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Es importante que el estudiante desarrolle una actitud positiva y respetuosa hacia los
microorganismos y su trabajo con ellos. El mal manejo de una tcnica puede causar la
contaminacin en su prueba e infecciones en usted; en particular cuando se trabaja con
patgenos en potencia. En el laboratorio de microbiologa es necesario observar ciertas
normas que harn de su trabajo prctico, una labor efectiva y sin riesgo.
1. En cada clase prctica es obligatorio el uso de mandil blanco y limpio, cabello
recogido (seoritas).
2. Antes de la realizacin de una prctica debe leer cuidadosamente el o los ejercicios
a desarrollar.
3. Debe mantener la mesa de trabajo libre de materiales no necesarios.
4. Es prohibido fumar, comer o aplicar cosmticos mientras permanece en el
laboratorio de microbiologa.
5. Al inicio y trmino de cada trabajo prctico deber desinfectar cuidadosamente su
rea de trabajo.
6. Cuando manipule cultivos de microorganismos, trabaje siempre bajo la proteccin
de un mechero y sin corrientes de aire.
7. Esterilicemos instrumentos de metal (asas de siembra, pinzas, etc.)siempre antes y
despus de utilizarlos con microorganismos.
8. En caso de accidentes, tales como cortes en las manos, quemaduras, salpicaduras de
cultivos vivos o absorcin de material contaminado reprtelo inmediatamente al jefe
de prcticas de laboratorio.
9. Todo material utilizado en la prctica con posible contaminacin deber ser
colocado en recipientes especiales .Los papeles de desecho sern descartados en el
tacho disponible.
10. Al trmino de cada sesin de prcticas y antes de salir del laboratorio lvese las
manos con jabn y desinfctelas con alcohol.
Observacin de Bacterias.
Las formas bacteriana s pueden ser examinadas al microscopio de dos maneras:
observando muestras frescas de clulas vivas, y observando clula muertas teidas con
ciertos colorantes .Las bacterias vivas carecen de color en preparaciones acuosas ,mientras
que en preparaciones teidas , aumentan su contraste con el medio circundante y se hacen
ms
visibles.
El distinguir
claramente
la
estructura
Tincin de bacterias.
Para entender como tien un colorante la clula bacteriana, debe entenderse en
esencia que es un colorante .La mayora de ellos constituyen sales en las cuales uno de los
iones presenta un color. Una sal es un compuesto formado por un in cargado
positivamente y uno cargado negativamente .Un colorante simple como el azul de metileno,
qumicamente constituye la sal cloruro de azul de metileno que se disocia como sigue:
Cloruro de azul de metileno = Azul de metileno + Cloruro -
Las clulas bacterianas tienen por lo general una superficie cargada negativamente
cuando el pH del medio circundante es cercano a la neutralidad, como generalmente ocurre.
La clula cargada negativamente se combina con el in positivo del azul de metileno,
cristal violeta, verde malaquita, safranina, etc.). Si el olor reside en el in negativo, se le
denomina colorante cido (eosina, etc.).
PRCTICA N 1
AMBIENTE Y MATERIALES DE LABORATORIO
Objetivo:
Conocer los diferentes ambientes de laboratorio de microbiolo ga e identificarlos.
Reconocer los distintos materiales de laboratorios de microbiologa y comprender
sus utilidades, as como de los equipos.
Fundamento.
El ambiente de laboratorio
El laboratorio de microbiologa debe ser un ambiente aislado y protegido de contaminacin
ya sea fsica qumica o biolgica.
En el laboratorio se debern de ubicar las siguientes salas o ambientes:
de
goma si se tienen.
Materiales de laboratorio
Materiales de vidrio.
Deben poseer las siguientes caractersticas:
Poseer bajo coeficiente de dilatacin, de modo que resistan los cambios bruscos de
temperatura.
Deben ser de vidrio neutro, o con mnima cantidad de lcali libre de modo que no
intervengan en las reacciones.
Transparentes
ocurren en su interior.
para preparar
De Material Diverso
Trpode:
Instrumento de metal compuesto por un anillo de metal circular apoyado sobre tres
patas equidistantes. Sirve como instrumento de soporte sobre el cual se coloca la
malla metlica y debajo del mechero Bunsen en operaciones de calentamiento.
Mechero de Bunsen:
Instrumento de metal conectado a una fuente de gas y que consta de dos llaves, una
que controla el paso del aire y otra el paso de gas con el fin de conseguir una llama
no luminosa, la cual, se utiliza para esterilizar otros materiales.
Malla metlica con amianto:
Es una malla compuesto por varios alambres entrelazados que posee en la parte
central una sustancia llamada asbesto. Se lo utiliza en operaciones de calentamiento,
permite difundir la llama a lo largo del asbesto con lo que se logra un calentamiento
moderado y se evita el contacto directo del fuego y la sustancia a calentar.
Equipos
Autoclave:
Cmara metlica de cerrado hermtico que sirve para esterilizar materiales y
eliminar muestras a vapor de presin .Posee un manmetro para controlar la presin
del vapor. En el interior se ubica una olla sostenida por un soporte, debajo de ella se
coloca el agua que al hervir desprende el vapor (El agua debe ser agua destilada o
desionizada).
