Figura 4.21). [fert6.html]
As espécies desenvolveram maneiras de prevenir a união de mais de dois
núcleos haplóides. A mais comum é a de impedir a entrada de mais de um
espermatozóide no óvulo. O óvulo do ouriço-do-mar tem dois mecanismos que
evitam a polispermia: uma reação rápida, efetivada por uma mudança elétrica
na membrana plasmática do óvulo, e uma reação mais lenta, causada pela
exocitose dos grânulos corticais.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 141
Zona
Segmento
(E) Núcleo equatorial do
Membrana
acrossomo
acrossômica
interna
Figura 4.20
Entrada de espermatozóide no óvulo do hamster dourado. (A) Micrografia eletrônica de
varredura do ato da fusão. O ponto “calvo” (sem microvilosidades) é o local abandona-
do pelo corpo polar. (B) Vista próxima da ligação espermatozóide-zona. (C ) Microgra-
fia eletrônica de transmissão mostrando a cabeça do espermatozóide atravessando a
zona. (D) Micrografia eletrônica de transmissão, do espermatozóide fundindo em para-
lelo a membrana do plasma do óvulo. (E) Diagrama da fusão do acrossomo do esper-
matozóide e membranas plasmáticas com as microvilosidades do óvulo. (Segundo
Yanagimachi e Noda, 1970; Yanagimachi, 1994; fotografias cortesia de R. Yanagimachi.)
Fusão pronuclear
(B)
Figura 4.22
Potencial de membrana de óvulos de ouriço-do-mar antes
e após a fertilização. (A) antes da adição do espermato-
zóide, a diferença de potencial através da membrana celu-
lar do óvulo é de aproximadamente –70 mV. De 1 a 3 se-
gundos após o espermatozóide fertilizante ter entrado em
Adição de contato com o óvulo, o potencial se desloca na direção
espermatozóide positiva. (B) Ovos controle desenvolvendo-se em Na+
490 mM. (C) Polispermia em ovos fertilizados em Na+
(A) 120 mM (colina foi substituída por sódio). Os ovos de
Segundos Lytechinus foram fotografados durante a primeira
clivagem. (D) Tabela mostrando a elevação da polispermia
com o decréscimo da concentração do íon sódio. (de Jaffe,
1980, fotografias cortesia de L. A. Jaffe.)
Porcentagem de
[Na+] (mM) ovos polispérmicos
zona pelúcida de maneira que esses não mais podem ligar-se a espermatozóide (Bleil
e Wassarman, 1980). Essa modificação é chamada reação da zona. Durante essa
reação, tanto ZP3 como ZP2 são modificadas. Florman e Wassarman (1985), propu-
seram que os grânulos corticais do óvulo do camundongo contêm uma enzima que
corta os resíduos terminais de açúcares de ZP3, com isso liberando espermatozóide
ligado à zona e evitando a fixação de mais espermatozóide. Esses grânulos corticais
contêm N-acetilglicosaminidases capazes de clivar N-acetilglicosamina de cadeias
de carboidrato de ZP3. Miller e colaboradores (1992, 1993) demonstraram que após
a fertilização, o resíduo de N-acetilglicosamina é removido, ZP3 não serve como
substrato para a ligação de galactosiltransferase. ZP2 é cortada pelas proteases
granulares perdendo também sua habilidade de ligar espermatozóide (Moller e Was-
sarman, 1989). Assim, o espermatozóide não pode mais iniciar ou manter sua ligação
à zona pelúcida e é rapidamente descartado.
Microfilamentos
Hialina
(iv) Envoltório de (D)
fertilização
Espermatozóide é liberado
Membrana
Camada hialina celular
(A) (E)
espermatozóide um feixe de luz atravessa a célula (Steinhardt et al., 1977; Gilkey et al.,
1978; Hafner et al., 1988). Como documentado pelas fotografias, os íons de cálcio não
se difundem simplesmente através do óvulo a partir do ponto da entrada do esperma-
tozóide. Ao contrário, a liberação de cálcio inicia-se de um lado da célula e termina do
outro. O mecanismo dessa onda será discutido logo adiante (veja Informações adici-
onais & Especulações, página 147). A total liberação de íons de cálcio é completada, a
grosso modo, em 30 segundos no ovo do ouriço-do-mar; os íons livres de cálcio são
re-seqüestrados pouco após sua liberação. Quando dois espermatozóides entram no
citoplasma do óvulo, a liberação de cálcio pode ser vista começando em dois pontos
separados da superfície celular (Hafner et al., 1988).
Vários experimentos demonstraram que íons de cálcio são responsáveis diretos
pela propagação da reação cortical e que são armazenados dentro do próprio óvulo.
A droga A23187 é um ionóforo que transporta íons de cálcio através de membranas,
permitindo a esses cátions atravessar barreiras antes impermeáveis. A colocação de
146 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Figura 4.25
Retículo endoplasmático rodeando grânu-
lo cortical no óvulo de ouriço-do-mar. (A)
O retículo foi corado com ósmio-iodeto de
zinco para permitir a visualização por mi-
crografia de transmissão eletrônica. O grâ-
nulo é visto rodeado pelo retículo. (B) Re-
trato de um óvulo inteiro corado por anti-
corpos fluorescentes para os canais de li-
beração de cálcio. Os anticorpos mostram
esses canais no retículo endoplasmático
cortical. (A de Luttmer e Longo, 1985, cor-
tesia de S. Luttmer; B de McPherson et
al., 1992, cortesia de F. J. Longo.) (A) (B)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 147
Informações adicionais
& Especulações
celular foram sintetizados e foram de- Entretanto, a cascata ligada à proteí- PDGF) foi injetado em oócitos de estre-
tectados na membrana celular do óvu- na-G não é o único caminho capaz de ge- la-do-mar, o receptor PDGF foi sintetiza-
lo. Os óvulos puderam ser “fertilizados” rar IP3 (veja Capítulo 3). Evidências re- do e incorporado nas membranas celula-
por serotonina e acetilcolina e foi ob- centes (Moore et al., 1994; Shilling et al., res desse organismo. Quando, após a
servado a reação cortical. Experimentos 1994; Yim et al., 1994) demonstram que a maturação dos oócitos, PDGF foi adicio-
semelhantes mostraram que quando ativação do receptor da tirosinoquinase nado à água banhando os óvulos, esses
neurotransmissores ativam o caminho também produz IP3 e ativa a onda de cál- apresentaram aumento de cálcio intrace-
da proteína G–IP3 em oócitos de camun- cio e a reação granular cortical (Figura lular livre, exocitose de grânulos corticais
dongo, são induzidos os eventos da fer- 4.26b). Quando o mRNA para o receptor e síntese de DNA. Alguns se desenvol-
tilização (Williams et al., 1992; Moore et dessa quinase (o receptor para o fator de veram em larvas. Quando o mRNA con-
al., 1993). crescimento derivado das plaquetas, tinha um ponto de mutação que impedia
Figura 4.26
Mecanismos possíveis da ativação do óvulo. (A) Trajetória do fosfatidilinositol medi-
ado pela G-proteína. (B) Trajetória do receptor da tirosinoquinase (RTK). (C) Trajetó-
ria da tirosinoquinase citoplasmática. (D) Trajetória na qual a G proteína ou
tirosinoquinase ativadas na membrana espermática ativam trajetórias no óvulo. (E)
Trajetórias de ativadores solúveis.
