Prctica No 4:

Aislamiento y Siembra de Bacterias Aerobias

OBJETIVO
Adquirir conocimientos bsicos tericos y prcticos de la siembra y aislamiento de
bacterias.

INTRODUCCIN
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades ms o menos
complejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que
dependern del tipo de microorganismo y del perodo de tiempo de conservacin que se
requiera. Para ello existen tcnicas de siembra, conservacin y mantenimiento de los
cultivos microbianos.
Una tcnica esencial en Microbiologa es la de obtencin de cultivos puros, a partir de los
cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Un cultivo
puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder obtenerlo es
necesario concurrir a las tcnicas conocidas como aislamiento.
SIEMBRA
Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a las
exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicacin, si se
incuba en condiciones adecuadas, un tiempo conveniente.
Para ello una pequea porcin de cultivo o muestra, que se denomina inculo se transfiere
al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la introduccin de otros
microorganismos ajenos al inculo.
El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce como tcnica
asptica.
La toma del inculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente:
1. La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bien
puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin
hablar.
2. Coloque frente a usted el mechero y la preparacin o muestra que contiene los
microorganismos, as como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos,
placas). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos.
3. Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero.

4. El ansa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo (flamelo hasta que
alcance un rojo incandescente) y antes de retirar el inculo debe facilitarse su
enfriamiento, a fin de evitar el deterioro del material a sembrar (enfrelo en la
proximidad de la llama unos 10 segundos).
5. Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa o aguja a la llama del
mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo. Nunca debe depositarse un
tapn sobre la mesa o gradilla, pues estos elementos estn cargados de
microorganismos.
6. Cuando est destapado, mantener el tubo en la forma ms horizontal posible para
evitar que los microorganismos del ambiente, en su cada, tengan acceso al interior.
7. Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde sern
transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de que
el ansa o aguja sea introducida. Tambin se debe flamear la boca del tubo antes de
taparlo. Este procedimiento fija al vidrio los microorganismos que pueden estar en
dicha boca y tiende a crear corrientes hacia afuera (el aire tiende a salir),
disminuyendo as el riesgo de contaminacin.
8. Para retirar el inculo o sembrar medios de cultivos en cajas de Petri, coloque la
placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio
de cultivo con los microorganismos. Llvela a la proximidad de la llama del
mechero y tome el inculo con el ansa de siembra. Otro mtodo permitido consiste
en retirar el inculo a sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para permitir la
introduccin del ansa o aguja, para evitar que los microorganismos ambientales se
depositen en la superficie del medio.
9. Si la siembra se realiza con pipeta, sta debe estar convenientemente preparada y
esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta
introducindola en una solucin antisptica.
10. Transfiera el inculo a otro medio de cultivo estril, tomando las mismas
precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad
de la llama, etc.).
La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. La
primera se efecta con cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de
renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien para conocer alguna de sus
propiedades culturales o bioqumicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un
material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para
obtener cultivos puros.
TOMA DEL INCULO

Si la muestra proviene de un medio lquido, el inculo se toma agitando el

suavemente el ansa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensin
superficial en el extremo del filamento del ansa de siembra.

Si el medio es slido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (caja de

Petri), tome una pequea porcin de cultivo mediante un ligero roce con el ansa de
siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en
pico de flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequea
porcin de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colquelo en el
soporte necesario.

TRANSFERENCIA
La tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de
recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:
a) Siembra de medio lquido a medio lquido: El procedimiento se puede realizar con
ansa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos.
b) Siembra de medio slido a medio lquido: El procedimiento se puede realizar con
ansa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.
c) Siembra de medio slido a medio slido: El procedimiento se puede realizar con
ansa o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en caja de
Petri, en superficie.
d) Siembra de medio lquido a medio slido: El procedimiento se puede realizar con
ansa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en
profundidad o en caja de Petri, ya sea en superficie o por homogenizacin.
Tcnica de transferencia en tubos de ensayo.

Tcnica para medio lquido

Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los
microorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la
misma altura.
Se sostienen con los dedos ndice, medio y anular apoyndolos en el dedo meique, y se
los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualizacin de toda
la superficie del cultivo.
Con el dedo pulgar e ndice (como un lpiz) de la otra mano, se toma la pipeta estril o
el mango de Koll con su aguja o ansa en anillo y se esteriliza.
Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el ansa, de la siguiente
manera: el tapn del tubo ms alejado del operador (que es el que contiene la muestra)
entre el dedo meique y la palma de la mano; el tapn del tubo ms cercano al operador
(que contiene el medio de cultivo estril) entre el meique y el anular.

Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inculo; se siembra; se flamean

nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de los
tapones y se quema el ansa.
Como el inculo procede de un medio lquido, antes de realizar la transferencia se debe
agitar el tubo para poner en suspensin a los microorganismos que pudieran estar
depositados. Si la siembra se realiza en medio lquido, se agita el tubo sembrado para
distribuir homogneamente el inculo.
Para realizar la agitacin se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos
ndice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo ndice de la
otra mano con una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubos entre
las palmas de las manos.

Tcnicas para medio slido.

