Biakan sel

Biakan sel Fibroblas Embrio Ayam (FEA) dipersiapkan dengan metode dari
Methods for Examining poultry Biologics and for Identifiying and quantifiying
Avian pathogens (1971).
Telur ayam berembrio (TAB) umur 10 hari, berasal dari induk yang tidak
divaksin dan bebas terhadap penyakit tetelo (ND), Pullorum dan berdasarkan
pemeriksaan serologic tidak ditemukan serum anti terhadap penyakit marek.
Embrio diambil secara aseptik,pisahkan kepala,organ dalam dan anggota tubuh
lainnya. kemudian badan embrio yg sudah tertinggal dipotong-potong sampai
halusk. Potongan jaringan dicuci beberapa kali dengan larutan PBS sampai
larutan tampak jernih. Untuk setiap embrio ditambahkan larutan tripsin 0.2%
sebanyak 5 mL. Campuran tripsin-jaringan ini diputar dengan pengaduk magnit
selama 15 menit pada suhu kamar. Sel-sel ditampung dalam satu tabung. Proses
tripsinasi ini diulang 3-4 kali,hingga yang tersisa hanya jaringan-jaringan yang
kasar. Semua sel-sel yang terekstraks diputar dengan kecepatan 1000 rpm
selama 15 menit. Endapan sel pada dasar tabung disuspensikan dengan 100 mL
medium, kemudian disaring. Kepekatan sel dihitung dengan hemositometer,
apabila terlalu pekat suspensi sel diencerkan dengan media hingga diperoleh
kepekatan sekitar 5 x 10 5 sel/mL. Sel-sel dalam media ini selanjutnya
ditumbuhkan didalam tabung Roux, dengan volume 75 mL untuk setiap tabung.
Untuk membuat biakan sekunder, lapisan sel tunggal yang terbentuk pada
dinding tabung dipanen dengan larutan tripsin-versen,dicuci dengan larutan PBS
2-3 kali dengan pemutaran 1000 rpm, masing-masing selama 15 menit.
Endapan sel diresuspensikan dengan media pertumbuhan dan selanjutnya
ditumbuhkan didalam beberapa peralatan :

Didalam tabung Roux sebanyak 75 mL untuk mengembangbiakan virus.

Didalan cawan petri sebanyak 5 mL untuk FAT, pengamatan terhadap
pertumbuhan,pengukuran lesi dan untuk titrasi virus.

Biakan sel didalam tabung Roux diinkubasikan pada suhu 37 o C, sedangkan

biakan didalam cawan petri diinkubasikan pada suhu 37 o C, dengan kadar
CO2 5 % dan kelembaban 80 %. Media yang dipergunakan adalah Eagles
Minimum Essential Medium dan untuk pertumbuhan dan pemeliharaan
dipergunakan media yang masing-masing mengandung serum sapi 10 % dan
2% dan selama masa inkubasi pH diatur sekitar 7,2-7,4 dengan natrium
karbonat 7,5%. Untuk menjaga sterilitas, kedalam media ditambahkan
antibiotik yaitu campuran penisilin-sterptomisin dan mikostatin dngan dosis
100 unit/mL, 100 u gram/mL dan 50 unit/mL.

http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.13_MAREK_DIS.pdf .
Selasa,10 Juni 2014 pukul 10.15 WIB

NB: Version adopted by the World Assembly

of Delegates of the OIE in May 2010

OIE
Terrestrial
Manual
2010 1

CHAPTER 2.3.13.

MAREKS DISEASE
SUMMARY
Mareks disease
(
MD
)
is a lymphomatous and neuropathic dis
ease of domestic fowl caused by an
alphaherpesvirus.
Diagnosis is made on clinical signs and gross or
microscopic lesions. Chickens may become
persistently infected with MD virus
(
MDV
)
without developing clinical di
sease. Infection by MDV is
detected by virus isolati
on and the demonstration of vi
ral antigen or antibodies.
MD is prevented by vaccination with
monovalent or multiv
alent live virus vaccines of various types.
The vaccine is injected
in ovo
or at hatch.
In chickens, MD occurs at 34 weeks of
age or older and is most common between 12 and
30 weeks of age. Clinical signs obs
erved are paralysis of the legs
and wings, with enlargement of

peripheral nerves, but nerve invo

lvement is sometimes not seen,
especially in adult birds. MDV
strains of higher virulence may also cause incr
eased mortality in young bi
rds of 12 weeks of age,
especially if they lack maternal antibodies. D
epending on the strain of MD
V, lymphomatosis can
occur, especially in the ovary,
liver, spleen, kidneys, lungs,
heart, proventriculus and skin. As
opposed to the uniform cell population that comprise
s the tumours caused by lymphoid leukosis, the
nerve infiltration and lymphomas caused by MDV
consist of lymphoid cells of various types.
Tumours that resemble thos
e produced by MDV can also be
induced
by
avian
retroviruses such as
avian leukosis virus
(
ALV
)
and reticuloendotheliosis virus
(
REV
)
and differentiation of MD from
these tumours is important.
Identification of the agent:
Under field conditions, most chickens become infected with MDV
during the first few weeks of life and then carry t
he infection throughout thei
r lives, often without
developing overt disease. The infect
ion is usually detected by inocul
ating live buffy coat cells on to
monolayer cultures of chicken kidney
cells or duck embryo fibroblasts, in which characteristic viral
plaques develop within a few days. Two serotypes
of MDV are recognised 1 and 2 and a third
serotype is represented by the
related herpesvirus of turkeys
(
HVT
)
. Serotype 1 includes all the
virulent strains and some attenuated vaccine strain
s. Serotype 2 includes t

he naturally avirulent
strains, some of which are used as vacci
nes. MDV genomic DNA and viral antigens can be
detected in the feather ti
ps of infected birds usi
ng polymerase chain reaction
(
PCR
)
and radial
immunoprecipitation test, respectively
(
see below
)
.
Serological tests:
Antibodies to MDV develop within 12 weeks of infection and are commonly
recognised by the agar gel immunodiffusion test,
the indirect fluorescent antibody test, and
sometimes by other serological tests su
ch as enzyme-linked immunosorbent assay.
Requirements for vaccines:
MD is prevented by vaccinating chi
ckens in ovo or at 1 day of age.
Live viral vaccines are used. HVT
(
serotype 3
)
, in either a cell-free
(
lyophilised
)
form, or a cellassociated
(
wet
)
form, is one of the widely used vaccines
.
Attenuated variants of serotype 1 strains
of MDV are the most commonly used vaccine. Seroty
pe 2 strains may also be used, particularly in
bivalent vaccines, together with HVT
.
Serotype 1 and 2 vaccines are only available in the cellassociated form. Bivalent vaccines consisting of
serotypes 1 and 3 or trivalent vaccines consisting
of serotypes 1, 2, and 3 are al
so used. The bivalent and trival
ent vaccines have been introduced to
combat the very virulent strain
s of MDV that are not well cont

rolled by the monovalent vaccines.

Vaccination greatly reduces clinical
disease, but does not
prevent the persistent
infection by MDV.
The vaccine viruses are also carried throughout the
life of the fowl and ar
e continued to be shed,
which results in the ubiqui
tous presence of MDV.
Chapter 2.3.13. Mareks disease

2
OIE
Terrestrial
Manual
2010

A. INTRODUCTION
Mareks disease (MD) (Davison & Nair, eds., 2004; Schat & Nair, 2008; Sharma,
1998) is a disease of domestic fowl (chickens) caused by a herpesvirus. Birds get infect
ed by inhalation of infected dust from the poultry houses, and following a complex life
cycle, the virus is shed from the feather follicle of infect
ed birds (Baigent & Davison, 2004). MD occurs at 34 weeks of age or older and is
most common between 12 and 30 weeks of age. MD is associated with several distinct
pathological syndromes, of which the lymphoproliferative syndromes are the most
frequent and are of most practical significance. In the classical form of the di
sease, characterised mainly by the involvement of nerves, mortality rarely exceeds 10
15% and can occur over a few weeks or many months. In the
acute form, in which there is usually lymphoma formation in the viscera,
a disease incidence of 1030% in the flock is not uncommon and outbreaks involving up
to 70% can occur. Mortality may increase rapidly over a few weeks and then cease, or
can continue at a steady or slowly falling rate for several months. Currently, the acute
form of the disease with extensive visceral lymphomas is most prevalent. In
its classical form, the most common clinical sign of MD is partial or complete paralysis of
the legs and wings. In the acute form, birds are often severely depressed and some may
die without showing signs of clinical disease. Non-neoplastic disease involving brain
pathology with vasogenic oedema resulting in transient paralysis is increasingly
recognised with MD induced by the more virulent strains. In the classical form, the
characteristic finding is enlargement of one or more peripheral nerves. Those most
commonly affected and easily seen at post-mortem are the brachial and sci
atic plexuses, coeliac plexus, abdominal vagus and intercostal nerves.
Affected nerves are often two or three times their normal thickness, the
normal cross-striated and glistening appearance is absent, and the nerve may appear
greyish or yellowish, and sometimes oedematous. Lymphomas are sometimes present
in the classical form of MD, most frequently as small, soft, grey tumours in the ovary, and
sometimes also in the lungs, kidneys, heart, liver and other tissues. Grey eye caused
by an iridocyclitis that renders the bird unable to accommodat
e the iris in response to light and causes a distorted pupil is common in older (1618
week) birds, and may be the only presenting sign. In the acute form, the typical finding is
widespread, diffuse lymphomatous involvement of the liver, gonads, spleen, kidneys,
lungs, proventriculus and heart. Sometimes lymphomas also arise in
the skin around the feather follicles and in the skeletal muscles. Affected birds usually

