Raport de Cercetare

Grant: nr. 121 tip AT/2003-2004

Autor: IGNAT CARMEN
Universitatea: BUCURESTI

ABERATII CROMOZOMIALE ASOCIATE CU TULBURARI ALE DIFERENTIERII SEXUALE SI

INFERTILITATE LA OM

INTRODUCERE

Lucrarea de fata si-a propus sa imbine metodele citogeneticii clasice cu cele moleculare in
scopul studierii disfunctiilor sexuale la om.
Daca in faza initiala a cercetarii, m-am axat pe aplicarea tehnicilor de bandare clasice, in
special bandarea G, teste ELIZA, test Barr, pentru cea de a doua etapa, m-am concentrat pe tehnicile
de citogenetica moleculara, in special pe tehnica FISH, si aplicabilitatea lor in domeniul geneticii
umane. Tehnica FISH ( Fluorescence in situ hybridization) este una din cele mai utilizate in
laboratoarele de diagnostic citogenetic, permitand evidentierea anomaliilor cromozomale, atat
numerice cat si structurale, chiar si in nucleii interfazici. Avantajele majore pe care le ofera sunt:
relativa simplitate a tehnicii, faptul ca poata fi folosita pe preparate deja arhivate, timpul de procesare
si analiza destul de scurt si nu altereaza morfologia celulelor.

MATERIALE SI METODE

Am luat in studiu un lot de aproximativ 200 persoane de ambele sexe, avand o

simtomatologie larga in materie de disfunctii sexuale, de la forme usoare pana la forme destul de
grave care afectau capacitatea de reproducere.

1. Obtinerea de culturi de limfocite prin metoda standard, la care in scopul optimizarii

culturilor am lucrat pe culturi pure, prin sapararea limfocitelor pe ficoll, si verificarea puritatii prin
preparate microscopice
2. Aplicarea testului Barr pe frotiuri obtinute din singe periferic, colorate May-Grunwald-
Giemsa
3. Aplicarea testului ELIZA pentru dozajul hormonal
4. Aplicarea tehnicii de bandare Giemsa, in vederea realizarii cariotipurilor.
5. Prelucrarea computerizata a imaginilor microscopice prin programul Image Pro si
realizarea cariotipurilor.
6. Aplicarea tehnicii FISH pe preparatele selectate: lamele au fost pretratate cu RNA- aza
30- 60 minute la 37 grade Celsius, spalate su 2xSSC 5 minute cu agitare, tratate cu PBS/50mM
MgCl2 5 minute si deshidratate intr-o serie de etanol 70%, 90%, 100% cate un minut fiecare.Sondele
au suferit un tratament de prehibridare dupa cum urmeaza :mixul de hibridare(2 µl DNA marcat cu
biotina+1µl Cot 1 DNA+ 7 µl MM2.1) a fost deneturat la 75 grade Celsius 5-7 minute urmat de o
tratare la gheata de 3 -5 minute si o incubare la 37 grade Celsius intre 15 minute si 2 ore. Urmatorul

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 1/6
pas a fost denaturarea metafazelor, care s-a realizat la 75 grade celsius timp de 2 minute pe o baie
de apa, urmata de mai multa spalari cu 2xSSC rece si o deshidratare cu etanol rece 70%, 90%, 100%
cate un minut fiecare
Pentru hibridizare se aplica 10 µl de mix pe lame, se acopera imediat si se lasa la 37 grade
Celsius peste noapte. Dupa hibridizare urmeaza o serie de spalari, marirea semnalului cu avidina
FITC si vizualizarea preparatelor.

REZULTATE SI DISCUTII

Din lotul de 200 indivizi luati in discutie, majoritatea (90%) prezentau dezechilibre hormonale
detectate prin metode ELISA (am avut in vedere valorile steroizilor si gonadotropilor hipofizari), dar
doar la un mic procentaj 3% dintre pacienti am intalnit, asociate, anomalii cromozomiale atat numerice
cat si structurale, si anume :
- doua cazuri de sindrom Klinefelter,
- un caz de sindrom XXX
- patru cazuri de sindrom Turner, dintre care unul clasic si trei cu anomali structurale pe
cromozomul X.
Tehnica FISH a fost adaptata pentru a putea vizualiza preparatele la microscopul cu
fluorescenta din dotarea laboratorului nostru. Am preferat marcarea cu biotina si detectarea cu avidina
FITC (verde) respectiv digoxigenina si detectata cu antidigoxigenin rodamina ( rosu).

CONCLUZII

1. Aplicarea testului Barr si a testelor ELIZA permit selectarea initiala si diagnosticarea

pacientilor cu disfunctii sexuale.

2. Cariotipul realizat prin metode de bandare G ne ofera o privire de ansamblu asupra

profilului genetic al individului studiat.

3. Utilizarea tehnicii FISH in laboratoarele de diagnostic citogenetic scurteaza timpul de

raspuns si creste precizia analizei.

4. Un alt mare avantaj pe care l-am exploatat in lucrare este faptul ca se poate aplica si pe
nuclei interfazici, nu doar pe preparate cromozomale- metafaze, cu rezultate precise- se poate
pune un diagnostic in functie de sondele utilizate.

5. Avand acesta privire de ansamblu putem trece la studierea zonelor care sunt de interes
prin intermediul tehnicii FISH. De aceea intr-un laborator citogenetic nu trebuie total
abandonate tehnicile de bandare clasica in favoarea tehnicilor moleculare, ci trebuie realizata
o combinatie intre cele doua in scopul unei analize cat mai acurate si competente.

