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Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Cincias Biolgicas


Departamento de Microbiologia

LUCIANE TEIXEIRA DE CASTRO ARAUJO

APLICAES DE LIPASES

Monografia apresentad a a o
progra ma d e Ps Graduao
em
Microbiologia
do
Depa rta mento de Microbiolog ia
do
Instituto
de
C incias
Biolgicas .
Orientador: Dr. Ary Corra Junior

Belo Horizonte
2009

LUCIANE TEIXEIRA DE CASTRO ARAUJO

APLICAES DE LIPASES

Universidade Federal de Minas Gerais


Instituto de Cincias Biolgicas
Departamento de Microbiologia
Belo Horizonte
2009

"A vida s pode existir custa de uma renovao contnua significando


ter que andar cada dia na estrada da evoluo. "
" O ritmo mais rpido da vida (...), manifesta-se nas formas orgnicas
como uma permuta qumica contnua tal como a vida psquica um
veculo em marcha que avana de curva em curva, de estao em
estao sem possibilidade de parar, assim a vida orgnica uma
renovao constante".
" Os caminhos da evoluo no nvel humano so cincia e trabalho.
A cincia pela cincia no tem valor, vale apenas como um meio de
ascenso da vida. Vossa cincia tem um pecado original: dirigir- se
apenas conquista do bem estar material. A verdadeira cincia deve ter
como finalidade tornar melhores os homens moralmente. Esta a minha
cincia".
Pietro Ubaldi - A Grande Sntese

Agradecimentos

Agradeo

tudo

todos

os

que

tornaram

possvel

energeticamente para que fosse realizado este trabalho, mesmo aos que de
longe estiveram to perto...
Ao ambiente ideal que me foi proporcionado para que tudo
acontecesse da forma como aconteceu... e em tempo e espao hbil.
Agradeo por saber que tudo pode ser melhorado e que estamos
abertos a transformaes e antecipo que serei sempre agradecida e bem
acolhida a novas crticas.
Agradeo tambm aos que fizeram o inverso, por me fornecer
ainda mais energia de ativao, possibilitando ento a concluso desta
monografia.

SU MRIO
Pg.
1

1. Res umo
2. Objetiv o
3. Intro duo
4. Rev iso de Literatura
4.1. En zimas
4.1.1. Histrico
4.1.2. Vis o geral
4.1.3. No me nclatura
4.1.4. Propriedades
4.1.5. Mecanis mo de ao
4.1.6. Fatores que afetam a v elo cidade da reao
enzimtica
4.1.7. Aplicaes de e nzimas
4.2. L ipases
4.2.1. Fontes de lpas es
4.2.2. Prop ried ades gerais de lipases
4.2.3. Re aes catalisadas po r lipa ses
4.2.4. Lipase s imobilizadas
4.2.5. Aplica es Industriais de lipases
4.2.5.1. Indstria de detergentes
4.2.5.2. Indstria de alimentos
4.2.5.3. Indstria far mac utica
4.2.5.4. Indstria de pap el e celulos e
4.2.5.5. Indstria qu mica
4.2.5.6. Trata mento de e flue ntes
4.2.5.7. Produo de Biodies el
5. Dis cusso
6. Conc luso
7. Referncias Bibliogrficas

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Lista de Figuras
Pg.

1 - Re pres entao es quemtica da trans fo rmao do


su bstrato (s acarose) em p rodu to s (g licose e frut ose ),
realizada pe la en zi ma (inv ertase).

15

2 - Modelo do mecanis mo de chav e fechadura proposto


por Emil Fish er.

16

3 - Reao geral de hidrlise de u m triac ilglicerol


ca ta lisada por lipas es.

25

4 - Hidrlise catalisada por lipase. Triac ilglicer deo


(TAG);
diac ilglicerdeo
(DAG);
monoac ilglicerdeo
(MAG); cid o grax o liv re (AGL).
5 - Reaes de bio trans formao de lipdio s.
6 - Meca nismo de c atlise por lipases.
7 - Principais mtodos de imo biliza o de enzimas .

29
30
34
39

1.

RESUMO
Nesta monografia apresentada uma reviso bibliogrfica sobre

as lipases enfocando suas diversas aplicaes devido ao seu enorme potencial


em processos industriais. As enzimas j so utilizadas pelo homem
empiricamente h milhares de anos em aplicaes prticas at serem
elucidados o modo de ao destes notveis catalisadores biolgicos.
Atualmente j se conhecem muitas enzimas e algumas delas so provenientes
de bactrias, fungos filamentosos e leveduras sendo que 75% destas enzimas
so as lipases que j esto sendo comercializadas. Com o aumento de
enzimas conhecidas, criou-se a um sistema para nome-las e numer-las,
dividindo-as em seis classes, de acordo com o tipo de reao catalisada devido
as ambigidades geradas. As lipases so da classe das hidrolases e so
solveis em gua. Agem peculiarmente na interface orgnico-aquosa, o que as
tornam catalisadoras enzimticas especializadas utilizadas em processos de
biotransformaes de leos e gorduras em diversas aplicaes e finalidades
industriais, dentre outras. Estas enzimas so bastante seletivas e favorecem
energeticamente a rota da reao atravs da catlise enzimtica. Seu stio
ativo liga ao substrato, formando produtos atravs da formao do complexo
enzima-substrato, diminuindo assim a barreira energtica entre reagentes e
produtos. As lipases microbianas so em sua maioria produzidas fora da celula,
ou seja, extracelulares, o que facilita sua extrao, isolamento e purificao.
Atravs da catlise em meio orgnico, elas transferem o grupo acila para
variveis compostas de aceptores diferentes da gua. Alguns fatores podem
afetar a velocidade das reaes e impedirem que as enzimas sejam

reutilizadas ou at mesmo inativ-las irreversvelmente. Fatores tais como


inibidores ou ativadores, pH e temperatura do meio reacional podem acarretar
desvios de linearidade na molcula da enzima e conseqentemente na sua
funo, tornando-as inviveis. Lipases catalisam reaes que geralmente so
controladas pelo contedo de gua no meio reacional, como da hidrlise, de
sua sntese reversa ou esterificao e, a de interesterificao. Sob condies
restritas de gua em reaes resultantes de concorrentes da hidrlise e
esterificao, minimizada a hidrlise da gordura mantendo dominante a
reao de interesterificao. Lipases esto sendo utilizadas em tcnicas de
imobilizao, o que permite seu melhoramento e sua reciclagem propiciando
maior estabilidade entre elas e as celulas transformado-as em catalisadores
heterogneos. As enzimas quando fisicamente confinadas ou localizadas em
regies definidas do espao podem ser reutilizadas, como quando proposta na
Primeira Conferncia em Engenharia de Enzimas. Devido a este enorme
potencial aplicativo em inmeras atividades, intensificaram-se as pesquisas
englobando lpases. importante que haja cada vez mais pesquisas, incluindo
a seleo de novas linhagens produtoras e sua otimizao, relacionadas com
esses biocatalisadores naturais devido ao fato de minimizarem o impacto
ambiental por no gerarem quantidades significativas de resduos poluentes ao
meio ambiente, tornando-os to atrativos industrialmente e de grande
relevncia nos dias atuais.

2.

OBJETIVO

O objetivo desta monografia fazer uma breve reviso


bibliogrfica sobre as lipases, estas notveis e promissoras enzimas, devido a
sua ampla aplicabilidade, seletividade, alta especificidade ao substrato e ao
seu grande potencial para diversos fins e em diversas aplicaes em
processos industriais.

3. INTRODUO
As enzimas so utilizadas em diversos processos industriais,
principalmente na indstria alimentcia, qumica, farmacutica, dentre outras.
Uma das principais enzimas utilizadas industrialmente so as lipases, que
hidrolisam leos e gorduras na interface orgnico-aquosa.
As lipases so aplicadas em diversos processos industriais, dentre
eles, a modificao de leos e gorduras na indstria leo-qumica, na indstria
txtil a enzima melhora a qualidade e as propriedades de tecidos, na indstria
alimentcia so usadas para melhorar o sabor de alimentos, como na
fermentao de salames e vinhos, so utilizadas na produo de aditivos
alimentares, como cidos graxos poliinsaturados e na indstria de detergentes,
para a remoo de manchas de difcil remoo.
Devido ao grande potencial de utilizao das lipases, vm
aumentando gradativamente pesquisas englobando isolamento e seleo de
novas linhagens produtoras de lipases, estudos de otimizao da produo e
pesquisas utilizando a enzima imobilizada.