have enlarged peripheral nerves, as in the classical form. In younger birds, liver
enlargementis usually moderate in extent, but in adult birds the liver may be greatly
enlarged and the gross appearance identical to that seen in lymphoid leukosis
, from which the disease must be differentiated. Nerve lesions are often absent in adult
birds with MD. In both the classical and acute forms of MD, the disease starts as a
proliferation of lymphoid cells, which is progressive in some cases and regressive in
others. The peripheral nerves may be affected by proliferative, inflammatory or minor
infiltrative changes, which are termed type A, B, and C lesions, respectively. The A-type
lesions consist of infiltration by proliferating lymphoblasts, large, medium and
small lymphocytes, and macrophages, and appear to be neoplastic in nature. The B-type
lesion is characterised by interneuritic oedema,infiltration by mainly
small lymphocytes and plasma cells, and Schwann cell proliferation, and appears to be
inflammatory. The C-type lesion consists of a light scattering of ma
inly small lymphocytes, and is often seen in birds that show no gross lesions
or clinical signs. It is thought to be a regressive, inflammatory lesion. Demyelination
frequently occurs in nerves affected by the A- and B-type lesions, and is
responsible for the clinical paralysis. Lymphomas in the visceral organs and other
tissues are similar cytologically tothe lymphoproliferations in the A-type lesions in nerves.
Usually the lymphoid cells are of mixed types, often wi
th a preponderance of small and medium lymphocytes, but sometimes, particularly in
acute MD in adult birds, large lymphocytes and lymphoblasts may predominate. The
heterogeneous population of lymphoid cells in MD lymphomas, as seen in haematoxylinand-eosin-stained sections, or in impression smears of lymphomas stained by May
GrnwaldGiemsa, is an important feature in differentiating the disease from lym
phoid leukosis, in which the lymphomatous infiltrations are composed of uniform
lymphoblasts. Another important difference is that, in lymphoid leukosis, gross
lymphomas occur in the bursa of Fabricius, and the tumour has an intrafollicular origin
and pattern of proliferation.In MD, although the
bursa is sometimes involved in the ly
mphoproliferation, the tum
our is less apparent, diffuse and interfollicular in
location. Peripheral nerve lesions are not
a feature of lymphoid l
eukosis as they are in MD. The greatest difficulty
comes in distinguishing between lymphoid leukosis and forms
of MD sometimes seen in adult birds in which the
tumour is lymphoblastic with marked liver enlargem
ent and absence of nerve le
sions. If post-mortems are
conducted on several affected birds, a diagnosis can
usually be made based on gross lesions and histopathology.
However there are other specialised
techniques described. The expression
of a Meq biochemical marker has
been used to differentiate between MD tu
mours, latent MDV infections and
retrovirus-induced tumours (Schat &
Nair, 2008). The procedure may require specialised reagent
s and equipment and it may not be possible to carry
out these tests in laboratories wi
thout these facilities. Other tec
hniques, such as detection by immuno-

fluorescence of activated T cell anti

gens present on the surfac
e of MD tumour cells (MD tumour-associated
surface antigen or MATSA), or of B-ce
ll antigens or IgM on the tumour cells
of lymphoid leukosis can give a
presumptive diagnosis, but
these are not specific to MD tumour cells.
Chapter 2.3.13. Mareks disease

OIE
Terrestrial
Manual
2010
3
Nerve lesions and lymphomatous
proliferations induced by ce
rtain strains of reticuloendotheliosis virus are similar,
both grossly and microscopically, to t
hose present in MD. Although reticul
oendotheliosis virus is not common in
chicken flocks, it should be borne in mind as a possibl
e cause of lymphoid tumour
s; its recognition depends on
virological and serological tests on the flock. Reticul
oendotheliosis virus can also cause neoplastic disease in
turkeys, ducks, quail and other species.
Another retrovirus, designated lymphopr
oliferative disease virus (LPDV),
also causes lymphoproliferative
disease in turkeys. Although chi
cken flocks may be seropositive for
reticuloendotheliosis virus, neoplastic disease is rare. T
he main features in the di
fferential diagnosis of MD,
lymphoid leukosis and reticuloendotheliosis are shown in
Table 1. Peripheral neuropathy
is a syndrome that can
easily be confused with the neurological
lesions caused by MD virus (MDV). This is not very common but its
incidence may be increasing in some European flocks (Bacon
et al.,
2001). There are no recognised health risks
to humans working with MDV or the related herpesvirus of turkeys (HVT).
Table 1.
Features useful in differentiating Marek's dis
ease, lymphoid leukosis
and reticuloendotheliosis
Feature
Mareks disease
Lymphoid leukosis
Reticuloendotheliosis
*

Age Any age. Usually 6 weeks or older Not under 16 weeks Not under 16 weeks

Signs Frequently paralysis N

on-specific Non-specific
Incidence Frequently above 5% in
unvaccinated flocks. Rare in
vaccinated flocks
Rarely above 5% Rare
Macroscopic lesions
Neural involvement Frequent Absent Infrequent
Bursa of Fabricius Diffuse enlargement or
atrophy Nodular tumours Nodular tumours
Tumours in skin, muscle
and proventriculus, grey
eye
May be present Usually absent Usually absent
Microscopic lesions
Neural involvement Yes No Infrequent
Liver tumours Often perivascu
lar Focal or diffuse Focal
Spleen Diffuse Often focal Focal or diffuse
Bursa of Fabricius Interfollicular tumour and/or
atrophy of follicles
Intrafollicular tumour Intrafollicular tumour
Central nervous system Yes No No
Lymphoid proliferation in
skin and feather follicles
Yes No No
Cytology of tumours Pleomorphic lymphoid cells,
including lymphoblasts, small,
medium and large lymphocytes
and reticulum cells. Rarely can be
only lymphoblasts
Lymphoblasts Lymphoblasts
Category of neoplastic
lymphoid cell
T cell B cell B cell

*
Reticuleondotheliosis virus may cause several different syndromes
. The bursal lymphoma syndrome is most likely to occur in
the field and is described here.

NB: Versi diadopsi oleh Majelis Dunia Delegasi dari OIE Mei 2010
OIE Terrestrial Pedoman 2010
1
BAB 2. 3. 1 3.
PENYAKIT Marek'S
RINGKASAN
Penyakit Marek (MD) adalah penyakit limfomatous dan neuropatik unggas domestik
disebabkan oleh alphaherpesvirus.
Diagnosis dibuat pada tanda-tanda klinis dan lesi kotor atau mikroskopis. Ayam dapat
menjadi terus terinfeksi dengan virus MD (MDV) tanpa mengembangkan penyakit klinis.
Infeksi oleh MDV adalah terdeteksi oleh virus isolasi dan demonstrasi antigen virus atau
antibodi.
MD dicegah dengan vaksinasi dengan vaksin monovalen atau multivalen virus hidup dari
berbagai jenis.

Vaksin ini disuntikkan pada ovo atau menetas.

