Historia de la Qumica

Histoqumica
A. Ulises Acua, Jos Elguero
Resumen: La qumica de colorantes contribuy al avance de reas cientficas muy diversas, entre ellas la histologa. El histlogo utiliza una
larga serie de colorantes para obtener imgenes de la morfologa de tejidos biolgicos y anatoma celular, mediante microscopa ptica. El
estudio microscpico de los componentes y reacciones qumicas que caracterizan los tejidos biolgicos constituye la histoqumica, y se basa,
asimismo, en la utilizacin de colorantes muy especficos. En Espaa, Santiago Ramn y Cajal destac no solamente por sus investigaciones
sobre el sistema nervioso, sino tambin como un gran innovador de la neurohistologa, ciencia que encontr brillantes continuadores en nuestro
pas en el siglo pasado.
Palabras clave: Histologa, histoqumica, colorantes, Ramn y Cajal, microscopa.
Abstract: Dye chemistry facilitated important advances in several scientific areas, as is the case of histology. In this field dyes are used to
record images of biological tissues and cell anatomy under the light microscope. Besides that, the related science of Histochemistry addresses
the understanding of the chemical composition and reaction mechanisms taking place in biological tissues. In Spain Santiago Ramn y Cajal,
well known by his crucial contributions to the current knowledge of the nervous system, was also a leading innovator of staining methods for
neurohistology, inaugurating a tradition of noted Spanish histochemists.
Keywords: Histology, histochemistry, dyes, Ramn y Cajal, microscopy.

Introduccin
Todos los qumicos conocen la importancia que tuvieron
los colorantes en el desarrollo de su disciplina,1,2 aunque
tambin saben que actualmente es un rea de la qumica relativamente poco frecuentada.
Hay, sin embargo, una parte de la ciencia de los colorantes
que ha jugado un papel histrico en otra especialidad: la histologa. El histlogo estudia, en primer lugar, la estructura microscpica de tejidos, clulas y orgnulos celulares paradescribir
su morfologa y posible funcin. Adems, le interesa llevar esta
descripcin a nivel molecular, y llegar a conocer con resolucin
espacial la composicin y reactividad qumicas (histoqumica)
del sistema biolgico. Para obtener imgenes de composicin
qumica o de actividad metablica in situ, manteniendo clula y
tejido intactos, utiliza fundamentalmente la microscopa ptica.
El microcopio ptico de transmisin se perfeccion considera-

blemente en Alemania a finales del sigloXIX, gracias al trabajo

conjunto de Carl Zeiss, de su responsable de investigacin
Ernst Abbe y de Otto Schott, que consigui desarrollar los nuevos tipos de vidrio que requeran los objetivos calculados por
Abbe. En este tipo de microscopa, las muestras de tejidos o las
clulas individuales tienen espesores pequeos (0,02-10 nm),
por lo que los cambiosde intensidad debidos a la absorcin
de luz por las diferentes partes de su estructura no alcanzan el
10-20% necesario para que el ojo humano pueda identificar
imgenes correctamente.3 Para aumentar el contraste se recurri muy pronto a aprovechar la extraordinaria sensibilidad del
ojo a diferentes longitudesde onda (colores), mediante tcnicas
de tincin de clulas y deorgnulos celulares. As, por ejemplo,
se utiliz la mauvena en preparaciones histolgicas poco tiempo despus de su descubrimiento por Perkin.2 En la mayora de
los casos se buscaba que la tincin fuera muy especfica4 y, por
supuesto, que no alterase la delicada estructura del sistema biolgico.5,6 En la historia de la ciencia, pero an ms en la historia
de la ciencia espaola, la figura de Santiago Ramn y Cajal est
indisolublemente unida a los mtodos de tincin de tejidos, a la
histologa y a lo que hoy se conoce como histoqumica.