4. REVISO DE LITERATURA
4.1. ENZIMAS
4.1.1- HISTRICO
O homem vem utilizando as enzimas empiricamente h milhares de
anos em diversos processos, tais como a fermentao do suco de uva para a
obteno do vinho, na fabricao de pes e queijos. Porm, eram apenas
aplicaes prticas, por no conhecerem o modo de ao destes catalisadores
biolgicos que s foi elucidado muito tempo depois (NELSON & COX, 2002).
Grande parte da histria das enzimas coincide com a da bioqumica.
O estudo das enzimas foi inicialmente reconhecido no sc. XVII a partir de
estudos sobre a digesto de alimentos por secrees do estmago e
posteriormente com pesquisas da converso de amido em acares simples
utilizando saliva e vrios extratos vegetais. Jean Baptista Van Helmont
considerava a transformao dos alimentos um processo qumico mediado por
fermentos. Lazzaro Spallanzani demonstrou que o suco gstrico continha um
princpio capaz de digerir a carne (DALLA-VECCHIA et al., 2004; NELSON &
COX, 2002).
Vrios cientistas se destacaram e propiciaram o progresso da
bioqumica, como Gustav Robert Kirchoff que, em 1814, utilizando extrato de
trigo demonstrou o fenmeno da converso do amido em acar. J em 1833,
Anselme Payen e Jean Franois Persoz demonstraram a converso do malte
em extrato etanlico (TIPTON & BOYCE, 2000).
Em 1850, Louis Pasteur descobriu que as leveduras catalisavam a
fermentao do acar em lcool e postulou que as leveduras eram

fermentos. Na mesma poca, Justus Von Liebig defendia idias opostas s


de Pasteur, para ele os processos fermentativos eram reaes qumicas. Em
1876, W. Frederick Khne sugeriu o termo enzima, que vem do grego e
significa na levedura, acreditando que este tipo de catalisador s atuava
dentro da clula (TIPTON & BOYCE, 2000).
Em 1897, Eduard Buchner finalizou a polmica entre Pasteur e
Liebig descobrindo que extratos de levedura fermentavam o acar, produzindo
lcool, e mesmo que as clulas fossem removidas do meio de cultura, o
processo continuava devido existncia de enzimas (NELSON & COX, 2002;
TIPTON & BOYCE, 2000).
A partir dos estudos envolvendo o isolamento e a cristalizao da
urease por James Sumner (1926) foi postulado que toda enzima uma
protena, proporcionando um grande avano nos estudos que envolvem
enzimas (DALLA-VECCHIA et al., 2004). Essa premissa permaneceu
controvertida durante algum tempo at ser completamente aceita aps John
Northrop e Moses Kunitz, em 1930, terem cristalizado a pepsina, tripsina e
outras enzimas envolvidas no processo da digesto, concluindo que estas
tambm eram protenas (NELSON & COX, 2002).
Neste mesmo perodo, J. B. S. Haldane sugeriu que as interaes
estabelecidas entre a enzima e o substrato seriam fracas e que mesmo
distorcendo a molcula do substrato, a reao continuava sendo catalisada
representando um importante passo para a elucidao da catlise enzimtica.
As pesquisas nesta rea intensificaram-se no final do sc. XX com a

purificao e a compreenso sobre o funcionamento do mecanismo qumico, a


estrutura molecular e a ao de vrias enzimas (NELSON & COX, 2002).

4.1.2 - VISO GERAL


Para a existncia da vida so necessrias certas condies
fundamentais. Para realizar todas as suas atividades como por exemplo
movimentar-se, alimentar-se e reproduzir-se, o organismo deve ser capaz de
utilizar a energia do meio ambiente como combustvel e de produzir
descendentes (NELSON & COX, 2002).
Quantidades substanciais de fontes de carbono na forma de
polissacardeos consumidas como alimentos so convertidas em acares
simples tais como glicose, frutose e maltose, produzindo energia para o
organismo. Embora alguns processos liberem energia qumica em segundos,
como por exemplo, quando se consome sacarose, outros tendem a ser mais
lentos (no-catalisados) mesmo que termicamente favorveis, como por
exemplo, no caso do armazenamento do acar, que pode levar vrios anos
at que a sacarose se converta em gs carbnico e gua, na presena de
oxignio, tornando a vida insustentvel por no ocorrer com velocidade
adequada (NELSON & COX, 2002).
A diferena est na catlise, que sustenta a vida em tempo hbil, e
acelera as reaes qumicas nos sistemas biolgicos com eficincia. As mais
notveis e altamente especializadas protenas catalisadoras so as enzimas,
que aceleram as reaes qumicas e em geral so mais eficientes do que os
catalisadores sintticos ou inorgnicos, por terem grande especificidade pelo

substrato e por funcionarem em solues aquosas sob condies brandas de


temperatura e pH, visto que, apenas um nmero limitado de catalisadores
possuem tais propriedades relevantes em todos os processos bioqumicos
(CHAMPE & HARVEY, 1996; NELSON & COX, 2002).
As enzimas so unidades funcionais do metabolismo celular e so
encontradas em vegetais, animais e microrganismos. So de natureza protica
e so formadas por subunidades ou aminocidos ligados entre si por ligaes
peptdicas (NELSON & COX, 2002), atuando em sequncias organizadas,
catalisando centenas de reaes em etapas, atravs das quais as molculas
de nutrientes so degradadas e as macromolculas so formadas atravs de
precursores simples, de forma que a energia qumica da catlise possa ser
conservada e transformada, equilibrando as atividades nos sistemas biolgicos
(NELSON & COX, 2002).
As enzimas esto presentes em todas as clulas em pequenas
quantidades, acelerando a velocidade de uma reao qumica sem serem
alteradas no processo, permanecendo intactas no final de cada reao
(CHAMPE & HARVEY, 1996).
A maioria das enzimas so protenas, exceto um pequeno grupo de
molculas de RNA cataltico, chamadas ribozimas. A atividade de catlise
depende da integridade da conformao protica nativa, ou seja, se uma
enzima dissociada em subunidades ou submetida desnaturao, tende-se a
perd-la e quando ocorre a quebra em seus aminocidos, sua atividade
perdida. Portanto, a integridade das estruturas desde a primria at a

quaternria so fundamentais para manter a atividade cataltica (DALLAVECCHIA et al., 2004; NELSON & COX, 2002).
O peso molecular das enzimas pode variar de 12.000 a mais de um
milho de Daltons (Da). Algumas podem ser modificadas atravs de ligao
covalente, por processos como fosforilao e glicosilao entre outros
envolvidos na regulao da atividade enzimtica (NELSON & COX, 2002).
Nem toda enzima necessita de um grupo qumico, alm dos
resduos de seus aminocidos, outras requerem a presena de co-fatores que
podem ser uma molcula orgnica complexa ou metalorgnica (coenzima) e/ou
um ou mais ons inorgnicos (Fe2+, Mg2+, Mn2+ ou Zn2+) para concluir sua
atividade enzimtica. Denomina-se grupo prosttico quando a parte protica de
uma enzima est ligada fortemente ou covalentemente a coenzima e/ou um on
metlico. A coenzima e/ou ons metlicos ligados a uma enzima denomina-se
holoenzima, sendo a parte protica dessa enzima chamada apoenzima ou
apoprotena (NELSON & COX, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001).

4.1.3 - NOMENCLATURA

Inicialmente as enzimas eram identificadas pelo nome do seu


descobridor, porm, com o aumento da quantidade de enzimas conhecidas
houve a necessidade da criao de uma nomenclatura sistemtica que
indicasse a ao especfica de cada enzima e os substratos sobre os quais
atua. Assim em 1955 a Unio Internacional de Bioqumica estabeleceu a

Comisso de Nomenclatura e Classificao de Enzimas, para esta finalidade


(CHAMPE & HARVEY, 1996; KIELING, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001).
De acordo com a nomenclatura utilizada, cada enzima recebe dois
nomes, um para o uso no dia-a-dia que o nome recomendado e outro mais
complexo, o nome sistemtico. O nome recomendado composto de trs
partes: o substrato preferente, o tipo de reao catalisada e a terminao ase.
O nome sistemtico utilizado quando a enzima deve ser identificada sem
ambigidade, neste caso, utiliza-se o sufixo ase unido a uma descrio da
reao qumica catalisada ou ao nome do substrato (CHAMPE & HARVEY,
1996; KIELING, 2002; SANT`ANN A Jr., 2001).
Por intermdio do acordo internacional, o sistema criado para
nomear e classificar as enzimas dividido em seis classes principais, com
subclasses de acordo com o tipo de reao catalisada, conforme apresentado
na tabela 1 (CHAMPE & HARVEY, 1996; KIELING, 2002; NELSON & COX,
2002; SANT`ANNA Jr., 2001).

