INTRODUO

Queijo minas frescal ou simplesmente queijo minas um queijo

brasileiro. Segundo o Regulamento Tcnico MERCOSUL de Identidade e
Qualidade n145/96, "entende-se por Queijo Minas Frescal o queijo fresco
obtido por coagulao enzimtica do leite com coalho e/ou outras enzimas
coagulantes apropriadas, complementada ou no com ao de bactrias
lcticas especficas (MERCOSUL, 1996).
Os alimentos que so contaminados com maior frequncia so as
carnes processadas, cremes de leite, queijos, saladas de batata e sorvetes.
Uma vez contaminado, se o alimento permanecer sem refrigerao (
temperatura ambiente ou estufa), ocorrera o crescimento da bactria. As
amostras de S. aureus que contaminam os alimentos so geralmente
provenientes de indivduos que manuseiam esses alimentos, podendo ser
portadores assintomticos ou indivduos que apresentam algum tipo de
infeco. Os sintomas da intoxicao alimentar estafiloccica consistem de
nuseas, vmitos, diarreia e dores abdominais. Geralmente, tem incio em
torno de quatro horas aps a ingesto do alimento e duram em mdia 12 horas.
Como as enterotoxinas so termoestveis, a coco dos alimentos no as
destri (TRABULSI, 2008).
Mastite uma inflamao da glndula mamria; a mastite bovina uma
inflamao do bere. Sob o ponto de vista econmico, a doena mais
importante do gado leiteiro, por causa da baixa quantidade e da pobre
qualidade do leite produzido pelos animais infectados. A mastite pode resultar
na destruio das glndulas produtoras de leite e, em alguns casos, a vaca
pode vir a morrer. Os agentes etiolgicos das mastites podem ocasionar
doena nos individuo que consomem o leite contaminado. Diversos tipos de
bactrias podem causar mastite; o mais comum Staphylococcus aureus. A
mastite bovina , em geral, o resultado de cuidados imprprios dos animais e
pode ser prevenida pela adoo de boas prticas de higiene (PELCZAR, 1981).
Os estafilococos foram descritos por Robert Kock em 1878, em secreo
purulenta proveniente de seres humanos. Foi cultivado em meio lquido em
1880 por Pasteur. Ogston (1881), demostrou sua patogenicidade para
camundongos, e em 1884, Rosenbach caracterizou o gnero com duas

espcies. Atualmente so conhecidas 32 espcies, e dessas, 16 so

encontradas em seres humanos e podem provocar diferentes sndromes
clnicas, incluindo infeces cutneas, infeces oportunistas, infeces das
vias urinrias e infeces sistmicas (JORGE, 2008).
Embora encontrado com relativa frequncia como membro da microbiota
normal do corpo humano, o Staphylococcus aureus uma das bactrias
patognicas mais importantes, uma vez que atua como agente de uma ampla
gama

de

infeces,

variando

desde

aquelas

localizadas, geralmente

superficiais, at algumas disseminadas com elevada gravidade (TRABULSI,

2008).
O gar Baird Parker pode ser utilizado para o plaqueamento direto de
alimentos processados ou in natura, tanto na enumerao com finalidades
indicativas como na enumerao com finalidades de sade pblica. Por outro
lado, o gar BP, no capaz de suprimir completamente o crescimento de
competidores de S. aureus, particularmente outras espcies no patognicas
do gnero Staphylococcus, que produzem colnias semelhantes, havendo
necessidade de submeter as colnias tpicas a testes adicionais para
confirmao definitiva (SILVA, 2001).
Suas colnias em meio slido geralmente so lisas, brilhantes, circulares
e translucidas. S. aureus e algumas outras espcies formam colnias
amarelas, acinzentadas ou laranja, em funo da presena de grande
quantidade de pigmentos carotenoides localizados na membrana celular. Os
estafilococos esto entre as mais resistentes de todas as bactrias no
formadoras de esporos (JORGE, 2008).
Os estafilococos apresentam-se como clulas esfricas de 0,5 a 1,5 um
de dimetro, isoladas aos pares ou mais, caracteristicamente com a disposio
de cachos irregulares. So imveis e no formam esporos, Gram-positivos,
anaerbios facultativos e geralmente produzem catalase (JORGE, 2008).
Prova da catalase destina-se verificao da presena da enzima
catalase. usada para diferenciao de estafilococos, micrococos e
estomatococos dos estreptococos que so catalase-negativos. A catalase
uma enzima que decompe o peroxido de hidrognio em oxignio e gua
(JORGE, 2008).
Prova da coagulase verifica a capacidade de um microrganismo