Estufa u Horno Pasteur:
Sirve para incubar microorganismos que requieren una temperatura de 20- 200C o
30-300C, as como para esterilizar materiales
Incubador:
Cmara similar aun horno que sirve para incubar microorganismos en medios de
cultivo que requieren temperaturas que varan entre los 0-50 C.
Jarra de anaerobiosis:
Es una cmara que se utiliza para incubar microorganismos que necesitan
condiciones anaerobias, esta jarra no permite la entrada de oxigeno.
Bao mara:
PRCTICA N2
PREPARACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO PARA
ESTERILIZAR
Objetivo:
Aprender a preparar los materiales de vidrio para la esterilizacin como
su
posterior utilizacin.
Comprender la importancia de la esterilizacin as como la proteccin de los
materiales contra la contaminacin microbiana.
Introduccin.
Existen Varios tipos de medios de acuerdo a las necesidades nutricionales
particulares. Al preparar un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos debe
tenerse en consideracin el proveer de las fuentes de energa, carbono, nitrgeno, fsforo,
azufre y de los factores de crecimiento que sean necesarios. En la formulacin de los
medios de cultivo podemos distinguir entre medios definidos y complejos.
que
constituyen
carbohidratos, etc.
fuentes
de
polipptidos aminocidos,
vitaminas,
algunos
-Permiten
el
crecimiento
indiscriminado
de
todo
tipo
de
Dependiendo
de
la
tcnica
de
cultivo
elegido,
los
medios
mencionados
anteriormente pueden ser preparados como lquidos o slidos .Los medios mencionados
anteriormente pueden ser preparados como lquidos o slidos. Los medios lquidos
contienen los nutrientes y otros elementos en una solucin acuosa que generalmente recibe
el nombre de caldo; los medios slidos contienen adems un agente solidificante llamado
agar que se utiliza para dar parte del nombre del medio e identificarlo como slido. El agar
es un polisacrido complejo derivado de un alga marina y posee caractersticas muy tiles
para microbiologa. Muy pocos microorganismos degradan el agar de tal manera que an
despus de un periodo de crecimiento, el medio con agar se mantiene slido .El agar se
funde a 90C o al punto de ebullicin del agua y permanece en estado lquido hasta que la
temperatura desciende hasta aproximadamente 40C.
Algodn, gasa
Balanza
Esptulas
Papel indicador de pH
Pipetas graduadas
Probetas de 100 ml
Tubos de ensayo
Procedimiento
a. Caldo nutritivo (extracto de carne, 0.3 % y peptona, 0.5 %)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Coloque los tubos los tapones de algodn evitando que queden flojos o muy
compactos.
7.
8.
Esterilice los tubos con medio en un autoclave a 121 C (15 lb. de presin)
durante 15 minutos.
Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del procedimiento
anterior con la correccin en el peso para la nueva cantidad solicitada y en le
erlenmeyer a usar, debe tener unas tres veces el volumen que tendr el medio).
2.
Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en bao de agua a ebullicin hasta
que el medio luzca transparente a la luz.
3.
4.
5.
6.
c. Agar mac conkey (peptona, 1.7 %; proteosa peptona, 0.3 %; lactosa,1%, sales
biliares,0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%, rojo neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001
%)
d. Agar manitol salado (Extracto de carne 0.1 %; proteosa peptona, 1.0 %; NaCl,
7.5%; manitol, 1.0%; agar, 1.5%, rojo fenol, 0.0025%)
1.
2.
3.
4.
su
medio
en los
procedimientos
Cuestionario.
1.
2.
3.
4.
5.
PRACTICA N 3
TCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Objetivo
Conocer las diferentes tcnicas de aislamiento en medios de cultivos slidos para la
obtencin de cultivos puros de bacterias.
Identificar las diferentes formas de medios de cultivos de uso general, diferenciales
y selectivos para los cultivos de diferentes especies bacterianas.
Fundamento
Para iniciar un cultivo de microorganismos es necesario que un nmero de clulas
(inculo) sea transferido (inoculado) a un medio fresco estril .Si se quiere cultivar una
especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos, deben emplearse
tcnicas de aislamiento que permitan obtenerla en forma pura. Esto involucra un
proceso seriado de varias transferencias y la utilizacin de medios tanto comunes como
especiales,
lo tanto su apariencia en
conservacin
de
cepas
(de
forma
aerbicas
anaerbicas
Objetivo
Observar las caractersticas de crecimiento de los microorganismos al transplante en
medios de cultivo lquido y slido.
Materiales
-
Cultivo de Microorganismos de 18
horas.
Tubos
con
agar
nutritivo
inclinado.
Asa de kolle.
Mechero.
Procedimiento
1. Esterilice el asa de kolle por flameo a la llama.
2. Tome el tubo con el cultivo de 18 horas, retire el tap6n, flamee la boca del tubo al
mechero y obtenga una pequea porcin del cultivo con ayuda del asa de kolle.
Flamee la boca del tubo antes de volver a taparlo.