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Tabela 1. Classificao de enzimas segundo a Unio Internacional de


Bioqumica e Biologia Molecular (IUBMB) (CASTRO & ANDERSON, 1995;
KIELING, 2002; SANTANNA Jr., 2001; NELSON & COX,2002; QUEIROZ,
2002).
Classe de
enzimas

Algumas
subclasses

Reaes catalisadas pelas enzimas

1.Oxidoredutases

Hidrogenases,
oxidases,
peroxidases

Reao de oxidao-reduo ou
transferncia de eltrons (ons
hidretos ou tomos de hidrognio)
atuando em CH-OH, C=O, C=O-,
CH-NH-, NADH e NADPH

2. Transferases

Transaldolases,
transcetolases

Reaes de transferncia de grupos


funcionais entre molculas. Grupos
com 1C, aldedo ou cetona, acil,
glicosil, fosfatos e enxofre

3. Hidrolases

Esterases,
lipases,
peptidases

Reaes de hidrlise (steres,


ligaes glicosdicas, peptdicas,
outras ligaes C-N e anidridos
cidos). Transferncia de grupos
funcionais para a gua

4. Liases

Descarboxilases,
cetocidoliases

Catalisam a quebra de ligaes


covalentes e a remoo de
molculas de gua, amnia e gs
carbnico (=C=C=, =C=O, =C=N-)

5. Isomerases

Racemases,
epimerases,
mutases

Transferncia de grupos dentro da


mesma
molcula para formar
ismeros

6. Ligases

Sintetases

Catalisam reaes de formao de


novas molculas a partir da ligao
entre duas pr-existentes custa de
energia (C-O, C-S, C-N, C-C)

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Atravs deste acordo internacional, alm dos nomes recomendado e


sistemtico, criou-se um mtodo para numerar as enzimas. Cada enzima
possui um dgito especfico e so identificada pelas letras E.C. (Enzyme
Commission) seguidas por um cdigo numrico, composto de quatro dgitos
separados por pontos e um nome sistemtico, identificando o tipo de reao
catalisada. Cada enzima possui um cdigo com 4 dgitos, conforme observado
abaixo (NELSON & COX, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001; TIPTON & BOYCE,
2000).
1 dgito classe
2 dgito subclasse
3 dgito sub-subclasse
4 dgito substrato
Podemos exemplificar com a enzima Hexoquinase (nome trivial) que
catalisa a reao abaixo.
ATP + D-glicose ADP + D-glicose-6-fosfato
Ela uma ATP-glicose fosfotransferase que transfere cataliticamente
um grupo fosfato do ATP para a glicose. O nmero desta enzima na Comisso E.C.
2.7.1.1. sendo o primeiro dgito indicador da classe a qual pertence a enzima,

neste caso o nmero 2 refere-se a uma transferase. O segundo dgito se refere


subclasse dentro de cada classe (o 7 se refere a uma fosfotransferase), o
terceiro se refere sub-subclasse, no caso uma fosfotransferase que
apresenta um grupo hidroxila aceptor de fosfato. O quarto o dgito usado para
identificar individualmente a enzima ou quem o aceptor do grupo e neste

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caso, o dgito 1 indica que a D-glicose o aceptor do grupo fosfato (NELSON &
COX, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001; TIPTON & BOYCE, 2000).

4.1.4 - PROPRIEDADES
As enzimas so bastante especficas nas transformaes
moleculares. Apresentam alguns tipos de especificidade, como absoluta, em
grupo, de ligao e estereoqumica (GONALVES, 2007; QUEIROZ, 2002).
A especificidade absoluta ocorre quando a enzima catalisa
apenas uma reao em particular. Na especificidade em grupo, a enzima dirige
a ao cataltica para um grupo funcional especfico na molcula do substrato,
como por exemplo distinguir o grupo hidroxila (OH). E na especificidade
estereoqumica a enzima atua sobre um tipo particular de ismero ptico ou
estreo. Na especificidade de ligao as enzimas atuam sobre um tipo
particular de ligao qumica da estrutura molecular, como o caso de algumas
que s catalisam a hidrlise de ligaes peptdicas e outras a hidrlise de
ligaes ster (GONALVES, 2007; QUEIROZ, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001).

4.1.5 MECANISMO DE AO
O funcionamento enzimtico aborda a catlise durante a reao,
alterando e favorecendo energeticamente a rota de reao alternativa,
diferentemente das reaes no-catalisadas. O stio ativo da molcula
enzimtica liga-se ao substrato, facilitando quimicamente a catlise (CHAMPE
& HARVEY, 1996).

13

As reaes qumicas possuem uma barreira energtica que


separa a energia dos substratos e um intermedirio de alta energia que ocorre
durante a formao do produto, denominada energia livre de ativao. Este
pico de energia representa a transio na qual um intermedirio se forma
durante a converso do substrato ao produto. Devido energia livre de
ativao, as velocidades das reaes qumicas no-catalisadas so mais lentas
do que as das reaes catalisadas. A velocidade da reao varia de acordo
com a quantidade de molculas energizadas ou seja; quanto menor a energia
livre de ativao, mais molculas tm energia suficiente para superar o estado
de transio, tornando mais rpida a velocidade de reao. Na ausncia de
uma enzima, apenas uma pequena proporo da populao de molculas deve
conter energia suficiente para atingir o estado de transio entre substrato e
produto (CHAMPE & HARVEY, 1996).
Na etapa inicial da catlise enzimtica, ocorre a formao de um
complexo enzima-substrato (ES). O substrato liga-se a uma regio especfica
da enzima chamada de stio ativo, contendo os radicais ou grupamentos
catalticos de aminocidos que participam da quebra de ligaes. As enzimas
reagem atravs da formao do complexo enzima-substrato para formarem os
produtos (CARLI, 2006; CHAMPE & HARVEY, 1996). Para exemplificar,
podemos citar a transformao da sacarose (substrato) em dois produtos:
glicose e frutose, sendo esta reao catalisada pela enzima invertase, como
pode ser observado na Figura 1.
A catlise enzimtica pode ser facilmente entendida atravs do
modelo ilustrativo do mecanismo da chave fechadura proposto por Emil Fisher

14

em 1894 (conforme observado na Figura 2) e do mecanismo do encaixe


induzido de Koshland Jr. desenvolvido no final dos anos 60 (QUEIROZ, 2002;
CARLI, 2006).
A hiptese da chave e fechadura diz que a especificidade de uma
enzima (representando a fechadura) e do seu substrato (representado pela
chave) provm da complementaridade das suas respectivas configuraes. Se
houver alteraes na forma tridimensional de uma enzima, esta deixar de
funcionar, pois no ocorrer o encaixe dos substratos no stio ativo. J o
modelo do mecanismo do encaixe induzido, proposto por Koshland Jr., prev
um stio de ligao no totalmente pr-formado, mas sim moldvel molcula
do substrato, ajustando a enzima ao substrato (CARLI, 2006; QUEIROZ, 2002).
Nas reaes catalticas, as enzimas aceleram a velocidade da
reao e diminuem a barreira energtica entre reagentes e produtos que
ocorrem por elas atrarem em orientaes favorveis os substratos no
complexo enzima-substrato (ES) (CARLI, 2006; QUEIROZ, 2002).

15

Figura 1: Representao esquemtica da transformao do substrato


(sacarose) em produtos (glicose e frutose), realizada pela enzima (invertase)
(CARDOSO et al., 2009).

16

Figura 2: Modelo do mecanismo de chave fechadura proposto por Emil Fisher


(QUEIROZ, 2002).

17

As caractersticas mais importantes relacionadas seletividade das


enzimas

so

quimiosseletividade,

regiosseletividade

enantiosseletividade. Na quimiosseletividade, as enzimas atuam sobre um


grupamento qumico especfico. Na regiosseletividade, as enzimas distinguem
entre grupos funcionais que esto situados em diferentes regies da mesma
molcula do substrato devido a sua estrutura tridimensional complexa. Na
enantiosseletividade, as enzimas so feitas de L-aminocidos e, portanto, so
catalisadores quirais. Como conseqncia, qualquer tipo de quiralidade
presente na molcula do substrato reconhecida na formao do complexo
enzima-substrato (QUEIROZ, 2002).

4.1.6 - FATORES QUE AFETAM A VELOCIDADE DA REAO


A velocidade de reao enzimtica pode ser afetada por alguns
fatores como a concentrao de substratos ou da enzima, pH e a temperatura
do meio reacional (CHAMPE & HARVEY, 1996).
Geralmente, a velocidade de reao diretamente proporcional
concentrao de enzimas presentes. Quando a concentrao da enzima
constante e ocorre um aumento na concentrao dos substratos h elevaes
cada vez menores na velocidade da reao. A presena de substncias
txicas, inibidores ou ativadores na soluo da enzima acarretam desvios na
linearidade (BRGIDA, 2006; CHAMPE & HARVEY, 1996).
Quanto ao pH, pode-se comprovar experimentalmente a influncia
deste na velocidade das reaes enzimticas, obtendo-se curvas que indicam

18

que as enzimas apresentam um pH timo de atividade, onde a velocidade da


reao mxima. O pH pode afetar a reao de vrias maneiras. Modificaes
no pH alteram o carter inico dos grupos aminos e carboxlicos da protena,
afetando no stio cataltico, atividade e a conformao de uma enzima. Estas
mudanas conformacionais influenciam na interao enzima-substrato afetando
a estabilidade da enzima (CHAMPE & HARVEY, 1996).
Algumas enzimas possuem grupos qumicos ionizveis como
carboxilas (COOH), amino (NH2), tiol (SH), imidazol, etc. nas cadeias laterais
de seus aminocidos. De acordo com o pH do meio, estes grupos podem ter
carga eltrica positiva, negativa ou neutra. Como a conformao das protenas
depende, em parte, de suas cargas eltricas, haver um pH no qual a
conformao ser a mais adequada para a atividade cataltica. Este o
chamado pH timo. Ligeiras mudanas de pH podem provocar a desnaturao
da protena. Algumas enzimas apresentam variaes peculiares. A pepsina do
estmago apresenta um timo de atividade a pH = 2, e a fosfatase alcalina do
intestino a pH = 12 (CHAMPE & HARVEY, 1996).
Outro fator que pode alterar a velocidade da reao qumica a
temperatura. Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da reao at
atingir uma temperatura tima, na qual ocorre a sua atividade mxima. A partir
dela, a atividade volta a diminuir por desnaturao da molcula, onde em
temperaturas elevadas, alteram-se as estruturas secundrias e tercirias da
enzima, afetando a sua configurao espacial. Como a ligao da enzima ao
substrato depende da forma da molcula da enzima, se a mesma for alterada,
conseqentemente a sua funo tambm ser. Em temperaturas acima de

19

70C, normalmente, as

reaes

enzimticas cessam, pois

ocorre a

desnaturao completa e irreversvel da maioria das enzimas (CHAMPE &


HARVEY, 1996).