coagular o plasma atravs da enzima coagulase. Geralmente usada para

identificao de estafilococos catalase-positiva, sendo frequentemente critrio
de virulncia e patogenicidade (JORGE, 2008).
Prova da DNAse a enzima difunde-se pelo meio de cultura, produzindo
hidrlise do DNA presente no meio. Quando da evidenciao com cido
clordrico, o mesmo precipita o DNA presente no meio. Assim, se o
microrganismo produzir DNAse, ocorre um halo transparente ao redor da
colnia, onde a enzima atuou sobre o DNA (JORGE, 2008).

OBJETIVO
Analisar a presena e/ou ausncia de Staphylococcus aureus em
amostras de queijo minas frescal atravs do meio de cultivo Baird Parker
seletivo diferencial, com confirmao por provas bioqumicas.

MATERIAIS E MTODOS
Pipetas graduadas de diversos tamanhos (1, 5 e 10mL)
Erlenmeyer
Basto de vidro
Tudos com rosca
Bico de Bunsen
Tela de amianto
Placas de petri
Ala de Drigalski
Balana analtica e semi-analtica
Esptula
Fluxo laminar
Autoclave
Pipetadores
Recipiente de plstico estril
Estante para tubos
Estufa

Lamina
Tubo Falcon
Centrifuga
Material de coleta sangunea
gua peptonada
Peroxido de Hidrognio
Plasma Sanguneo
EDTA
HCL 1 Mol
Meios de Cultura:
gar Baird Parker
gar DNAse
Emulso de gema de ovo/ soluo salina 0,9%
Telurito de potssio 1%

METODOLOGIA:
Preparao da amostra e diluies seriadas, foi extrado 10 gramas da
amostra (cone trufado), adicionou-se 90ml de gua peptonada totalizando a
1
diluio 10 , foi extrado 1,0 ml da diluio

101

e adicionou-se em um

tubo com rosca estril contendo 9ml de gua peptonada, formando a diluio
102 . Da diluio

102

foi extrado 1ml e inoculado em outro tubo com

rosca estril contendo 9ml de gua peptonada, formando a diluio

103 .

Preparao da emulso de gema de ovo/ soluo salina 0,9%: colocouse o ovo submerso em lcool 70% por 10 minutos, em seguida em fluxo
laminar separou-se a gema da clara, no qual a gema foi pesada em balana
semi-analtica, foi pipetado a mesma quantidade de soluo salina 0,9% (1/1).
Pipetou-se telurito de potssio 1% no gar Baird Parker, em seguida foi
adicionado a emulso no mesmo, que foi vertida em placa de petri.
Aps a solidificao do gar BP pipetou-se 0,1 mL do inculo em trs
placas formando as diluies, espalhou-se o inoculo com uma ala de Drigalski

e aguardou-se a completa absoro do liquido e incubou-se as placas

invertidas, a 37C/ 48 horas.
Provas Bioqumicas:
Selecionou-se as placas com presena de colnias tpicas de S. aureus
para realizao das provas bioqumicas:
Prova da Catalase.
Em uma lamina adicionado 3 gotas de peroxido de hidrognio 3%, em
seguida adicionado uma alada contendo uma colnia isolada do inoculo.
Observou-se se ocorre o borbulhamento imediato (teste positivo) ou no (teste
negativo).
Prova da Coagulase:
A prova realizada colocando-se uma ala de cultura de estafilococos
em 0,5 mL de plasma humano contendo anticoagulante (EDTA). A seguir
incubou-se a 37 C de 2/4 horas e, observou-se coagulao, o que indica prova
positiva.
Prova da DNAse:
Em meio de cultura contendo DNA (gar DNAse), foi estriado uma
alada de inoculo verticalmente, em seguida incubou-se a 37 C durante 48
horas. Aps o perodo de incubao, a placa foi coberta com HCL 1 mol. E
observou se ocorreu a formao do halo transparente em volta da rea de
crescimento.
Contagem das colnias selecionou-se as placas 20 a 200 colnias no
qual foram contadas e calculou-se o numero de unidades formadoras de
colnias (UFC) por grama da amostra, multiplicou-se o numero de colnias
pelo inverso da diluio inoculada e volume semeado (10). Usou-se notao
exponencial e apenas uma casa decimal depois da vrgula para apresentar o
resultado.