3. Tome el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores introduzca
el asa en el lquido para dejar el inculo. Homogenice la mezcla girando el tubo
entre las palmas de la mano.
4. Repita el procedimiento 1 para obtener m6s in6culo, pero usando esta vez aguja de
kolle.
5. Tome el tubo con agar inclinado y realice la siembra depositando el inculo a lo
largo de una sola lnea descrita desde la base de la inclinaci6n hasta el extremo.
6. Repita el procedimiento 1 para obtener inculo, usando nuevamente aguja de kolle.
7. Tome el tubo con agar vertical y realice la siembra por picadura profunda del
medio.
8. Rotule los tubos sembrados y pngalos a incubar a 37 C por 24 horas.
9. Cumplido el tiempo de incubacin, evalu el crecimiento y anote sus resultados en
la hoja adjunta, segn lo siguiente:
Distribucin en la superficie:
Uniforme o irregular
Arborescente,
equinulado,
filiforme.
Consistencia del crecimiento:
Pigmentacin
rizoide,
Microbiologa General
Caldo
Apariencia o tipo:
Cuestionario
10. Por
qu
algunos
microorganismos
desarrollan
en
caldo
un
caracterstico
Microbiologa General
Objetivo.
Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando
tcnicas de aislamiento.
Materiales.
-
Mechero
Procedimiento
a) Aislamiento por estras
1. Tome el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del
asa o aguja de kolle previamente esterilizada a la llama, retire inoculo. Considere
todas las recomendaciones antes dadas para el trabajo en asepsia.
2. Tome la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda de los dedos
pulgar e ndice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se
encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No descubra por completo la
placa, as evitara mayor contaminacin. Con el asa cargada de inoculo, haga estrias
sobre toda la superficie del medio, procurando trazar una ultima estra en un espacio
libre. Cierre la placa.
3. Esterilice el asa a la llama nuevamente.
4. Repita los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey.
2
Microbiologa General
Microbiologa General
Cuestionario
1. Qu procedimiento seguira a continuacin del desarrollado en estos ejercicios
para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? Como
podramos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las
colonias aisladas?
2. Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de cultivo?
3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el
nmero total de colonias por gramo. Plantee una metodologa cuantitativa basada en
diluciones sucesivas para resolver el problema.
4. En qu consiste la tcnica del nmero ms probable y que usos tiene?
5. De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?
6. Qu tcnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaerbicos?
Microbiologa General
PRCTICA N4
PREPARACIN DE UNA MUESTRA FIJA PARA TINCIN
Objetivos:
Aprender las tcnicas de preparacin de frotis, de fijacin y coloracin ms
utilizadas en el estudio microscpico de cultivos bacterianos.
Fundamentos:
Previo al desarrollo de una tcnica de tincin, el material a ser observado debe ser
fijado, es decir adherido a una lmina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tincin.
Si la preparacin no es fijada, la muestra tiende a perderse durante los procedimientos
de tincin. El procedimiento de fijacin mata al microorganismo, coagula el
protoplasma celular y provoca su adhesin a la lmina de vidrio .Un agente de fijacin
ideal preserva la estructura de la clula en la forma y posicin normal sin causar la
aparicin de artefactos (estructuras no presentes en las clula viviente). Aunque el
calentamiento es el agente de fijacin ms comn, el alcohol y otros agentes qumicos
tambin pueden ser usados satisfactoriamente.
Materiales
-
Mechero de alcohol
Asa de Kolle
Procedimiento
1. Coloque una gota de agua sobre una lmina porta objeto completamente limpia.
Con ayuda del asa de Kolle coloque sobre la gota una pequea porcin de la
Microbiologa General
Microbiologa General
Fundamentos.
La tincin simple construye una tcnica sencilla y directa que a travs del uso de un
colorante, nos permite contrastar y diferenciar los microorganismos de su entorno.
Los colorantes bsicos, los cales se utilizan comnmente para teir microorganismos,
difieren en el grado de reactividad con las clulas. El azul de metileno reacciona con las
clulas cargadas negativamente a la tasa ms baja, tomando de 20 a 30 segundos para
teir apropiadamente una preparacin microbiana. El cristal violeta es ms reactivo y
generalmente requiere slo 10 segundos. El carbol fucsina es un colorante an ms
reactivo y generalmente requiere solo 15 segundos. Su reactividad es tan grande que
ciertamente puede dificultar una tincin apropiada, sobre todo cuando la muestra
contiene abundante materia orgnica.
Materiales
-
Aceite de inmersin
Colorantes bsicos:
Azul de metileno
Cristal violeta
Carbolfucsina
-
Papel secante
Piseta de agua
Microbiologa General
Procedimiento
1. Coloque las lminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tincin.
2. Agregue 5 o 6 gotas de cada colorante dejando que acten por un tiempo de 30
segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta; y 5 segundos
para la carbolfucsina.
3. Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lmina con la piseta de
agua.
4. Seque las lminas al aire o dentro del papel secante
5. Examine las preparaciones teida bajo el objeto de inmersin (100 150 x) de un
microscopio compuesto.
6. Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamao,
forma y agrupaciones que se presenten.