Fosfolipase C (PLC)
Receptor
G-proteína
Receptor de Tirosinoquinase
Tirosinoquinase
Receptor de IP3
Retículo endoplasmático
G-proteína
Receptor de IP3
Retículo endoplasmático
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 149
o receptor interagir com a fosfolipase C, Outra possibilidade é que a ativa- gura 4.26 D, a bindina meramente liga o
nenhuma dessas reações ocorreu (Shilling ção do caminho do IP3 não é devida à óvulo ou, talvez, motive a fosforilação
et al., 1994). Assim, tanto o caminho liga- ligação do espermatozóide e óvulo, mas de proteínas necessárias em fases mais
do ao receptor proteína-G como aquele à fusão das membranas do óvulo e do avançadas do desenvolvimento.)
do receptor da tirosinoquinase, parecem espermatozóide. Mc Culloch e Chambers Ainda outra possibilidade é que o
ser capazes de ativar essa fosfolipase, (1992) obtiveram evidência eletrofisio- agente ativo na liberação de cálcio ligado
criar IP3 e induzir o fluxo de cálcio no lógica que a ativação dos óvulos do venha do citosol do espermatozóide.
óvulo. O receptor da bindina não ofere- ouriço-do-mar não ocorre até depois da Parrington e colaboradores (1996) isola-
ce pistas para explicar como ocorre essa junção do espermatozóide com o óvulo. ram uma proteína de 33-kDA, chamada
ativação, por não ter semelhante em ou- Eles sugerem que os componentes oscilina, localizada no escasso citoplas-
tras proteínas transmembrana. No entan- ativadores do óvulo se localizam na ma da cabeça do espermatozóide (Figura
to, 5 segundos após ligar a bindina, fica membrana ou no citoplasma do esper- 4.26 E). A microinjeção dessa proteína em
fosforilado em um dos seus resíduos matozóide. É até mesmo possível que óvulos de camundongo pode iniciar libe-
tirosina citoplasmáticos (Abassi e Foltz, por ocasião da fusão das membranas, ração de cálcio, porém, os outros parâme-
1994). Isso sugere que o receptor de as proteínas G da membrana espermáti- tros da ativação do óvulo (exocitose dos
bindina ligado, pode interagir com a ca ou as tirosinoquinases (ativadas pela grânulos, recrutamento de mRNA e reto-
tirosinoquinase plasmática tal como geléia do óvulo para iniciar a reação a- mada do ciclo celular) não são observa-
aqueles que medeiam a liberação de cál- crossômica) ativem a cascata polifosfo- dos. Não é conhecido qual o papel que
cio durante a ativação de células T (Fi- inositídica para liberação de cálcio do essa proteína pode ter na fisiologia da ati-
gura 4.26 C; Hall et al., 1993). óvulo. (No cenário apresentado na Fi- vação do óvulo.
Respostas precoces
O contato entre o espermatozóide do ouriço-do-mar ativa dois principais bloqueios à
polispermia: o bloqueio rápido, iniciado pelo influxo de sódio na célula, e o bloqueio
lento, iniciado pela liberação intracelular de íons de cálcio. A ativação de todos os
óvulos parece depender do aumento da concentração de íons livres de cálcio dentro
do óvulo. Em protostomatas, como lesmas e vermes, ao menos parte do cálcio geral-
mente entra no óvulo vindo de fora. Em deuterostomatas, tais como: peixes, rãs,
ouriços-do-mar e mamíferos, a ativação é acompanhada pela liberação de íons de
cálcio do retículo endoplasmático, resultando na onda de cálcio varrendo o óvulo
(Jaffe, 1983; Terasaki e Sardet, 1991).
*Em certas salamandras, essa função desenvolvimental da fertilização está totalmente divor-
ciada da função genética. A salamandra prateada (Ambystoma platineum) é uma espécie híbrida
que consiste somente de fêmeas. Cada uma produz um ovo com um número não-reduzido de
cromossomos. Esse ovo, porém, não pode se desenvolver sozinho; assim, a salamandra prateada
copula com o macho da salamandra Jefferson (A. jeffersonianum). O espermatozóide desse macho
somente estimula o desenvolvimento do ovo; não contribui com material genético (Uzzell,
1964). Para detalhes desse complexo mecanismo de procriação veja Bogart et al., 1989.
150 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Ativação da Conversão de
NAD+ quinase NAD+ em NADP+
Respostas tardias
Pouco tempo após o aumento dos níveis de íons cálcio, o pH intracelular também
aumenta. Acredita-se que essas duas condições iônicas (> [Ca2+], < [H+] ajam em
conjunto para fornecer o espectro completo dos eventos da fertilização, incluindo a
síntese de proteínas e de DNA (Winkler et al., 1980; Whitaker e Steinhardt, 1982). O
aumento do pH intracelular começa com o segundo influxo de íons de sódio, causan-
do uma troca 1:1 entre íons de sódio da água do mar e os íons hidrogênio do óvulo*.
Essa perda de hidrogênio faz o pH elevar-se de 6.8 a 7.2, ocasionando enormes mudan-
ças na fisiologia do ovo (Shen e Steinhardt, 1978).
As respostas tardias da fertilização produzidas por essas alterações iônicas, inclu-
em a ativação da síntese de DNA e da proteína. O surto de síntese de proteína ocorre
vários minutos após a entrada do espermatozóide e não depende da síntese de novo
RNA mensageiro (Figura 4.28). Em seu lugar, a síntese de proteína nova utiliza mRNAs
já presentes no citoplasma do oócito (muito mais sobre isso será mencionado no
Capítulo 12). Esses RNAs incluem aqueles que codificam proteínas como histonas,
tubulinas, actinas e fatores morfogenéticos que são utilizados durante o desenvolvi-
mento precoce. Tal surto de síntese protéica pode ser induzido pelo aumento artificial
do pH citoplasmático por íons amônio (Winkler et al., 1980). Reciprocamente, agentes
que bloqueiam o aumento do pH inibem eventos da fertilização tardia como a síntese
de DNA e proteína. Quando ovos recém-fertilizados são colocados em soluções con-
tendo baixas concentrações de íons de sódio e amiloride (uma droga que inibe a troca
Na+/H+), a síntese protéica falha, os movimentos dos pronúcleos do óvulo e do esper-
matozóide são prevenidos, e a divisão celular não ocorre (Dube et al., 1985).