Pada ayam, MD terjadi pada 3-4 minggu atau lebih tua dan paling sering terjadi antara 12
dan
30 minggu usia. Tanda-tanda klinis yang diamati adalah kelumpuhan kaki dan sayap,
dengan pembesaran
saraf perifer, tetapi keterlibatan saraf kadang-kadang tidak terlihat, terutama pada burung
dewasa. MDV
strain virulensi yang lebih tinggi juga dapat menyebabkan peningkatan mortalitas pada
burung muda dari 1-2 minggu usia,
terutama jika mereka tidak memiliki antibodi maternal. Tergantung pada strain MDV,
lymphomatosis dapat
terjadi, terutama di ovarium, hati, limpa, ginjal, paru-paru, jantung, proventrikulus dan
kulit. Sebagai
bertentangan dengan populasi sel seragam yang terdiri dari tumor yang disebabkan oleh
leukosis limfoid, yang
infiltrasi saraf dan limfoma disebabkan oleh MDV terdiri dari sel-sel limfoid dari berbagai
jenis.
Tumor yang mirip dengan yang dihasilkan oleh MDV juga dapat disebabkan oleh retrovirus
burung seperti
virus avian leukosis (ALV) dan virus reticuloendotheliosis (REV) dan diferensiasi MD dari
tumor ini sangat penting.
Identifikasi agen: Dalam kondisi lapangan, sebagian besar ayam terinfeksi MDV
selama beberapa minggu pertama kehidupan dan kemudian membawa infeksi sepanjang
hidup mereka, sering tanpa
mengembangkan penyakit yang jelas. Infeksi ini biasanya dideteksi dengan inokulasi sel
mantel buffy hidup pada
kultur monolayer sel ginjal ayam atau fibroblas embrio bebek, di mana virus karakteristik
plak berkembang dalam beberapa hari. Dua serotipe MDV diakui - 1 dan 2 - dan yang ketiga
serotipe diwakili oleh virus herpes terkait kalkun (HVT). Serotipe 1 mencakup semua
strain virulen dan beberapa strain vaksin dilemahkan. Serotipe 2 meliputi alami avirulent
strain, beberapa di antaranya digunakan sebagai vaksin. Antigen DNA genomik dan virus
MDV dapat
terdeteksi dalam tips bulu burung yang terinfeksi dengan menggunakan polymerase chain
reaction (PCR) dan radial
uji immunoprecipitation, masing-masing (lihat di bawah).
Tes serologis: Antibodi terhadap MDV berkembang dalam waktu 1-2 minggu dari infeksi dan
umumnya
diakui oleh uji imunodifusi gel agar, uji antibodi fluoresen tidak langsung, dan
kadang-kadang dengan uji serologis lainnya seperti enzyme-linked immunosorbent assay.
Persyaratan untuk vaksin: MD dicegah dengan vaksinasi ayam di ovo atau 1 hari usia.
Vaksin virus hidup yang digunakan. HVT (serotipe 3), baik dalam sel-bebas (lyophilised)
bentuk, atau sel-a terkait ('basah') bentuk, adalah salah satu vaksin banyak digunakan.
varian dilemahkan dari strain serotipe 1 dari MDV adalah vaksin yang paling umum
digunakan. Serotipe 2 strain juga dapat digunakan, terutama di vaksin bivalen, bersamasama dengan HVT. serotipe 1 dan 2 vaksin hanya tersedia dalam sel- bentuk terkait. Vaksin
bivalen terdiri dari serotipe 1 dan 3 atau vaksin trivalen terdiri dari serotipe 1, 2, dan 3 juga
digunakan. The bivalen dan trivalen vaksin telah diperkenalkan untuk memerangi strain
yang sangat virulen MDV yang tidak terkontrol dengan baik oleh vaksin monovalen.
Vaksinasi sangat mengurangi penyakit klinis, tetapi tidak mencegah infeksi persisten oleh
MDV. Virus vaksin juga dilakukan selama umur unggas dan terus ditumpahkan,

yang menghasilkan kehadiran di mana-mana MDV.

Page 2
Bab 2.3.13. - Penyakit Marek
2
OIE Terrestrial Pedoman 2010
A. PENDAHULUAN
Penyakit Marek (MD) (Davison & Nair, eds, 2004;. Schat & Nair, 2008; Sharma, 1998)
adalah penyakit domestik unggas (ayam) yang disebabkan oleh virus herpes a. Burung
terinfeksi oleh menghirup debu yang terinfeksi dari rumah-rumah unggas, dan mengikuti
siklus hidup yang kompleks, virus ditumpahkan dari folikel bulu burung yang terinfeksi
(Baigent & Davison, 2004). MD terjadi pada 3-4 minggu atau lebih tua dan paling sering
terjadi antara 12 dan 30 minggu usia. MD adalah dikaitkan dengan beberapa sindrom
patologis yang berbeda, dimana sindrom limfoproliferatif yang paling sering dan memiliki
signifikansi yang paling praktis. Dalam bentuk klasik dari penyakit, ditandai terutama oleh
keterlibatan saraf, kematian jarang melebihi 10-15% dan dapat terjadi selama beberapa
minggu atau berbulan-bulan. Dalam bentuk akut, di mana biasanya ada pembentukan
limfoma di jeroan, kejadian penyakit 10-30% di flock tidak jarang dan wabah yang
melibatkan hingga 70% dapat terjadi. Kematian dapat meningkatkan pesat selama beberapa
minggu dan kemudian berhenti, atau dapat melanjutkan pada tingkat yang stabil atau
perlahan-lahan jatuh selama beberapa bulan. Saat ini, akut bentuk penyakit dengan limfoma
visceral yang luas yang paling umum. Dalam bentuk klasiknya, yang paling umum
Tanda klinis dari MD adalah kelumpuhan parsial atau lengkap dari kaki dan sayap. Dalam
bentuk akut, burung sering parah tertekan dan beberapa mungkin mati tanpa menunjukkan
tanda-tanda penyakit klinis. Penyakit yang melibatkan non-neoplastik otak
patologi dengan edema vasogenik mengakibatkan kelumpuhan sementara semakin diakui
dengan MD disebabkan oleh strain yang lebih virulen.
Dalam bentuk klasik, temuan karakteristik pembesaran satu atau lebih saraf perifer. Mereka
yang paling sering terkena dan mudah dilihat di post-mortem adalah brakialis dan pleksus
siatik, celiac plexus, vagus perut dan saraf interkostal. Saraf yang terkena dampak sering dua
atau tiga kali ketebalan normal mereka, para penampilan cross-lurik dan berkilau normal
adalah tidak ada, dan saraf mungkin muncul keabu atau kekuningan, dan kadang-kadang
edema. Limfoma kadang-kadang hadir dalam bentuk klasik MD, paling sering sebagai
kecil, lembut, tumor abu-abu dalam ovarium, dan kadang-kadang juga di paru-paru, ginjal,
jantung, hati dan jaringan lainnya.
'Abu-abu eye' yang disebabkan oleh iridocyclitis yang membuat burung tidak mampu
menampung iris sebagai respon terhadap cahaya dan
menyebabkan murid terdistorsi adalah umum pada yang lebih tua (16-18 minggu) burung,
dan mungkin merupakan tanda hanya menyajikan.
Dalam bentuk akut, temuan khas adalah luas, keterlibatan limfomatous menyebar dari hati,
gonad, limpa, ginjal, paru-paru, proventrikulus dan jantung. Kadang-kadang limfoma juga
muncul di kulit seluruh bulu folikel dan otot rangka. Unggas yang terkena biasanya telah
diperbesar saraf perifer, seperti dalam klasik form. Pada burung muda, pembesaran hati
biasanya moderat luasnya, tetapi pada burung dewasa hati mungkin sangat diperbesar dan
penampilan kotor identik dengan yang terlihat pada leukosis limfoid, dari mana penyakit
tersebut harus dibedakan. Lesi saraf yang sering absen pada burung dewasa dengan MD.
Dalam kedua bentuk klasik dan akut MD, penyakit ini dimulai sebagai proliferasi sel-sel
limfoid, yang merupakan progresif dalam beberapa kasus dan regresif pada orang lain. Saraf
perifer dapat dipengaruhi oleh proliferasi, Perubahan infiltratif inflamasi atau kecil, yang