Cuestionario.
1. Cuales son las asociaciones ms frecuentes en las bacterias?
2. En que rango de tamao se definen las bacterias?
3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?
4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?
5. Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes
empleados?
Microbiologa General
PRACTICA N5
TINCIN DIFERENCIAL GRAM Y TINCIN DIFERENCIAL CIDO
RESISTENTE.
Objetivo.
Demostrar a travs de la tcnica de tincin diferencial de Gram la existencia de dos
grupos principales de bacterias.
Distinguir a travs de dos tcnicas de tincin diferencial la presencia de endosporas
bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.
Fundamento.
Tincin diferencial Gram
Los microorganismos no slo difieren qumicamente de su entorno, sino tambin
muestran diferencias fsicas y qumicas entre ellos. Esto da lugar a que puedan
reaccionar diferencialmente ante un procedimiento de tincin. La tincin diferencial por
lo tanto, nos permite distinguir entre grupos de microorganismos .En particular, la
tincin de Gram, es la ms utilizada de las tcnicas de tincin diferencial para distinguir
entre dos grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.
La diferencia entre estos dos tipos de clulas radica en la variacin de capas que
conforman sus paredes. La pared de la gram-positivas es principalmente una gruesa
capa de peptidoglucano, mientras que las gram-negativas la pared es una multicapa
formada por una capa de peptidoglucano rodeada por una capa externa de protena y
lipopolisacrido. La diferente permeabilidad de estas estructuras de superficie ante los
reactivos utilizados en la tincin Gram, permite la diferenciacin en la coloracin final.
Microbiologa General
10
Microbiologa General
Procedimiento.
1. Prepare una lmina fija de cada uno de los cultivos microbianos proporcionados y
una lmina fija con la mezcla Streptoccus y Escherichia coli
2. Agregue cristal violeta y deje que acte por 30 segundos.
3. Enjuague con agua
4. Cubra la pelcula teida con lugol y deje que acte por 30 a 60 segundos.
11
Microbiologa General
Enjugue con agua y seque la lmina al aire o dentro del papel secante.
Microbiologa General
Tincin De Endosporas
Las especies del genero Bacillus y Clostridium producen una estructura denominada
endospora. A diferencia de la clula la endospora es una estructura resistente capaz de
sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables, en condiciones extremas de
alta temperatura o bajo la accin de agentes desfavorables, en condiciones extremas de
alta temperatura o bajo la accin de agentes qumicos.
Existen variadas tcnicas que se utilizan para la tincin de endosporas. Destacan entre
ellas la tcnica Drner y la de Schaeffer & Fulton. En la primera se emplea carbol
fucsina para teir la espora y nigrosina como agente decolorante y de tincin negativa;
la espora se tie de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la estructura aparece sobre
un fondo oscuro .La tcnica se Schaeffer y Fulton emplea carbolfucsina para teir la
espora, alcohol cido como decolorante y verde malaquita como colorante de contraste;
la espora se tie de rojo y la parte vegetativa de verde. Ambas tcnicas emplean fenol y
alta temperatura como agentes coadyugantes para lograr la penetracin de la Fucsina en
la estructura de la espora.
Tcnica de Drner
Materiales
- Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp.
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Microbiologa General
- Aceite de inmersin
- Asa de Klle
- Bao de agua a 100C
- Lmina porta objeto
- Soluciones colorantes: Carbolfucsina, Nigrosina.
- Tubos con agua destilada estril.
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Microbiologa General
Procedimiento.
1. Haga una suspensin concentrada del organismo en 2 3 gotas de agua destilada
contenida en un tubo pequeo de prueba.
2. Aada igual cantidad de carbolfucsina y coloque el tubo en un recipiente con agua
hirviendo por 10 min.
3. Transfiera una gota de la suspensin de clulas hervidas en un recipiente con agua
hirviendo por 10 minutos.
4. Agregue una gota de nigrosina y extienda la mezcla con ayuda de otra lmina hasta
obtener una delgada pelcula.
5. Seque la lmina al aire o dentro del papel secante.
6. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto en inmersin.
7. Elabore los esquemas correspondientes.
Procedimiento
1. Prepare una muestra fija del microorganismo proporcionado.
2. Agregue a la preparacin carbolfucsina hasta cubrirla totalmente.
3. Con ayuda de una pinza, caliente la lmina con el colorante hacindola pasar
ligeramente por la llama del mechero hasta que observe el desprendimiento de
vapores.
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Microbiologa General
4. Mantenga esta condicin durante tres minutos , evitando que el colorante se seque o
entre en ebullicin
5. La ve con alcohol cido hasta que este resulte incoloro.
6. Enjuague con agua.
7. cubra la preparacin con unas gotas de verde malaquita dejando que acte por dos
minutos.
8. Enjuague con agua.
9. Seque la lmina al aire o dentro del papel secante.
10. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto de inmersin.
11. Elabore los esquemas correspondientes.
Cuestionario
1. Bajo que circunstancia la tincin diferencial de Gram podra resultar errada?
2. Que efecto traera reemplazar el lugol con otro agente oxidante.
3. Podra usted variar el colorante primario y el contraste obteniendo los mismos
resultados?