Colorantes histolgicos y qumica mdica

A. Ulises Acua1

J. Elguero2

1 Instituto

Qumica-Fsica Rocasolano, Consejo Superior

de Investigaciones Cientficas, 28006 Madrid.
C-e: roculises@iqfr.csic.es
2 Instituto de Qumica Mdica, Consejo Superior
de Investigaciones Cientficas, 28006 Madrid.
C-e: iqmbe17@iqm.csic.es
Recibido: 20/06/2011. Aceptado: 03/09/2011.

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Paul Erhlich (1854-1915, Premio Nobel de Medicina en

1908) realiz su investigacin de doctorado sobre la teora y
prctica de la tincin histolgica (Beitrge zur Theorie und
Praxis der histologischen Frbung, Facultad de Medicina
de Leipzig, 1878). A l se debe la demostracin de la existencia de la barrera hematoenceflica al colorear con anilina la
sangre de un ratn y observar que el cerebro del animal no se
tea. Una de sus mayores innovaciones consisti en el uso de
diferentes colorantes (azules de metileno y de indofenol) para
la tincin selectiva de diferentes tipos de clulas. Erlich clasificaba como basfilas, acidfilas y neutrfilas aquellas clulas que se coloreaban especficamente con colorantes bsicos,
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Histoqumica

cidos o neutros, respectivamente, explicando dicha especificidad mediante la presencia de los correspondientes grupos
ionizables. Tambin fueron importantes sus aportaciones al
campo de la quimioterapia, que incluyen el descubrimiento
del 606 (por ser fruto de 606 experimentos), en 1901, de la
bala mgica o Salvarsn (arsfenamina), una preparacin de
arsnico orgnico empleada en el tratamiento de la sfilis y
de la fiebre recurrente, y del Neosalvarsn (neoarsfenamina).
El neosalvarsn fue conocido durante mucho tiempo como
(Ehrlich 914) por tratarse del compuesto n 914 preparado
por Ehrlich y su ayudante para combatir dichas enfermedades.
Gerhard Domagk (1895-1964, Premio Nobel de Medicina
1939), trabaj en los laboratorios de microbiologa de
IGFarben en el uso de los colorantes como antibiticos,
siguiendo las pautas marcadas por Ehrlich. Encontr que
la sulfonamida prontosil (un colorante rojo, prontosil
rubrum, en realidad un profrmaco) era efectiva contra
las infecciones causadas por estreptococos. Experiment el
producto en su propia hija, afectada de una grave septicemia
que haba contrado al pincharse con una aguja, logrando
una curacin espectacular. Domagk obtuvo el premio Nobel
por el descubrimiento del prontosil, primer frmaco efectivo contra las infecciones bacterianas. Fue forzado por el
rgimen nacionalsocialista a rehusar el premio, que recibi
finalmente en 1947.
Ehrlich descubri en 1891 que el azul de metileno constitua un tratamiento efectivo contra la malaria,7,8 pero era
ligeramente txico, coloreaba la orina en verde y el blanco de
los ojos en azul. Durante la Segunda Guerra Mundial aquellos
pases que luchaban en el Pacfico, como EE UU y Francia
(Indochina), buscaron disminuir su toxicidad y sus propiedades colorantes reducindolo de fenotiacinio a fenotiacina
(Figura 1). En los laboratorios Rhne-Poulenc se descubri
que las fenotiacinas no posean actividad contra la malaria,
pero eran potentes antihistamnicos. Sucesivas modificaciones (Figura 1) llevaron a la prometazina (Fenergan)y
de sta, con la colaboracin de los mdicos Laborit, Delay
y Deniker, a la clorpromazina (Largactil, Torazina), el
mayor avance jams realizado para el tratamiento de las
enfermedades mentales.9 Simone Courvoisier, la responsable
de farmacologa en los laboratorios Rhne-Poulenc, jug un
papel crucial diseando originales experimentos con animales
de laboratorio para identificar los efectos de la clorpromazina
sobre el sistema nervioso central.
N
N
Me
N
S
Me
Me
N
S
Cl
Me
Cl
IIII Guerra
Guerra Mundial.
Mundial.
Azul
de metileno
metileno
(fenotiacinio):
II Guerra
Mundial.
Azul
de
(fenotiacinio):
tratamiento
de la
la malaria
malaria
(t xico)
Azul de metileno
(fenotiacinio):
tratamiento
de
(txico)
tratamiento de la malaria (t xico)
Me
N
MeMe
N
Me