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 2/6
1. PACIENT D.D.
DIAGNOSTIC : Sindrom Klinefelter
- PRODUS BIOLOGIC : Sange periferic din deget-frotiuri
- TIP DE ANALIZA :Test Barr

- REZULTAT : Frotiurile obtinute au fost colorate May-Grunwald-Giemsa. In urma examinarii

microscopice se constata prezenta la nivelul polimorfonucletelor neutrofile a
cromatinei sexuale.
- CONCLUZIE : Test Barr pozitiv

- PRODUS BIOLOGIC : Plasma

- TIP ANALIZA : Test ELIZA pentru determinarea nivelurilor plasmatice ale Testosteronului,
FSH si LH plasmatic
- REZULTATE : Testosteronul = 1,5 NG/ML (valori normale barbati=2,4-12NG/ML)
FSH = 50 MUI/ML (valori normale barbati=2-10MUI/ML)
LH =50 MUI/ML (valori normale barbati=1-13,8MUI/ML)

2. PACIENT : M.M.
DIAGNOSTIC : Sindrom triplu X
- PRODUS BIOLOGIC : sange periferic recoltat din deget- frotiuri
- TIP DE ANALIZA :Test Barr

- REZULTATE : In urma examinarii microscopice se constata prezenta la nivelul

polimorfonucleatelor neutrofile a cromationei sexuale.

- PRODUS BIOLOGIC : Plasma

- TIP ANALIZA : Test ELIZA pentru determinarea nivelurilor plasmatice ale Testosteronului,
FSH si Estradiolului plasmatic
- REZULTATE : Testosteronul = 0,32 NG/ML (valori normale femei= 0,1-1,2 NG/ML)
FSH = 18 MUI/ML (valori normale femei, ovulatie, ziua 14= 7-20)
Estradiol=270 PG/ML (valori normale femei, ovulatie, ziua 14= 130-370)

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 3/6
3. PACIENT : V.M.
DIAGNOSTIC : Sindrom Turner
- PRODUS BIOLOGIC : sange periferic recoltat din deget- frotiuri
- TIP DE ANALIZA :Test Barr

- REZULTAT : Frotiurile obtinute au fost colorate May-Grunwald- Giemsa. In urma examinarii

microscopice se constata absenta cromatinei sexuale.

- CONCLUZIE : Test Barr negativ

- PRODUS BIOLOGIC : Sange periferic, recoltat pe heparina

- TIP DE ANALIZA : Cariotip

- REZULTATE : S-au efectuat culturi de limfocite din sange periferic, sacrificate la 72 ore.
Preparatele cromozomiale obtinute au fost colorate prin metoda de bandare
G cu tripsin. In urma analizarii a 50 de metafaze se constata ca pacienta
prezinta un cariotop 45,X0, caracteristic Sindromului Turner.

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 4/6
4. PACIENT : C. M. M.
DIAGNOSTIC : Sindrom Klinefelter
- PRODUS BIOLOGIC : Sange periferic din deget- frotiuri
- TIP DE ANALIZA : Test Barr

- REZULTAT : Frotiurile obtinute au fost colorate May-Grunwald-Giemsa. In urma

examinarii microscopice se constata prezenta la nivelul polimorfonucleatelor
neutrofile, a cromatinei sexuale.
- CONCLUZIE : Test Barr pozitiv

- PRODUS BIOLOGIC : Sange periferic recoltat pe heparina

- TIP DE ANALIZA : Cariotip

- REZULTAT : S-au efectuat culturi de limfocite din sange periferic, sacrificate la 72 ore. Pe
preparatele cromozomiale obtinute s-a plicat metoda de bandare G cu tripsina.
In urma examinarii a 50 de metafaze se constata ca pacientul prezinta cariotip
47,XXY, caracteristic Sindromului Klinefelter

- PRODUS BIOLOGIC : Plasma

- TIP ANALIZA : Test ELIZA pentru determinarea nivelurilor plasmatice ale Testosteronului,
FSH si LH plasmatic
- REZULTATE : Testosteronul = 1,04 NG/ML (valori normale barbati=2,4-12NG/ML)
FSH = 47 MUI/ML (valori normale barbati=2-10MUI/ML)

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 5/6
 LH =39 MUI/ML (valori normale barbati=1-13,8MUI/ML)

5. PACIENT : V.M.
DIAGNOSTIC : Sindrom Turner
- PRODUS BIOLOGIC : Sange periferic recoltat pe heparina
- TIP DE ANALIZA : FISH

- REZULTAT : Aplicarea tehnicii FISH pe nuclei interfazici a dus la evidentierea prezentei

unui singur cromozom X.

BIBLIOGRAFIE

1. DIG Application Manual for Filter Hybridization Roche, Molecular Biochemicals, 2000
2. Genetica Medicala Progrese Recente. Dragos T. Stefanescu, George A. Calin, Fulvia C.
Stefanescu, Editura Tehnica Bucuresti, 1998
3. Genetica- metode de laborator. P. Raicu, I. Anghel, Veronica Stoian, Doina Duma, Elena Taisescu,
Elena Badea, Liliana Gregorian, Editura Academiei, 1983
4. Molecular Genetic Analysis of Populations. A Practical Approach Second edition A.R. Hoelzel IRL
Press at Oxford University Press 1998
5.Molecular Cloning A Laboratory Manual Second edition J. Sambrook, E.F.Fritsch, T. Maniatis, Cold
Spring Harbour Laboratory Press 1989
6. Human genetics. Problems and Approaches.Third edition. F. Vogel, A.G.Motulsky Springer 1997

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 6/6