4. Cul es la influencia del pH? en la reaccin Gram?
5. Liste cinco ejemplos de bacterias gram positivas y cinco de Gram negativas,
sealando su importancia.
6. Cual de los mtodos utilizados le permiti observar mejor las endosporas
bacteriana? A qu atribuye la diferencia?
7. Qu efecto producir el reemplazar el alcohol cido por otro decolorante como el
alcohol cetona?
8. Qu otros gneros de bacterias pueden formar endosporas?
9. Revise otras tcnicas de tincin de esporas y comprelas con las tcnicas usadas en
este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.
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Microbiologa General
PRACTICA N6
MICROORGANISMOS DEL AIRE
Objetivo.
Observar el desarrollo de hongos misceleares y levaduriformes en sustrato de
diferente origen e identificar los gneros ms frecuentes.
Observar las muestras diversas para obtener crecimiento bacteriano en colonias
aisladas (cultivo y aislamiento), adems del estudio de reacciones hemolticas en
una amplia variedad de microorganismos.
Materiales.
-
Agar Sangre
Agar sabouraud
Cristal violeta
Safranina
Lugol
Alcohol Cetona
Azul de metileno
Procedimiento.
a) Observacin macroscpica
Hongos y levaduras en Agar Sabouraud
1. Observe cuidadosamente cada sustrato infectado y determine el tipo de colonia que
desarrolla.
2. Describa el aspecto externo de las colonias de hongos
Reacciones Hemolticas en Agar Sangre Humana
1. Observe las caractersticas de las colonias deacuerdo a las reacciones hemolticas.
Hemlisis alfa: lisis parcial de los glbulos rojos. Se observa un halo de
color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la
oxidacin de la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color
17
Microbiologa General
Materiales.
-
Microbiologa General
Procedimiento.
1. Elija u punto determinado en el ambiente que quiera evaluar.
2. Destape la placa petri exponiendo al medio de cultivo al aire (Se asume que las
esporas de hongos se encuentran suspendidas). El tiempo de exposicin puede ser
de 5 a 10 minutos. Vuelva a tapar la placa identifiquela con su nombre, grupo y
lugar muestreado.
3. Trabaje de manera similar para cada placa y lugar.
4. En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 C por cuatro o cinco das.
5. Transcurrido el tiempo, examine las placas y realice una descripcin detallada de las
mismas.
Cuestionario.
1. Qu gneros de Hongos abundan frecuentemente en el medio ambiente?
2. Qu variaciones medio ambientales modificara sustancialmente la presencia de
hongos? Formule su respuesta tomando en cuenta modificaciones en cantidades y
en diversidades de especies.
3. Podran las especies de hongos patgenos estar presentes en el aislamiento de
hongos que usted realizo?
4. Cul es la diferencia entre microorganismos exigentes y no exigentes?
5. Cules son los tipos de reacciones hemolticas?
19
Microbiologa General
PRACTICA N7
AISLAMIENTO DE COLIFORMES
Objetivos
Familiarizarse con la tcnica de preparacin de muestras slidas.
Determinar la prueba positiva sobre la presencia de coliformes en la muestra.
Fundamento.
Streptococcus.
Son cocos gram (+) de forma esfrica u ovoide que crecen en pares o longitudes
variada. No forman esporas, son catalasa negativa, inmvil, algunos capsulados, y son
anaerobios facultativos. Existen 25 especies identificadas.
A pesar de ser gram (+) pueden convertirse en gram (-) a medida que el cultivo
envejece. En consecuencia su pared consta de:
1. Peptidoglucano, que le confiere rapidez.
2. Protenas.
3. cido teicoico.
Para la clasificacin de streptococcus existen dos criterios que son muy tiles: Segn la
hemlisis y segn el criterio de Lancefield.
Genero Escherichia.
Son enterobacterias, es decir bacterias en forma de bacilos, gram (-), de 2-4 m de
largo, con bordes redondeados, no esporulados. Su metabolismo es respiratorio y
fermentativo. Este gnero contiene ms de veinte gneros y ms de cien especies.
20
Microbiologa General
Por ser la entero bacterias gram (-), su envoltura celular est formada por: Membrana
celular, pared celular (contenida en el periplasma) y membrana externa, siendo sus
componentes individuales:
1. Fosfolpidos.
5. Cpsula.
2. Peptidoglucano.
6. Fimbrias.
3. Lipopolisacrido.
7. El
antgeno
enterobacterial
comn.
Este gnero tiene una estructura antignica compleja, habindose detectado ms de 150
antgenos somtico o termoestables (lipopolisacridos), ms de 100 antgenos k
termolbiles (capsulares) y ms de 50 antgenos H (flagelares).
21
Microbiologa General
Aunque existe la probabilidad de reemplazar las bacterias coniformes por los virus
conocidos como colifagos (que infectan los coliformes), que se hallan presentes
constantemente en la heces humanas, desages, aparte que su deteccin es fcil y
rpida, de modo que la relacin coliformes colifagos es muy estrecha, adems los
colifagos tambin seran indicadores de enterovirus en muestras contaminadas. Por
ello se piensa que los colifagos podran ser una alternativa frente a los coliformes
Balanza mecnica.