Me
N
Me Me
N
Me

H
NH
N
Rh ne-Poulenc
Me
Me
Rh
ne-Poulenc
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N Me
reduccin
MeN
N
S
N
Me
Me
reducci n
Me
Me
reducci Fenotiacinas:
n
Fenotiacinas:
a la malaria;
Fenotiacinas:
inactivas inactivas
frente
a lafrente
malaria;
activas
frente
a
la
histamina
inactivas
frente
a
la
malaria;
activas frente a los sntomas de la alergia
activas frente a la histamina

Rhne-Poulenc

Paul Charpentier
Paul Charpentier
director
de qumica
de qumica
Paul Charpentier
de director
Rhne-Poulenc
de
Rh ne-Poulenc
director
de qumica

Me
Me
MeN Me
N
N
Cl
de Rh ne-Poulenc
Me
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Simone
Courvoisier
Me
N
Simone
Courvoisier
S
Simone Courvoisier
N
S
Clorpromacina:
S
Clorpromazina:
"Large
number of
Clorpromacina:
S
Large number
physiological
actions"
"Largeofnumber
of
Prometacina:
Prometazina:
LARGACTIL,
physiological
actions"
potente
antihistamnico
Prometacina:
physiological
actions 1952
potente
antihistamnico
(Torazina)
LARGACTIL, 1952
(Fenergan,
potente antihistamnico
(Fenergan,
1946)1946)
LARGACTIL
1952, Torazina 1954
(Torazina)
(Fenergan, 1946)

Figura 1. Desarrollo de frmacos a partir del azul de metileno.

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115

Cajal y las tcnicas tintoriales en neurohistologa

La tincin de tejido nervioso era un problema difcil, debido, entre otras razones, a la elevada concentracin de lpidos
que impeda el uso de los colorantes polares habituales. Cajal
desarroll varios mtodos originales de tincin especfica10,11
y modific, mejorndolos, algunos de los ya existentes, como
el de Golgi. En 1903 descubri el mtodo del nitrato de plata
reducido,10 que le permiti estudiar la estructura de las neuronas en fases de su desarrollo en las que el mtododeGolgi
no era til. Son dos mtodos complementarios,12 el de
Golgiimpregna la superficie celular, salvo en la modificacin
para teir el aparato de Golgi, y permite estudiar clulas enteras y sus conexiones, mientras que el del nitrato reducido se
usa para estudiar la estructura del citoplasma y ncleo celular
(neurofibrillas, cuerpo de Cajal, etc.).
Probablemente Cajal no hubiese tenido tanto xito si no
hubiesen concurrido dos circunstancias: era un gran dibujante
y un excelente fotgrafo (Figura 2); vea ms all que los
otros histlogos de su tiempo, y donde stos pretendan ver
una red inextricable, un continuo (el reticularismo), influidos por consagrados criterios de escuela, Cajal comprob
laexistencia de neuronas individuales11 (el neuronismo). La
ciencia no es descripcin neutra, es interpretacin de lo observado. Sin sus dotes artsticas, sus colorantes y su independencia de criterio posiblemente Cajal no hubiera alcanzado una
comprensin revolucionaria del sistema nervioso.

a
c

Figura 2 . (a) Preparacin histolgica de Cajal del cerebro de un enfermo con demencia senil en la que utiliza su mtodo del oro-sublimado.13
(b) Microfotografa combinada del ganglio plexiforme de un perro en
la que Cajal, utilizando su mtodo del nitrato de plata reducido, consigue mostrar el recorrido del axn (a) combinando tres microfotografas de otros tantos planos focales. (c) Dibujo de una clula piramidal
de conejo, realizado por Cajal a partir de una preparacin en la que
utiliz su modificacin del mtodo del azul de metileno (reproduccin
autorizada por los herederos de S. Ramn y Cajal).