disebut tipe A, B, dan C lesi, masing-masing. The A-jenis lesi terdiri dari infiltrasi
berkembang biak lymphoblasts, besar, menengah dan kecil limfosit, dan makrofag, dan
tampaknya neoplastik di alam. The B-tipe lesi ditandai dengan edema interneuritic, infiltrasi
terutama limfosit dan sel plasma kecil, dan proliferasi sel Schwann, dan tampaknya inflamasi.
The C-type Lesi terdiri dari hamburan cahaya limfosit terutama kecil, dan sering terlihat pada
burung yang menunjukkan tidak ada lesi bruto atau tanda-tanda klinis. Hal ini dianggap
sebagai regresif, lesi inflamasi. Demielinasi sering terjadi pada saraf
dipengaruhi oleh A-dan B-tipe lesi, dan bertanggung jawab atas kelumpuhan klinis.
Limfoma pada organ visceral dan jaringan lain yang serupa sitologi dengan
lymphoproliferations di Aketik lesi pada saraf. Biasanya sel-sel limfoid adalah jenis campuran, sering dengan dominan
kecil dan
limfosit menengah, tapi kadang-kadang, terutama di MD akut pada burung dewasa, limfosit
besar dan lymphoblasts
mungkin mendominasi.
Populasi heterogen sel limfoid di MD limfoma, seperti yang terlihat dalam hematoksilineosin dan-bernoda
bagian, atau dalam apusan kesan limfoma ternoda oleh May-Grnwald-Giemsa, merupakan
fitur penting dalam
membedakan penyakit dari leukosis limfoid, di mana infiltrasi limfomatous terdiri dari
lymphoblasts seragam. Perbedaan penting lainnya adalah bahwa, dalam leukosis limfoid,
limfoma kotor terjadi di
bursa Fabricius, dan tumor memiliki asal intrafollicular dan pola proliferasi. Di MD,
meskipun
bursa kadang-kadang terlibat dalam lymphoproliferation tersebut, tumor kurang jelas,
menyebar dan interfollicular di
lokasi. Lesi saraf perifer bukan fitur leukosis limfoid ketika mereka berada di MD. Kesulitan
terbesar
datang dalam membedakan antara limfoid leukosis dan bentuk MD kadang-kadang terlihat
pada burung dewasa di mana
tumor lymphoblastic dengan pembesaran hati ditandai dan tidak adanya lesi saraf. Jika pascaotopsi yang
dilakukan pada beberapa burung yang terkena, diagnosis biasanya dapat dibuat berdasarkan
lesi kotor dan histopatologi.
Namun ada teknik khusus lainnya yang dijelaskan. Ekspresi penanda biokimia MEQ
memiliki
telah digunakan untuk membedakan antara tumor MD, infeksi laten MDV dan retrovirus
yang diinduksi tumor (Schat &
Nair, 2008). Prosedur yang mungkin membutuhkan reagen khusus dan peralatan dan
mungkin tidak mungkin untuk membawa
tes ini di dalam laboratorium tanpa fasilitas ini. Teknik lainnya, seperti deteksi oleh immunofluoresensi diaktifkan antigen sel T hadir pada permukaan sel tumor MD (MD tumor terkait
antigen permukaan atau Matsa), atau antigen sel-B atau IgM pada sel tumor dari leukosis
limfoid dapat memberikan
diagnosis dugaan, tetapi ini tidak spesifik untuk sel-sel tumor MD.
Page 3
Bab 2.3.13. - Penyakit Marek
OIE Terrestrial Pedoman 2010
3

Lesi saraf dan proliferations limfomatous disebabkan oleh strain tertentu dari virus
reticuloendotheliosis serupa,
baik terlalu dan mikroskopis, mereka yang hadir di MD. Meskipun virus reticuloendotheliosis
tidak umum di
ternak ayam, harus diingat sebagai kemungkinan penyebab tumor limfoid; pengakuan
tergantung pada
tes virologi dan serologi kawanannya. Virus Reticuloendotheliosis juga dapat menyebabkan
penyakit neoplastik di
kalkun, bebek, puyuh dan spesies lainnya. Retrovirus lain, ditunjuk virus penyakit
limfoproliferatif (LPDV),
juga menyebabkan penyakit limfoproliferatif pada kalkun. Meskipun kelompok ayam
mungkin seropositif untuk
virus reticuloendotheliosis, penyakit neoplastik jarang. Fitur utama dalam diagnosis
diferensial dari MD,
limfoid leukosis dan reticuloendotheliosis ditunjukkan pada Tabel 1. Neuropati perifer adalah
sindrom yang dapat
mudah bingung dengan lesi neurologis yang disebabkan oleh virus MD (MDV). Hal ini tidak
sangat umum namun
insiden mungkin meningkat di beberapa ternak Eropa (Bacon et al., 2001). Tidak ada risiko
kesehatan yang diakui
manusia bekerja dengan MDV atau virus herpes terkait kalkun (HVT).
Tabel 1. Fitur berguna dalam membedakan Marek Penyakit, limfoid leukosis dan
reticuloendotheliosis
Ciri
Penyakit Marek
Leukosis limfoid
Reticuloendotheliosis
*
Usia
Setiap usia. Biasanya 6 minggu atau lebih
Tidak berada di bawah 16 minggu
Tidak berada di bawah 16 minggu
Tanda
Sering kelumpuhan
Non-spesifik
Non-spesifik
Insidensi
Sering di atas 5% pada
ternak tidak divaksinasi. Langka di
ternak divaksinasi
Jarang di atas 5%
Langka
Lesi makroskopik
Keterlibatan saraf
Sering
Absen
Jarang
Bursa of Fabricius
Pembesaran difus atau atrofi
Tumor nodular

Tumor nodular
Tumor di kulit, otot
dan proventrikulus, 'abu-abu
eye '
Mungkin hadir
Biasanya tidak ada
Biasanya tidak ada
Lesi mikroskopis
Keterlibatan saraf
Ya
Tidak
Jarang
Tumor hati
Sering perivaskular
Fokal atau difus
Focal
Limpa
Membaur
Seringkali fokus
Fokal atau difus
Bursa of Fabricius
Tumor interfollicular dan / atau
atrofi folikel
Tumor Intrafollicular
Tumor Intrafollicular
Sistem saraf pusat
Ya
Tidak
Tidak
Proliferasi limfoid di
kulit dan bulu folikel
Ya
Tidak
Tidak
Sitologi tumor
Sel limfoid pleomorfik,
termasuk lymphoblasts, kecil,
limfosit menengah dan besar
dan sel retikulum. Jarang bisa
hanya lymphoblasts
Limfoblastik
Limfoblastik
Kategori neoplastik
sel limfoid
Sel T
Sel B
Sel B
*
Virus Reticuleondotheliosis dapat menyebabkan beberapa sindrom yang berbeda. Sindrom
limfoma bursal yang paling mungkin terjadi pada

lapangan dan dijelaskan di sini.

Page 4
Bab 2.3.13. - Penyakit Marek
4
OIE Terrestrial Pedoman 2010
B. DIAGNOSTIK TEKNIK
1. Identifikasi agen
isolasi Virus
Infeksi oleh MDV pada sekelompok ternak dapat dideteksi dengan mengisolasi virus dari
jaringan ayam yang terinfeksi. Namun, sifat mana-mana dari MDV harus dipertimbangkan
dan diagnosis MD harus didasarkan pada kombinasi dari MDV isolasi atau deteksi genom
dengan polymerase chain reaction (PCR) dan penyakit klinis. Sumber yang umum digunakan
adalah sel mantel buffy dari sampel darah heparinised, atau suspensi sel limfoma atau sel
limpa. Ketika sampel ini dikumpulkan di lapangan, disarankan bahwa mereka diangkut ke
laboratorium dalam kondisi dingin. Sebagai MDV sangat sel yang terkait, itu adalah
penting bahwa suspensi sel ini mengandung sel-sel yang layak. Suspensi sel diinokulasi ke
kultur monolayer sel ginjal ayam atau fibroblas embrio bebek (fibroblas embrio ayam (CEF)
adalah kurang sensitif untuk virus primer isolasi). Serotipe 2 dan 3 virus (lihat Bagian C.1.a)
lebih mudah terisolasi di CEF dibandingkan sel-sel ginjal ayam. Biasanya suspensi 0,2 ml
yang mengandung dari 10 6 sampai 10 7 sel-sel hidup diinokulasi menjadi duplikat
monolayers tumbuh di piring kultur sel plastik (60 mm). Diinokulasi dan budaya kontrol plot
perlakuan tanpa inokulasi diinkubasi pada 38,5 C dalam inkubator lembab yang
mengandung 5% CO 2 . Atau, pembuluh budaya tertutup dapat digunakan. Media kultur
diganti pada interval 2 hari. Area efek sitopatik, disebut plak, muncul dalam waktu 3-5 hari
dan bisa dihitung sekitar 7-10 hari. , Kurang umum digunakan sumber lain dari MDV untuk
tujuan diagnostik adalah kiat bulu, dari mana sel-bebas MDV dapat diekstraksi. Tips sekitar 5
mm, atau saluran cincang kulit berisi tips bulu, adalah ditangguhkan dalam SPGA / EDTA
(sukrosa, fosfat, glutamat dan albumin / etilendiamin tetra-asetat acid) penyangga untuk
ekstraksi dan titrasi bebas sel MDV (Calnek et al., 1970). Buffer dibuat sebagai berikut:
0,2180 M sukrosa (7,462 g); 0,0038 M monopotassium fosfat (0,052 g); 0,0072 M
dipotassium fosfat (0,125 g); 0,0049 M L -Monosodium glutamat (0,083 g); 1,0% bovine
albumin bubuk (1.000 g); 0,2% EDTA (0,200 g); dan air suling (100 ml). Buffer disterilkan
dengan filtrasi dan harus di sekitar pH 6,5. Suspensi ini disonikasi dan kemudian disaring
melalui 0,45 pM filter membran untuk inokulasi pada 24 - jam-lama terkuras ayam
monolayers sel ginjal. Setelah penyerapan selama 40 menit, medium ditambahkan, dan
kultur diinkubasi seperti di atas selama 7-10 hari. Menggunakan metode ini, MDV serotipe 1
dan 2 dapat diisolasi, bersama-sama dengan HVT (serotipe 3), jika hadir sebagai hasil dari
vaksinasi. Dengan pengalaman, plak yang disebabkan oleh serotipe virus yang berbeda dapat
dibedakan cukup akurat atas dasar saat penampilan, laju perkembangan, dan plak
morfologi. Plak HVT muncul lebih awal dan lebih besar dari serotipe 1 plak, sedangkan
serotipe 2 plak muncul kemudian dan lebih kecil dari serotipe 1 plak.
MDV dan HVT plak dapat diidentifikasi sebagai tersebut dengan menggunakan antibodi
spesifik yang diangkat dalam ayam. Monoklonal antibodi dapat digunakan untuk
membedakan serotipe (Lee et al., 1983).
Deteksi Antigen
Sebuah variasi dari uji AGID digunakan untuk serologi (lihat di bawah) dapat digunakan
untuk mendeteksi antigen MDV dalam tips bulu
sebagai indikasi infeksi oleh MDV. Slide kaca disusun dengan lapisan dari 0,7% agarosa
(misalnya A37) di