4.1.7 - APLICAES DE ENZIMAS


Atualmente j se conhecem muitas enzimas e vrias esto sendo
estudadas e aproximadamente 200 so comercializadas. Estas ltimas so
provenientes de bactrias, fungos filamentosos e leveduras (CASTRO et al.,
2004; JAEGER et al., 1994; SHARMA et al., 2001).

O emprego de enzimas em processos industriais tem um grande


potencial devido a sua eficincia. As enzimas executam uma srie de
transformaes de modo seletivo e rpido, sendo bastante ativas, versteis e
no requerem altas temperaturas ou valores extremos de pH para executar
suas atividades enzimticas (DZIEZAK, 1991; GONAVES, 2007; PATEL,
2002).

Das enzimas aplicadas industrialmente, cerca de 75% so hidrolases


as quais depolimerizam substncias naturais e dentre elas, as proteases
representam 40% de todas as enzimas comercializadas e so usadas em
vrias indstrias como de detergentes, alimentos, do couro e farmacutica.
Outro grande grupo de hidrolases de aplicao industrial composto pelas
carboidrases, utilizadas na panificao, na produo de cervejas, na indstria

20

de amido, txteis, de papel, na fabricao de rao animal, etc. (TREVISAN,


2004).
Pesquisas sobre enzimas tm ganhado ateno em diversos
setores, sendo importante em diversas reas. Por exemplo, sabe-se que em
animais a deficincia, a ausncia de uma ou mais enzimas ou sua atividade
excessiva pode desencadear algumas doenas genticas hereditrias,
tornando as pesquisas sobre enzimas de grande importncia na medicina.
Tambm podem ser utilizadas em matrizes para diagnsticos patolgicos
laboratoriais, atravs da medio da atividade enzimtica no plasma
sangneo, eritrcitos ou amostras de tecidos biolgicos (NELSON & COX,
2002; SAID & PIETRO, 2004).

4.2 - LIPASES
As lipases (triacilglicerol acilhidrolases E.C. 3.1.1.3) so enzimas
pertencentes famlia das hidrolases, atuando na interface orgnica-aquosa
demonstrando nveis considerveis de atividade e estabilidade em ambientes
aquosos e no-aquosos, ao contrario de outras enzimas (HASAN et al., 2004;
MARTINS et al., 2008; SAXENA et al.,1999).
A funo biolgica da lipase catalisar a hidrlise de longas cadeias
de triacilglicerdeos (TAG), formando cidos graxos e glicerol, alm de
realizarem esterificao, isto , a sntese reversa a partir de longas cadeias de
cidos

graxos

glicerol.

Outra

reao

catalisada

por

lipase

21

interesterificao, reao onde um cido graxo, um lcool ou um ster reagem


com o TAG produzindo diferentes TAG's. Dependendo do substrato da reao,
esta tambm pode ser chamada de alcolise, acidlise ou transesterificao
(HASAN et al., 2004; MARTINS et al., 2008; SAXENA et al.,1999).
Existe uma vasta aplicabilidade das lipases em diversos processos
podendo ser usadas na composio de detergentes, na indstria alimentcia e
txtil, na produo de papel, no tratamento de efluentes entre outras aplicaes
como pode ser observado na Tabela 2 (JAEGER & REETZ, 1998).

22

Tabela 02: Aplicaes de lipases conforme o tipo de reao catalisada (DURLI,


2007).
Tipos de Reaes

Hidrlise

reas de
Aplicao
Alimentos
(laticnios)

Aplicaes

Hidrlise de
gorduras do leite

Produtos

Agentes
flavorizantes para
queijos e derivados

Qumica
Hidrlise de leos cidos graxos,
(processame e gorduras
diglicerdeos e
nto de leo)
monoglicerdeos
(emulsificantes,
reagentes para
anlise de lipdeos)
Qumica
Remoo de
Detergentes de uso
(detergentes) manchas de leos em lavanderias e
domsticos
Medicina

Esterificao

Dosagem de
triglicerdeos no
sangue

Indstria fina Sntese de


geral
steres
Indstria
alimentcia

Kits para
diagnsticos

Intermedirios
quirais steres,
emulsificantes

Esterificao ou
leos ou gorduras,
transesterificao flavorizantes e na
produo de
aromatizantes

Indstria
Sntese de
Antiinflamatrios
farmacutica intermedirios em (naproxeno,
medicamentos
ibuprofeno,
cetoprofen,
suprofen)
Transesterificao Indstria fina Transesterificao Produo de
em leos vegetais Biodiesel

23

4.2.1 - FONTES DE LIPASES


As lipases podem ser de origem animal (pancretica, heptica e
gstrica), vegetal e microbiana (bactrias e fungos) (MARTINS et al., 2008).
Nos animais, estas enzimas participam do metabolismo de lipdeos, como a
digesto, a adsoro, a reconstituio de gorduras e tambm no metabolismo
de lipoprotenas. Nas plantas, so encontradas em tecidos de reserva de
energia (SHARMA et al., 2001).
Industrialmente

economicamente,

as

lipases

microbianas

apresentam uma srie de vantagens em relao s lipases de origem animal e


vegetal. As lipases de microrganismos so em sua maioria extracelulares,
apresentando procedimento mais fcil de extrao, isolamento e purificao
tendo um custo de produo menor, so mais estveis e possuem
propriedades distintas das lipases de origem animal e vegetal (DALLAVECCHIA et al., 2004; LIMA et al., 1975; MARTINS et al., 2008; NAWANI et al.,
1998; SHARMA et al., 2001).
Dentre as bactrias produtoras de lipase podemos citar os seguintes
gneros;

Bacillus,

Burkholderia,

Chromobacterium,

Propionibacterium,

Pseudomonas, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus (CASTRO et al., 2004;


RAPP & BACKHAUS, 1992; SHARMA et al., 2001).
Os gneros de fungos filamentosos produtores de lipases so
Aspergillus, Curvalaria, Dreschslera, Fusarium, Geotrichum, Hicrothrix, Mucor,
Norcadia, Pcecilomyces, Penicillium, Pycnoporus, Rhizopus, Rhodococcus,
Sclerotium,

Staurophoma,

Syncephalis,

Thanatenopjorus,

Thielavia,

24

Trichocladium, Verticilium, entre outros. Os gneros de leveduras produtoras


de

lipases

so

Candida,

Cryptococcus,

Humicola,

Kurtzmanomyces,

Ophiostoma, Pichia, Streptomyces, Yarrowia, entre outros (CASTRO et al.,


2004; RAPP & BACKHAUS, 1992; SHARMA et al., 2001).

4.2.2 - PROPRIEDADES GERAIS DE LIPASES


As lipases so enzimas que catalisam a hidrlise total ou parcial do
triacilglicerol liberando cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris e
gliceris (Fig. 3), agindo apenas na interface leo/gua, podendo catalisar
tambm reaes de esterificao, transesterificao e interesterificao em
solventes orgnicos. As lipases tambm catalisam a formao de amidas a
partir de steres no ativados. Estas enzimas podem ser confundidas com as
esterases, porm as esterases so enzimas que agem em steres solveis em
gua

ou

que

hidrolisam

outros

lipdeos

como

as

acilhidrolases,

colesterolesterase e tioesterases (BORNSCHEUER et al., 2002; JAEGER &


EGGERT, 2002; JAEGER & REETZ, 1998; QUEIROZ, 2002; SAXENA et al.,
1999; SHARMA et al., 2001).

25

Figura 3: Reao geral de hidrlise de um triacilglicerol catalisada por lipases


(JAEGER & REETZ, 1998).