Partiendo inicialmente de los hallazgos de Camillo Golgi

y de Luis Simarro,14 Cajal mostr una paciencia, una constancia y una obstinacin ejemplares. En una aproximacin
desprovista de todo fundamento racional, que recuerda a
lasde Erhlich y Domagk, prob todo lo que le haban dicho,
todo lo que otros descubrieron, incluidas las tcnicas de Freud
(Figura 3) para el sistema nervioso central,15 todo lo que pudo
imaginar, para mejorar las imgenes de sus cortes neurohistolgicos. As, hasta los ltimos das de su vida.16

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Figura 4. De izquierda a derecha A. Carrato, R. J. Wegmann y R.Martnez, en una de las visitas del histlogo francs a Espaa (1979).

Figura 3. Mtodo de tincin de tejido nervioso desarrollado por

Sigmund Freud.

El conocido inters de Cajal por la fotografa y el avanzado

carcter de sus trabajos en este campo17 nos llevan a preguntarnos si su uso de la plata en fotografa precedi o sigui asu
uso en histologa. Histricamente, el inters de Cajal por la
fotografa fue anterior (1868, 1879) a sus trabajos histolgicos
(1881), pero luego ambos campos se entrecruzan y fertilizan
mutuamente, avanzando en paralelo (su libro La fotografa en
colores es de 1912). As por ejemplo, para su tcnica favorita
de tincin histolgica mediante nitrato de plata, Cajal recomienda la utilizacin de un reductor fotogrfico, el pirogalol.

La histoqumica en el Instituto Cajal

El inters por la investigacin histoqumica renaci en
la segunda mitad del siglo XX en el Instituto Cajal (CSIC)
de la mano del Dr. Ricardo Martnez Rodrguez, Jefe del
Departamento de Neurohistoqumica y Neurobioqumica. El
Dr.Martnez (Ribadavia, Orense, 1925), mdico de la Armada,
se especializ en Histologa bajo la tutela del Dr.A.Carrato,
catedrtico de histologa y anatoma patolgica (Univ. Complutense de Madrid) y Director del Instituto Cajal (1963-1981).
Asimismo, Martnez trabaj con Raymond J. Wegmann,
Director del Institute de Histochimie de las Universidades de
Pars y omnipresente impulsor de la histoqumica y biologa
molecular y celular en Europa y Sudamrica (Figura 4).
Martnez puso a punto, en los laboratorios del Instituto
Cajal, numerosas tcnicas histoqumicas y desarroll mtodos
originales para detectar actividades enzimticas in situ, como
parte de su investigacin sobre neurotransmisores que fue
reconocida con el Premio Ramn y Cajal del CSIC (1967). Para
sistematizar y difundir este extenso conocimiento escribi, a
finales de la dcada de los 70, un tratado de histoqumica de ms
de 1000 pginas, del cual se distribuyeron copias producidas de
manera artesanal.18 A partir de esta obra, Martnez y Gragera
editaron recientemente un enciclopdico compendio de la teora
y prctica de la Histoqumica,5d al que contribuyeron, adems,
Joaqun Plumet, Ricardo Martnez-Murillo y Javier Capilla.
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El lector encontrar aqu mtodos histoqumicos especficos

para la determinacin in situ de diferentes grupos funcionales
orgnicos (aldehdos, cetonas, alcoholes,), de aminocidos,
protenas, lpidos, hidratos de carbono, cidos nucleicos, etc.,
as como de una larga serie de enzimas y de procesos metablicos. En cada captulo se discute el fundamento qumico de
la reaccin de tincin, cuando se conoce, y, a continuacin, se
detalla el correspondiente protocolo de trabajo. Para un qumico
es curioso comprobar que, en la mayora de los casos, el mecanismo de la reaccin responsable de la selectividad del mtodo
histolgico se conoce slo fragmentariamente.