RESULTADO E DISCUSSO:
Tabela 1: Resultados obtidos atravs da contagem padro em placas.
Inoculao

101

Resultado

31

Formula: n colnias x 10 x
= 31 x 10 x 10= 3,1 x

102

103

103
11

101 .
UFC/ g.

Provas Bioqumicas
Catalase
Tabela 2: Resultados obtidos atravs da prova bioqumica catalase.
Inoculao
Resultado

101
Positivo

102
Positivo

103
Positivo

Figura 1: Imagem ilustrativa demonstrando a reao positiva da catalase podendo ser

visualizado a formao de bolhas.

Coagulase:
Tabela 3: Resultado obtido atravs da prova bioqumica coagulase.
Inoculao
Resultado

10

Negativo

10

Positivo

10

Negativo

Figura 2: Imagem ilustrando a formao de coagulo em plasma sanguneo, positivando para S.

aureus.

DNAse:
Tabela 4: Resultado obtido atravs da prova bioqumica DNAse.
Inoculao
Resultado

101
Negativo

102
Positivo

103
Negativo

Figura 3: Imagem ilustrando a formao do halo transparente em torno da rea de crescimento.

DISCUSSO
Atravs dos resultados obtidos podemos observar a presena de S.
aureus em nmero elevado evidenciando uma contaminao prejudicial a
sade humana. Komatsu (2008) analisou a presena de estafilococos
coagulase positiva em queijo minas, onde verificou que 88% das amostras
encontraram-se contaminadas com nveis inaceitveis de estafilococos
coagulase positiva.
Segundo Brant et al., (2007) a contaminao da maioria das amostras
de queijos artesanais por estafilococos coagulase positiva podem ser
explicadas pelo fato de as principais fontes de contaminao do queijo serem a
matria-prima e a manipulao por pessoas portadoras desse microorganismo.
Assumpo et al, (2003) verificando as fontes de contaminao por
Staphylococcus aureus em linhas de processamento de queijo prato,
constataram contagens elevadas nas mos ou nos antebraos dos
manipuladores. Apesar de o tratamento trmico ter eliminado a populao de

Staphylococcus

sp.

no

leite,

as

etapas posteriores

pasteurizao

comprometeram a qualidade microbiolgica do produto final.

Com esse embasamento demonstramos que nossos resultados foram
de acordo com os dados anlisados anteriormente por outros pesquisadores.
Nos quais foi encontrado a bactria S. aureus.

CONCLUSO
Conclumos atravs dos resultados apresentados que a amostra de
alimento anlisada estava imprpria para consumo pois entrava em desacordo
com a legislao RDC N. 12, de 2 de janeiro de 2001 por conter uma
quantidade acima do numero permitido pela legislao 10. Contendo uma
quantidade de microrganismos

103 , nmero muito acima do permitido pela

legislao acima citada.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
RESOLUO MERCOSUL/GMC/RES.N145/96. Regulamento Tcnico
MERCOSUL de Identidade e Qualidade de Queijo Minas Frescal. Disponvel
em: http://www.agais.com/normas/leite/queijo_minas_frescal.htm. Acesso em:
16, abril de 2014.
JORGE, O.C. Microbiologia: atividades prticas. 2 ed. So Paulo: Santos
2008.
TRABULSI, L. R. Microbiologia. 5 ed. So Paulo: Atheneu 2008.
PELCZAR, J.R. Microbiologia: conceitos e aplicao. 2 ed. So Paulo:
McGraw-Hill, 1981
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de
anlise microbiolgica de alimentos. 2 ed. So Paulo: Varela/ 2001. 31-39 p.

ASSUMPO, E.G.; PICCOLI VALLE, R.H.; HIRSCH, D.; ABREU, L.R. Fonte
de contaminao por Staphylococcus aureus na linha de processamento de
queijo prato. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia,
Lavras MG, v.55, n. 3, p.366-370, 2003.
KOMATSU, R.S. Origem dos Queijos Minas artesanal produzidos em
Uberlndia-MG e ocorrncia de Staphylococcus Coagulase Positiva. 2008.
11p. Dissertao (Mestrado em Cincias Veterinria, Sade Animal)
Faculdade de Medicina Veterinria Universidade Federal de Uberlndia, 2008.
BRANT, L.M.F.; FONSECA, L.M.; SILVA,M.C.C. Avaliao da qualidade
microbiolgica do queijo-de-Minas artesanal do Serro-MG. Arquivo Brasileiro
de Medicina Veterinria e Zootecnia, Belo horizonte MG, v.59, n. 6, p.
1570-1574, 2007.