8% natrium klorida, yang mengandung MDV antiserum. Tips bulu kecil yang diambil dari
burung menjadi
diperiksa dan dimasukkan secara vertikal ke dalam agar-agar, dan slide dipertahankan seperti
yang dijelaskan di bawah ini. Itu
pengembangan zona radial presipitasi sekitar tips bulu menunjukkan kehadiran di bulu
MDV antigen dan karenanya infeksi pada burung.
Polymerase chain reaction (PCR)
Genom dari ketiga serotipe telah benar-benar diurutkan (Afonso et al, 2001;. Lee et al,
2000.).
Tes PCR telah dikembangkan untuk diagnosis MD. Real-time PCR kuantitatif (qPCR) untuk
mengukur MDV
salinan genom juga telah dijelaskan (Abdul-Careem et al, 2006;. Baigent et al, 2005;.. Islam
et al,
2004). Selain itu, tes PCR yang memungkinkan diferensiasi strain onkogenik dan nononkogenik serotipe
1 MDV, dan strain vaksin MDV serotipe 2 dan 3 (Becker et al, 1992;. Bumstead et al, 1997.;
Handberg et al, 2001.; Silva, 1992; Zhu et al., 1992) telah dijelaskan. PCR juga dapat
digunakan untuk
quantitate beban virus dalam jaringan (Baigent et al, 2005;. Bumstead et al, 1997;. Burgess
& Davison, 1999;
. Reddy et al, 2000) atau diferensial mendeteksi MDV dan HVT dalam darah atau bulu tips
(Baigent et al, 2005.;
Davidson & Borenshtain, 2002).
Page 5
Bab 2.3.13. - Penyakit Marek
OIE Terrestrial Pedoman 2010
5
2. Tes serologis
Kehadiran antibodi terhadap MDV pada ayam non-divaksinasi dari sekitar 4 minggu usia
merupakan indikasi
infeksi. Sebelum usia itu, antibodi tersebut dapat mewakili transmisi maternal antibodi
melalui kuning telur dan
bukan bukti infeksi aktif.
Virus, antigen dan antisera dapat diperoleh dari pemasok komersial atau dari OIE Reference
Laboratories untuk
Penyakit Marek (lihat Tabel pada Bagian 3 Manual Terrestrial ini), tetapi reagen standar
internasional belum
telah diproduksi.
a) imunodifusi Agar gel
Tidak ada tes diresepkan untuk perdagangan, tetapi gel imunodifusi agar (AGID) tes
digunakan paling
umum untuk mendeteksi antibodi. Tes ini dilakukan dengan menggunakan slide kaca dilapisi
dengan 1% agar fosfat
buffered saline yang mengandung 8% natrium klorida. Sumur yang berdekatan diisi dengan
antigen atau serum dan ini
diinkubasi dalam suasana lembab pada suhu 37 C selama 24 jam untuk difusi berlangsung;
positif sera acara
Reaksi identitas dengan serum positif dikenal dan antigen. Antigen yang digunakan dalam tes
ini baik terganggu

Sel kultur jaringan MDV terinfeksi atau ekstrak tips bulu, atau kulit yang mengandung
saluran bulu yang diperoleh dari
Ayam MDV terinfeksi. Kultur sel antigen disiapkan dengan menyebarkan MDV dalam sel
ginjal ayam atau
sel fibroblast embrio ayam. Bila efek sitopatik adalah konfluen, sel-sel yang terlepas dari
budaya
kapal dan tersuspensi dalam media kultur atau fosfat buffered saline tanpa tryptose kaldu
fosfat
(Kehadiran kaldu fosfat tryptose dapat menghasilkan garis precipitin non-spesifik) pada
konsentrasi sekitar
1 10
7
sel / ml. Suspensi ini kemudian membekukan-dicairkan tiga kali dan digunakan sebagai
antigen.

Prosedur pengujian
i)
Membuat larutan 1% dari Difco Bactoagar di 8% natrium klorida dengan berdiri adonan ke
dalam air mendidih
bath.
ii)
Entah slide mikroskop atau cawan Petri dapat digunakan dan agar dituangkan ke ketebalan 23 mm.
iii) Potong lubang di agar menggunakan template dengan pusat baik dan 6 sumur spasi pada
jarak yang sama di sekitar
pusat dengan baik. Diameter sumur harus sekitar 5,3 mm, dan sumur harus sekitar
2,4 mm terpisah. Sebuah template dengan pemotong tersedia secara komersial.
iv) antigen ditempatkan di tengah dengan baik dan antiserum standar ditempatkan dalam
sumur eksterior alternatif.
Sampel serum yang akan diuji ditempatkan di sisa tiga sumur sehingga. Garis kontinu
identitas
terbentuk antara sampel yang tidak diketahui yang positif dan diketahui positif serum kontrol.
v)
Menetaskan slide selama 24 jam pada suhu 37 C dalam wadah lembab dan membaca hasil
lebih lampu di
gelap kamar.
b) Tes lain
Tes-tes lain untuk antibodi MDV meliputi tes antibodi fluorescent langsung dan tidak
langsung. Menunjukkan ini
kemampuan serum tes untuk noda MDV plak dalam kultur sel (Silva et al, 1997;. Spencer &
Calnek, 1970).
Tes ini adalah kelompok spesifik dan lebih sensitif dibandingkan dengan pengujian AGID.
Sebuah tes virus netralisasi untuk
kemampuan serum untuk menetralkan properti pembentuk plak dari MDV sel-bebas juga
dapat digunakan. Namun,
tes ini lebih cocok untuk tujuan penelitian selain untuk penggunaan diagnostik rutin.
Enzyme-linked
tes immunosorbent (ELISA) untuk mendeteksi antibodi MDV tersedia (Cheng et al, 1984;.
Sharma,