La histoqumica hoy: microscopa

de fluorescencia y nanoscopa
El microscopio ptico de transmisin alcanz, hacia 1900,
el lmite fsico de resolucin lateral (~ 0,2 nm), que viene
dado por la condicin de difraccin de Abbe.19 Los nuevos
instrumentos, como el microscopio confocal de transmisin,20
que mejor la resolucin a lo largo del eje perpendicular al
plano de la muestra, o el de contraste de fases interferencial,
que no requiere la tincin previa del sistema biolgico, no
pueden escapar al lmite de Abbe. La ruptura de la barrera de
difraccin tendra que esperar al desarrollo de la microscopa
de fluorescencia, una tcnica que se inici tempranamente en
Alemania.21 En un microscopio de fluorescencia se incorpora a
la muestra un colorante fluorescente (fluorforo) y se observa
desde el mismo lado del que se excita (epi-iluminacin), como
cuando se observa un objeto opaco; idealmente este instrumento podra proporcionar imgenes con un contraste infinito (luz/
oscuridad). La utilidad de esta tcnica depende de la habilidad
del qumico para obtener fluorforos con las propiedades de
selectividad que requiere el bilogo y que, adems, emitan
eficientemente y sean fotoestables una vez incorporados al
sistema biolgico. Para resolver este arduo problema hoy se
recurre a ingeniosos diseos moleculares,22 anticuerpos, cristales semiconductores o protenas fluorescentes. La disponibilidad de marcadores fluorescentes, unida a la de nuevos lseres,
cmaras digitales y tcnicas de anlisis de imgenes, ha dado
como resultado el moderno microscopio confocal de fluorescencia, que permite obtener imgenes de especmenes vivos y
tejidos de una excelente calidad (Figura 5), con una resolucin
lateral muy prxima al lmite de difraccin.

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Histoqumica

Las tcnicas de imagen basadas en la fluorescencia han

conducido, adems, a la aparicin de la microscopa ptica con
resolucin de nanmetros, es decir, la nanoscopa.23 Entre los
varios mtodos que actualmente se estn desarrollando destacamos aquellos que se basan en la utilizacin de fluorforos
biestables, es decir, que pueden bascular entre un estado
apagado (no fluorescente) y encendido (fluorescente). En estos
mtodos (por ejemplo PALM y STORM, por sus siglas en
ingls), se marca densamente el objeto con molculas del fluorforo que se encuentran inicialmente en el estado apagado.
Mediante un pulso lser de muy baja intensidad se hace pasar
al estado encendido a unas pocas molculas distribuidas al
azar por la superficie del objeto. La tecnologa electroptica
actual permite determinar la posicin de estas molculas nicas, ahora fluorescentes, con una exactitud mejor de 1 nm, por
lo que, repitiendo el proceso un nmero elevado de veces, se
puede reconstruir la imagen del objeto con resolucin lateral
nanomtrica.24 Desgraciadamente, hoy se conocen muy pocas
sustancias fluorescentes con esta propiedad. El gran reto del
(histo)qumico del siglo XXI es el diseo de los nuevos tipos
de molculas fluorescentes que necesita la nanoscopa, con la
bioespecificidad que reclama el bilogo.25
a

Figura 5. Imgenes de microscopa confocal de fluorescencia: a)

Clula de carcinoma de pulmn humano. El sistema de microtbulos (verde, dim. ~ 25 nm) se marc con un anlogo fluorescente del
frmaco antitumoral paclitaxel26 y el ncleo se ti con el colorante
Hoechst 33342.27 Barra 10 nm (imagen cedida por la Dra. I. Barasoan); b) Astrocitos de cerebro de ratn. El citoplasma (verde) y el
ncleo (rojo) se marcaron mediante anticuerpos fluorescentes especficos de protenas que aparecen nicamente en dichas localizaciones.
Barra 20 nm (imagen cedida por el Dr. R. Martnez Murillo).