26

Durante a ao das lipases, qualquer tipo de interferncias causadas


na interface resultam em alteraes na sua sntese e atividade. So vrios os
fatores que influenciam a sntese e as propriedades da enzima, entre eles
fatores ambientais como a composio do meio de cultura, uso de
estimuladores, indutores e inibidores, a concentrao de oxignio, nitrognio e
sais inorgnicos, a fonte de carbono, a temperatura e o pH do meio de cultivo,
a agitao e agentes capazes de afetar a interface (DOMINGUEZ et al., 2003;
GONALVES, 2007; MARTINS et al., 2008; WOOLEY & PETERSON, 1994).
Dependendo da fonte, a massa molecular das lipases pode variar
entre 20 a 75 quilodaltons (kDa), a atividade em pH na faixa de 4 a 9 e
temperatura entre a ambiente at 70C, mas com atividade tima na faixa entre
30 e 40C, variando sua termoestabilidade consideravelmente em funo da
origem, sendo as lipases microbianas as de melhor estabilidade trmica
(CASTRO et al., 2004).
Lipases so serina hidrolases e contm a sequncia G- X1 S X2G como meio cataltico, onde G= glicina, S= serina, X1= histidina e X2= cido
asprtico ou glutmico (CASTRO et al., 2004).
As lipases microbianas so classificadas em funo da relao da
sua especificidade ao substrato e esto classificadas em 3 grupos
(CARVALHO et al., 2003; CASTRO & ANDERSON, 1995; CASTRO et al.,
2004):
- Lipases 1,3 especficas: liberam cidos graxos resultantes da
catlise, especificamente nas posies sn-1,3 dos acilgliceris.

27

Espcies produtoras de lipases pertencentes a este grupo com


tal especificidade esto Aspergillus niger, Mucor miehei e
Rhizopus

delemar, assim tambm como a tpica lipase

pancretica e de alguns vegetais como colza, mostarda e lupino


(CARVALHO et al., 2003; CASTRO & ANDERSON, 1995;
CASTRO et al., 2004).
- Lipases

cido graxos

especficas: so biocatalisadores

hidrolticos de tipos especficos de grupos acilas nas molculas


de TAG. Uma espcie que hidrolisa preferencialmente grupos
acilas de cadeia longa que contm dupla ligao cis na posio 9
a levedura Geotrichum candidum (CARVALHO et al., 2003;
CASTRO & ANDERSON, 1995; CASTRO et al., 2004).

ipases no especficas: catalisam aleatoriamente a hidrlise de


TAG para cidos graxos livres e glicerol no mostrando
especifidade com relao ao grupo acil ou posio de
esterificao no glicerol. So exemplos, lipases produzidas por
Penicilium cyclopium, Corynebacterium acnes, Pseudomonas
fluorescens, Staphylococcus aureus e Candida cylindracea
(CARVALHO et al., 2003; CASTRO & ANDERSON, 1995;
CASTRO et al., 2004).
4.2.3 - REAES CATALISADAS POR LIPASES

28

A lipase catalisa in vivo a hidrlise de steres carboxlicos em


triacilglicerol (TAG), diacilglicerol (DAG) e monoacilglicerol (MAG), onde cidos
carboxlicos e alcois, com um menor nmero de steres so liberados, como
pode ser observado na Figura 4 (TREVISAN, 2004).
A lipase catalisa as

reaes

de

hidrlise, esterificao e

interesterificao (alcolise, acidlise e transesterificao) representadas na


Figura 5 (TREVISAN, 2004).
A reao de hidrlise consiste no ataque a ligao ster do TAG
para produzir glicerol e cidos graxos, na presena de gua. O tipo e a posio
estereoespecifica do resduo de cido graxo esto relacionados com a alta
especificidade das lipases, o que propicia um grande nmero de aplicaes.
Atravs da hidrlise parcial dos triacilglicerdeos obtm-se flavorizantes
utilizados em alimentos animais, inclusive de humanos (OLIVEIRA et al., 2004).
A reao de esterificao , em sua essncia, a reao inversa da
hidrlise, ocorrendo entre alcois polihdricos e cidos graxos livres do
glicerdeo correspondente. A relao entre as velocidades da reao direta
(hidrlise) e da reao inversa (esterificao) normalmente controlada pelo
contedo de gua do meio de reao (CARVALHO et al., 2003; OLIVEIRA,
2004).

29

Figura

4:

Hidrlise

catalisada

por

lipase.

Triacilglicerdeo

(TAG);

diacilglicerdeo (DAG); monoacilglicerdeo (MAG); cido graxo livre (AGL)


(TREVISAN, 2004).

30

Figura 5: Reaes de biotransformao de lipdios (TREVISAN, 2004).

31

O termo interesterificao relaciona-se com a troca de radicais acil


entre um ster e um cido (acidlise), um ster e um lcool (alcolise) ou um
ster e outro ster (transesterificao). Nestas reaes um cido graxo, um
lcool ou outro ster, reagem com o TAG, resultando em um rearranjo dos
grupos de cidos graxos do TAG produzindo um novo TAG com propriedades
fsicas e qumicas diversas. Este rearranjo resultante de reaes
concorrentes de hidrlise e de esterificao (CARVALHO et al., 2003;
OLIVEIRA, 2004; TREVISAN, 2004).
O rearranjo resultado de reaes concorrentes da hidrlise e
esterificao sob condies nas quais, a quantidade de gua no sistema
restrita, a hidrlise de gordura pode ser minimizada de forma que a
interesterificao seja a reao dominante. A reao tambm tem sido utilizada
para tornar os leos vegetais mais ricos em cidos graxos poliinsaturados
(AGPIs) de interesse nutricional (CARVALHO et al., 2003; OLIVEIRA, 2004) .
Em meio orgnico, as lipases catalisam a transferncia do grupo
acila do composto doadores para uma ampla faixa de compostos aceptores
diferentes da gua (YAHYA et al., 1998).
Em geral, steres sintticos ou no podem sofrer diferentes tipos de
transformaes associadas a seletividade das reaes catalisadas por lipases,
requerendo mtodos especficos de anlise. A deteco da atividade hidroltica
de lipases baseada no monitoramento do substrato utilizado ou do(s)
produto(s) (TREVISAN, 2004).
Atualmente, os mtodos imunolgicos e fsico-qumicos existentes
para ensaio e deteco de lipases so classificados em (TREVISAN, 2004):

32

- titrimetria (como meio de crescimento em placas de petri),


- espectroscopia,
- cromatografia,
- radioatividade,
- tensiometria interfacial,
- turbidiometria,
- condutivimetria,
- imunoqumica,
- microscopia.
Podem ser utilizados equipamentos automatizados que permitem o
ensaio em paralelo de grandes nmeros de amostras. A formao de halos
lipdicos, em volta das colnias em crescimento em placas de gar contendo
tributirina, triolena e rodamina B podem ser indicatrios da produo de
lipases, medidos por fluorescncia em comprimento de onda a 350 nanmetros
(TREVISAN, 2004).
O surfactante TWEEN 80 usado em meio slido para deteco
simples e confivel de lipase, onde a formao de zonas opacas ao redor da
colnia um indicador de que a lipase foi produzida. Para modificaes deste
ensaio, podem ser usados diferentes tipos de surfactantes da famlia TWEEN
combinados com azul do Nilo e sais de clcio (TREVISAN, 2004).
A atividade no sobrenadante pode ser medida atravs da hidrlise
de steres p-nitrofenlicos de cidos graxos, com tamanhos de cadeias maiores
que 10 carbonos seguida pela deteco espectrofotomtrica em 410 nm
(TREVISAN, 2004).

33

O stio ativo das lipases consiste da trade cataltica formada SerHist- Asp/ Glu, onde a hidrlise do substrato ocorre em duas etapas (Fig. 6):
inicia com um ataque do oxignio hidroflico pertencente ao grupo hidroxila do
resduo serina ao carbono da carbonila ativado do ster do lipdeo (Fig. 6A).
Forma-se um intermedirio tetradrico, sendo estabilizado o O-, pela interao
com dois grupos peptdicos NH (QUEIROZ, 2002; TREVISAN, 2004).
A histidina doa um prton ao componente lcool que est deixando o
substrato (Fig. 6B) restando ento um intermedirio covalente (enzima acilada),
estando o componente cido do substrato esterificado pelo resduo serina da
enzima. O resduo histidina ativa uma molcula de gua na vizinhana e o on
hidroxila resultante realiza um ataque nucleoflico ao tomo de carbono da
carbonila do intermedirio covalente (Fig. 6C). Um prton doado pelo resduo
histidina ao tomo de oxignio do resduo serina ativo, quebrando a ligao
ster entre a serina e o componente acila, liberando o produto acilado,
favorecendo a enzima, para que esta receba uma nova molcula de substrato
(TREVISAN, 2004).

34

Figura 6: Mecanismo de catlise por lipases (TREVISAN, 2004).