1998; Zelnik et al., 2004). Untuk mempersiapkan antigen untuk ELISA, sumur piring
microtitre 96-well yang dilapisi
dengan sel MDV terinfeksi.
C. PERSYARATAN VAKSIN
1. Latar Belakang
a) penggunaan Dasar Pemikiran dan dimaksudkan produk
Pengendalian MD dasarnya dicapai dengan meluasnya penggunaan vaksin hidup yang
dilemahkan (Nair, 2004).
Produk biologi komersial yang digunakan dalam pengendalian MD adalah terkait sel atau selbebas (lyophilised) hidup virus atau HVT, masing-masing (lihat di bawah). Vaksin penyakit
Marek yang disuntikkan pada telur berembrio pada hari ke-17 atau ke-18 (Sharma, 1999)
Page 6
Bab 2.3.13. - Penyakit Marek
6
OIE Terrestrial Pedoman 2010
2. Garis produksi dan minimum persyaratan untuk vaksin konvensional
Persyaratan untuk memproduksi vaksin yang diuraikan di bawah ini, dan dalam Bab 1.1.8
Prinsip vaksin hewan produksi, namun sumber lain harus dikonsultasikan untuk informasi
lebih lanjut mengenai prosedur (Dewan Eropa, 1997a dan 1997b; Merieux et al, 1974.;
Departemen Pertanian, Perikanan dan Pangan, Inggris, 1990; Kantor Federal
Peraturan, USA (1989); Thornton, 1985). Protokol diberikan dalam British Pharmacopoeia
Monografi 589, dan US Code of Federal Regulations, Volume 9, bagian 113 (Amerika Serikat
Departemen Pertanian [USDA],
1995 |). Pedoman dalam Pedoman Terestrial ini dimaksudkan untuk menjadi umum di alam
dan dapat dilengkapi
oleh persyaratan nasional dan regional.
a) Karakteristik benih
i) Karakteristik biologis
Virus dari kelompok MDV diklasifikasikan dalam tiga serotipe - 1, 2, dan 3 - atas dasar
mereka keterkaitan antigenik.
Serotipe 1: Ini mencakup semua strain patogen virus, mulai dari strain yang sangat
virulen plus (misalnya 648A), sangat virulen (misalnya Md / 5, Md/11, Ala-8, RB-1B),
virulen (misalnya HPRS-16, JM GA), sedikit virulen (misalnya HPRS-B14, Conn A) dan
akhirnya ke lemah virulen (misalnya CU-2, CVI-988). Ini strain dapat dilemahkan oleh
bagian dalam kultur jaringan, dengan hilangnya sifat patogen tetapi retensi imunogenisitas,
untuk memberikan strain yang telah digunakan sebagai vaksin. Mereka yang telah digunakan
komersial termasuk dilemahkan CVI-988 (Rispens) strain HPRS-16 dan. Varian dilemahkan
dari sangat virulen noda telah digunakan dalam vaksin eksperimental untuk melindungi
terhadap bentuk varian MD akut yang disebabkan oleh sangat virulen noda. Md11/75C/R2/23
adalah satu strain tersebut (Witter, 2001 |) lisensi untuk digunakan di Amerika Serikat.
Serotipe vaksin 1 disusun dalam sel-terkait ('Basah') bentuk yang harus disimpan dalam
nitrogen cair.
Serotipe 2: Ini termasuk strain avirulen alami dari MDV (misalnya SB-1, HPRS-24, 301B / 1,
HN-1), dan beberapa ini telah terbukti memberikan perlindungan terhadap strain virulen. SB1 dan 301B / 1 strain telah dikembangkan secara komersial dan digunakan, terutama dengan
HVT, dalam vaksin bivalen untuk perlindungan terhadap strain virulen sangat. Serotipe 2
vaksin hanya ada dalam bentuk sel-terkait.
Serotipe 3: ini berisi alunan HVT alami avirulent (misalnya FC126, PB1), yang secara luas

digunakan sebagai vaksin monovalen, dan juga dalam kombinasi dengan serotipe 1 dan 2
strain di bivalen atau vaksin trivalen terhadap strain yang sangat virulen MDV. HVT dapat
dibuat dalam bentuk sel-bebas a-beku-kering (lyophilised) vaksin atau dalam bentuk selterkait ('basah').
ii) Kriteria kualitas (sterilitas, kemurnian, kebebasan dari agen asing)
Substrat yang digunakan untuk produksi vaksin komersial fibroblas embrio ayam primer
(CEF) berasal dari patogen tertentu bebas (SPF) ternak atau fibroblas embrio bebek. CEF dari
SPF ternak yang lebih suka bebek sel karena lebih banyak yang diketahui tentang ayamembrio yang ditularkan patogen dan metode untuk deteksi mereka.
Metode untuk menguji ternak SPF untuk bebas dari infeksi yang tersedia (Departemen
Pertanian, Perikanan dan Makanan, Inggris, 1990; Thornton, 1985). SPF ternak ayam harus
bebas dari unggas adenovirus, termasuk telur-drop syndrome 76 virus, virus avian
encephalomyelitis, leukosis burung virus (sub kelompok A, B dan J), virus avian nephritis,
reoviruses burung, rotavirus burung, ayam virus anemia, unggas virus cacar, infeksi virus
bronkitis, infeksi virus penyakit bursal, infeksi virus Laringotrakheitis, virus influenza tipe A,
MDV, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae,
Newcastle virus penyakit, virus reticuloendotheliosis, Salmonella spp., Dan kalkun
rhinotracheitis virus. SPF bebek ternak harus bebas dari adenovirus burung, reoviruses
burung, Chlamydia, virus bebek enteritis, jenis virus hepatitis bebek I dan II, virus influenza
tipe A, virus penyakit Newcastle, Pasteurella (Sekarang Riemerella) anatipestifer, REV, dan
infeksi Salmonella. Kebebasan dari infeksi lain mungkin juga diperlukan karena mereka
menjadi diakui. Virus Bibit harus bebas dari agen terdaftar untuk SPF ternak dan dari
kontaminan lainnya yang mungkin diperoleh di laboratorium. Sebuah strain vaksin yang
berasal dari kalkun juga harus bebas dari LPDV dan haemorrhagic enteritis virus.
Kemampuan master seed virus - virus dan diturunkan di batas rentang bagian yang digunakan
untuk menghasilkan virus vaccinal (biasanya tidak lebih dari lima bagian kultur jaringan) untuk melindungi terhadap MD harus ditentukan. Tes perlindungan Standarisasi diterbitkan.
Mereka melibatkan vaksinasi MD- ayam SPF rentan pada 1 hari usia dan tantangan dengan
MDV virulen yang cukup 8 hari kemudian untuk menyebabkan setidaknya kejadian 70% dari
MD pada ayam yang tidak divaksinasi. Dua jenis tes yang digunakan. Dalam
uji indeks perlindungan, dosis field (1000 PFU) (plak unit pembentuk) vaksin diberikan dan
kejadian MD unggas yang sudah divaksinasi dibandingkan dengan yang tidak divaksinasi
pada burung. Indeks pelindung
harus lebih besar dari 80, yaitu burung divaksinasi harus menunjukkan penurunan setidaknya
80% dalam kejadian
MD kotor, dibandingkan dengan kontrol yang tidak divaksinasi.
Page 7
Bab 2.3.13. - Penyakit Marek
OIE Terrestrial Pedoman 2010
7
A PD
50 (50% dosis pelindung) tes juga digunakan, yang melibatkan inokulasi lima pengenceran
serial empat kali lipat virus vaksin yang dipilih untuk memberikan perlindungan atas dan di
bawah level 50%, diikuti oleh tantangan 8 hari kemudian untuk menentukan PD
50 nilai. Alat tes dilakukan menggunakan referensi standar
Vaksin untuk perbandingan. PD 50 mungkin serendah 4 PFU, tetapi nilai-nilai yang lebih
tinggi dapat diperoleh tergantung pada strain vaksin, apakah sel-bebas atau sel terkait dan ada
atau tidaknya keibuan antibodi dalam tes ayam. Atas dasar PD 50