Cucharilla.
Mechero Bunsen.
Tubos de ensayo.
Matraz Erlenmeyer.
Pipeta 1 ml.
Placas petri.
Papel craft.
Tapones de algodn.
Agar VRBA.
Alcohol.
Muestras
Licuadora.
Estufa.
analizar
(Chifn,
smola).
Procedimiento experimental.
3. Preparacin De Muestra Slida.
22
Microbiologa General
Llevamos el frasco una vez tapado con los 10 g de muestra y los 90 ml de ssp a
licuar, el tiempo necesario hasta que todo se desmenuce y la mezcla quede
uniforme.
De la SM o de la muestra original (en caso sea lquida de por s) extraemos con una
pipeta de 1 ml cerca del mechero 1 ml y lo depositamos en el tubo de ensayo con 9
ml SSP, lavamos la pipeta. Esta ser la dilucin 10 -1 .
A cada placa agregamos una delgada lmina o capa de agar VRVA, esterilizando el
autoclave, uniformizamos el contenido de la placa movindola en crculos y
esperando que el agar solidifique: siembra por incorporacin.
Luego agregamos una segunda capa y protectora de agar VRBA a las mismas
placas(esta ya deberan estar rotuladas al agregar el 1 ml de la dilucin)
Contamos las colonias que estn en el fondo de las placas y no en las superficies.
PRCTICA N8
DETERMINACIN DE BACTERIAS DEL AGUA
23
Microbiologa General
Objetivos
Determinar el nmero de unidad formadora de colonia en un mililitro de agua.
Identificar diferencias entre la flora microbiana del agua.
Identificar las bacterias presentes en el agua y comparar sus requerimientos
nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.
Fundamento.
Bacteria de aguas continentales.
Entre la flora bacteriana del suelo y las aguas continentales hay ciertas relaciones y
esto es particularmente si se trata de aguas que estn constantemente expuestas a la
contaminacin del suelo. No obstante en las aguas y arroyos slo se pueden desarrollar de
las bacterias del suelo menos exigentes. En el caso de microorganismos patgenos ms
frecuentemente transmitidos por el agua producen infecciones del aparato digestivo, como
tifoidea y clera, cuyos agentes, eteolgicos de esta se encuentran en materias fecales y la
orina de los infectados.
el
vibrin
cholerae,
aunque
tambin
suele
encontrarse
con
frecuencia
verano.
24
Microbiologa General
Tanto los virus como las bacterias de agua son ms resistentes en agua dulce que en
agua de mar.
Materiales.
- Placas petri
- Pipetas de 1 ml.
- Tubos de ensayo.
- Matraz Erlenmeyer.
- Esptulas
Reactivos.
- Muestra suelo.
- Agar VRA
- Agar nutritivo
- Violeta de Genciana
- SSP
- Zafranina
- Solucin alcohol-cetona.
- Agua destilada.
- Aceite de inmersin.
Equipos.
-
Microscopio ptico.
Mechero.
Balanza mecnica.
Estufa.
Procedimiento.
a) Preparacin de la solucin madre
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Microbiologa General
Con ayuda de una esptula depositamos 10 g de muestra (suelo frtil) sobre el papel.
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Microbiologa General
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Microbiologa General
PRCTICA N9
DETERMINACIN DE BACTERIAS DEL SUELO
Objetivos
Determinar el nmero de unidad formadora de colonia en el suelo.
Identificar diferencias entre la flora microbiana del suelo.
Identificar las bacterias presentes en el suelo y comparar sus requerimientos
nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.
Fundamento.
En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando comunidades
de diversos gneros y especies, por lo que es casi imposible encontrar un hbitat con un
solo gnero de microorganismos.
(estudios sinecolgicos).
Se
han
empleado
una
serie
Los mtodos
asa previamente esterilizada y colocarla sobre una superficie del medio de cultivo
slido que se encuentra en una caja de Petri, Posteriormente se trazan una serie de estras
pegadas al borde de la caja, esterilizando el asa al final de cada serie.
El mtodo
28
de
Microbiologa General
Esto es posible
ya que a partir de una muestra perfectamente medida se realizan una serie de diluciones,
lo que nos da la oportunidad de conocer la cantidad exacta de muestra en cada tubo de
dilucin, si despus de sembrar la muestra en nuestro medio conocemos el nmero de
colonias que crecieron, podemos multiplicar este por la inversa de la dilucin y por
la inversa de la alcuota que sembramos, dndonos como resultado el nmero de
unidades formadoras de colonias (UFC) por unidad de volumen o masa de la muestra
original.
Para el trabajo con ambos procedimientos se requiere procesar las muestras bajo
condiciones de esterilidad con objeto de no incorporar microorganismos de otra
fuente extraa a la que estamos analizando.
Materiales.
-
Muestra de Suelo.
Horno o incubadora
5 pipetas de 1 mL estriles
Asa bacteriolgica
Varilla acodada
Alcohol
Metanol
destilada estril.