35

A ao das lipases triacilglicerdicas so mais ativas em substratos


insolveis do que solveis. Entre as teorias que explicam a ativao na
presena de interfaces gua-lipdeo, a hiptese que aponta mudanas
conformacionais na enzima est suportada para lipases de Rhizomucor miehei,
pancretica humana e de Geotrichum candidum, que apresentam tampas que
cobrem o stio ativo e se abrem na presena do substrato expondo-o
(QUEIROZ, 2002; TREVISAN, 2004).
As lipases que so enzimas solveis em gua atuam na interface
gua-lipdeo, contrariando as equaes de Michaelis Menten para a cintica
enzimtica que so vlidas somente para reaes catalisadas em fase
homognea. Geralmente o substrato lipdico utilizado sob forma de emulso
em anlises da lipase e medida que vo se formando os produtos e
degradando o substrato ocorre variao na composio da interface gualipdeo. Portanto a velocidade da reao determinada pela rea superficial da
emulso das partculas por unidade de volume e no pela concentrao de
lipdeos na emulso (triacilglicerol) (GONALVES, 2007).
O tamanho das gotculas de leo e a rea da interface sofrem
sucessivas mudanas variando tanto o tamanho da rea da interface leo-gua
quanto a atividade lipsica em funo da concentrao do substrato
(GONALVES, 2007; OLIVEIRA, 2000).
Para ensaios de controle da atividade lipsica, as gotculas lipdicas
da emulso do substrato devero ser amplas, estveis, perfeitamente
dispersas, homogneas e estabilizadas, determinando assim a atividade

36

lipsica fornecida pelos resultados reprodutivos, onde qualquer tipo de


alterao na interface conseqentemente dever refletir na sntese de sua
atividade lipoltica (GONALVES, 2007; OLIVEIRA, 2000).
Pelas inmeras potencialidades, cada vez mais pesquisas voltadas a
rea de diferentes aplicaes e metodologias fsicas, qumicas e enzimticas
vm sendo relatados, visando obteno de concentrados de importncia
mdica e nutricional de cidos graxos poliinsaturados (AGPI) a partir de
substratos microbianos, animais e de leos vegetais, dependente da
capacidade de absoro destes cidos pelos humanos (CARVALHO et al.,
2003).

4.2.4 - LIPASES IMOBILIZADAS


Enzimas imobilizadas esto fisicamente confinadas ou localizadas
em uma regio definida do espao, com reteno de suas atividades catalticas
e podem ser utilizadas repetidas ou continuamente. Esta definio foi proposta
em 1971 na Primeira Conferncia em Engenharia de Enzimas, realizada em
Henniker, nos Estados Unidos (CARVALHO et al., 2006; VIRKAJRVI &
LINKO, 1999).

Para a catlise enzimtica funcionar eficientemente necessrio


proteger a enzima da interao do meio contendo solvente, pois o mesmo
poderia provocar sua inativao, impossibilitando a reao. Devido a este
problema, tm sido desenvolvidas tcnicas de imobilizao oferecendo maior

37

estabilidade, facilitando sua recuperao e manipulao no final do processo,


possibilitando sua reutilizao, especialmente na presena de solventes
orgnicos. O uso de biocatalisadores imobilizados est aumentando em escala
industrial principalmente na indstria farmacutica e alimentcia (JAEGER &
REETZ, 1998; SHARMA et al., 2001; VECCHIA et al., 2004; VILLENEUVE et
al., 2000).

Esto disponveis comercialmente lipases nativas imobilizadas e


atravs

de

tcnicas

de

imobilizao

de

enzimas

em

snteses

biotransformaes, onde elas e as clulas so transformadas em catalisadores


heterogneos, apesar de que, em muitas outras aplicaes, elas no esto na
forma imobilizada (TREVISAN, 2004).

A tcnica permite sua reciclagem e o melhoramento na atividade e


estabilidade, sendo ajustveis a um processo contnuo e dependendo da
tcnica,

as

propriedades

dos

biocatalisadores

podem

ser

alteradas

significativamente para melhor ou pior (QUEIROZ, 2002; TREVISAN, 2004).

Os mtodos utilizados para a imobilizao de enzimas baseiam-se


nas ligaes qumicas e fsicas entre a enzima e o suporte. Entre eles esto
adsoro fsica (interaes hidrofbicas e de Van der Waals) e qumica (ligao
covalente e inica), imobilizao por confinamento em matriz ou microcpsula
e ligao cruzada. Na Figura 7 a seguir, podem ser observados esquemas dos
mtodos de imobilizao de enzimas (CARDOSO et al., 2009; DALLAVECCHIA et al., 2004).

38

39

Figura 7: Principais mtodos de imobilizao de enzimas (CARDOSO et al.,


2009).

40

O mtodo mais empregado em imobilizao de enzimas o de


adsoro. Este mtodo apresenta poucos efeitos deletrios para a atividade e
seletividade da enzima, alm de apresentar baixo custo e ser de fcil
execuo. Neste mtodo ocorre a adeso da enzima na superfcie do suporte
insolvel, que se encontra em meio aquoso, atravs de interaes de Van der
Waals, interaes hidrofbicas, ligaes de hidrognio e interaes especficas
(CARDOSO et al., 2009; CARVALHO et al., 2006; DALLA-VECHIA et al.,
2004).

Na imobilizao por adsoro em membrana polimricas, a carga de


enzimas em membranas hidrofbicas tende a ser maior do que nas hidroflicas,
porm, resultam em derivados menos ativos do que nas hidroflicas. Foram
relatados diversos tipos de aplicaes com lipases imobilizadas em reatores de
membranas (TREVISAN, 2004).

Na tcnica de adsoro inica, a enzima se une ao suporte atravs


de atraes eletrostticas estabelecidas entre as cargas opostas presentes na
enzima e na superfcie do suporte. No mtodo de imobilizao por ligao
covalente existe a formao de ligaes covalentes entre os grupos funcionais
presentes na superfcie do suporte e nos grupos funcionais dos resduos de
aminocidos da enzima (CARDOSO et al., 2009; CARVALHO et al., 2006;
DALLA-VECHIA et al., 2004).

Na imobilizao em matriz de gel ocorre a sntese da matriz em


torno do biocatalisador a ser imobilizado. Neste mtodo a enzima est com seu

41

movimento restrito por uma rede de gel ou polmero. A porosidade da matriz


evita a perda da enzima, porm permite o movimento do substrato e do
produto. J na imobilizao em microcpsula, a enzima envolvida por
membranas

semipermeveis

ou

por

micelas

reversas

formadas

por

surfactantes. A enzima permanece livre em soluo, mas com restrio de


espao (CARDOSO et al., 2009; CARVALHO et al., 2006).

Na tcnica de imobilizao por ligao cruzada as enzimas esto


ligadas imas s outras ou a protenas inativadas (como a albumina) formando
uma estrutura tridimensional complexa. Podem ser obtidas por mtodos
qumicos e fsicos (CARDOSO et al., 2009).

Vrios materiais podem ser utilizados como suportes para a


imobilizao de enzimas. A seleo do suporte depende das propriedades do
material como fora mecnica, estabilidade fsica e qumica, carter
hidroflico/hidrofbico, capacidade da enzima de adsoro e o custo. A
eficincia da adsoro dependente do tamanho que a protena absorvida ter,
da rea superficial adsorvente e principalmente da porosidade e do tamanho
dos poros (CARVALHO et al., 2006; DALLA-VECHIA et al., 2004).

Dentre os diversos materiais empregados como suporte para a


imobilizao de enzimas, temos: alginato, alumina, gar, celulose, cloreto de
polivinila, Eupergit C, pectina, poliacrilamida, polivinilalcool, slica, vidros e
sintticos como o poli-oxido de etileno, etc. (CANILLA et al., 2006; CARVALHO
et al., 2006; DALLA-VECHIA et al., 2004; QUEIROZ, 2002).

42

Estudos tm mostrado que suportes como slica, alumina e celite,


levam a um aumento da atividade de enzimas da classe das lipases junto aos
polmeros hidrofbicos como poli-oxido de etileno e polipropileno onde as
enzimas so facilmente absorvidas (QUEIROZ, 2002).

Avanos biotecnolgicos vm permitindo utilizar lipases imobilizadas


em reaes e biorreatores, alm de melhorar suas propriedades.

expectativa de que as lipases futuramente tenham tanta importncia como os


catalisadores usados industrialmente (proteases e carboidrases) (TREVISAN,
2004).

4.2.5 - APLICAES INDUSTRIAIS DE LIPASES


As lipases so enzimas largamente utilizadas no processamento de
alimentos, detergentes e sntese de produtos para qumica fina e frmacos,
processamento de leos e gorduras, manufatura de papel e produo de
cosmticos, alm de serem utilizadas no tratamento de efluentes gordurosos.
Geralmente as lipases industriais so derivadas de fontes fngicas e
bacterianas (TREVISAN, 2004).
A escolha da enzima ideal conduzida aps cuidadosa
investigao sobre os fatores que influenciam sua aplicao em processos
industriais tais como mtodos de anlise, especificidade, temperatura, pH e
agentes capazes de alterar a reao, o produto e seus custos (SAID &
PIETRO, 2004).