Figura 4.28
Incorporação de valina[14C] na
do no citoplasma do oócito. (A) Síntese protéica em óvulos do ouri- água do mar
normal
ço-do-mar Arbacia punctulata fertilizada na presença ou ausência
de actinomicina D, um inibidor da transcrição. Durante as primeiras
horas, a síntese protéica ocorre sem nova transcrição dos núcleos
do zigoto ou embrião. Um segundo surto de síntese protéica ocorre
durante os estágios medianos de blástula, e isso representa tradu-
ção de mensagens recém-transcritas (e, portanto, não é visto em
embriões crescendo em actinomicina). (B) Aumento na porcenta- Água do mar tratada
gem de ribossomos recrutados para polissomos durante as primei- por actinomicina
ras horas do desenvolvimento do ouriço-do-mar, especialmente du-
rante o primeiro ciclo celular. (A segundo Gross et al., 1964; B
segundo Humphreys, 1971.)
Horas após a fertilização
Porcentagem de ribossomos
em polissomos
(A) (B)
Pronúcleo do óvulo
Ponte internuclear
Figura 4.29
histonas espermatozóide-específicas, que se ligam fortemente ao DNA. Esse pro- Eventos nucleares na fertilização do ouriço-
do-mar. (A) Migração dos pronúcleos do
cesso começa quando o espermatozóide entra em contato com uma glicoproteína na
óvulo e do espermatozóide em um ovo de
geléia do óvulo que eleva o nível da atividade proteinoquinase cAMP-dependente. Clypeaster japonicus. O pronúcleo do es-
(Tais proteino-quinases cAMP-dependentes foram mencionadas no Capítulo 1.) permatozóide está rodeado por microtúbu-
Essas quinases fosforilam vários resíduos básicos das histonas espermatozóide- los do seu áster. (B) Fusão de pronúcleos no
específicas interferindo, desse modo, com sua ligação ao DNA (Garbers et al., 1980, ovo do ouriço-do-mar. (A de Hamaguchi e
1983; Porter e Vacquier, 1986). Esse afrouxamento é considerado facilitar a substitui- Hiramoto, 1980, cortesia dos autores; B cor-
ção das histonas espermatozóide-específicas por outras histonas que haviam sido tesia de F. J. Longo.)
estocadas no citoplasma do oócito (Poccia et al., 1981; Green e Poccia, 1985). Uma
vez descondensado, o DNA pode iniciar a transcrição e a replicação. [fert9.html]
Depois que o espermatozóide do ouriço-do-mar entra no citoplasma do óvulo, o
pronúcleo masculino gira 180o fazendo com que o centríolo fique entre o pronúcleo do
espermatozóide e o pronúcleo do óvulo. Em seguida, o centríolo espermático age
como um centro organizador de microtúbulos, estendendo seus próprios microtúbu-
los e integrando-os com os microtúbulos do óvulo formando um áster*. Esses
microtúbulos se estendem através de todo o óvulo, contatam o pronúcleo feminino, e
trazem os dois pronúcleos um para perto do outro (Hamaguchi e Hiramoto, 1980;
Bestor e Schatten, 1981). A fusão forma o núcleo zigótico diplóide (Figura 4.19). A
iniciação da síntese de DNA pode ocorrer no estágio pronuclear (durante a migração)
ou depois da formação do núcleo zigótico.
Em mamíferos, o processo da migração pronuclear dura aproximadamente 12
horas, comparado com menos de uma hora no ouriço-do-mar. O espermatozóide do
mamífero entra quase tangencialmente à superfície do óvulo em vez de aproximá-la
perpendicularmente, e funde com numerosas microvilosidades (veja Figura 4.20). O
núcleo do espermatozóide mamífero também se parte quando sua cromatina
descondensa, sendo depois reconstruído por vesículas coalescentes. O DNA do
núcleo espermático é ligado por proteínas básicas chamadas protaminas; essas
proteínas nucleares estão firmemente compactadas através de ligações dissulfeto.
Uma vez no óvulo, a glutationa reduz essas ligações de dissulfeto, permitindo o
desdobramento da cromatina do espermatozóide (Calvin e Bedford, 1971; Kvist et
*Quando Oskar Hertwig observou esse arranjo radial de ásteres de espermatozóide no seu
recém-fertilizado ovo de ouriço-do-mar, chamou-o de “sol dentro do ovo”, e considerou-o feliz
indicação de uma fertilização bem-sucedida (Hertwig, 1877). Mais recentemente, Simerly e
colaboradores (1994) descobriram que certos tipos de infertilidade em homens eram devidos a
defeitos na capacidade do centrossoma formar esses ásteres microtubulares. Essa deficiência
causa a falência da migração pronuclear e a interrupção do desenvolvimento.
154 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Figura 4.30
Movimento pronuclear em hamster. (A)
Entrada de espermatozóide na célula e al., 1980). O pronúcleo masculino dos mamíferos aumenta enquanto o núcleo do
tumefação do pronúcleo do espermatozói- oócito completa sua segunda divisão meiótica (Figura 4.30 A).
de. (B) Aposição dos pronúcleos do es- O centrossomo que acompanha o pronúcleo masculino produz seus ásteres
permatozóide e do óvulo. (C ) Estágio
(principalmente a partir de proteínas armazenadas no oócito) e contata o pronú-
bicelular mostrando duas células de tama-
nhos iguais com núcleos bem definidos.
cleo feminino. Então, cada pronúcleo migra ao encontro do outro, replicando seu
Entulho no espaço perivitelínico são os cor- DNA ao longo do trajeto. No encontro, os dois envoltórios nucleares se desinte-
pos polares em degeneração. (de Bavister, gram (Figura 4.30B). No entanto, em lugar de produzir um núcleo zigótico comum
1980, cortesia de B. D. Bavister.) (como acontece na fertilização do ouriço-do-mar), a cromatina condensa-se para
formar cromossomos que se orientam num fuso mitótico comum. Assim, um núcleo
zigótico verdadeiro em mamíferos é visto primeiro não no zigoto, mas no estágio
bicelular (Figura 4.30 C). [fert10.html]
Informações adicionais
& Especulações
G
ERALMENTE ASSUME-SE que lizando um óvulo no qual o pronúcleo óvulos se desenvolvam na ausência de
machos e fêmeas portam geno- feminino está ausente. Após penetrar no espermatozóide. A habilidade de desen-
mas haplóides equivalentes. óvulo, os cromossomos do espermato- volver um embrião sem contribuição es-
Um dos princípios fundamentais da ge- zóide se duplicam restaurando seu nú- permática é chamada partenogênese (do
nética Mendeliana é que os genes deri- mero diplóide. Assim, todo o genoma é grego, significando “nascimento vir-
vados do espermatozóide são funcional- derivado do espermatozóide (Jacobs et gem”). Os óvulos de muitos invertebra-
mente equivalentes aqueles derivados al., 1980; Ohama et al., 1981). Aqui ve- dos e de alguns vertebrados são capa-
do óvulo. No entanto, estudos recentes mos uma situação em que as células so- zes de se desenvolver normalmente na
mostram que em mamíferos o genoma de- brevivem, se dividem e têm um número ausência do espermatozóide se o óvulo
rivado do óvulo pode ser funcionalmen- normal de cromossomos, porém, apre- for ativado artificialmente. Nessas situa-
te diferente e ter papel complementar du- sentam um desenvolvimento anormal. Em ções, a contribuição do espermatozóide
rante certos estágios do desenvolvimen- vez de formar um embrião, o ovo se trans- para o desenvolvimento parece dispen-
to. A primeira evidência dessa não-equi- forma numa massa de células placento- sável. Os mamíferos, no entanto, não a-
valência veio de estudos de um tumor símiles. Não há desenvolvimento normal presentam a partenogênese. A colocação
humano chamado mola hidatidiforme. quando o genoma inteiro vem do paren- de oócitos de camundongo em um meio
Esses tumores parecem tecido placentá- te masculino. Evidência para a não-equi- de cultura que artificialmente ativa o
rio. A maioria dessas molas se desenvol- valência dos pronúcleos mamíferos vem oócito, ao mesmo tempo suprimindo a for-
ve de um espermatozóide haplóide ferti- também de tentativas de conseguir que mação do segundo corpo polar, produz
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 155
Pólo animal
Citoplasma Núcleo do Material do
Cortical oócito núcleo do oócito
Citoplasma
amarelo claro
Gema cinzenta
(A) (B)
Ponto de
entrada do
espermatozóide Crescente
cinzento
Córtex
Citoplasma
interno Zona de
deslizamento
Figura 4.33
Reorganização do citoplasma no ovo recém-fertilizado da rã. (A) Corte transversal
esquemático de um ovo na metade do primeiro ciclo de clivagem. O ovo tem simetria
radial em torno do seu eixo animal-vegetal. O espermatozóide entrou por um lado e
seu núcleo está migrando para o interior. O córtex está representado como o de Rana,
com um hemisfério animal altamente pigmentado e um hemisfério vegetal transparen-
te. (B) Quando está aproximadamente em 80% de seu caminho na primeira clivagem,
o citoplasma cortical gira cerca de 30 o em relação ao citoplasma interno. Essa rotação é
importante porque a gastrulação irá começar na região oposta ao ponto de entrada do
espermatozóide onde ocorre o maior deslocamento do citoplasma. (Segundo Gerhart
et al., 1989.)
