PRCTICA.

9:

AGAR KIA (KLIGLER IRON

AGAR)

2n de laboratori de diagnstic clnic

Crdit 5: Microbiologia

1.OBJECTIU:

Sembrar un medi en bec de flauta per picadura i en superfcie.

Realitzar una prova bioqumica per a identificar microorganismes.
Identificar el gnere (i espcie, si podem) dels microorganismes utilitzats en la
prctica.

2.FONAMENT TERIC:
2.1.Els Enterobacteris :
Sn de lordre dels Enterobacteriales i de la famlia dels Enterobacteriaceae) sn
bacteris Gram negatius que contenen ms de 30 gneres i ms de 100 espcies i que
poden tenir morfologia de bacils o cocs. Els membres d'aquest grup formen part
especialment de la microbiota de l'intest (anomenats coliforms), tot i que tamb
d'altres rgans de l'sser hum i d'altres espcies animals. Algunes espcies poden
viure en el terra, en laigua o en les plantes. Sucumbeixen amb relativa facilitat a
desinfectants comuns, incls el clor. Sovint es troben espcies d'enterobacteris en la
bio-indstria: per comprovar la sanitat de la fermentaci de formatges i productes
lctics, alcohols i en tractaments mdics, com la producci de toxines en l's de
cosmtics i fabricaci d'agents antivirals de la indstria farmacutica, etc.

2.2.Composici en g/l del medi agar KIA:

Extracte de carn 3.0

Glucosa 1.0

Extracte de llevat 3.0

Clorur sdic 5.0

Peptona 20.0

Citrat frric amnic 0.5

Lactosa 10.0

Tiosulfat sdic 0.5: font de sofre, els bacteris el redueixen produint cid
sulfhdric (precipitat negre)

Vermell de fenol 0.03: indicador, si vira a rosat, indica basicitat del medi, si s
groc indica acidificaci (derivada de cid de la fermentaci)

 2.3.Proves que valorarem:

Utilitzaci dels hidrats de carboni (canvi de pH):

No fermentaci de glucosa ni de lactosa K/K: bec i fons alcal (vermell). El medi

salcalinitza degut a la formaci damines a partir de protenes. Aquest podria
ser una Pseudomona aeruginosa (bacil no Enterobacteriaceae gram-).

Fermentaci de glucosa i no de la lactosa K/A: bec alcal (vermell) i fons cid

(groc). Aquests poden ser Shigella, Proteus, Salmonella, etc...

Fermentaci de glucosa i lactosa A/A: bec i fons cid (groc). El medi sacidifica
degut a la formaci dcids orgnics. Aquests poden ser E.coli, Klebsiella,
Enterobacter, etc...

Producci de gas:

Aparici de bombolles de CO2 i H2 com productes finals del metabolisme de la

glucosa a la part inferior del medi. Es denota amb un cercle al voltant del
smbol que indica lacidesa o basicitat (K/A, K/K, A/A).

Producci de sulfur dhidrogen:

Es detecta per la formaci de sulfur ferrs (FeS) que s de color negre. Com
que es requereix un medi cid perqu un microorganisme produeixi H2S, un
fons negre sha de llegir com a cid, tot i que el color groc estigui enfosquit pel
precipitat negre. Sindica amb una S al costat del smbol que indica lacidesa o
basicitat a la part inferior del tub.

2.4.identificaci dels microorganismes:

Escherichia coli: s una enterobactria que es troba generalment en els

intestins animals, per se'l pot trobar a altres llocs, ja que s un organisme
ubico. Aquesta i altres bacteris sn necessries per al funcionament correcte
del procs digestiu, a ms de produir les vitamines B i K. s un bacil que
reacciona negativament a la tinci de Gram (gramnegativo), s anaerobi
facultatiu, mbil per flagels pertrics (que envolten el seu cos), no forma
espores, s capa de fermentar la glucosa i la lactosa i la seva prova de IMVIC
s ++ -.s un bacteri utilitzat freqentment en experiments de gentica i
biologia molecular.