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Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Miguel A. Freire la Figura 2, as como
su inestimable ayuda y comentarios durante la elaboracin de
este trabajo; y a los Drs. R. Martnez Murillo, A. Toledano,
F. Amat y P. Garca Madrazo su valiosa colaboracin. Los
autores agradecen a los herederos de Santiago Ramn y
Cajal el permiso para la reproduccin de la Figura2. Trabajo
financiado por el Proyecto CTQ2010/16457 del Ministerio de
Ciencia e Innovacin, Espaa.

Bibliografa
1. (a) H. Zollinger, Color Chemistry. Synthesis, Properties, and
Applications of Organic Dyes and Pigments, Third edition,
Wiley-VCH, Verlag Helvetica Chimica Acta, Zrich, 2003.
(b) K.Nassau, The physics and Chemistry of Color, WyleyInterscience, New York, 1983.
2. S. Garfield, Mauve: How One Man Invented a Color That
Changed the World, Faber & Faber Ltd., London, 2001.
3. Para aumentar el contraste se han desarrollado varios mtodos
pticos muy ingeniosos, que transforman diferencias de ndice
de refraccin (fase), polarizacin, etc. en diferencias de intensidad de luz.
4. El teido en microscopa ptica no slo se utiliza para aumentar
el contraste en un tejido, sino para determinar la localizacin
espacial de un tipo especfico de compuestos (lpidos, p. ej.) o
de una actividad enzimtica.
5. Existen numerosos manuales sobre las tcnicas de tincin y los
colorantes ms utilizados en histologa, p. ej. (a) J. Kiernan,
Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice,
Pergamon Press, Elmsford, 1981. (b) E. B. Prophet, B. Mills,
J.B. Arrington, L. H. Sobin, Eds. Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington,
D.C., 1992. (c) Uno de los ms clebres es R. W. Horobin,
J. A. Kierman, Eds. CONNS Biological Stains, 10th Edition,
Biological Stain Comission, Oxford, 2002. (d) R. Martnez
Rodrguez, R. R. Gragera Martnez Eds. Fundamentos tericos
y prcticos de la Histoqumica. Publicaciones del CSIC, 2008.
6. Hay varias revistas cuyo ttulo incluye la palabra Histoqumica, p.
ej.: Biotechnic and Histochemistry, Histochemistry and Cell Biology
y Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Otras, aunque no la
incluyen, publican esencialmente artculos de tipo histoqumico.
7. En 1876, Heinrich Caro (el cientfico responsable de la reaccin
de Caro y el cido de Caro), trabajando en la BASF, prepar
un nuevo colorante, el azul de metileno, a partirde p-aminodimetilanilina. Auguste Bernthsen, un qumico deHeidelberg,
determin su estructura, a peticin de Caro, y denomin fenotiazina al anillo. Siguiendo la teora de la bala mgica de Ehrlich,
Koch us azul de metileno para caracterizar la micobacteria de
la tuberculosis. Ehrlich encontr que el azul de metileno tambin
coloreaba el parsito de la malaria, lo que le llev a ensayarlo
como antipaldico. Tambin descubri que coloreaba las clulas
nerviosas, lo que condujo a Pietro Bodoni en 1899 a usarlo para
tratar desrdenes psicticos (sin xito). Sin el azul de metileno
no hubiera habido antihistamnicos (dos Premios Nobel, Daniel
Bovet y James Black) y sin antihistamnicos no hubiera habido
antipsicticos ni antidepresivos tricclicos.
8. Martnez y Gragera5d mencionan con detalle varias de sus
aplicaciones histolgicas, incluida la determinacin de residuos
bsicos (basofila) en tejidos (p. 375). En 5c se describe el
cambio de color en metanol desde el azul, mabs=656 nm, a incoloro, mabs=330 nm, por reduccin a azul de leucometileno, una
fenotiacina (p. 93), as como sus propiedades como colorante de
tincin celular (pp. 299 y 423).

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A. Ulises Acua et al.

9. (a) J. E. Kristiansen, Dan. Med. Bull. 1989, 36, 178185. (b) W.