tes, telah disarankan bahwa Vaksin minimum dosis lapangan harus lebih besar dari dua nilai:
10 3 PFU atau 100 PD 50 . Uji coba lapangan yang luas dari strain vaksin baru dengan
adanya tantangan lapangan harus dilakukan, menggunakan keturunan yang berbeda dari
burung dari berbagai MDV status antibodi ibu, untuk memastikan efektivitas dan
ketekunan imunitas. Pengalaman menunjukkan bahwa kekebalan vaccinal, sekali diperoleh,
adalah seumur hidup.
b) Metode pembuatan
i) Prosedur
Vaksin terhadap MD dibuat dari strain hidup yang dilemahkan milik 3 serotipe menggunakan
CEF sebagai substrat.
ii) Persyaratan untuk substrat dan media
Sel substrat unggulan ke kapal datar-bottomed untuk inkubasi stasioner, atau ke silinder
kapal untuk digulung inkubasi. Media yang umum digunakan adalah medium minimal
esensial Eagle, atau 199 menengah, buffered dengan natrium bikarbonat dan ditambah
dengan 5% serum anak sapi. Inkubasi adalah pada 38 - 39 C selama 48 jam.
Untuk vaksin terkait sel, budaya terinfeksi HVT produksi atau MDV benih-virus saham,
dalam sel- bentuk terkait, yang biasanya dua bagian luar benih induk. Budaya diinkubasi
selama 48 jam maka sel-sel yang terinfeksi dipanen dengan memperlakukan lembar sel dicuci
dengan Larutan EDTA / tripsin untuk memungkinkan sel untuk mulai melepaskan. Termos
kemudian dikembalikan ke inkubator (38,5 C) untuk memungkinkan detasemen lengkap.
Sel-sel yang mengalami kecepatan rendah sentrifugasi, dan kemudian disuspensi kembali
dalam campuran beku yang terdiri dari media pertumbuhan sel yang mengandung 7,5-15%
dimetilsulfoksida (DMSO), dan diadakan pada suhu 4 C atau dibagikan langsung ke dalam
vaksin akhir kontainer, biasanya ampul kaca, yaitu api disegel dan dibekukan dalam nitrogen
cair. Vaksin lyophilised bebas sel dapat dibuat dari HVT, tetapi bukan dari MDV strain.
Untuk produksi dari bentuk vaksin, budaya HVT terinfeksi diinkubasi selama 72 jam, sel
yang terinfeksi yang terpisah dari kapal seperti dijelaskan di atas, atau dikorek dari dinding
kapal. Sel-sel yang ditangguhkan dalam volume kecil dari medium pertumbuhan,
disentrifugasi, dan diresuspensi dalam larutan buffer stabilizer
mengandung 8% sukrosa, tetapi bebas dari protein untuk mencegah buih. Suspensi sel
sonicated untuk melepaskan virus, puing-puing sel dihapus, suspensi diencerkan dengan
stabilizer lengkap - seperti SPGA - diisi ke dalam wadah akhir, dan lyophilised.
Tingkat pengenceran untuk kedua vaksin bebas sel-sel terkait dan didasarkan pada
pengalaman sebelumnya, seperti
jumlah dosis yang diperlukan per kontainer, karena kandungan virus dari bahan dipanen tidak
bisa harus diuji sebelum mengisi wadah akhir. Isi virus dari produk jadi dapat kemudian
ditambahkan ke label.
iii) Dalam proses kontrol
Untuk hasil yang optimal dalam mempersiapkan terkait sel vaksin, tingkat lambat pembekuan
(1-5 C per menit) dan pencairan yang cepat sangat penting. Infektivitas titer dari sel yang
terinfeksi, dan karenanya jumlah dosis per
ampul, ditentukan setelah mengisi ampul. Demikian pula untuk vaksin sel-bebas, kandungan
virus suspensi akhir, dan karenanya jumlah dosis per kontainer, ditentukan setelah mengisi.
iv) tes bets produk akhir
Menggunakan immunofluorescence assay (IFA) dengan monospecific serum, pemeriksaan
harus dilakukan untuk menunjukkan bahwa produk tersebut dari kekhususan yang sama
seperti virus benih. Hal ini paling baik dilakukan dengan menggunakan monoklonal
antibodi. Sterility / kemurnian Pengujian ekstensif diperlukan dari bahan yang digunakan
untuk memproduksi vaksin, dan produk akhir. Sel Substrat harus datang dari kawanan SPF,
khususnya, bebas dari agen menular secara vertikal. Zat yang berasal dari hewan yang

digunakan dalam penyusunan vaksin seperti serum, tripsin, dan sapi serum albumin, harus
bebas dari agen asing. Batch vaksin akhir yang dihasilkan harus diuji untuk bebas dari
kontaminasi bakteri, jamur, Mycoplasma dan virus terdaftar untuk SPF ternak; tes untuk
kemurnian pengencer juga harus dilakukan. Suitable tests for the detection of extraneous
agents at all stages of vaccine production are recommended by several official bodies
(Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, UK, 1990; Office
Page 8
Chapter 2.3.13. Marek's disease
8
OIE Terrestrial Manual 2010
of Federal Regulations, USA (1989); Thornton, 1985) and in Chapter 1.1.9 Tests for sterility
and
freedom from contamination of biological materials.
Keselamatan
Ten doses of vaccine or a quantity of diluent equivalent to two doses of vaccine should be
inoculated
into separate groups of ten 1-day-old SPF chickens. No adverse reactions should occur during
a 21day observation period.
With cell-associated vaccine, care is necessary to avoid injury from ampoules that may
explode when
they are removed from liquid nitrogen. Eye protection must be worn.
Batch potency
The standard dose of each type of vaccine is 1000 PFU per chicken or egg. Virus content
assays are
conducted on batches of vaccine to ensure that the correct dose per bird will be achieved.
c) Requirements for authorisation
i)
Safety requirements
Target animal safety
The master seed virus should be shown to be non-pathogenic for chickens by inoculating ten
times the
field dose into 1-day-old SPF chickens of a strain susceptible to MD, to ensure that it does
not cause
gross lesions or significant microscopic lesions of MD by 120 days of age. It should be noted
that some
vaccine strains of MDV and HVT may produce minor and transient microscopic nerve
lesions.
Reversion-to-virulence for attenuated/live vaccines
No increase in virulence should occur during six serial passages of the vaccine strain in 1day-old SPF
MD-susceptible chickens. Ten times the field dose of vaccine is inoculated initially and then
passaged
by inoculation of heparinised blood at 57-day intervals, and tests for viraemia are run to
check that
virus is transferred at each passage. The birds receiving the final passage are kept for 120
days and
should be free from MD lesions. However, some strains such as Rispens, may cause some
mild MD

lesi. The important observation is that the virulence should not change. This is a difficult test
because the genetic resistance of the chickens fundamentally affects the apparent virulence of
the
virus, so does the type of inoculum. After successful completion of laboratory safety tests, the
safety of
the strain should be confirmed in extensive field trials.
ii)
Efficacy requirements
A test for duration of immunity is carried out on the seed virus only. Such immunity is
apparently
lifelong. Preservatives are not included in the vaccine or diluent. During use, reconstituted
vaccine must
be kept cool and cell-associated vaccine should be agitated to keep cells in suspension.
iii) Stability
Tests for stability are carried out on six representative batches of vaccine to show that titre is
maintained during the stated shelf life of the vaccine. These tests should be conducted under
the
conditions of storage of the vaccine. The lyophilised product should have a shelf life of 12
months when
stored at 28C. Manufacturers may double the virus content of the vaccine to compensate
for some
loss of titre during storage. Appropriate diluting fluids are provided for use with cellassociated and
freeze-dried vaccines. The stability of reconstituted vaccine over a 2-hour period should be
tested.
3. Vaccines based on biotechnology
a) Vaccines available and their advantages
Although genetically engineered recombinant vaccines have been developed (Reddy et al. ,
1996) and tested
in laboratory and field trials (Lee et al. , 2010), they are currently not in commercial use.
b) Special requirements for biotechnological vaccines, if any
Tidak ada.
Page 9
Chapter 2.3.13. Marek's disease
OIE Terrestrial Manual 2010
9
REFERENSI
A
BDUL
-C
AREEM
MF, H
UNTER
BD, N
AGY
E., R
EAD
LR, S
ANEI

B., S
PENCER
JL & S
HARIF
S. (2006). Pengembangan
a real-time PCR assay using SYBR Green chemistry for monitoring Marek's disease virus
genome load in feather
tips. J. Virol. Methods , 133 (1), 3440.
A
FONSO
CL, T
UMLIN
ER, L
U
Z., Z
SAK
L., R
OCK
DL & K
UTISH
GF (2001). The genome of turkey herpesvirus. J.
Virol., 75 , 971978.
B
ACON
LD, W
ITTER
RL & S
ILVA
RF (2001). Characterization and experimental reproduction of peripheral
neuropathy in white leghorn chickens. Avian Pathol., 30 , 487499.
B
AIGENT
SJ & D
AVISON
F. (2004). Marek's disease virus: biology and life cycle. In: Marek's disease: An Evolving
Problem, Davison F. & Nair V., eds. Elsevier Academic Press, London, UK, 6277.
B
AIGENT
SJ, P
ETHERBRIDGE
LJ, H
OWES
K., S
Mith
LP, C
URRIE
RJW & N
AIR
V. (2005). Absolute quantitation of