Agua destilada
Capsulas de porcelana
cultivo
Pinzas
levaduras (Saboraud)
Mechero
para
hongos
Procedimiento.
a) Mtodo de la disolucin.
1. Pesar 10g de suelo y colocarlos en condiciones de esterilidad en una botella
de dilucin conteniendo 90mL de agua destilada estril.
29
Microbiologa General
2. Por medio de una pipeta de vidrio, tomar 1mL del sobrenadante de la botella
de dilucin, teniendo cuidado de no arrastrar sedimento y vaciar en condiciones
de esterilidad a un tubo de ensaye con 9mL de agua destilada estril. Agitar
perfectamente para homogenizar la muestra (figura 1).
3. A partir del tubo anterior, tomar 1 mL y vaciarlo a otro tubo de ensaye con 9 mL de
agua destilada estril, agitar perfectamente.
4. Repita el punto tres, tomando siempre 1mL del ltimo tubo inoculado y vacelo a un
tubo nuevo con 9mL de agua destilada estril (figura 1).
5. Al terminar la serie de tubos, tomar de los tres ltimos tubos 0.1mL y colocarlo en
el centro de tres cajas de Petri perfectamente marcadas para su identificacin.
6. Tomar una varilla acodada esterilizarla flameando con alcohol, y una vez
fra, distribuir la muestra sobre toda la superficie de la caja, girando sta y
moviendo la varilla en un sentido.
7. Colocar las cajas en una canastilla e incubarlas a 35 37 C durante 24 h.
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Microbiologa General
Transcurrido
el
tiempo
de
incubacin
para
las
cajas
utilizadas en ambos
Microbiologa General
Cuestionario
1. Desde el punto de vista prctico, qu ventajas y desventajas encontr al utilizar los
dos mtodos de aislamiento?
2. Qu
caractersticas
generales
tienen
las
colonias
bacterianas
que
las
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Microbiologa General
PRCTICA N10
ACTIVIDAD ENZIMTICA Y METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
AMINOCIDOS Y UREA
Fundame nto
Para el caso de los microorganismos, la mayora de los carbohidratos de que
disponen se encuentra en la forma de polisacridos. Un ejemplo comn de estos
compuestos es el almidn. Un organismo puede hidrolizar almidn solo si produce la
enzima amilasa. Como no todos los microorganismos producen amilasa, la hidrlisis del
almidn puede ser usado para ayudar a identificar microorganismos desconocidos.
Materiales
-
Medios de cultivos: Placas de agar almidn, agar gelatina, agar casena, agar
grasa.
Asa de kolle
Mechero
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Microbiologa General
Procedimiento
1. Con un plumn marcador dividir la base de la placa en cuatro secciones, enumerarlos
como I, II, III y IV.
2. Utilizando la aguja de Kolle, colocar una estra de cada cultivo en un cuadrante.
Dejar el primer cuadrante como control.
3. Invertir las placas e incubar a 37" C por 18 - 24 horas.
Materiales
-
Medios de cultivos: Agar Kligler, agar citrato de Simmon's, caldo lisina, caldo
triptfano y caldo urea
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Microbiologa General
Asa de kolle
Mechero
I. Degradacin de carbohidratos
Interpretacin
Parte inferior amarillo
Fermentacin de glucosa
Fermentacin de lactosa
Rojo de fenol
Adems:
H2 S positivo
Procedimiento
1. Inocular con la aguja de Kolle sobre la superficie inclinada del agar citrato
de Simmon's
2. Incubar a 37 C por 24 horas
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Microbiologa General
3. La prueba es positiva cuando el medio vira del color verde al azul o cuando
se observa crecimiento del microorganismo.
c) Degradacin de aminocidos
Descarboxilacion de la lisina
La Descarboxilacin de un aminocido consiste en la perdida de su grupo carboxilo
para producir una amina y CO 2 . La descarboxilacin bacteriana puede ser demostrada por
la desaparicin del aminocido, usualmente un procedimiento complejo, o la formacin de
amina y CO 2 . Como la reaccin resulta en la acumulacin de una amina (la cual es bsica),
la descarboxilacin tambin puede ser demostrada midiendo la elevacin del pH.
Procedimiento
Inocular con el asa de Kolle en el caldo lisina un microorganismo determinado
Incubar a 37 C por 18 - 24 horas.
Interpretacin
Durante las primeras horas el medio se torna amarillo por fermentacin de la
glucosa contenida en el medio y produciendo cido. Posteriormente, al ocurrir la
descarboxilacin del aminocido, el medio se torna alcalino y el indicador vira al rojo
prpura.
Degradacin del triptfano
El indol es un compuesto que contiene nitrgeno que puede ser formado de la
degradacin del aminocido triptfano por ciertas bacterias. La prueba de indol es
importante porque solo ciertas bacterias forman indol, y pueden ser fcilmente
detectadas. De este modo, la degradacin del triptfano es otra reaccin de diferenciacin.
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Microbiologa General
Las bacterias que poseen triptfanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano
con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco.
Procedimiento
Inocular con el asa de Klle en el caldo indol un microorganismo determinado
incubar a 37 C por 24 horas. Luego de la incubacin agregar reactivo de Kovacs al
tubo de ensayo.