Em rãs como Xenopus, nas quais não se vê um crescente cinzento, podemos assim
mesmo, observar a rotação do citoplasma cortical em relação à camada interna,
subcortical. Esse movimento foi demonstrado por Vincent e seus colaboradores (1986).
Esses investigadores imprimiram uma grade hexagonal de corante (Azul Nilo) sobre o
citoplasma abaixo do córtex enquanto aplicavam outro tipo de corante (uma lectina
ligada à fluoresceína) à superfície do ovo. Quando o ovo foi mantido em sua posição
por inclusão em gelatina, os pontos de Azul Nilo puderam ser vistos rodar de 30° em
relação às manchas da lectina fluorescente (Figura 4.34). Em ovos normais, não inclu-
sos, a superfície do ovo é considerada girar enquanto o citoplasma subcortical, torna-
do pesado pelas plaquetas de gema, permanece estabilizado por gravidade.
O motor para esses movimentos citoplasmáticos em ovos de anfíbios parece ser
um conjunto de microtúbulos paralelos que ficam entre os citoplasmas interno e cortical
do hemisfério vegetal, na direção da rotação citoplasmática. Os rastros dos
microtúbulos são primeiramente vistos imediatamente antes do começo da rotação, e
desaparecem quando esse movimento cessa (Figura 4.35; Elinson e Rowning, 1988).
Tratamento do ovo com colchicina ou radiação ultravioleta interrompe a formação
desses microtúbulos, com isso parando as rotações citoplasmáticas. Usando anticorpos
ligantes desses microtúbulos, Houliston e Elinson (1991a) acharam que esses rastros
eram formados por microtúbulos derivados do espermatozóide e do óvulo, e que o
centríolo espermático direciona sua polimerização, fazendo com que cresçam para o
interior da região vegetal do ovo. Ao atingir o córtex vegetal, esses microtúbulos se
desviam do ponto de entrada do espermatozóide, em direção ao pólo vegetal. A posi-
ção descentralizada do centríolo espermático quando esse inicia a polimerização
microtubular, proporciona direção à rotação. A força motriz para a rotação é possivel-
mente, fornecida pela ATPase cinesina. Tal como a dineína e a miosina, a cinesina
pode fixar-se às fibras e produzir energia pela hidrólise de ATP. Essa ATPase está
localizada nos microtúbulos vegetais e nas membranas do retículo endoplasmático
cortical (Houliston e Elinson, 1991b).
O movimento do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno causa profunda
movimentação nesse último. Danilchik e Denegre 1991) marcaram plaquetas da gema
158 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
(A) (B)
(C) (D)
Figura 4.34
Rotação do citoplasma subcortical relativa ao citoplasma de superfície da célula. (A)
Um ovo recentemente fertilizado foi marcado com uma grade hexagonal de corante
Azul Nilo (que cora os lípidios nas plaquetas de gema). O ovo foi embebido em
gelatina, e as posições originais de alguns dos pontos marcados na superfície celular
com fluoresceína (círculos em A). O ponto de entrada do espermatozóide está marcado
com um S. (B,C) Com o progredir do primeiro ciclo, os pontos do citoplasma
subcortical mudaram de aproximadamente 30 o em relação à superfície externa imobili-
zada do ovo. O local no ovo designando a futura superfície dorsal do embrião está
marcado com um D. (D) Sumário desses movimentos na região vegetal (inferior) do
ovo. (de Vincent et al., 1986, fotografias cortesia de J. C. Gerhart.)
com Azul Nilo e observaram seu movimento por microscopia fluorescente (o corante
ligado emite fluorescência vermelha). Durante a parte intermediária do primeiro ciclo
celular, a massa do citoplasma central do ovo flui do presumível lado ventral (abdome),
para o futuro lado dorsal (posterior) do embrião (Prancha 7). Ao fim da primeira divi-
são, o citoplasma presumivelmente do lado dorsal do embrião, é distintamente diferen-
te daquele do provável lado ventral. O que havia sido um embrião radialmente simétri-
co, é agora um embrião bilateralmente simétrico.
Como veremos nos Capítulos 6 e 15, esses movimentos citoplasmáticos iniciam
uma cascata de eventos que determina o eixo dorso-ventral da rã. Realmente, os
microtúbulos paralelos que permitem esses rearranjos parecem estender-se ao longo
do futuro eixo dorso-ventral (Klag e Ubbels, 1975; Gerhart et al., 1983).
Figura 4.35
Arranjo paralelo de microtúbulos se esten-
dem ao longo do hemisfério vegetal, ao longo
do futuro eixo dorso-ventral. (A) Arranjo pa-
ralelo de microtúbulos vistos na segunda par-
te do primeiro ciclo celular por anticorpos
fluorescente à tubulina. (B) Antes da rotação
citoplasmática (cerca de metade do ciclo) ne-
nhum arranjo pode ser visto. (C) No término
da rotação do citoplasma, os microtúbulos
despolimerizam. (de Elinson e Rowning,
(B) 1988, cortesia de R. Elinson.)