43

O uso de agentes ativadores ou inibidores depende da indstria


em questo, do custo/ benefcio gerado, representando um custo adicional ao
processo, pela possvel necessidade de ter que acrescent-los ou exclu-los
quando a reao for concluda. Seu custo depende de mltiplos fatores como
sua qualidade e processos de produo e recuperao enzimtica, alm do
estado de pureza em que est sendo vendida (SAID & PIETRO, 2004).
Portanto, quanto mais purificada estiver a enzima, maior custo ela
ter e reaes laterais advindas de enzimas parcialmente purificadas
comprometem seu produto final, devendo ser levada em conta sua tolerncia
por estes processos (SAID & PIETRO, 2004).
As lipases por exemplo, degradam preferencialmente cadeias de
cidos graxos de diferentes tamanhos, podendo alterar o produto (SAID &
PIETRO, 2004). A posio, o tamanho da cadeia e o grau de insaturao dos
cidos graxos influenciam as propriedades fsicas e o valor sensorial do
triacilglicerdeo (JAEGER & REETZ, 1998). Na fabricao de queijos, por
exemplo, o sabor do produto desejado de acordo com a especificidade da
enzima escolhida em degradar tipos especficos de cidos graxos (SAID &
PIETRO, 2004).
4.2.5.1 - INDSTRIA DE DETERGENTES
O uso de enzimas em formulaes de detergentes muito comum
em pases desenvolvidos, aproximadamente metade de todos os detergentes
comercializados contm enzimas. Na indstria de detergentes utiliza-se
principalmente proteases, amilases, celulases e lipases (HASAN et al., 2006;
JAEGER & REETZ, 1998; SHARMA et al., 2001).

44

A utilizao de lipases em detergente representa aproximadamente


32% da venda de lipases, correspondendo a aproximadamente 1.000
toneladas por ano. A presena de lipases em detergentes aumentam a
capacidade de remoo de manchas de leos e gorduras que so difceis de
remover em condies normais de lavagem (CARDENAS et al., 2001; HASAN
et al., 2006; HEMACHANDER & PUVANAKRISNAN, 2000; JAEGER & REETZ,
1998; KIRK et al., 2002; SAID & PIETRO, 2004).
As lipases so atrativas na indstria de formulao de detergentes
pois possuem a habilidade de hidrolisar leos e gorduras, devido a suas
caractersticas de baixa especificidade ao substrato, capacidade de suportar
condies extremas de pH e temperaturas alm de manterem estveis na
presena de surfactantes e enzimas (TREVISAN, 2004).
A primeira lipase utilizada industrialmente foi a Lipolase, produzida
pela Novo Nordisk, lanada em 1994, originada do fungo Thermomyces
lanuginosus e expressa em Aspergillus oryzae. Em 1995, duas lipases de
bactrias foram introduzidas, a Lumafast produzida a partir de Pseudomonas
mendocina e Lipomax, uma alcalina de Pseudomonas alcaligenes M-1, ambas
produzidas pela Genencor International (HASAN et al., 2006; JAEGER &
REETZ, 1998; SAID & PIETRO, 2004).

4.2.5.2 - INDSTRIA DE ALIMENTOS

45

A lipase bastante utilizada na indstria de alimentos. Esta enzima


atua no desenvolvimento de sabores e odores especficos de alguns alimentos,
como na maturao de queijos e no desenvolvimento de aromas em diversos
produtos (TREVISAN, 2004).
Lipases so responsveis por caractersticas desejveis ou no, em
alguns

produtos

alimentcios

desde

que,

empregadas

em condies

controladas; caso contrrio, elas atuam sobre os lipdeos hidrolisando-os quase


que totalmente resultando no aparecimento de sabores indesejveis como em
processos de rancificao de carnes, peixes, derivados do leite e de outros
produtos ricos em lipdeos (JAEGGER & REETZ, 1998; REED, 1975;
ZAREVUCKA et al., 1995). Os resultados so dependentes da posio, do
tamanho da cadeia e do grau de insaturao dos cidos graxos e do valor
sensorial de um triacilglicerdeo (JAEGER & REETZ, 1998).
Na indstria de laticnios, as lipases so empregadas para a hidrlise
da gordura do leite. As aplicaes incluem a melhoria do sabor e a acelerao
do processo de cura de queijos, manufatura de produtos similares ao queijo e
liplise da manteiga e creme de leite. As fontes tradicionais de lipases para a
indstria de queijos so os tecidos animais, principalmente glndulas (pncreas
e fgado) e tecidos pr-gstricos de ruminantes jovens. Atualmente so
utilizados

vrios

preparados

microbianos

de

lipases,

desenvolvidos

especialmente para a manufatura de queijos, como por exemplo da Aspergillus


niger, A. oryzae e Mucor miehei

(SAID & PIETRO, 2004; WOOLLEY &

PETERSEN,1994).

46

A vantagem da utilizao do processo enzimtico o bom


rendimento obtido alm de uma maior seletividade, menores geraes de
rejeitos e produtos indesejveis (CANACKCI, 2007; HASAN et al., 2006;
JAEGER & EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO
et al., 2005).
No processo de fermentao de salsichas, utiliza-se Rhizomucor
miehei como produtora de lipase, acelerando o processo de maturao,
representando um baixo custo como aspecto positivo (CASTRO et al., 2004).
Um campo promissor de aplicao de lipases na indstria de
panificao, utilizando a lipase 1,3 especfica pelo seu efeito condicionador da
massa, o que facilita sua manipulao nos equipamentos convencionais da
indstria de panificao. Podem tambm aumentar o volume do po,
conferindo ao miolo uma cor mais clara, melhorando sua textura, com a
degradao dos lipdeos do trigo pela lipase, mudando sua interao com o
glten permitindo ao mesmo, uma rede mais elstica e resistente (CASTRO et
al., 2004; GOMEZ et al., 2004).
A lipase muito usada na indstria de panificao. Gandra e
colaboradores (2008) empregaram lipase ou monoacilglicerdeo (emulsificante)
na produo de pes enriquecidos com fibras visando a melhoria das
caractersticas do produto, tais como maciez, textura e aumento da vida de
prateleira. O objetivo do trabalho foi verificar a possibilidade de substituio do
monoacilglicerdeo utilizado como aditivo qumico amaciador, que complexa
com a amilose, dificultando sua recristalizao e a perda de gua do produto
pela lipase que atua como um coadjuvante tecnolgico natural. Os

47

monoacilglicerdeos so empregados como substncias emulsificantes na


indstria de alimentos, cosmticos e frmacos. Neste trabalho, eles obtiveram
uma reduo na umidade, responsvel pelo envelhecimento, que causado
pela digesto do amido, mantendo assim o miolo mais firme, tanto na
formulao controle quanto naquelas contendo lipase e monoacilglicerdeo,
porm verificaram que existe possibilidade de substituir o monoacilglicerdeo
pela lipase na formulao do po de forma enriquecido com fibras.

4.2.5.3 - INDSTRIA FARMACUTICA


A conscincia da crescente importncia da quiralidade na
atividade biolgica vem estimulando pesquisas por mtodos de sntese
industriais de enantimeros puros na sntese de drogas. O uso de cidos
graxos poliinsaturados (AGPIs) como frmacos e aditivos de alimentos tm
aumentado visando obterem AGPIs de lipdeos vegetais ou animais que
posteriormente sero aplicados na produo de frmacos (TREVISAN, 2004).
Peixes de regies frias como as anchovas e sardinhas possuem
um tipo de leo com efeitos teraputicos e fisiolgicos que vm atraindo a
ateno das indstrias farmacuticas atualmente. Estes atuam no sistema
cardaco, circulatrio e imunolgico juntamente aos processos carcinognicos e
inflamatrios. Nestes leos, so encontrados cidos graxos de cadeia longa,
poliinsaturados do tipo -3 como os cidos licosapentaenoico (EPA) e
decosahexaenoico (DHA), respectivamente, na ligao cis 5, 8, 11, 14, 17 e cis
4, 7, 10, 13, 16, 19. Os cidos EPA e DHA perdem muito das suas

48

propriedades teraputicas quando so hidrogenados. de interesse industrial


obterem triacilglicerdeos homogneos a partir desses cidos. No preparo
destes triacilglicerdeos, o processo de esterificao no vivel por destruir
parcialmente todas as ligaes cis -3 por migrao de duplas ligaes,
isomerizao ou oxidao (CASTRO et al., 2004).

4.2.5.4 - INDSTRIA DE PAPEL E CELULOSE


de crescente importncia a aplicao de lipases na indstria de
papel para a remoo dos componentes hidrofbicos (triacilglicerdeos e ceras)
da madeira, causadores de alguns problemas durante a fabricao do papel
(JAEGER & REETZ, 1998).
Utilizando-se a lipase produzida por Candida rugosa, possibilitouse controlar o alcatro que constitudo em grande parte por ceras e
triacilglicerdeos que causam problemas na manufatura de polpa e papel
(TREVISAN, 2004).