Shigella dysenteriae: s un bacteri amb forma de bacil del gnere Shigella,

habitant normal del tracte gastrointestinal hum i que pot causar shigellosis
(disenteria bacteriana). s un bacteri Gram-negativa, no formadora d'espores i
no-mtil. Es propaga contaminant l'aigua i els aliments, causant les ms
severes disenteries causa de la seva potent i mortal toxina Shiga, encara que
altres espcies tamb poden ser agents de disenteria. Encara que sn
aneerobios facultatius, per creixen millor en condicions aerbies. Les colnies
convexes, circulars i transparents amb vores ntides arriben a un dimetre
d'aproximadament 2 mm en 24 hores. Fermenta la glucosa per no la lactosa.
Forma cid a partir de carbohidrats, per poques vegades produeixen gas.
Produeix una exotoxina termolbil que afecta l'intest i el sistema nervis
central. La exotoxina s una protena antignica mortal per als animals
d'experimentaci. Actua com enterotoxina i produeix diarrea. En humans tamb
inhibeix l'absorci de sucre i aminocids en l'intest prim. Actua com
neurotoxina i aquesta substncia pot contribuir a la gravetat extrema i
naturalesa mortal de les infeccions per S. dysenteriae.

Pseudomona aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa s un bacteri Gramnegativa, aerbica, amb motilitat unipolar. s un patogen oportunista en
humans i tamb en plantes. Secreta una varietat de pigments com piocianina
(blau verds), fluorescena (groc verds fluorescent) i piorrubina (vermell bru).
s sovint identificada, de manera preliminar, per la seva aparena perlada i olor
de ram in vitro. La identificaci clnica definitiva de P. aeruginosa freqentment
inclou, tant identificar la producci de piocianina i fluorescena com determinar
la seva habilitat de crixer a 42 C. P. aeruginosa s capa de crixer en
combustibles com queros o gasoil, ja que s un microorganisme capa de
nodrir a partir d'hidrocarburs, causant estralls de corrosi microbiana, i creant
una gelatina fosca que de vegades s'identifica inadequadament amb una alga.

3. MATERIAL:

Materia

Foto

al

Materi

MEDI

INCUB

KIA
ADORA

NANSA

GRAD

DE
ETA
KOLLE

BECBUNS
EN

Foto


4.PROCEDIMENT:
PROCEDIMENT 1: Reconstituci i sembra dels microorganismes.

Primer de tot preparem el lloc de treball engegant el bec-bunsen per

proporcionar un ambient estril. Seguidament agafem el medi de tioglicolat,
reconstitum els microorganismes i ho deixem incubar com a mnim 24 hores.
Passat aquest perode de temps procedirem a la sembra en Agar TSA. Un cop
sembrats els medis de cultiu, els incubarem a 37C durant 24 hores, i a partir
de les colnies pures crescudes en els medis realitzarem les proves
bioqumiques.

PROCEDIMENT 2: inoculaci dels medis

Primer de tot preparem el lloc de treball engegant el bec-bunsen per

proporcionar un ambient estril. Prepararem tot el material necessari per a la
realitzaci de la prctica i seguidament identifiquem cada tub de Agar KIA (3)
amb el nmero de la mostra a sembrar, la data de sembra i una identificaci del
grup de treball. En el nostre cas hem posat: per la mostra 1 (M1, 9-03-15, LL) ,
la mostra 2 (M2, 9-03-15, LL) i la mostra 3 (M3, 9-03-15, LL).

En cada tub realitzarem dues sembres per picadura. Cal treballar a prop del
bec Bunsen per intentar que la sembra es realitzi amb esterilitat i sense
contaminacions. Comencem flamejant la nansa recta fins que quedi roja i la
deixem refredar per no produir la mort dels microorganismes. Recollim diverses
colnies de microorganismes amb la nansa de kolle estril (una vegada estigui
freda) del medi TSA sembrat. Seguidament obrim el medi KIA, flamegem el coll

del tub i procedim a sembrar en picadura. La picada ha se ser el ms vertical

possible, al centre del medi, introduint parts de la nansa en el medi sense
tocar les parets amb el mnec. Esterilitzem la nansa, flamegem el tap i el coll
del tub KIA i tapem.

A continuaci agafem la nansa de kolle estndard i procedirem a sembrar en

superfcie tots els tubs de medi KIA amb lincul adequat. Comencem flamejant
la nansa estndard fins que quedi roja i la deixem refredar per no produir la
mort dels microorganismes. Recollim diverses colnies de microorganismes
amb la nansa de kolle estril (una vegada estigui freda) del medi TSA sembrat.
Seguidament obrim el medi KIA, flamegem el coll del tub i procedim a sembrar
la superfcie del medi sobre el bec de flauta. Aqu ens interessa tenir
creixement, no allament.