(A) (C)
LITERATURA CITADA
Abassi, Y. A. and Foltz, K. R. 1994. Tyrosine Amos, L. A. and Klug, A. 1974. Arrangement Asai, D. J. 1996. Functional and molecular
phosphorylation of the sperm receptor at ferti- of subunits in flagellar microtubules. J. Cell diversity of dynein heavy chains. Semin. Cell
lization. Dev. Biol. 164: 430-443. Sci. 14: 523-549. Dev. Biol. 7: 311-320.
Afzelius, B. A. 1976. A human syndrome caused Ancel, P. and Vintenberger, P. 1948. Re- Austin, C. R. 1952. The “capacitation” of
by immotile cilia. Science 193: 3173-19. cherches sur le determinisme de la mammalian sperm. Nature 170: 326.
symmetrie bilatérale dans l’oeuf des
Almeida, E. A. C. and ten others. 1995. Mouse Austin, C. R. 1960. Capacitation and the
amphibiens. Bull. Biol. Fr. Belg. [Suppl.]
egg integrin a α P β functions as a sperm recep- release of hyaluronidase. J. Reprod. Fert. 1:
31: 1-182.
tor. Cell 81: 1095-1104. 310-311.
160 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Austin, C. R. 1965. Fertilization. PrenticeHall, 1992. A potential fusion peptidle and an integrin Ciapa, B. and Whitaker, M. 1986. Two
Englewood Cliffs, New Jersey. domain in a protein active in spermegg fusion. phases of inositol polyphosphate and
Nature 356: 248-251. diacylglycerol production at fertilization.
Ayabe, T., Kopf, G. S. and Schultz, R. M. 1995. FEBS Lett. 195: 347-351.
Regulation of mouse egg activation: presence Bogart, J. P., Elinson, R. P. and Licht, L. E.
of ryanodine receptors and effects of microin- 1989. Temperature and sperm incorporation in Clermont, Y. and Leblond, C. P. 1955. Spermi-
jected ryanodine and cyclic ADP ribose on polyploid salamanders. Science 246: 1032-1034. ogenesis of man, monkey, and other animals as
uninseminated and inseminated eggs. Develop- shown by the “periodic acidSchiff” technique.
ment 121: 2233-2244. Bookbinder, L. H., Cheng, A., and Bleil, J. D. Am. J. Anat. 96: 229-253.
1995. Tissue- and species-specific expression
Baltz, J. M., Katz, D. F. and Cone, R. A. 1988. of sp56, a mouse sperm fertilization protein. Colwin, A. L. and Colwin, L. H. 1963. Role of
The mechanics of sperm-egg interaction at the Science 269: 86-87. the gamete membranes in fertilization in
zona pellucida. Biophys. J. 54: 643-654. Saccoglossus kowalevskii (Enteropneustra). I.
Boveri, T. 1902. On multipolar mitosis as a means The acrosome reaction and its changes in early
Barlow, D. P., Stöger, R., Herrmann, B. G., Saito, of analysis of the cell nucleus. (Translated by S. stages of fertilization. J. Cell Biol. 19: 477-500.
K. and Schweifer, N. 1991. The mouse insulin- Gluecksohn-Waelsch.) In B. H. Willier and J. M.
like growth factor type-2 receptor is imprinted Oppenheimer (eds.), Foundations of Experimen- Colwin, L. H. and Colwin, A. L. 1960. Formation of
and closely linked to the Time locus. Nature tal Embryology. Hafner, New York, 1974. sperm entry holes in the vitelline membrane of
349: 84-87. Hydroides hexagonis (Annelida) and evidence of their
Boveri, T. 1907. Zellenstudien VI. Die Entwi- lytic origin. J. Biophys. Biochem. Cytol. 7: 315-320.
Bavister, B. D. 1980. Recent progress in the cklung dispermer Seeigeleier. Ein Beiträge zur
study of early events in mammalian fertilizati- Befruchtungslehre und zur Theorie des Kernes. Conklin, E. G. 1905. The orientation and cell-
on. Dev. Growth Differ. 22: 385-402. Jena Z. Naturwiss. 43: 1-292. lineage of the ascidian egg. J. Acad. Nat. Sci.
Phila. 13: 5-119.
Bentley, J. K., Shimomura, H. and Garbers, D. L. Braden, A. W. H. and Austin, C. R. 1954. The
1986. Retention of a functional resact receptor number of sperm about the eggs in mammals Cook, S. P. and Babcock, D. F. 1993. Selective
in isolated sperm plasma membranes. Cell 45: modulation by cGMP of the K+ channel activated
and its significance for normal fertilization. Aust.
281-288. by speract. J. Biol. Chem. 268: 22402-22407.
J. Biol. Sci. 7: 543-551.
Berridge, M. J. 1993. Inositol triphosphate and Corselli, J. and Talbot, P. 1987. In vivo
Burks, D. J., Carballacla, R., Moore, H. D. M.
calcium signalling. Nature 361: 315-325. penetration of hamster oocyte-cumulus com-
and Saling, P. M. 1995. Interaction of a tyrosine
plexes using physiological numbers of sperm.
Bestor, T. M. and Schatten, G. 1981. Antitubulin kinase from human sperm with the zona pellucida
Dev. Biol. 122: 227-242.
immunofluorescence microscopy of microtubu- at fertilization. Science 269: 83-86.
les present during the pronuclear movements of Cross, N. L. and Elinson, R. P. C. 1980. A fast
Busa, W. B., Ferguson, J. E., Joseph, S. K.,
sea urchin fertilization. Dev. Biol. 88: 80-91. block to polyspermy in frogs mediated by
Williamson, J. R. and Nuccitelli, R. 1985. changes in the membrane potential. Dev. Biol.
Bi, G.-Q., Alderton, J.M. and Steinhardt, R.A. 1995. Activation of frog (Xenopus laevis) eggs by 75:187-198.
Calcium-mediated exocytosis is required for cell inositol triphosphate. I. Characterization of Ca2+
membrane resealing. J. Cell Biol. 131:1747-1758. release from intracellular stores. J. Cell Biol. Dan, J. C. 1967. Acrosome reaction and lysins. In
100: 677-682. C. B. Metz and A. Monroy (eds.), Fertilization,
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1980. Vol. 1. Academic Press, New York, pp. 237-367.
Mammalian sperm and egg interaction: Identi- Calvin, H. I. and Bedford, J. M. 1971. Formati-
fication of a glycoprotein in mouseegg zonae on of disulfide bonds in the nucleus and accessory Danilchik, M. V. and Denegre, J. M. 1991. Deep
pellucidae possessing receptor activity for sperm. structures of mammalian spermatozoa during cytoplasmic rearrangements during early deve-
Cell 20: 873-882. maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. lopment in Xenopus laevis, Development Ill:
[Suppl.] 13: 65-75. 845-856.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1986.
Autoradiographic visualization of the mouse Carroll, E. J. and Epel, D. 1975. Isolation and Davis, B. K. 1981. Timing of fertilization in
egg’s sperm receptor bound to sperm. J. Cell biological activity of the proteases released by mammals: Sperm cholesterol/ phospholipid ratio
Biol. 102:1363-1371. sea urchin eggs following fertilization. Dev. Biol. as determinant of capacitation interval. Proc.
44: 22-32. Nall. Acad. Sci. USA 78: 7560-7564.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1988.