4.2.5.5 - INDSTRIA QUMICA


As lipases so utilizadas como biocatalisadores, pois apresentam
diversas

vantagens

sobre

os

catalisadores

clssicos

industriais.

As

caractersticas que as tornam atrativas do ponto de vista industrial so seu alto


grau de especificidade, regiosseletividade e enantioseletividade, permitindo a
sntese de compostos de alta pureza e gerando poucos subprodutos e

49

resduos. Seu uso minimiza a degradao de compostos lbeis e evitam o uso


de compostos qumicos com alto potencial poluente (SHARMA et al., 2001).
As lipases so muito utilizadas em snteses orgnicas, pois no
necessitam de coenzimas e so suficientemente estveis em solventes
orgnicos e em temperaturas relativamente altas. Esta estabilidade abriu
inmeras possibilidades no campo da sntese qumica, onde as diferentes
seletividades de lipases de vrias fontes, aliada s condies suaves de
temperatura e presso em que atuam apresentam uma enorme vantagem em
relao aos catalisadores convencionais (GULATI et al., 2005; JAEGER &
REETZ, 1998; SHARMA et al., 2001).
Na dcada de 80 comprovaram que as lipases no desativavam
em solventes orgnicos incentivando ento, estudos que possibilitaram que
estas enzimas fossem uma ferramenta ideal na qumica orgnica (TREVISAN,
2004).

4.2.5.6 - TRATAMENTO DE EFLUENTES


Existe um grande interesse em utilizar lipase no tratamento de
efluentes ricos em lipdeos, pois estas enzimas clivam triacilgliceris
especficos embora as lipases possam no ser to especficas e catalisam a
reao de hidrlise de triacilgliceris, que possuem diferente composio de
cidos graxos, o que pode ser um atrativo para a remoo de leos e gorduras
de estaes de tratamento que empregam lodo ativado (MENDES et al., 2005).

50

A camada de gordura no permite a transferncia de oxignio,


comprometendo a degradao da matria orgnica presente e tambm diminui
o tempo de vida til dos equipamentos e das estaes de tratamento de
esgoto. As lipases podem ser usadas na sua forma bruta (caldo fermentado)
ou isoladas na promoo de um pr tratamento antes da digesto anaerbia
(HASAN et al., 2006; MENDES et al., 2005).
As lipases agem na interface que separa as duas fases distintas, a
qual corresponde em nvel molecular a um grupo de duas camadas adjacentes
de molculas ordenadas, uma hidrofbica e outra hidroflica. Quanto maior a
interface maior a quantidade de enzima adsorvida, aumentando a taxa de
hidrlise (HASAN et al., 2006; MENDES et al., 2005).
Tcnicas para melhoramento da eficincia em biodigestores incluem
a instalao de caixas de gorduras ou de flotadores, adicionando lcalis ou
enzimas como as hidrolases e lipases para auxiliarem na remoo deste
material gorduroso (HASAN et al., 2006; MENDES et al., 2005).
A lipase MY produzida por uma linhagem de Candida sp. tem sido
utilizada no tratamento de esgotos em grandes edifcios e hotis, esta enzima
utilizada na limpeza da tubulao de plantas de tratamento de esgotos nos
Estados Unidos (SEITZ, 1974).

4.2.5.7 - PRODUO DE BIODIESEL

51

Os leos vegetais podem ser modificados atravs da reao de


transesterificao

visando

melhorar

caractersticas

como

viscosidade,

densidade especfica, entre outras para serem utilizadas como forma


alternativa de combustvel, o biodiesel (ALZUHAIR, 2005; CANAKCI, 2007;
JAEGER & EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO
et al., 2005).
As pesquisas tm sido voltadas atualmente na utilizao das
lipases em reaes de transesterificao de molculas de cidos graxos de
elevado peso molecular, catalisando a reao do lcool com leos de girassol,
colza, soja e gordura animal. O emprego de matrias primas agro-pecuria
como fontes de biocombustveis, vm crescendo e destacando nas reas
biotecnolgica, social e econmica (CANAKCI, 2007; LEE et al., 2002).
O biodiesel definido como monoalquil ster de cidos graxos de
cadeia longa, produzido a partir de leos vegetais ou gordura animal, que so
produtos provenientes de fontes renovveis, podendo ser utilizados em
motores de ignio por compresso ou como misturas em combustveis
derivados do petrleo, o diesel (ALZUHAIR, 2005; CANAKCI, 2007; JAEGER &
EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO et al.,
2005).
A

obteno

do

biodiesel

ocorre

atravs

da

reao

de

transesterificao, onde um leo reage com um lcool, na presena de um


catalisador, como um lcalis, um cido ou uma enzima (lipase). A vantagem de
se utilizar processo enzimtico devido ao bom rendimento obtido, maior
seletividade, inexistncia de rejeito aquoso alcalino e menor produo de

52

outros contaminantes (CANAKCI, 2007; HASAN et al., 2006; JAEGER &


EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO et al.,
2005). Utilizando o biodiesel diminui a produo de xidos de enxofre
(ALZUHAIR, 2005; CANAKCI, 2007; JAEGER & EGGERT, 2002; LEE et al.,
2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO et al., 2005).

53

5. DISCUSSO
As enzimas so eficientes catalisadores bioqumicos capazes de
catalisarem seletivamente e eficientemente os reatantes (substratos) para rotas
teis e, de todos os processos metablicos, mantendo-se inalteradas diante ao
processo.
As lipases so enzimas que possuem alta especificidade pelo
substrato, podendo ser obtidas a partir de diversas fontes produtoras como
animais, vegetais e, em especial, as microbiolgicas.
No entanto, variantes de lipases e seus produtores juntamente ao
nome sistemtico so motivos

para confuso, necessitando que se

desenvolvam tcnicas para obteno dessas variantes e de triagem das


mesmas, ampliando o leque de pesquisas e necessitando de mtodos bem
estabelecidos.
Muitas pesquisas tm sido realizadas para a diminuio dos custos
de produo das diversas enzimas empregadas industrialmente. Estes estudos
vo desde a seleo de novos microrganismos bons produtores, otimizao
das condies de produo, imobilizao da enzima at o uso da tecnologia do
DNA recombinante e engenharia de protenas (KIRK et al., 2002). Necessitamse mais estudos sobre fatores que influenciam na biossntese lipsica
juntamente

aos

seus

efeitos,

decorrentes

em

todos

os

tipos

de

microorganismos produtores da enzima, para otimizarem a produo.


Atualmente, a utilizao de lipases ocorre em nmero reduzido em
relao s possibilidades de utilizao desta enzima. No futuro sua utilizao
est diretamente relacionada com a reduo dos custos dos processos de

54

produo e purificao, na busca por novas linhagens produtoras ou no seu


melhoramento gentico em espao e tempo hbeis com caractersticas
desejveis. Lipases nativas e imobilizadas esto disponveis comercialmente,
pois um nmero crescente de aplicaes em sntese e biotransformaes tm
exigido esta forma.
A utilizao de lipases em diversos processos e em muitos pases
uma grande conquista podendo ser um fator indispensvel para a economia
mundial, por estas serem enzimas biolgicas e biodegradveis e, no caso das
lipases, atuando em diversos processos modificando leos e gorduras e em
outras reaes energticamente possveis.
Um assunto muito em pauta ultimamente tm sido o biodiesel,
utilizando lipases, pelo fato de serem naturais, apresentam bons rendimentos,
tm maior seletividade, variabilidade e especificidade, como tambm pela
inexistncia de rejeitos e uma diminuio na produo de contaminantes em
comparao com as de reaes cidas ou bsicas.
Enfim, so uns dentre outros motivos que as tornam to atrativas
entre tantas possibilidades de estudos assim como, para uma diminuio dos
custos de produo tornando-as ainda mais viveis industrialmente.

55

6. CONCLUSO
Atravs deste trabalho, vimos que estudos sobre enzimas so de
grande importncia prtica e a catlise enzimtica das reaes so essenciais
para os sistemas vivos. So catalisadores extraordinrios e so produtos
naturais, tendo como funo viabilizar a atividade celular, quebrando molculas
ou juntando-as para formarem novos compostos. Diversas enzimas so
utilizadas industrialmente devido a sua especificidade ao substrato e pelo fato
de no serem txicas, destacando-se as lipases.
Conclui-se que as lipases so dotadas de um grande potencial,
em diversos tipos de aplicaes e em diferentes processos industriais. As
lipases produzidas por microrganismos so geralmente extracelulares, o que
permite fcil extrao e possvel reutilizao, diminuindo o custo da produo.
So eficientes, estveis e dotadas de alto grau de especificidade, o que as
tornam to atrativas no ponto de vista industrial e econmico, alm de diminuir
a gerao de sub produtos indesejveis ao meio ambiente.
de grande perspectiva futura a utilizao destes notveis
biocatalisadores enzimticos em novos processos de biotransformaes a
serem desenvolvidos.

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