Mantindrem una atmosfera aerbica en linterior del medi (tub no enroscat del
tot) i els incubarem durant 24-48 hores. Tamb incubarem un tub de medi KIA
sense incul que ens servir de control.

5. RESULTATS:

Mostra 1:

Producci de gas (es pot observar en el fons del tub al veure com ha elevat el

medi).
Doble color (bec alcal (vermell) i fons cid (groc). Per tant estem davant un

microorganisme que fermenta la glucosa i no fermenta la lactosa (K/A).

No esveu ennegriment del medi.

Podria ser Escherichia coli, tot i que E.coli s A/A (tan el bec com el fons de
color groc, ja que fermenta la glucosa i la lactosa i tamb produeix gas) per en
aquest cas podria ser que la sembra no shagus realitzat correctament i no

shagus produt creixement a la punta, ja que el bec de flauta no s vermell

dalcalinitat sin que s rosat com el medi inicial.

Mostra

2:

Doble color (bec alcal (vermell) i fons cid (groc), per tant estem davant un

microorganisme que fermenta la glucosa per no la lactosa (K/A).

No es veu producci de gas
Ennegriment del medi, per tant producci de sulfur dhidrogen.

Podria ser Shigella dysenteriae, ja que s un microorganisme (K/A)

Mostra 3:

Trobem tant el bec com el medi de color vermell (K/K). Per tant tenim un medi

alcal i per tant un microorganisme que ni fermenta la glucosa ni la lactoca.

No es veu producci de gas.
No es veu ennegriment del medi

Podria ser Pseudomona aeruginosa, ja que s un microorganisme (K/K).

6.EXERCICI:

Elabora un breu resum de les caracterstiques estudiades al llarg de les

diferents prctiques realitzades per al microorganisme Escherichia coli.

LEscherichia coli la podem identificar mitjanant:

1. Primer de tot cal realitzar la tinci de gram per veure si es tracta de un bacil
gram negatiu.
2. Agar Salmonella - Shigella: S'utilitza per allar bacteris lactosa negativa com
Salmonella i Shigella. Espcies de la famlia Enterobacteriaceae lactosa positives, com Escherichia coli, presenten colnies rosades en aquest tipus de
mitj.
3. Agar MacConkey: Igual que l'anterior separa els bacteris fermentadors de la
lactosa. Escherichia coli produeix colnies rosades.
4. Prova d'ureasa: Els microorganismes que hidrolitzen la urea a travs de l'enzim
ureasa, alliberen amonac qual cosa produeix un canvi de color vermell en el
medi. L'agar urea de Christensen permet la detecci de menors quantitats
d'amonac per a aquells microorganismes que produeixen menors quantitats de
ureasa s'avaluen amb aquest mtode. 1% de positivitat per a aquesta prova en
E. coli.
5. Producci de Indol: El indol s un dels productes de la degradaci de
l'aminocid triptfan. Per a la seva detecci del bacteri s conreada en brou
triptona i posteriorment s'utilitza el reactiu d'Ehrlich, el qual s ms sensible que
el reactiu de Kovacs quan s'estudien bacils no fermentadors o anaerobis la
producci de indol s mnima. 98% de positivitat per a aquesta prova en E. coli.
6. Prova de fermentaci de carbohidrats: Es recomana l's del brou de base
porpra de bromocresol contenint un determinat substrat a una concentraci de
l'1% per a la determinaci de la fermentaci de carbohidrats i alcohols per
espcies de la famlia Enterobacteriaceae. D-Sorbitol 94% de positivitat.

Lactosa 95% de positivitat. Sacarosa 50% de positivitat. Maltosa 96% de

positivitat.
7. Prova KIA: fermenta tant la glucosa com la lactosa (K/K)

7.BIBLIOGRAFIA:

https://www.google.es/imghp?hl=es&tab=wi&ei=uYBVOTbCovLaPSSgcgF&ved=0CAQQqi4oAg

https://biotaetscientia.wordpress.com/2011/06/15/pruebas-microbiologicaspara-e-coli/

www.wikipedia.com