Galactose at the nonreducing terminus of O- Chambers, E. L., Pressman, B. C. and Rose, B. Dawid, I. B. and Blackler, A. W. 1972. Maternal
1974. The activity of sea urchin eggs by the and cytoplasmic inheritance of mitochondria in
linked oligosaccharides of mouse egg zona
divalent ionophores A23187 and X 537A. Xenopus. Dev. Biol. 29: 152-161.
pellucida glycoprotein ZP3 is essential for the
glycoprotein’s sperm receptor activity. Proc. Biochem. Biophys. Res. Commun. 60: 126-132. DeChiara, T. M., Robertson, E. J. and Efstradiatis,
Natl. Acad. Sci. USA 85: 6778-6782. A. 1991. Parental imprinting of the mouse insulin-
Chandler, D. E. and Heuser, J. 1979. Membrane
fusion during secretion: Cortical granule exocytosis like growth factor II gene. Cell 64: 849-859.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1990. Identi-
fication of a ZP3-binding protein on acrosome- in sea urchin eggs as studied by quick-freezing and De Robertis, E. D. P., Saez, F. A. and De Robertis,
intact mouse sperm by photoaffinity crosslin- freeze fracture. J. Cell Biol. 83: 91-108. E. M. F. 1975. Cell Biology, 6th Ed., Saunders,
king. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5563-5567. Philadelphia.
Chang, M. C. 1951. Fertilizing capacity of
Bleil, J. D., Greve, J. M. and Wassarman, P, M. spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Dube, F., Schmidt, T., Johnson, C. H. and Epel,
1988. Identification of a secondary sperm re- Nature 168: 697-698. D. 1985. The hierarchy of requirements for an
ceptor in the mouse egg zona pellucida: Role in elevated pH during early development of sea
Cherr, G. N., Lambert, H., Meizel, S. and Katz,
maintenance of binding of acrosome-reacted urchin embryos. Cell 40: 657-666.
D. F. 1986. In vitro studies of the golden hamster
sperm to eggs. Dev. Biol. 28: 376-385.
sperm acrosomal reaction: Completion on zona Eisen, A . and Reynolds, G. T. 1985. Sources and
Blobel, C. P, Wolfsberg, T. G., Turck, C. W., pellucida and induction by homologous zonae sinks for the calcium release during fertilization of
Myles, D. G., Primakoff, P. and White, J. M. pellucidae. Dev. Biol. 114:119-131. single sea urchin eggs. J. Cell Biol. 100: 1522-1527.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 161
Eisenbach, M. 1995. Sperm changes enabling Fol, H. 1877. Sur le commencement de I’hémo- Glabe, C. G. 1985. Interaction of the sperm
fertilization in mammals. Curr. Opin. Endocri- génie chez divers animaux. Arch. Zool. Exp. Gén. adhesive protein, bindin, with phospholipid
nol. Diabetes 2: 468-475. 6: 145-169. vesicles. II. Bindin induces the fusion of mixed-
phase vesicles that contain phosphatidylcholine
Elinson, R. P. 1985. Changes in levels of Foltz, K. R., Partin, J. S. and Lennarz, W. J.
and phosphatidylserine in vitro. J. Cell Biol.
polymeric tubulin associated with activation and 1993. Sea urchin egg receptor for sperim:
100: 800-806.
dorsoventral polarization of the frog egg. Dev. Sequence similarity of binding domain to hsp70.
Biol. 109: 224-233. Science 259: 1421-1425. Glabe, C. G. and Lennarz, W. J. 1979. Species-
specific sperm adhesion in sea urchins: A
Elinson, R. P. 1986. Fertilization in amphibians: Franklin, L. E. 1970. Fertilization and the role
quantitative investigation of bindin-mediated egg
The ancestry of the block to polyspermy. Int. of the acrosomal reaction in non-mammals.
agglutination. J. Cell Biol. 83: 595-604.
Rev. Cytol. 101: 59-100. Biol. Reprod. [Suppl.] 2:159-176.
Glabe, C. G. and Vacquier, V. D. 1977. Species-
Elinson, R. P. and Rowning, B. 1988. A transient Fulton, B. P. and Whittingham, D. G. 1978.
specific agglutination of eggs by bindin isolated
array of parallel microtubules in frog eggs: Activation of mammalian oocytes by intracellu-
from sea urchin sperm. Nature 267: 836-838.
Potential tracks for a cytoplasmic rotation that lar injection of calcium. Nature 273: 149-151.
specifies the dorso-ventral axis. Dev. Biol. Glabe, C. G. and Vacquier, V. D. 1978. Egg
Furuichi, T., Yoshikawa, S., Miyawaki, A., Wada,
128:185-197. K., Maeda, N. and Mikoshiba, K. 1989. Primary surface glycoprotein receptor for sea urchin
structure and functional expression of the sperm bindin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Endo, Y. G., Kopf, G. S. and Schultz, R. M.
inositol 1,4,5-trisphosphatebinding protein 75: 881-885.
1987. Effects of phorbol ester on mouse eggs:
Dissociation of sperm receptor activity from P400. Nature 342: 32-38. Gong, X., Dubois, D.H., Miller, D. J., and Shur, B.
acrosome reaction-inducing activity of the Garbers, D. L., Tubb, D. J. and Kopf, G. S. 1980. D. 1995. Activation of a G protein complex by
mouse zona pellucida protein, ZP3. Dev. Biol Regulation of sea urchin sperm cAMP-dependent aggregation of β -1,4-galactosyltransferase on the
123: 574-577 protein kinases by an egg associated factor. Biol. surface of sperm. Science 269: 1718-1721.
Epel, D. 1977. The program of fertilization. Reprod. 22: 526-532. González-Martfnez, M. T., Guerrero, A.,
Sci. Am. 237(5): 128-138. Garbers, D. L., Kopf, G. S., Tubb, D, J, and Olson, Morales, E., de la Torre, L. and Darszon, A.
G. 1983. Elevation of sperm adenosine 3':5'- 1992. A depolarization can trigger Ca2+ uptake
Epel, D. 1980. Fertilization. Endeavour N.S. 4: and the acrosome reaction when preceded by a
26-31. monophosphate concentrations by a fucose
sulfate-rich complex associated with eggs. I. hyperpolarization in L. pictus sea urchin sperm.
Epel, D., Patton, C., Wallace, R. W. and Cheung, Structural characterization. Biol. Reprod. 29: Dev. Biol. 150: 193-202.
W. Y. 1981. Calmodulin activates NAD kinase 1211-1220. Gould, M. and Stephano, J. L. 1987. Electrical
of sea urchin eggs: An early response. Cell 23: response of eggs to acrosomal protein similar to
543-549. Gardiner, D. M. and Grey, R. D. 1983. Membrane
junctions in Xenopus eggs: Their distribution those induced by sperm. Science 235: 1654-1656.
Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S. and suggests a role in calcium regulation. J. Cell Biol. Gould, M. and Stephano, J. L. 1991. Peptides
Snyder, S. H. 1989. Purified inositol 1,4,5- 96: 1159-1163. from sperm acrosomal protein that activate de-
trisphosphate receptor mediates calcium flux in velopment. Dev. Biol. 146: 509-518.
reconstituted lipid vesicles. Nature 342: 87-89. Gerhart, J., Ubbels, G., Black, S., Hara, K. and
Kirschner, M. 1981. A reinvestigation of the Gould-Somero, M., Jaffe, L. A. and Holland, L.
Florman, H. M. 1995. Sequential focal and glo- role of the grey crescent in axis formation in Z. 1979. Electrically mediated fast polyspermy
bal elevations of sperm intracellular Ca2+ are Xenopus laevis. Nature 292: 511-516. block in eggs of the marine worm, Urechis
initiated by the zona pellucida during acrosomal caupo. J. Cell Biol. 82: 426-440.
exocytosis. Dev. Biol. 165: 152-164. Gerhart, J., Black, S., Gimlich, R. and Scharf, S.
1983. Control of polarity in the amphibian egg. Green, G. R. and Poccia, E. L. 1985. Phos-
Florman, H. M. and Storey, B. T. 1982. Mouse In W. R. Jeffery and R. A. Raft (eds.), Time, phorylation of sea urchin sperm H1 and H2B
gamete interactions: The zona pellucida is the Space, and Pattern in Embryonic Development. histories precedes chromatin decondensation
site of the acrosome reaction leading to fertili- Alan R. Liss, New York, pp. 261-286. and H1 exchange during pronuclear formation.
zation in vitro. Dev. Biol. 91:121-130. Dev. Biol. 108: 235-245.
Gerhart, J., Danilchik, M., Doniach, T.,
Florman, H. M. and Wassarman, P. M. 1985. Roberts, S., Rowning, B. and Stewart, R. 1989. Gross, P. R., Malkin, L. I., and Moyer, W. 1964.
O-linked oligosaccharides of mouse egg ZP3 Cortical rotation of the Xenopus egg: Conse- Templates for the first proteins of embryonic
account for its sperm receptor activity. Cell quences for the anterioposterior pattern of development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51:
41: 313-324. embryonic dorsal development. Development 407-414.
1989 [Suppl.]: 37-51.
Florman, H. M., Bechtol, K. B. and Wassarman, Gundersen, G. G., Medill, L. and Shapiro, B. M.
P. M. 1984. Enzymatic dissection of the Giles, R. E., Blanc, H., Cann, H. M. and Wallace, 1986. Sperm surface proteins are incorporated
functions of the mouse egg’s receptor for sperm. D. C. 1980. Maternal inheritance of human into the egg membrane and cytoplasm after fer-
Dev. Biol. 106: 243-255. mitochondrial DNA. Proc. Natl, Acad. Sci. USA tilization. Dev. Biol. 113: 207-217.
77: 6715-6719.
Florman, H, M., Corron, M. E., Kim, T. D. H. Gwatkin, R. B. L. 1976. Fertilization. In G.
and Babcock, D. F. 1992. Activation of voltage- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. G. and Poste and G. L. Nicolson (eds.), The Cell
dependent calcium channels of mammalian Reynolds, G. T. 1978. A free calcium wave Surface in Animal Embryogenesis and
sperm is required for zona pellucida-induced traverses the activating egg of the medaka, Deveopment. Elsevier North-Holland, New
acrosomal exocytosis. Dev. Biol. 152: 304-314. Oryzias latipes. J. Cell Biol. 76: 448-466. York, pp. 1-53.
Foerder, C. A. and Shapiro, B. M. 1977. Release Ginzburg, A. S. 1985. Phylogenetic changes in Gyllensten, U., Wharton, D., Josefson, A.
of ovoperoxiclase from sea urchin eggs hardens the type of fertilization. In J. Mlékovsky and V. and Wilson, A. 1991. Paternal inheritance
fertilization membrane with tyrosine crosslinks. J. A. Novák (eds.), Evolution and Morphogene- of mitochondrial DNA in mice. Nature 352:
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4214-4218. sis. Academia, Prague, pp. 459-466. 255-258.
162 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. Jacobs, P. A., Wilson, C. M., Sprenkle, J. A., Kvist, U., Afzelius, B. A. and Nilsson, L. 1980.
B., Kramp, D. and Schatten, G. 1988. Wave of Rosenshein, N. B. and Migeon, B. R. 1980. The intrinsic mechanism of chromatin decon-
free calcium at fertilization in the sea urchin egg Mechanism of origin of complete hydatidiform densation and its activation in human sperma-
visualized with Fura-2. Cell Motil. Cytoskel. 9: moles. Nature 286: 714-716. tozoa. Dev. Growth Differ. 22: 543-554.
271-277.
Jaffe, L. A. 1976. Fast block to polyspermy Langlais, J., Kan, F. W. K., Granger, L.,
Hall, C. G., Sancho, J., and Terhorst, C. 1993. in sea urchins is electrically mediated. Nature Raymond, L., Bleau, G. and Roberts, K. D.
Reconstitution of T cell receptor ζ -mediated 261: 68-71. 1988. Identification of sterol acceptors that
calcium mobilization in nonlymphoid cells. stimulate cholesterol efflux from human
Jaffe, L. A. 1980. Electrical polyspermy block
Science 261: 915-918. spermatozoa during in vitro capacitation.
in sea urchins: Nicotine and low sodium
Gamete Res, 20: 185-201.
Hamaguchi, M. S. and Hiramoto, Y. 1980. Fertili- experiments. Dev. Growth Differ. 22: 503-507.
zation process in the heart-urchin, Clypaester Lechleiter, J. D. and Clapham, D. E. 1992. Molecular
Jaffe, L. A. 1996. Egg membranes during fertili-
japonicus, observed with a differential interferen- mechanisms of intracellular calcium excitability in
zation. In S. G. Schultz et al. (eds.), Molecular
ce microscope. Dev. Growth Differ. 22: 517-530. X. laevis oocytes. Cell 69: 283-294.
Biology of Membrane Transport Disorders.
Hamaguchi, M. S. and Hiramoto, Y. 1981. Plenum, NY, pp. 367-378. Leeuwenhoek, A. van. 1685. Letter to the Royal
Activation of sea urchin eggs by microinjection Society of London. Quoted in E. G. Ruestow,
Jaffe, L. A. and Cross, N. L. 1983. Electrical
of calcium buffers. Exp. Cell Res, 134: 171-179. 1983, Images and ideas: Leeuwenhoek’s
properties of vertebrate oocyte membranes. Biol.
perception of the spermatozoa. J. Hist. Biol.
Hardy, D. M., Harumi, T. and Garbers, D. L. Reprod. 30: 50-54.
16:185-224.
1994. Sea urchin sperm receptors for egg
Jaffe, L. A. and Gould, M. 1985. Polyspermy-
peptides. Sem. Dev. Biol. 5: 217-224. Levine, A. E., Walsh, K. A. and Fodor, E. J. B.
preventing mechanisms. Biol. Fert. 3: 223-250.
1978. Evidence of an acrosin-like enzyme in
Hartsoeker, N. 1694. Essai de dioptrique. Paris.