Marek's disease virus genome copy number in chicken feather and lymphocyte samples using
real-time PCR. J.
Virol. Methods, 123 , 5364 .
B
ECKER
Y., A
SHER
Y., T
ABOR
E., D
AVIDSON
I., M
ALKINSON
M. & W
EISMAN
Y. (1992). Polymerase chain reaction for
differentiation between pathogenic and non-pathogenic serotype 1 Marek's disease virus
(MDV) and vaccine
viruses of MDV-serotypes 2 and 3. J. Virol. Methods , 40 , 307322.
B
UMSTEAD
N., S
ILLIBOURNE
J., R
ENNIE
M., R
OSS
N. & D
AVISON
F. (1997). Quantification of Marek's disease virus in
chicken lymphocytes using the polymerase chain reaction with fluorescence detection. J
Virol. Methods , 65 , 75
81.
B
URGESS
SC & D
AVISON
TF (1999). A quantitative duplex PCR technique for measuring amounts of cellassociated Marek's disease virus: differences in two populations of lymphoma cells. J. Virol.
Methods , 82 , 2737.
C
ALNEK
BW, H
ITCHNER
SB & A
DLDINGER
HK (1970). Lyophilization of cell-free Marek's disease herpesvirus and
a herpesvirus from turkeys. Appl. Microbiol., 20 , 723726.
C
HENG

Y.-Q., L
EE
LF, S
Mith
EJ & W
ITTER
RL (1984). An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection
of antibodies to Marek's disease virus. Avian Dis., 28 , 900911.
C
OUNCIL OF
E
UROPE
(1997a). Marek's Disease Vaccines (Live). In: European Pharmacopoeia, Third Edition.
Editions of the Council of Europe, Strasbourg, France, 18141818. ISBN 92-871-2990-8.
C
OUNCIL OF
E
UROPE
(1997b). Vaccines for Veterinary Use. Chapter 5.2.2. Chicken flocks free from specified
pathogens for the production and quality control of vaccines. In: European Pharmacopoeia,
Third Edition. Edisi
of the Council of Europe, Strasbourg, France, 301304. ISBN 92-871-2990-8.
D
AVIDSON
I. & B
ORENSHTAIN
R. (2002). The feather tips of commercial chickens are a favourable source of DNA for
the amplification of MDV and ALV-J. Avian Pathol ., 31 , 237240.
D
AVISON
F. & N
AIR
V.,
EDS
. (2004). Marek's disease: An Evolving Problem. Elsevier Press, Amsterdam, the
Netherlands and Boston, USA.
H
ANDBERG
KJ, N
IELSON
OL & J
ORGENSEN
PH (2001). Use of serotype 1 & serotype 3 specific polymerase chain
reaction for the detection of Marek's disease virus in chickens. Avian Pathol ., 30 , 243249.
Saya
SLAM
A., H
ARRISON
B., C
HEETHAM

BF, M
AHONY
TJ, Y
Oung
PL & W
ALKDEN
-B
Rown
SW (2004). Diferensial
amplification and quantitation of Marek's disease viruses using real-time polymerase chain
reaction. J. Virol.
Methods , 119 (2), 103113.
L
EE
LF, K
REAGER
KS, A
RANGO
J., P
ARAGUASSU
A., B
ECKMAN
B., Z
HANG
H., F
ADLY
AM, L
UPIANI
B. & R
EDDY
SM
(2010). Comparative evaluation of vaccine efficacy of recombinant Marek's disease virus
vaccine lacking Meq
oncogene in commercial chickens. Vaccine, 28 , 12941299.
L
EE
LF, L
IU
X. & W
ITTER
RL (1983). Monoclonal antibodies with specificity for three different serotypes of
Marek's disease virus in chickens. J. Immunol ., 130 , 10031006.
Page 10
Chapter 2.3.13. Marek's disease
10
OIE Terrestrial Manual 2010
L
EE
LF, W

U
P., S
UI
D., R
EN
D., K
AMIL
J., K
UNG
HJ & W
ITTER
RL (2000). The complete unique long sequence and
the overall genomic organization of the GA strain of Marek's disease virus. Proceedings of
the National Academy
of Sciences, USA, 97 , 60916096.
M
ERIEUX
C., H
ULSE
EC, G
AUDRY
D., A
Ilan
WH, R
EGAMEY
RH,
EDS
(1974). International Symposium on
Requirements for Poultry Virus Vaccines. Proceedings of the 42nd Symposium, International
Association of
Biological Standardization, Lyon, France, August 1973. Dev. Biol. Stand ., 25 , 423.
M
INISTRY OF
A
Griculture
,F
ISHERIES AND
F
OOD
(1990). Guidelines for the Production and Control of Avian Virus
Vaksin. MAL 74. HMSO, London, UK.
N
AIR
V. (2004). Successful control of Marek's disease by vaccination . In: Control of Infectious
Animal Diseases by
Vaccination, Schudel A. & Lombard M., eds. Dev. Biol. (Karger, Basel, Switzerland), 119 ,
147154.
O
FFICE OF
F

EDERAL
R
EGULATIONS
(1989). Animals and Animal Products. Code of Federal Regulations, Vol. 9.
National Archives of the United States, USA.
R
EDDY
SK, S
HARMA
JM, A
Hmad
J., R
EDDY
DN, M
C
M
ILLEN
JK, C
OOK
SM, W
ILD
MA & S
CHWARTZ
RD (1996).
Protective efficacy of a recombinant herpesvirus of turkeys as an in ovo vaccine against
Newcastle and Marek's
diseases in specific-pathogen-free chickens. Vaccine, 14 , 469477.
R
EDDY
SM, W
ITTER
RL & G
IMENO
IM (2000). Development of a quantitative-competitive polymerase chain
reaction assay for serotype 1 Marek's disease virus. Avian Dis ., 44 , 770775.
S
CHAT
KA & N
AIR
V (2008). Marek's disease. In: Diseases of Poultry, Twelfth Edition, Saif YM et al ., eds.
Blackwell Publishing, Ames Iowa, USA, 452514.
S
HARMA
JM (1998). Marek's disease. In: A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of
Avian
Pathogens, 4th Edition. Swayne DE et al ., eds. American Association of Avian Pathologists,
116124.
S
HARMA
JM (1999). Introduction to poultry vaccines and immunity. Adv. Vet. Med., 41 , 481494.

S
ILVA
RF (1992). Differentiation of pathogenic and non-pathogenic serotype 1 Marek's disease
viruses (MDVs)
by the polymerase chain reaction amplification of the tandem direct repeats within the MDV
genome. Avian Dis .,
36 , 521528.
S
ILVA
RF, C
ALVERT
JG & L
EE
LF (1997). A simple immunoperoxidase plaque assay to detect and quantitate
Marek's disease virus plaques. Avian Dis., 41 , 528534.
S
PENCER
JL & C
ALNEK
BW (1970). Marek's disease: application of immunofluorescence for detection of antigen
and antibody. Am. J. Vet. Res ., 31 , 345358.
T
HORNTON
DH (1985). Quality control and standardisation of vaccines. In: Marek's Disease, Payne LN
ed.
Martinus Nijhoff, Boston, USA, 267291.
U
Nited
S
TATES
D
EPARTMENT OF
A
Griculture
(USDA) (1995). Code Of Federal Regulations, Title 9, Parts 1199.
US Government Printing Office, Washington DC, USA.
W
ITTER
RL (2001). Protective efficacy of Marek's disease vaccines. In: Marek's disease, Hirai K., ed.
SpringerVerlag, Berlin, Germany, 5890.
Z
HU
G.-S., O
JIMA
T., H
IRONAKA
T., I
HARA
T., M

IZUKOSHI
N., K
ATO
A., U
EDA
S. & H
IRAI
K. (1992). Differentiation of
oncogenic and non-oncogenic strains of Marek's disease virus type 1 by using polymerase
chain reaction DNA
amplification. Avian Dis ., 36 , 637645.
Z
ELNIK
V., H
ARLIN
O., F
EHLER
F., K
ASPERS
B., G
OEBEL
TW, N
AIR
V. & O
STERRIEDER
N. (2004). An enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for detection of marek's disease virus-specific antibodies and
its application in an
experimental vaccine trial. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health , 51, 6167.
*
**
NB: There are OIE Reference Laboratories for Marek's disease (see Table in Part 3 of this
Terrestrial Manual or
consult the OIE Web site for the most up-to-date list: www.oie.int).
Page 11
Chapter 2.3.13. Marek's disease
OIE Terrestrial Manual 2010
11
NB: There is an OIE Reference Laboratory for Scrapie
(see Table in Part 3 of this Terrestrial Manual or consult the OIE Web site for the most up-todate list:
http://www.oie.int/en/our-scientific-expertise/reference-laboratories/list-of-laboratories/ ).
Please contact the OIE Reference Laboratories for any further information on
diagnostic tests, reagents and vaccines for Scrapie