Cuando el medio de cultivo a sembrar es slido, se puede sembrar en superficie, en

profundidad o en profundidad y superficie.
a) En superficie:

Por estra: Introducir el asa o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo
diluyendo el inculo en el agua de condensacin que se acumula en esa parte, luego
mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.

Por trazo: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar
una lnea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin
ejercer presin para que no se rompa el medio.

b) En profundidad:

Por puncin: El medio de cultivo que se emplea est solidificado en tubo en forma
vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inculo
rpidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin se
realiza en el centro del medio o excntricamente.

c) En profundidad y superficie:

Por puncin y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con
mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo,
se retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta.

Tcnica de transferencia en caja de Petri.

La siembra en caja de Petri, puede hacerse:
1. En superficie.

Por estra central: Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la

introduccin del ansa con la carga de microorganismos, inicindose la estra en el
borde del medio ms alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de
la placa, luego se gira sta 180 y se contina realizando otra estra de la misma
manera. Esta divisin evita el obstculo del borde de la placa

Por estra en cuadrantes: Se divide la caja en cuatro sectores y se siembra en

estra cada uno de ellos, partiendo del borde de la caja hacia el centro. El cuadrante
a sembrar debe ser el ms alejado del operador y el inculo en cada caso puede ser
el mismo (la misma especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante.

Por diseminacin con esptula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio slido

contenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del material a sembrar, que
luego se extender por toda la superficie del medio con una esptula de
DRIGALSKY. La esptula se introduce inmediatamente despus de su uso en un
recipiente para su esterilizacin en autoclave o en formaldehdo al 5 %.

2. Por homogeneizacin:

Tcnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inculo se introduce con

el ansa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 C en
cantidad suficiente para cubrir la placa de Petri. Se homogeneiza por rotacin y se
vuelca en la placa previo flameado de la boca del tubo.

Tcnica del agar volcado: Se deposita el inculo con pipeta en el centro de la caja
de Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo fundido y enfriado a
45C. Se homogeneiza por rotacin para lo cual se le imprime a la caja movimientos
circulares, en sentido horario y en sentido antihorario y movimientos rectilneos,
horizontales y verticales.
Se debe tener en cuenta que de las cajas de Petri preparadas con medio de cultivo
para sembrar, debe eliminarse el agua de sinresis (condensacin) antes de efectuar
dicha operacin. Para tal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. de
anticipacin y dejarlas invertidas a temperatura ambiente.

EQUIPOS

Campana de Flujo Laminar

MATERIALES

Cajas Petri con agar McConkey

Cajas Petri con agar nutritivo.

PROCEDIMIENTO
Las tcnicas a desarrollar durante esta prctica son las siguientes:
1. Tcnica de transferencia en tubos de ensayo.
a) En superficie:

Por estra: Tomar la muestra problema e introducir el asa en el tubo de agar

inclinado hasta su superficie; luego mover el ansa suavemente sobre la superficie
del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte
superior del medio.
Por trazo: Tomar la muestra problema e introducir el asa en el tubo de agar
inclinado hasta su superficie; luego introducir la aguja en el tubo de agar inclinado y
trazar una lnea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo
superior, sin ejercer presin para que no se rompa el medio.

b) En profundidad:

Por puncin: Tomar la muestra problema e introducir la aguja en el tubo de agar

inclinado hasta su superficie; luego se introduce la aguja con el inculo rpidamente
en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin se realiza en el
centro del medio o excntricamente.

2. Tcnica de transferencia en caja de Petri.

a) En superficie.

Por estra central: Tomar la muestra problema y levantar la tapa lo suficiente como
para permitir la introduccin del ansa con la carga de microorganismos, inicindose
la estra en el borde del medio ms alejado del operador y se la extiende hasta llegar
al centro de la placa, se tapa la caja y se gira sta 180 y se contina realizando otra
estra de la misma manera. Esta divisin evita el obstculo del borde de la placa
Por estra en cuadrantes: Tomar la muestra problema y levantar la tapa lo
suficiente como para permitir la introduccin del ansa con la carga de
microorganismos, Se divide la caja en cuatro sectores y se siembra en estra cada
uno de ellos, partiendo del borde de la caja hacia el centro. El cuadrante a sembrar
debe ser el ms alejado del operador y el inculo en cada caso puede ser el mismo
(la misma especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante.
Por diseminacin con esptula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio slido
contenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del material a sembrar, que
luego se extender por toda la superficie del medio con una esptula de
DRIGALSKY. La esptula se introduce inmediatamente despus de su uso en un
recipiente para su esterilizacin en autoclave o en formaldehdo al 5 %.

NOTA: ANTES Y DESPUES DE TOMAR LA MUESTRA PROBLEMA ES

NECESARIO ESTERILIZAR POR MEDIO DEL MECHERO EL EQUIPO
UTILIZADO, YA SEA EL ASA DE SIEMBRA O LA AGUJA DE SIEMBRA.
PREGUNTAS
1.
2.
3.
4.

Describa las formas de reproduccin bacteriana.

Qu diferencias existe entre una siembra por difusin y por diseminacin?
Cul es el objetivo de la siembra de microorganismos?
Qu mtodos utilizara para cultivar y aislar microorganismos anaerobios?

RESULTADOS Y CONCLUSIONES.