Jaffe, L. F. 1983. Sources of calcium in egg sea urchin sperm. Dev. Biol. 63: 299-306.
Heinecke, J. W. and Shapiro, B. M. 1989. activation: A review and hypothesis. Dev, Biol.
Leyton, L. and Saling, P. 1989a. 95 kd sperm
Respiratory oxygen burst of fertilization. Proc. 99: 265-276.
proteins bind ZP3 and serve as tyrosine kinase
Natl. Acad. Sci. USA 86: 1259-1263.
Jones, R., Brown, C. R. and Lancaster, R. T. substrates in response to zona binding. Cell 57:
Hertwig, 0. 1877. Beiträge zur Kenntniss der 1988. Carbohydrate-binding properties o boar 1123-1130.
Bildung, Befruchtung, und Theilung des sperm proacrosin and assessment of its role in
Leyton, L. and Saling, P. 1989b. Evidence that
theirischen Eies. Morphol. Jahr. 1: 347-452. sperm-egg recognition and adhesion during fer-
aggregation of mouse sperm receptors by ZP3
tilization. Development 102: 781-792.
Hollinger, T. G. and Schuetz, A. W. 1976. triggers the acrosome reaction. J. Cell Biol. 108:
“Cleavage” and cortical granule breakdown in Just, E. E. 1919. The fertilization reaction in 2163-2168.
Rana pipiens oocytes induced by direct micro- Echinarachinus parma. Biol. Bull. 36: 1-10.
Leyton, L., Leguen, P., Bunch, D. and Saling, P.
injection of calcium. J. Cell Biol. 71: 395-401.
Kaufman, M. H., Barton, S.C. and Surani, M. A. M. 1992. Regulation of mouse gametic interac-
Hong, K. and Vacquier, V. D. 1986. Fusion of H. 1977. Normal postimplantation development tion by a sperm tyrosine kinase. Proc. Natl. Acad.
liposomes induced by a cationic protein from of mouse parthenogenetic embryos to the Sci. USA 93: 1164-1169.
the acrosomal granule of abalone spermatozoa. forelimb bud stage. Nature 265: 53-55.
Longo, F. J. 1986. Surface changes at fertilizati-
Biochemistry 25: 543-549.
Keller, S. H. and Vacquier, V. D. 1994a. Nlinked on: Integration of sea urchin (Arbacia punctu-
Houliston, E. and Elinson, R. P. 1991a. Patterns oligosaccharides of sea urchin egg jelly induces lata) sperm and oocyte plasma membranes. Dev.
of microtubule polymerization relating to the sperm acrosome reaction. Dev. Growth Biol. 116: 143-159.
cortical rotation in Xenopus laevis eggs. Deve- Differ. 36: 551-556.
Longo, F. J. and Kunkle, M. 1978. Transforma-
lopment 112:107-117.
Keller, S. H. and Vacquier, V. D. 1994b. The tion of sperm nuclei upon insemination. In A.
Houliston, E. and Elinson, R. P. 1991b. isolation of acrosome-reaction-inducing A. Moscona and A. Monroy (eds.), Current Topics
Evidence for the involvement of microtubu- glycoproteins from sea urchin egg jelly. Dev. in Developmental Biology, Vol. 12. Academic
les, endoplasmic reticulum, and kinesin in Biol. 162: 304-312. Press, New York, pp. 149-184.
cortical rotation of fertilized frog eggs. J. Cell
Klag, J. J. and Ubbels, G. A. 1975. Regional Longo, F. J., Lynn, J. W., McCulloh, D. H. and
Biol. 114: 1017-1028.
morphological and cytochemical differentiati- Chambers, E. L. 1986. Correlative ultrastructural
Humphreys, T. 1971. Measurements of mes- on of the fertilized egg of Discoglossus pictus and electrophysiological studies of sperm-egg
senger RNA entering polysomes upon fertiliza- (Anura). Differentiation 3: 15-20. interactions of the sea urchin Lytechinus
tion in sea urchins. Dev. Biol. 26: 201-208. variegatus. Dev. Biol. 118: 155-166.
Kline, D. 1988. Calcium-dependent events
Hunter, R. H. F. 1989. Ovarian programming at fertilization of the frog egg: Injection of Lopez, L. C., Bayna, E. M., Litoff, D., Shaper,
of gamete progression and maturation in the a calcium buffer blocks ion channel opening, N. L., Shaper, J. H. and Shur, B. D. 1985. Recep-
female genital tract. Zool. J. Linn. Soc. 95: exocytosis, and formation of pronuclei. Dev. tor function of mouse sperm surface galactosyl-
117-124. Biol. 126: 346-361. transferase during fertilization. I. Cell Biol. 101:
1501-1510.
Hylander, B. L. and Summers, R. G. 1982. An Kline, D., Simoncini, L., Mandel, G., Maue, R., Kado,
ultrastructural and immunocytochemical locali- R. T. and Jaffe. L. A. 1988. Fertilization events Luttmer, S. and Longo, F. J. 1985. Ultrastructural
zation of hyaline in the sea urchin egg. Dev. induced by neurotransmitters after injection of and morphometric observations of cortical
Biol. 93: 368-380. mRNA into Xenopus eggs. Science 241: 464-467. endoplasmic reticulum in Arbacia, Spisula, and
mouse eggs. Dev. Growth Differ. 27: 349-359.
Iwao, Y. and Jaffe, L. A. 1989. Evidence that Kline, D, Kopf, G., Muncy, L. F. and Jaffe, L. A.
the voltage-dependent component in the ferti- 1991. Evidence for the involvement of a pertussis Manes, M.E. and Elinson, R.P. 1980. Ultraviolet
lization porcess is contributed by the sperm. Dev. toxin-insensitive G-protem in egg activation of light inhibits gray crescent formation in the frog
Biol. 134: 446-451. the frog Xenopus laevis. Dev. Biol. 143: 218-229. egg. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 189: 73-76.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 163
Manes, M. E., Elinson, R. P. and Barbieri, F. D. pellucida glycoprotein ZP2 following activation Poirier, G. R. and Jackson, J. 1981. Isolation
1978. Formation of the amphibian gray crescent: of mouse eggs. Dev. Biol. 132: 103-112. and characterization of two proteinase inhibitors
Effects of colchicine and cytochalasin-B. from the male reproductive tract of mice.
Moore, G. D., Kopf, G. S. and Schultz, R M. 1993. Gamete Res. 4: 555-569.
Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 185: 99-104.
Complete mouse egg activation in the absence of
McCulloh, D. H. and Chambers, E. L. 1992. sperm by stimulation of an exogenous G protein- Porter, D. C. and Vacquier, V. D. 1986. Phos-
Fusion of membranes during fertilization. J. Gen. coupled receptor. Dev. Biol. 159: 669-678. phorylation of sperm histone HI is induced by
Physiol. 99:137-175. the egg jelly layer in the sea urchin Strongylo-
Moore, G. D., Ayabe, T., Visconti, P. E., Schultz, centrotus purpuratus. Dev. Biol. 116: 203-212.
McGrath, J. and Solter, D. 1984. Completion of