Sneader, Drug News & Perspectives 2002, 15, 466471.
10. J. De Felipe, E. G. Jones, Trends in Neurosciences 1992, 15,
237245.
11. T. R. Heinz, Biotechnic & Histochemistry 2005, 80, 211222.
12. Se pueden encontrar excelentes reproducciones de los dibujos
y preparaciones histolgicas de Ramn y Cajal en las publicaciones de Miguel Freire y colaboradores: (a) A. Martnez,
V.G.Marn, S. Ramn y Cajal Junquera, R. Martnez-Murillo,
M. Freire, Nature Rev. Cancer 2005, 5, 904909. (b) V. GarcaMarn, P. Garca-Lpez, M. Freire, Cajals contributions to glia
research, Trends Neurosci. 2007, 30, 479487. (c) V. GarcaMarn, P. Garca-Lpez, M.Freire, J. History Neurosci. 2009,
18, 197210. (d) P. Garca-Lpez, V. Garca-Marn, M. Freire,
Front. Neuroanatomy 4:9. doi 10:3389/neuro 05.009.2010.
13. En este mtodo se utiliza para la tincin una mezcla de cloruros
arico y mercrico, conocido ste en el siglo XIX como sublimado corrosivo.
14. N. Fernndez, C. Breathnach, J. Hist. Neurosci 2001, 10, 1926.
15. K. Mayer, Chlorure dor: propos des tudes chimiques et histochimiques de Sigmund Freud, 1996, 312, 406408. S. Freud,
1884, 7, 8688.
16. J. Elguero, Metodologa de la investigacin: los ejemplos de
Freud y de Cajal, Anexo III (Mtodos de tincin), Real Academia
de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales, Madrid, 2004.
17. M. B. Mrquez, Santiago Ramn y Cajal: mbitos 2004,
139153.
18. R. Martnez Rodrguez, con la colaboracin de A. Toledano Gasca,
R. Martnez Murillo, L. M. Garca-Segura, Histoqumica 1979.

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19. E. Abbe, Arch. Mikroskop. Anat. 1873, 9, 413418.

20. El microscopio confocal de barrido es uno de los grandes
avances de la microscopa ptica. Fue inventado en 1956 en
la Universidad de Harvard (EE UU) por el joven matemtico
M. L. Minsky (Nueva York, 1927), el cual estaba interesado
en mejorar las tcnicas de observacin, precisamente, de las
sinapsis neuronales. Para explotar las grandes posibilidades
de este tipo de microscopio hubo que esperar a los nuevos
lseres, detectores y microprocesadores de la dcada de los
90. Minsky se traslad en 1958 al Massachusetts Institute
of Technology, en donde cre una nueva especialidad cientfica, la inteligencia artificial, por la cual es mundialmente
conocido.
21. O. Heimstadt, Z. Wissens. Mikrosk. 1911, 28, 330.
22. Hay una gran variedad de marcadores fluorescentes disponibles
comercialmente, ver p. ej. Molecular Probes Handbook, 11th
Edit. 2010, Invitrogen Corp. (Carlsbad, EEUU) o Fluorescent
Labels and Dyes Catalog, ATTO-TEC (Siegen, Alemania).
23. S. W. Hell, Science 2007, 316, 11531158.
24. G. Patterson, M. Davidson, S. Manley, J. Lippincot-Schwartz,
Ann. Rev. Phys. Chem. 2010, 61, 345367.
25. S. W. Hell, Nature Methods 2009, 6, 2432.
26. (a) A. A. Souto, A. U. Acua, J. M. Andreu, I. Barasoan, M.Abal,
F. Amat-Guerri, Angew. Chem. Intl. Ed. 1996, 34, 27102712; (b)
M. Abal, A. A. Souto, F. Amat-Guerri, A.U.Acua, J.M.Andreu,
I. Barasoan, Cell Motil. Cytoskel. 2001, 49, 115.
27. El colorante Hoechst 33342 es una bisbenzimida cuyo rendimiento cuntico de fluorescencia aumenta considerablemente al
intercalarse en la doble hlice del ADN.

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