Interpretacin
La formacin de un anillo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo,
indica la presencia de indol.
Degradacin de la urea
Procedimiento
Inocular en tubos con caldo urea los microorganismos a ensayar. Incubar junto
con un tubo control a 37 C por 24 horas.
Interpretacin
La presencia de un color prpura indica la degradaci6n de la urea por la
ureasa. Anotar los resultados en la hoja de reporte.
Cuestionario
1. Nombre algunos cidos producidos por bacterias. Mencione el gnero principal
que producen cada uno de estos cidos.
2. Algunos microorganismos usan carbohidratos sin formar niveles de cido
detectables. En tales casos, cmo podra determinar si el carbohidrato ha sido
utilizado?
3. Por qu las amilasas, gelatinazas, caseinazas y lipasas son clasificadas como
enzima hidrolticas?
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Microbiologa General
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Microbiologa General
PRCTICA N11
CONTROL DE CRECIMIENTO POR AGENTES QUMICOS
Objetivo
Determinar el efecto bactericida o bacteriostatico de algunos agentes qumicos
Fundamento.
Existen infinidad de compuestos qumicos que afectan la viabilidad de los
microorganismos. Hay sustancias qumicas que pueden interferir o eliminar el desarrollo
bacteriano tales como desinfectantes, colorantes, metales pesados y sus compuestos,
antibiticos, etc. Aqu nos ocuparemos de los que inhiben el crecimiento o matan a la clula
y de modo especial de algunos productos qumicos que se emplean para prevenir la actividad
infecciosa o destructora de los microorganismos.
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Microbiologa General
Materiales
-
Cultivos en caldo nutritivo: Bacillus sp, E. co/i, Salmonella sp, Staphylococcus sp.
Placas estriles
Pinzas
Asa de Kolle
Reactivos
-
Soluciones colorantes:
Cristal violeta:
Verde malaquita:
Azul de metileno:
l0.5%, 1 % y 3%
0.5%, 1 % y 3%
0.5%, 1 % y 3%
Procedimiento
1. Colocar dos asadas de uno de los cultivos bacterianos a los tubos con los medios
licuados, mezclar bien y verter el contenido de los tubos en las placas petri. Dejar
enfriar.
2. Despus de la solidificacin del medio dividir la superficie de la placa en seis
partes iguales con un plumn marcador.
3. En condiciones aspticas, coger un disco de papel de filtro con las pinzas y
sumerja ligeramente uno de sus bordes en una de las soluciones antimicrobianas.
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Microbiologa General
Una vez que el colorante ha impregnado el disco colquelo sobre el agar en uno de
los sectores marcados.
4. Repetir el procedimiento con cada uno de los agentes antimicrobianos y los
cultivos.
5. Incubar las placas a 37 C por 24 horas. Observar los resultados.
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Microbiologa General
EXPERIMENTO
ctedra.En ella podr comprender la importancia de los distintos tipos de metabolismo que
caracterizan a los microorganismos del suelo (autotrfico, litotrfico, organotrfico y
heterotrfico) y que permiten, entre otras actividades microbianas , la transformacin de
la materia orgnica. La columna de Winodrasky es un medio muy simple que se le
permitir observar el desarrollo de distintos tipos de microbios del suelo.
Esta columna permite el desarrollo de bacterias del tipo fotosinttico. La columna provee
un gradiente de oxigeno desde la superficie al fondo de la misma que junto a una fuente
de luz crea un ambiente adecuado para organismos aerobios y bacterias fotosintticas
(anaerbicas). El tipo de suelo y los nutrientes determinan las variedades de organismos
que aparecen en la columna luego de un cierto tiempo. La capa acuosa de la parte superior
soporta el desarrollo de una mezcla de protozoos, hongos y algas. Todos estos
microorganismos son aerobios, teniendo estilos de vida y requerimientos nutritivos
diferentes. En el fango anaerbico se encuentran las bacterias fotosintticas (Brock y
Madigan, 1991).
PREPARACION DE LA COLUMNA
Metodologa de trabajo
Mezclar 1gr de CaSO 4 con 2g de CaCO 3 y 0.5 g de papel pulverizado por 2mm.Se puede
utilizar suelo de distinto origen (jardn, campo, fondo de estanque, etc). Colocar la mezcla
preparada en un cilindro de vidrio (Pj, Una probeta) y mezclar suavemente con el objeto
de remover los poros de aire de mayor tamao .Agregar agua para humedecer la mezcla
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Microbiologa General
de suelo y con una varilla remover las burbujas de aire. Agregar suelo adicional , sin
aditamentos , y volver a agregar agua hasta que la columna este llena en un 80% de su
capacidad. Cubrir el cilindro utilizando una luz incandescente de baja intensidad (60 wats;
longitud de onda 720-1000 nm) .Es til cubrir la columna con papel de aluminio los
primeros 7-8 das , para protegerlas de la luz. Durante ese periodo comienzan a desarrollar
organismos heterotrficos con respiracin anaerbica, facilitando la formacin de un flujo
de H2 S y CO 2
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